Programa de Ingeniera de Alimentos Biotecnologa Alimentaria Taller 1

1. Explique y de un ejemplo de crecimiento Diuxico 2. Explique y cite un estudio de caso donde un AMG haya sido la causa de un problema 3. Explique las pruebas que se le realizan a un AMG antes de salir al mercado y que diferencias podra haber con respecto a las pruebas que se le hacen a un alimento natural 4. Que significa que la molcula de ADN es antiparalela? 5. Explique cmo se produce una nueva hlice de ADN 6. Explique la funcin de un plsmido 7. Explique Como se hace una clonacin y de ejemplo 8. Explique PCR (Reaccin en cadena de la polimerasa) y sus etapas.

SOLUCION

1.

Crecimiento diauxico es el desarrollo del microorganismo sobre dos fuentes de energa presentes al mismo tiempo. Primero utiliza una de las fuentes, hasta agotarla, luego hay una pequea latencia, posteriormente reinicia al crecimiento con la segunda fuente de energa. Tiempo Log N/ml

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El crecimiento diauxico este tipo de crecimiento tiene lugar cuando una bacteria crece en un medio con dos fuentes de carbono, una de las cuales se usa con preferencia frente a la otra. Es consecuencia de la represin catablica (Mecanismo de regulacin de la expresin gnica.)

Da lugar a una curva de crecimiento con dos fases exponenciales separadas por una fase estacionaria corta. Esto ocurre porque la bacteria crece primero a expensas de la fuente de Carbono preferente, cuando la agota entra en fase estacionaria hasta que sintetiza enzimas para degradar la otra fuente de carbono, entonces reemprende el crecimiento exponencial, si bien con una pendiente mas suave.

(1)

Ejemplo: Supongamos que inoculamos una bacteria en un medio lquido provisto de dos fuentes de carbono (glucosa y lactosa), de las cuales una (en este ejemplo, la glucosa) es usada preferencialmente. Bases del crecimiento diuxico: La bacteria usa en primer lugar slo la fuente preferencial de Carbono (en este caso, la glucosa, que suele ser la fuente preferencial en muchos hetertrofos),

sin "tocar" la otra fuente. Una vez que agota la primera fuente, se dispone a usar la segunda (lactosa), pero tarda un tiempo hasta que sintetiza los enzimas catablicos necesarios para degradar esa segunda fuente. Cuando las bacterias han logrado niveles de esos enzimas adecuados, se restablece el crecimiento exponencial, aunque, como se puede constatar, con una pendiente menor (lo que significa que esta fuente alternativa permite una tasa menor que la preferencial).

2.

CASO 1: Se cita un artculo donde se analiza todos los aspectos referentes a la seguridad alimentaria relacionados con los organismos modificados genticamente en la agricultura y la alimentacin. Se discuten las incertidumbres asociadas a la insercin de genes extraos en organismos, facilitando ejemplos de efectos imprevistos e indeseados y de inestabilidades de los organismos as fabricados artificialmente. Luego se aportan datos tanto de agencias oficiales como de la literatura existente, que cuestionan la seriedad y fiabilidad de los anlisis de riesgo sobre la inocuidad para la salud de estos organismos y se discute la falta casi absoluta de estudios cientficos que analicen la seguridad/peligrosidad de los alimentos transgnicos para la salud. Dadas todas estas incgnitas, se tienen que tomar en cuenta otros factores, en particular la contaminacin gentica de los cultivos no modificados genticamente, que empieza a ser generalizada en algunas partes del mundo. No poder dar marcha atrs en caso de problemas resulta irresponsable. Otros elementos importantes son los impactos sobre el medio ambiente (como la aparicin de resistencias en insectos, la prdida de biodiversidad, el aumento de los productos qumicos empleados) con repercusiones indirectas sobre la salud y/o la futura produccin de alimentos.

Por ltimo se introducen elementos de discusin sobre la seguridad alimentaria en trminos de disponibilidad de alimentos y soberana alimentaria, dado que el mercado de las semillas transgnicas y los agroqumicos asociados est copado por cinco grandes empresas transnacionales. La conclusin hace un anlisis de la contribucin de la agricultura biotecnolgica a la sostenibilidad. Revista Espaola de Salud Pblica Versin impresa ISSN 1135-5727 Rev. Esp. Salud Publica v.79 n.2 Madrid mar.-abr. 2005 COLABORACIN ESPECIAL

ORGANISMOS MODIFICADOS GENTICAMENTE: UNA NUEVA AMENAZA PARA LA SEGURIDAD ALIMENTARIA

Liliane Spendeler. Amigos de la Tierra Espaa - Miembro de Amigos de la Tierra Internacional

http://scielo.isciii.es/scielo.php?pid=S1135-57272005000200013&script=sci_arttext

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CASO2: Soja Transgnica: Cuidado.

