UNIVERSIDADE DE LISBOA FACULDADE DE MEDICINA VETERINRIA

ESTUDO RETROSPETIVO SOBRE TREMOR EPIZOTICO EM PORTUGAL

ANA CATARINA DA SILVA BARRETO

CONSTITUIO DO JRI Doutora Maria da Conceio da Cunha e Vasconcelos Peleteiro Doutor Virglio da Silva Almeida Doutor Jos Manuel Antunes Ferreira da Silva Doutora Maria Leonor dos Santos Diniz Orge

ORIENTADORA Doutora Maria Leonor dos Santos Diniz Orge CO-ORIENTADOR DoutorJos Manuel Antunes Ferreira da Silva

2014 LISBOA

UNIVERSIDADE DE LISBOA FACULDADE DE MEDICINA VETERINRIA

ESTUDO RETROSPETIVO SOBRE TREMOR EPIZOTICO EM PORTUGAL

ANA CATARINA DA SILVA BARRETO

TESE DE MESTRADO INTEGRADO EM MEDICINA VETERINRIA

CONSTITUIO DO JRI Doutora Maria da Conceio da

ORIENTADORA Doutora Maria Leonor dos Santos Diniz Orge CO-ORIENTADOR DoutorJos Manuel Antunes Ferreira da Silva

Cunha e Vasconcelos Peleteiro Doutor Virglio da Silva Almeida Doutor Jos Manuel Antunes Ferreira da Silva Doutora Maria Leonor dos Santos Diniz Orge

2014 LISBOA

Agradecimentos Agradeo Kippy. Agradeo ao Franz. Agradeo Doutora Leonor Orge, s tcnicas Alice Santos e Sandra Fernandes pelo eficiente trabalho. Agradeo ao amigo Henrique o apoio tcnico. Agradeo ao Prof. Doutor Ferreira da Silva pela prestabilidade.

Estudo retrospetivo sobre Tremor Epizotico em Portugal

Resumo O tremor epizotico (TE) uma encefalopatia espongiforme transmissvel (EET) que ocorre naturalmente em ovinos, caprinos e mufles. uma doena conhecida h mais de 250 anos. Caracteriza-se pela acumulao da isoforma patolgica- protena prinica resistente (PrPres ou PrPsc) de uma protena fisiolgica do hospedeiro- protena prinica celular (PrPc) no sistema nervoso central, conduzindo progressiva neurodegenerao e morte. O tremor epizotico ou scrapie, representa o prottipo das doenas prinicas. Existem dois tipos de scrapie classificados at data, o scrapie clssico e o scrapie atpico/Nor98. A suscetibilidade a qualquer dos tipos de scrapie determinada por polimorfismos do gene prinico. O scrapie clssico uma doena infecciosa sendo que o scrapie atpico/Nor98 visto como uma doena de ocorrncia espordica e dependente da mudana espontnea de conformao da protena prinica. O tipo de scrapie mais prevalente em Portugal o scrapie atpico/Nor98. Assim, elaborou-se o presente estudo retrospetivo com o intuito de determinar o potencial de ocorrncia de scrapie no nosso pas entre 1995 e 2002, examinando, pela tcnica de imunohistoqumica (IHQ), amostras de tecido nervoso de pequenos ruminantes arquivadas no Laboratrio de Patologia do Instituto Nacional de Investigao Agrria e Veterinria (INIAV), e contribuir para a caracterizao epidemiolgica desta doena no nosso pas.

Palavras-chave Tremor Epizotico, Scrapie atpico, Scrapie clssico, Prio, EETs.Portugal, Imunohistoqumica.

