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AISLAMIENTO DE BACTERIAS AMILOLTICAS Laboratorio de Bio !"te i Mi#robia"a 1$%&. Febrero-Mayo de 2010. Semestre 2010/2

PRCTICA # 1. PRODUCCIN DE AMILASAS.

Ob'eti(o )e"era*e +
Aprender y aplicar tcnicas de Microbiologa bsicas, !e se !tili"an en la manip!laci#n de microorganismos. $esarrollar la tcnica de screening primario y sec!ndario para el aislamiento de bacterias degradadoras de almid#n. $eterminar la acti%idad en"imtica de las amilasas c!alitati%amente.

PRIMERA SESION ,(ier"e -. de /ebrero0 ELABORACIN Y ESTERILI1ACIN DE MEDIOS DE CULTI2O OB3ETI2OS ESPEC4ICOS
Aprender el concepto de esterili"aci#n y s! !tilidad en Microbiologa. &onocer las principales 'ormas de preparar el material para esterili"aci#n. &omprender el concepto de medio de c!lti%o en Microbiologa y (iosntesis, as como s! clasi'icaci#n y %alidaci#n. Mane)ar los conceptos de traba)o en rea estril, mane)o asptico del material, conser%aci#n de la esterilidad.

MATERIAL Y REACTI2OS 1 Matra" *rlenmeyer de 2+0 ml 2 ,ipeta de 10 ml. 2 ,ipetas de 1 ml. 1 -arilla en . 1 Mec/ero 1 0ripi 1 (ase para mec/ero 1 ,robeta de 100 ml 1 *spt!la 1 -idrio de relo) 1 (alan"a granataria 2 0!bos de 221100 con tap#n de rosca 12 0!bos de 1311+0. 1 emb!do de %idrio

MEDIO DE CULTI2O DE ENRI5UECIMIENTO &omposici#n *4tracto de le%ad!ra 6a&l Almid#n sol!ble Agar Ag!a destilada cbp. p7

g/. 5.0 +.0 10.0 1+.0 1000 m. 8.0 9 0.2

METODOLO)IA
a0 Pre6ara#i7" de* 8ateria* 1. -eri'icar el material para %eri'icar s! estado. 2. .a%ar el material de %idrio, en)!agar y de)ar sacar al aire. 2. ,reparar el material con algod#n y papel para s! esterili"aci#n, en el caso de las pipetas serol#gicas.

2 b0 Pre6ara#i7" de *o 8edio de #9*ti(o. 1. -eri'icar !e se enc!entren todos los reacti%os para preparar el medio de enri !ecimiento. 2. $e ac!erdo a la composici#n de medio de enri !ecimiento reali"ar los clc!los para preparar :0 ml de este medio ;8 ml para 2 t!bos de 1311+0mm y 20 ml para los t!bos de 221100< 5. Adicionar 20 ml de ag!a destilada a !n matra" erlenmeyer. 2. ,esar lo ms rpido posible los reacti%os y colocarlos en el matra" *rlenmeyer. +. Adicionar el %ol!men restante de ag!a destilada. Agitar para disol%er. 3. &olocarle !n tap#n de algod#n. 8. &alentar el medio /asta eb!llici#n para !e se dis!el%a el agar, el medio tiene !e pasar de t!rbio a transl!cido. :. &on la ay!da de !n emb!do de %idrio distrib!ir en los t!bos tal y como se indica en el p!nto 2. =. &olocarles !n tap#n de algod#n a los t!bos !e lo re !ieran 10. Mandar esterili"ar los t!bos y las pipetas en%!eltas en a!tocla%e a 121>&, d!rante 1+min. 12. Al trmino de la esterili"aci#n se inclinan los t!bos para 'orma !n ?pico de 'la!ta@ 15. 7acer la pr!eba de esterilidad inc!bando los medios, /asta la sig!iente sesi#n. 12. .as pipetas se g!ardan en las ga%etas.

SE)UNDA SESION ,(ier"e : de 8ar;o0 T<CNICAS DE SIEMBRA OB3ETI2OS ESPECI4ICOS

Aeali"ar alg!nas tcnicas de siembra !e se !tili"an para c!lti%ar microorganismos y comprender la !tilidad y prop#sitos de cada !na. -&omprender el concepto de promoci#n del desarrollo microbiano.