Si tomas soja, asegrate que no es transgnica, busca que ponga algo como: No contiene OMG, o Soja de Agricultura ecolgica (no llevan transgnicosOMG (OMG: Organismos Modificados Genticamente). La soja modificada genticamente est relacionada con la esterilidad y mortalidad infantil en hamsteres. (Surov, mayo 2010) Un estudio reciente de mayo de 2010 muestra las evidencias de los daos de la soja transgnica en la esterilidad y mortalidad infantil en hamsteres. El bilogo Ruso Alexey V. Surov, cuenta que este estudio fue slo rutina. l y sus colegas se propusieron descubrir si la soja transgnica (OMG) de Monsanto, que se cultiva en el 91% de los campos de soja de EEUU, conduce a problemas en el crecimiento o en la reproduccin. Despus de alimentar grupos de hamsteres a lo largo de tres aos durante ms de tres generaciones, aquellos que fueron alimentados con soja modificada genticamente, y especialmente los del grupo que fueron alimentados con mayor cantidad de soja OMG, mostraron resultados devastadores. En la tercera generacin, la mayora de hamsteres alimentados con la soja transgnica perdieron la habilidad de tener cras. Tambin sufrieron un crecimiento ms lento, y una tasa de mortalidad ms alta entre las cras. Ms impactante an, algunos en la tercera generacin tenan pelo creciendo dentro de sus bocas, un fenmeno raramente visto, pero ms prevalente entre los hamsteres que comieron soja transgnica. A principio de este ao Surov mostraba en Doklady Biological Sciences que en raras ocasiones, el pelo crece empotrado en unas bolsas dentro de las bocas de los hamsteres. Algunas de estas bolsas, contenan pelos sueltos, mientras que otras contenan gruesos haces de pelos incoloros o pigmentados que llegaban tan alto como la superficie de masticacin de los dientes. A veces, la fila de dientes se rode de un paquete de cepillo de pelo en ambos lados, los pelos crecieron verticalmente y haba extremos puntiagudos, a menudo cubiertos con trozos de un tapn de moco (Es flipante esta descripcin, pero la realidad hay que verla, pues estamos hablando del futuro gentico de nuestra especie y los dems seres vivos que nos acompaan en este mundo).

El estudio, ha sido realizado conjuntamente por el Instituto Surov de Ecologa y Evolucin, de la Academia Rusa de las Ciencias y la Asociacin Nacional para la Seguridad del Gen. Surov dice que estos efectos pueden no ser slo por la modificacin gentica. Adems de los transgnicos, que pueden ser contaminantes, estn aadidos los residuos de los herbicidas asociados a estas plantas como el glifosato (roundup). Por lo tanto la soja transgnica, lleva siempre la doble amenaza del contenido ms alto de herbicida junto con los efectos secundarios de la ingeniera gentica. Desrdenes reproductivos de la alimentacin transgnica. Los hamsteres de Surov son slo los ltimos animales que han sufrido desrdenes reproductivos despus de consumir transgnicos. En 2005, Irina Ermakova, tambin con la Academia Nacional Rusa de Ciencias, inform que ms de la mitad de las cras (50%) de las madres hmster alimentadas con soja transgnica murieron en el espacio de unas tres semanas. Esto fue cinco veces mayor que el 10% de la tasa de mortalidad del grupo alimentado sin soja transgnica. Los cachorros en el grupo OMG eran tambin ms pequeos y no podan reproducirse. En una coincidencia, despus de los ensayos de alimentacin de Ermakova, su laboratorio comenz a alimentar todas las ratas de las instalaciones con comida comercial para ratas usando soja transgnica. En el plazo de dos meses la mortalidad infantil de las ratas de la instalacin haba alcanzado el 55%. Ermakova encontr tambin cambios significativos en el color de los testculos, incluyendo clulas daadas en espermatozoides jvenes. Por otra parte el ADN de los embriones de los padres ratones alimentados con soja OMG, funcionaba de manera diferente. Un estudio del gobierno de Austria (pas en el que est prohibido el cultivo de transgnicos) mostraba que cuanto ms maz OMG se daba a los ratones, menos cachorros tenan, y ms pequeos eran los cachorros. El agricultor Jerry Rosman, de Iowa, EEUU, tambin tuvo problemas con los cerdos y las vacas que se volvan estriles. Despus de meses de investigaciones y pruebas, finalmente relacion el problema con el maz transgnico. Cada vez que un peridico, revista o programa de televisin informa de los problemas de Jerry, el recibe llamadas de ms agricultores quejndose de