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Retrospective study on scrapie in Portugal

Abstract Scrapie is naturally occurring transmissible spongiform encephalopathy (TSE) in sheep, goat and mufflons almost worldwide and it is known for about 250 years. It is characterized by the accumulation of an abnormal isoform- resistant prion protein (PrPres or PrPsc) of host encoded prion protein- cellular prion protein (PrPc) in the central nervous system leading to progressive neurodegeneration and death. Scrapie represents the prototype of the so-called prion diseases. It is observed to date as two types, classical and atypical/Nor98 scrapie. The susceptibility to both types is modulated by polymorphisms of the prion gene. Whereas classical scrapie is clearly a naturally occurring transmissible disease, atypical scrapie seems to be caused by spontaneous misfolding of prion protein. The most prevalent type of scrapie in Portugal is the atypical/Nor 98 strain. This retrospective study intends to find out the potential occurrence of scrapie in Portugal before 2002, examining through imunohistochemistry (IHC) samples of small ruminants archived from 1995 to 2002 in the Pathology laboratory from INIAV (Instituto Nacional de Investigao Agrria e Veterinria The National Institute for Agricultural and Veterinary Research), contributing to the epidemiological characterization of the disease in this country.

Keywords Atypical Imunohistochemistry.

Classical

scrapie,

Atypical

scrapie,

Prion,

TSE,

Portugal,

iii

NDICE GERAL ndice de Figuras ndice de Tabelas Abreviaturas e Siglas Parte I. Reviso Bibliogrfica 1. Introduo 1.1. Scrapie nota histrica 1.2. Sinais clnicos do scrapie 1.3. Etiologia - hiptese do prio 1.3.1. Caractersticas da protena prinica 1.3.2. Visualizao da protena prinica 1.3.3. A infeco pela PrPsc: mecanismos moleculares 1.3.4. Funo biolgica da PrPc 1.4. Formas de scrapie 1.4.1. Sinais clnicos do scrapie atpico/Nor98 em ovinos 1.4.2. Distribuio da PrPsc no scrapie atpico/Nor98 1.4.3. Epidemiologia do scrapie atpico/Nor98 1.4.4. A gentica da PrPsc associada ao scrapie atpico/Nor98 1.4.5. Transmisso e Patogenia de scrapie atpico/Nor98 1.4.6. Ocorrncia de scrapie atpico/Nor98 antes de 1998 1.4.7. A situao de Portugal 1.4.8. Estratgias de controlo 2. Parte II. Trabalho Experimental 2.1. Objetivos 2.2. Material e Mtodos 2.2.1. Caracterizao da amostragem 2.2.2. A tcnica de Imunohistoqumica (IHQ) 2.2.3. Condies de Leitura 2.3. Resultados 2.4. Discusso 2.5. Concluso 3. Bibliografia 4. Anexos v vi vii

1 1 3 4 5 7 8 12 13 15 17 18 20 23 24 26 27 28 28 28 29 31 32 47 49 50 55

iv

NDICE DE FIGURAS Figura 1 - Formao da PrPsc segundo Prusiner (1992). Figura 2 - Imunohistoqumica para a PrPsc usando mAb anticorpo F89/160.1.5 em dois casos de scrapie atpico/Nor98 na Noruega (Benestad et al., 2008). Figura 3 Controlo negativo (anlise 15593/08 do 2 ensaio). Figura 4a- Controlo positivo- cerebelo (anlise 32458/10 controlo do 17 ensaio). Figura 4b- Controlo positivo camada molecular do cerebelo (anlise 32458/10 controlo do 17 ensaio). Figura 4c Controlo positivo- camada molecular do cerebelo (anlise 32458/10 controlo do 17 ensaio) - pormenor de 4b. Figura 4d Controlo positivo- cerebelo, substncia branca (anlise 32458/10 controlo do17 ensaio). Figura 5 Controlo positivo- cerebelo, camada granulosa (anlise13026/08 controlo do 2 ensaio). Figura 6 Artefactos de congelao substncia branca ao nvel crtex cerebral (anlise 3863/95). Figura 7a- Artefactos de marcao no cerebelo (anlise 1546/96). Figura 7b - Artefactos de marcao observados noutra rea da seco de 7a (anlise 1546/96cerebelo). Figura 8 Imunomarcao no cerebelo do ovino 1546/96. Figura 9a Imunomarcao no cerebelo do ovino 2219/99. Figura 9b Partculas de imunomarcao noutra rea de observao da seco do cerebelo do ovino 2219/99. Figura 10a Dispersa imunomarcao em partculas na camada molecular do cerebelo do ovino 2475/99. Figura 10b- Camada molecular do cerebelo do ovino 2475/99. Pormenor da figura 10a. Figura 11a Imunomarcao em grnulos na camada granulosa do cerebelo do ovino 10884/99. Figura 11b Camada granulosa do cerebelo do ovino 10884/99. Pormenor da figura11a. Figura 12a Imunomarcao no crtex cerebral do ovino 11511/99. Figura 12b Crtex cerebral do ovino 11511/99. Outra rea da seco da figura 12a. Figura 13 Imunomarcao em linhas no crtex cerebral do ovino 10884/99. Figura 14 Imunomarcao na substncia branca do cerebelo do ovino 1546/96. 8 18 37 37 38