MATERIAL Y REACTI2OS 2 Mec/eros 1 Bradilla 1 0ripi y c/arola de metal MEDIOS DE CULTI2O 2 0!bos de 1311+0mm con caldo n!triti%o y : &a)as ,etri. Di/ere"#ia* ,a=ar a*8id7"0 &omposici#n ,eptona de carne *4tracto de le%ad!ra 6a&l Almid#n sol!ble Ag!a destilada cbp. p7

2 Asas bacteriol#gicas 1 -aso de precipitados de 2+0 ml

g/. +.0 5.0 +.0 10.0 1000 m. 8.0 9 0.2

MATERIAL BIOL)ICO. M!estras de tierra o alimentos como elote y t!brc!los con alto contenido de
almidones ;papas, camote< sin la%ar. Ag!a de la lla%e

METODOLO)A a0 )e"erar >rea a ?6ti#a.

1.- .impiar la mesa de traba)o. 2.- Aplicar sol!ci#n desin'ectante en la mesa de traba)o y de)ar secar.

3 5. &olocar medios de c!lti%os y el material necesario para sembrar, comoC asas bacteriol#gicas, pipetas estriles, etc.

b0 @er(ir e* a=9a
1. &olocar en el %aso de precipitados apro4imadamente el e !i%alente a dos c!c/aradas de material biol#gico y 100 m. de ag!a de la lla%e. 2. &alentar a eb!llici#n d!rante 10 min!tos y de)ar asentar la tierra presente en la m!estra.

#0 T?#"i#a de ie8bra.
I"o#9*a#i7" #o" a a ba#terio*7=i#a e" #a'a Petri. 1. *sterili"ar al ro)o %i%o el asa. 2. $e)ar en'riar. 5. 0omar de la m!estra de tierra /er%ida !na asada. A=ota8ie"to de a a. &olocar la m!estra !e se tom#, en la ca)a ,etri, reali"ar !n estriado contin!o de i" !ierda a derec/a, sin le%antar el asa ni repetir el estriado

Sie8bra 8a i(a. &on la pipeta estril, colocar 1 ml de ag!a donde se /ir%i# la tierra. $estapar la %arilla de s! en%olt!ra y distrib!ir la m!estra en toda la s!per'icie de la ca)a.

1 ml de muestra

C9adra"te i86*e. $i%idir el 'ondo de la ca)a en c!atro c!adrantes. *sterili"ar el asa, 0omar la m!estra y depositarla en !n c!adrante de la ca)a, sin esterili"ar el asa se pasa al seg!ndo c!adrante y as /asta terminar, e%itar tocar los c!adrantes ni lateralmente ni en el centro.

4 C9adra"te radia*. 1. 0omar el in#c!lo y estriar en !n segmento, se esterili"a el asa y se arrastra del primero al seg!ndo, se esterili"a el asa y se arrastra del seg!ndo al tercero, se esterili"a el asa y se arrastra del tercero al c!arto y el c!arto termina con !n estra ond!lada al centro, no deben tocarse la primera y la Dltima estra.

I"o#9*a#i7" #o" a a ba#terio*7=i#a e" t9bo i"#*i"ado . 1. *sterili"ar el asa. 2. 0omar !na m!estra de la tierra /er%ida. 5. Enoc!lar los t!bos con agar inclinado ;pico de 'la!ta< colocando la m!estra /asta el 'ondo, Enoc!laci#n por estra ond!lada se %a mo%iendo de lado a lado mientras se s!be el asa ;reali"ar en !n t!bo de 131+0 y en !no de 224180<. Enoc!laci#n por estra recta se desli"a el asa /acia arriba en 'orma recta asa ;reali"ar en !n t!bo de 131+0 y en !no de 224180<. I"o#9*a#i7" #o" a a ba#terio*7=i#a e" 8edio *!A9ido . 1. *sterili"ar el asa. 2. 0omar m!estra de la tierra /er%ida. 5. Enoc!lar en !n t!bo de 1311+0 mm del t!bo. Agitar el medio l !ido !e contiene caldo n!triti%o, ;s!mergiendo el asa con la m!estra, casi al 'ondo

Enc!bar las ca)as ,etri y los t!bos en la ga%eta y el l!nes re'rigerarlas /asta la sig!iente sesi#n.