la esterilidad del ganado en su finca, vinculados con el maz transgnico. (Ms abajo pongo el video con el caso del agricultor alemn Gottfried Glockner.) En Haryana, India, un equipo de investigacin de veterinarios inform que los bfalos que consumen semillas de algodn transgnico sufren de infertilidad, as como frecuentes abortos, partos prematuros, y prolapso de tero. Muchos bfalos adultos y jvenes han muerto tambin misteriosamente.

3.

Los alimentos transgnicos, antes de llegar al mercado sufren una serie de evaluaciones rigurosas (realizadas por comits independientes) sobre su seguridad alimentaria y sus cualidades nutritivas, de tal modo que se puede decir que estos controles son, en general, ms severos que los que se emplean en otros productos alimenticios. El objetivo de estos estudios previos es asegurarse de que como mnimo, no se altera el nivel de seguridad del producto convencional del que deriva el transgnico. Para esta evaluacin se ha introducido el concepto de "equivalencia sustancial", segn el cual, si un alimento procedente de la nueva biotecnologa se puede caracterizar como equivalente a su predecesor convencional, se puede suponer que no plantea nuevos riesgos, y por lo tanto, es aceptable para consumo. Este concepto fue introducido por la OCDE en 1993 (antes de la comercializacin de ninguna planta genticamente manipulada), tras varios aos de trabajos de numerosos expertos de muchos pases. En 1996 la OMS y la FAO recomendaron su adopcin como base para los estudios de seguridad alimenticia de los OGMs. La propia OCDE sigue profundizando en este enfoque, en un intento de mejorarlo, de modo que en la actualidad se estn desarrollando nuevas metodologas de evaluacin que incluyen la identificacin de niveles de nutrientes, antinutrientes y posibles toxinas y alrgenos en todo tipo de plantas de cultivo.

Pero hay que tener claro que la equivalencia sustancial no viene a sustituir a evaluaciones de seguridad ms rigurosas, sino slo a exigir que la variedad GM sea tan segura como la antigua predecesora. De hecho, en el caso de

identificarse alguna diferencia, se realizan ensayos nutricionales, inmunolgicos y toxicolgicos adicionales. Cuando un producto va a salir nuevo al mercado se tienen en cuenta los siguientes resultados: Cambios buscados por la manipulacin Posibles cambios no pretendidos Estabilidad de la construccin gentica Posible transferencia gnica horizontal a otras plantas. A la hora del consumo no sea toxico, no contenga antinutrientes.

Veamos esto con un ejemplo: La soja manipulada para hacerla resistente al herbicida glifosato contiene un nuevo gen que determina la enzima EPSPS (relacionada con el metabolismo de los aminocidos aromticos). Los estudios moleculares demostraron que se produjo el cambio buscado en la planta la construccin gentica era estable durante varias generaciones de cultivo la enzima producida en la planta no era txica, tal como determinaban los correspondientes ensayos. Adems, la protena se destrua rpidamente bajo las condiciones habituales de procesamiento de la soja. Aun cuando se consuma en crudo, la protena se degrada rpidamente en el tracto digestivo. En resumidas cuentas, la posibilidad de expresin de nuevas toxinas, alrgenos o antinutrientes en las plantas transgnicas no es intrnsecamente superior a la de las plantas convencionales.

4.

Las dos cadenas de ADN son antiparalelas, por esta razn la ADN polimerasa puede solamente sintetizar un nuevo ADN en la direccin 5' a 3'. Esto plantea problemas especiales para la replicacin de una doble cadena de ADN.