38

39 39 40 40 41 41 42 42 43 43 44 44 45 45 46 46

NDICE DE TABELAS Tabela 1 - Encefalopatias Espongiformes Transmissveis Tabela 2 - Designao para o scrapie consoante os diferentes pases Tabela 3 - Isoformas fisiolgica PrPc e patolgica PrPsc Tabela 4 - Designao das protenas prinicas de mamferos de acordo com a forma de doena Tabela 5 - Pries Fngicos Tabela 6 - Categorizao das TSEs em pequenos ruminantes- adaptao da EFSA (2005) Tabela 7 - Forma de morte de ovinos consoante o tipo de scrapie na Alemanha (Lhken etal., 2007) Tabela 8 - Idade de ovinos positivos para os diferentes tipos de scrapie na Alemanha (Lhken et al., 2007) Tabela 9 - Animais positivos para os diferentes tipos de scrapie em rebanhos na Alemanha (Lhken et al., 2007) Tabela 10 - Gentipos da PrPsc associada ao scrapie atpico/Nor98 Tabela 11 - Nmero de animais testados por imunohistoqumica (IHC) entre 1980 e 1989 no Reino Unido. (Webb et al., 2009) Tabela 12 Descriogeogrfica da amostragem de acordo com a DRA de origem Tabela 13 - Identificao das amostras e resultados obtidos em cada ensaio de Imunohistoqumica Tabela 14 Descrio da amostragem utilizada neste estudo retrospetivo 2 3 7 11 12 14 16 19 20 21 25 29 34 55

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NDICE DE ABREVIATURAS E DE SMBOLOS ABC- Avidin-biotin-complex Complexo avidina-biotina BSE Bovine Spongiform Encephalopathy- Encefalopatia espongiforme bovina CJD- Creutzfeld-Jacob-Disease- Doena de Creutzfeld-Jacob CWD Chronic Wasting Disease, Doena emaciante crnica DAB-Diaminobenzidina DMNV- Dorsal motor nucleus of vague nerve- ncleo motor dorsal do nervo vago DRA- Direco geral de agricultura EEB- Encefalopatia espongiforme bovina EET Encefalopatia espongiforme transmissvel EFSA- European Food Safety Agency- Autoridade europeia para a segurana alimentar fCJD Familiar Creutzfeld-Jacob-Disease- doena de Creutzfeld-Jacob familiar FFI Fatal Familiar Insomnia- insnia familiar fatal FSE Feline Spongiform Encephalopathy- encefalopatia espongiforme felina GSS Gertsmann- Strussler Scheinker iCJD Iatrogenic Creutzfeld-Jacob-Disease- doena de Creutzfeld-Jacob iatrognica IHQ-Imunohistoqumica INIAV- Instituto Nacional de Investigao Agrria e Veterinria IPAC- Instituto Portugus de Acreditao MAb- Monoclonal antibody- anticorpo monoclonal min-minuto Prion Proteinaceous infectious particle pnrp-Gene que codifica a PrPc PrPc- Protena prinica celular PrPsc- Protena prinica resistente sCJD Sporadic Creutzfeld-Jacob-Disease- doena de Creutzfeld-Jacob espordica sFI Sporadic Familiar Insomnia-insnia espordica fatal SNC- Sistema Nervoso Central SNP- Sistema Nervoso Perifrico TE Tremor Epizotico TME Transmissible Mink Encephalopathy- Encefalopatia espongiforme do viso TBS- TRIS Buffer saline- tampo TRIS (trishidroximetilaminometano) salino TSE Transmissible Spongiform Encephalopathy-encefalopatia espongiforme transmissvel vCJD- Variant Creutzfeld-Jacob-Disease- variante da doena de Creutzfeld-Jacob v/v- volume-volume