TERCERA SESION ,(ier"e 1- de 8ar;o0 MOR4OLO)A MACROSCPICA Y MICROSCPICA TINCIN DI4ERENCIAL DE )RAM PRIMER AISLAMIENTO

OB3ETI2OS ESPECI4ICOS
Edenti'icar alg!nas caractersticas c!lt!rales macrosc#picas y microsc#picas de los microorganismos y la importancia !e tienen en (iosntesis. Aeali"ar alg!nas de las preparaciones y tinciones ms !tili"adas en Microbiologa. Seleccionar !na colonia de ac!erdo a las caractersticas macro y microsc#picas para reali"ar el primer aislamiento para el aislamiento de bacterias degradadoras de almid#n.

MATERIA Y REACTI2OS 2 Microscopios 2 Mec/eros 2 (!lbos de goma &olorantes de Bram Ao)o de metilo MEDIOS DE CULTI2O 2 0!bos de 151100 mm con ag!a destilada estril. : &a)as ,etri con agar almid#n

2 Bradillas 2 Asas bacteriol#gicas 2 ,ipetas ,aste!r A"!l de metileno

Medio Di/ere"#ia* ,a=ar a*8id7"0 &omposici#n ,eptona de carne *4tracto de le%ad!ra 6a&l Almid#n sol!ble Ag!a destilada cbp. p7

g/. +.0 5.0 +.0 10.0 1000 m. 8.0 9 0.2

MUESTRAS BIOL)ICAS. &!lti%os de la sesi#n pasada, Bacillus subtilis y Serratia marcescens METODOLO)A

)e"erar >rea a ?6ti#a.

1.- .impiar con sol!ci#n desin'ectante la mesa de traba)o y de)ar secar. 2. &olocar medios de c!lti%os y el material necesario para sembrar, comoC asas bacteriol#gicas, pipetas estriles, etc.

Mor/o*o=!a 8a#ro #76i#a B 8i#ro #76i#a

1. Fbser%ar las ca)as ,etri inoc!lados la sesi#n pasada, de ac!erdo a las instr!cciones de los pro'esores. 2. Fbser%ar los t!bos inoc!lados la sesi#n pasada, de ac!erdo a las instr!cciones de los pro'esores.

Ti"#i7" Di/ere"#ia* de )ra8 ,e ta ti"#i7" e rea*i;ar> #o" *o 8i#roor=a"i 8o 6rob*e8a B *a 89e tra #o"tro*0
1. *legir las ca)as petri !e contengan colonias ;crecimiento microbiano< aisladas

6 2. *n !n portaob)etos colocar !na pe !eGa gota de ag!a 5. &on ay!da del asa estril tomar !na pe !eGa m!estra de !na colonia aislada 2. Me"clar la m!estra con el ag!a y /acer el e4tendido ;'rotis< +. $e)ar secar al aire. 3. 0omarlo por !n e4tremo con pin"as. 8. ,asar por el mec/ero 2 # + %eces para 'i)ar con calor. :. &!brir el 'rotis con el cristal %ioleta ;colorante primario< y de)ar act!ar por !n min!to. =. *liminar el e4ceso y la%ar con ag!a. 10. Agregar el l!gol, de)ar act!ar por !n min!to. 11. *liminar el e4ceso y la%ar con ag!a. 12. $ecolorar con + a 10 gotas de la sol!ci#n de alco/ol-acetona. 15. ,arar la decoloraci#n la%ando con ag!a. 12. AGadir la sa'ranina ;colorante de contraste< y de)ar act!ar por !n min!to. 1+. *liminar el e4ceso y la%ar con ag!a, de)ar secar la preparaci#n. 13. Fbser%ar con el ob)eti%o de 1001. 6o ol%idar !tili"ar aceite de inmersi#n y reportar

Pri8er ai *a8ie"to
2 ca)as con agar almid#n Asa bacteriol#gica Mec/ero 1. *sterili"ar el asa bacteriol#gica. 2. 0omar !na asada de la colonia aislada de donde se reali"# la tinci#n de Bram y res!spenderla en !n t!bo de sol!ci#n salina estril ;SSE< 5. Enoc!lar dos ca)as ,etri con medio de agar almid#n ;medio di'erencial<, !tili"ando la tcnica de c!adrante radial 2. &ada miembro del e !ipo debe de tomar dos collonias y sembrar en dos ca)as petri.