LA doble cadena de ADN, est desenrollada y lista para la replicacin. Note la naturaleza antiparalela de las cadenas; esto es la orientacin 5' a 3' de la cadena de arriba y la orientacin 3' a 5' de la cadena complementaria de abajo. Experimentos mostraron que, una cadena formar una copia continua, mientras que en la otra se formarn una serie de fragmentos cortos conocidos como fragmentos de Okazaki . La cadena que se sintetiza de manera continua se conoce como cadena adelantada y la que se sintetiza en fragmentos cadena atrasada. Para que trabaje la ADN polimerasa es necesario la presencia, en el inicio de cada nuevo fragmento, de pequeas unidades de ARN conocidas como cebadores, a posteriori, cuando la polimerasa toca el extremo 5' de un cebador, se activan otras enzimas, que remueven los fragmentos de ARN, colocan nucletidos de ADN en su lugar y, una ADN ligasa los une a la cadena en crecimeinto.

(3)

5.

6. Los plsmidos son fragmentos extracromosmicos de cidos nucleicos (ADN o ARN) que aparecen en el citoplasma de algunos procariotas. Son de tamao variable aunque menor que el cromosoma principal. Cada bacteria puede tener uno o varios a la vez. Los plsmidos tienen una conformacin variable que puede ser lineal, circular o con estructura superenrrollada. El control de la replicacin del plsmido depende del tipo de plsmido, existiendo plsmidos cuya replicacin est acoplada con la replicacin del cromosoma bacteriano y plsmidos cuya replicacin no est relacionada con la del cromosoma. El tipo de genes que portan los plsmidos es variado, tratndose generalmente de genes que aportan ventajas adaptativas a la bacteria que los porta: genes de resistencia a antibiticos, genes de produccin de sustancias txicas para otras bacterias o genes que codifican enzimas tiles para degradar sustancias qumicas.

Los plsmidos se pueden clasificar siguiendo distintos criterios. Uno de estos criterios es el tipo de genes que portan. As se define el grupo de plsmidos con genes de degradacin de sustancias, el grupo de plsmidos con genes de fertilidad, el que porta genes de virulencia o el grupo que porta genes de resistencia.

Los plsmidos son herramientas muy tiles en ingeniera gentica para la transformacin gnica y la manipulacin gentica de procariotas y eucariotas. Los plsmidos empleados en ingeniera gentica se llaman vectores. Son muy tiles para sintetizar en grandes cantidades protenas de inters, como la insulina o los antibiticos, mediante un procedimiento conocido como transformacin. El proceso de transformacin comienza con la seleccin de un plsmido adecuado, en el que se introducen los genes que se quieren expresar con protocolos especficos que usan enzimas de restriccin y DNA ligasa. Posteriormente se transforma un tipo de bacteria con el plsmido modificado y se seleccionan las bacterias transformadas que produzcan las sustancias deseadas. Estas bacterias se cultivan en sistemas de tipo biorreactores para su

crecimiento en grandes cantidades. En este proceso se eligen plsmidos con caractersticas que permitan seleccionar las bacterias transformadas en un medio de cultivo como por ejemplo plsmidos con genes de resistencia a antibiticos o con genes de enzimas que sinteticen compuestos coloreados. El gen a ser replicado se inserta en copias de un plsmido el cual contiene genes que hacen clulas resistentes a un antibitico en particular. En el paso siguiente el plsmido es insertado en la bacteria por medio de un proceso llamado transformacin. Luego, la bacteria es expuesta a un antibitico particular. Solo la bacteria que toma copias del plsmido sobrevive al antibitico debido a que el plsmido lo hace resistente. En particular, los genes protectores son expresados (usados para hacer protena) y la protena expresada evita la accin del antibitico. De esta forma, los antibiticos actan como un filtro que seleccionan nicamente la bacteria modificada. Ahora, estas bacterias pueden ser cultivadas en largas cantidades, cosechadas y el plsmido de inters puede ser aislado. Otro uso importante de los plsmidos es fabricar grandes cantidades de protenas. En este se deja crecer la bacteria que contiene el plsmido que encierra al gen de inters. Solo como la bacteria produce la protena que le confiere si resistencia a los antibiticos, este tambin puede ser usado para producir protenas en grandes cantidades desde el gen insertado. Esta es una forma barata y fcil de producir genes o protenas que este codifica de forma masiva, como por ejemplo insulina, o inclusive antibiticos. 7.

8. La reaccin en cadena de la polimerasa, conocida como PCR por sus siglas en ingls (polymerase chain reaction), es una tcnica de biologa molecular

desarrollada en 1986 por Kary Mulls, 1 cuyo objetivo es obtener un gran nmero de copias de un fragmento de ADN particular, partiendo de un mnimo; en teora basta partir de una nica copia de ese fragmento original, o molde. La Reaccin en cadena de la polimerasa, PCR se fundamenta en la amplificacin enzimtica de un fragmento de ADN flanqueado por dos secuencias de oligonucletidos que hibridan en la cadena complementaria de la molcula molde que se va a amplificar (cebadores o primer) Y que son utilizados por una ADN polimerasa termoresistente para copiar la secuencia de la misma. La reaccin es un proceso que consta de 3 etapas: desnaturalizacin, hibridacin y extensin.

ETAPAS DE LA PCR

Desnaturalizacin: Para que pueda iniciarse la reaccin es preciso que las molculas de ADN molde se encuentren en forma de cadena simple. Esto se consigue calentando a temperatura de 90 a 95C para que produzca la rotura de los enlaces puente de hidrogeno intercatenarios y la separacin de ambas cadenas, para asegurar la completa separacin de la doble cadena del ADN esta temperatura debe mantenerse unos minutos. Si el ADN solo se desnaturaliza parcialmente ste tender a renaturalizarse muy rpidamente dificultando con esto el proceso de hibridacin.

Hibridacin: Una vez que el ADN est desnaturalizado se disminuye la temperatura de la reaccin hasta un rango comprendido entre los 40 y los 60C para que se pueda producir la hibridacin especfica de los cebadores a las secuencias flanqueantes del fragmento que se desea amplificar, la temperatura a la que se realiza esta etapa debe establecerse para cada reaccin en funcin de la longitud de los cebadores y su secuencia (Temperaturas inferiores a la ptima nos producirn hibridaciones inespecficas de los cebadores y temperaturas superiores nos dificultarn la eficiencia de la misma.

Extensin: Durante esta etapa la ADN polimerasa termoresistente incorpora nucletidos en el extremo 3 del cebador utilizado como molde la cadena de ADN previamente desnaturalizada. La temperatura a la que se realiza esta etapa de la reaccin suele ser de 72C ya que es la temperatura a la que la Taq polimerasa alcanza su mxima actividad. Normalmente una extensin de 20 segundos es suficiente para fragmentos menores de 500 pares de bases, y 40 segundos para fragmentos por encima de 1.2Kb.Al finalizar cada uno de los ciclos el nmero de copias obtenidas se duplica y despus de 20 ciclos ya tenemos aproximadamente 1 milln de copias de cada una de las molculas molde iniciales ADN.

BIBLIOGRAFIA:

1. DIVERSIDAD MICROBIANA Y TAXONOMA

Ins Martn Snchez; Universidad de granada; Departamento de microbiologia de la UGR. http://www.diversidadmicrobiana.com/index.php?option=com_content&view=article&id=471&Ite mid=519; http://dungun.ufro.cl/~CyT/Reactores/descargables/Bioreactores2.pdf

2. Microbiology 5th; Lansing Prescott; Capitulo 5 y 6 http://www.iib.unsam.edu.ar/php/docencia/licenciatura/biotecnologia/2011/MicroBiol/crecimi ento_diauxico.pdf http://www.slideshare.net/Nolertrincon/crecimiento-2007-1

3. EL ADN Y LA GENETICA MOLECULAR; Traduccin, redaccin y diagramacin a cargo de: Dr. Jorge S. Raisman, lito@unne.edu.ar Ing. Ana Mara Gonzalez, anitama39@yahoo.com Actualizado en Febrero del 2000. http://www.efn.uncor.edu/dep/biologia/intrbiol/adntema1.htm

4. http://www.diversidadmicrobiana.com/index.php?option=com_content&view=article&id=471 &Itemid=519 5. http://www.biologia.edu.ar/microgeneral/micro-ianez/14_micro.htm#diaux 6. http://semillasysalud.wordpress.com/la-soja-modificada-geneticamente-esta-relacionadacon-la-esterilidad-y-mortalidad-infantil-en-hamsteres/ 7. http://www.ugr.es/~eianez/Biotecnologia/seguridad.htm 8. http://www.slideshare.net/munevarjuan/biologia-de-plasmidos 9. http://medmol.es 10. http://www.cienciahoy.org.ar/hoy23/reaccion.htm