A*98"o 1

A*98"o -

+. Enc!bar a temperat!ra ambiente d!rante 82 /oras.

Se=9"do ai *a8ie"toC eDtra#*a e ,*9"e

&a)as con agar almid#n Asa bacteriol#gica.

1: de 8ar;o0+

7 Mec/ero

METODOLO)IA
1. Seleccionar dos colonias aisladas, ;dos colonias por al!mno< !e tengan b!en crecimiento y !e el medio a s! alrededor pare"ca ligeramente transl!cido. 2. Aislar por c!adrante radial !na ca)a. Enc!bar a temperat!ra ambiente /asta la sig!iente sesi#n.

CUARTA SESION ,(ier"e 1$ de 8ar;o0+ TERCER AISLAMIENTO SELECCION DE CEPA AMILOLITICA SIL2ESTRE
OB3ETI2OS ESPECI4ICOS &ontin!ar con la tcnica de screening sec!ndario para el aislamiento de bacterias capaces de degradar el almid#n. Seleccionar !na cepa sil%estre amiloltica y !e prod!"ca esporas. MATERIAL 2 mec/eros 2 asas bacteriol#gicas 1 microscopio 1 gradilla 1 'rasco con %erde de mala !ita al +H ,apel 'iltro

1 tripi 1 c/arola de metal 1 %aso de pp de 2+0 m. 1 )!ego de colorantes de Bram 1 'rasco con sa'ranina 0.+H

MEDIOS DE CULTI2O. 2 &a)as con agar almid#n. METODOLO)IA 1. Seleccionar de entre las colonias aisladas en cada ca)a del aislamiento anterior a !ella !e macrosc#picamente se obser%e p!ra y se enc!entre ms separada del resto de las colonias adems de !e se obser%e !n /alo de /idr#lisis a s! alrededor. 2. Marcar la colonia seleccionada con nDmero en el re%erso de la ca)a. 5. A partir de cada colonia inoc!lar por estra radial, por d!plicado, en ca)as ,etri con medio di'erencial y /acer dos 'rotis. 2. Enc!bar las ca)as a 58I&. +. 0eGir !no de los 'rotis con !na tinci#n de Bram y el otro con !na tinci#n de esporas. 3. Ae%elar con l!gol alrededor de la colonia seleccionada. 8. Fbser%ar los 'rotis. :. Aeali"ar !n c!adro con las caractersticas obser%adas en las coloniasC

8 Colonia 1 % E Morfologa macroscpica Tincin de Gram Tincin de esporas Degradacin del almidn

Ti"#i7" Se*e#ti(a de e 6ora ,e ta ti"#i7" e rea*i;ar> #o" *o 8i#roor=a"i 8o 6rob*e8a B *a 89e tra #o"tro*0
1. *legir las ca)as petri !e contengan colonias ;crecimiento microbiano< aisladas 2. *n !n portaob)etos colocar !na pe !eGa gota de ag!a 5. &on ay!da del asa estril tomar !na pe !eGa m!estra de !na colonia aislada 2. Me"clar la m!estra con el ag!a y /acer el e4tendido ;'rotis< +. $e)ar secar al aire. 3. ,oner a calentar ag!a en el %aso de precipitados ;1/2 %aso de ag!a< c!ando el ag!a s!elte %apores colocar el portaob)etos con el 'rotis en los bordes s!periores del %aso. 8. &olocar !n papel 'iltro sobre el 'rotis e impregnarlo del colorante %erde de mala !ita, mantener /Dmedo el papel 'iltro con el colorante d!rante 10 min!tos. :. 0ransc!rrido el tiempo retirar el papel 'iltro y la%ar con ag!a. =. *liminar el e4ceso de ag!a. 10. AGadir la sa'ranina al 0.+ H ;colorante de contraste< y de)ar act!ar por !n min!to. 11. *liminar el e4ceso, la%ar con ag!a y de)ar secar la preparaci#n. 12. Fbser%ar con el ob)eti%o de 1001. 6o ol%idar !tili"ar aceite de inmersi#n y reportar

5UINTA SESION ,2ier"e -. de8ar;o0 ED6o i#i7" de re 9*tado C di #9 i7" B #o"#*9 io"e .