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PARTE I. REVISO BIBLIOGRFICA 1.Introduo O scrapie ou Tremor Epizotico (TE) a Encefalopatia Espongiforme Transmissvel (EET ou TSEs, sigla da terminologia anglo-saxnica Transmissible Spongiform Encephalopathy) mais antiga e a mais ubqua das doenas prinicas conhecidas at hoje. O scrapie foi pela primeira vez descrito em 1732 (Stockman, 1913). Os dados apontam para a sua ocorrncia relativamente espordica e consistentemente de baixa incidncia. Durante mais de dois sculos permaneceu como curiosidade cientfica at que a Encefalopatia Espongiforme Bovina (EEB ou BSE, da terminologia anglo-saxnica Bovine Spongiform Encephalopathy) surgiu em 1985 e o interesse pelas TSEs cresceu notavelmente. Em 1996 estabelecida a relao entre a BSE e a variante humana da doena de Creutzfeldt-Jacob, uma encefalopatia neurodegenerativa causada pela ingesto de alimentos contaminados com produtos infetados com protena prinica bovina. A partir de ento aumenta a ateno pblica para as TSEs de forma exponencial. 1.1.Scrapie nota histrica O termo encefalopatia espongiforme transmissvel (EET ou TSE) usado para nos referirmos a um conjunto de doenas neurodegenerativas fatais que afetam diferentes mamferos entre os quais o homem. As TSE que afetam o homem incluem a doena de Creutzfeldt-Jakob, a sndrome de Gertsmann-Strussler-Scheinker (GSS), a Kuru, a insnia familiar fatal (FFI, Fatal Familiar Insomnia) e a insnia familiar espordica (sFI, Sporadic Fatal Insomnia). As TSEs que afetam mamferos no humanos so o scrapie clssico e atpico em ovinos e caprinos, a encefalopatia espongiforme bovina (BSE), a encefalopatia transmissvel do viso (TME, Transmissible Mink Encephalopathy), a doena emaciante crnica dos cervdeos (CWD, Chronic Wasting Disease), a encefalopatia espongiforme felina (FSE, Feline Spongiform Encephalopathy), e a encefalopatia dos ungulados exticos (Tabela 1) (Schneider, Fangerau & Michaelsen, 2008). Precedentemente, as pessoas mais interessadas em scrapie eram os produtores de ovinos que eram diretamente afetados economicamente pela doena. Desde ento, e com a possibilidade da transmisso das TSE ao homem, aquele interesse atingiu a comunidade cientfica.

Tabela1 - Encefalopatias Espongiformes Transmissveis por ano de identificao Espcie afetada Ovinos, caprinos, mufles Homem Homem Homem Encefalopatia Scrapie Clssico Kuru Doena de Creutzfeldt-Jacob espordica (sCJD) Sndrome de Gertsmann-StrusslerScheinker (GSS) Homem Viso Doena de Creutzfeldt-Jacob familiar (fCJD) Encefalopatia Transmissvel do Viso (TME) Cervdeos Homem Doena Emaciante Crnica (CWD) Doena de Creutzfeldt-Jacob iatrognica (iCJD) Bovinos Encefalopatia Espongiforme Bovina (BSE) Nyala, oryx, kudu Encefalopatia Espongiforme dos Ungulados Exticos Homem Gato Insnia familiar fatal (FFI) Encefalopatia Espongiforme Felina (FSE) Homem Variante da doena de CreutzfeldtJacob (vCJD) Ovinos ecaprinos Homem (adaptado de Orge, 2005) Scrapie Atpico Insnia familiar espordica (sFI) 1998 1999 1996 1986 1990 1986 1985 1967 1974 1930 1947 Ano de Identificao 1732 1900 1920 1926

O scrapie conhece diferentes nomes consoante os diferentes pases onde surge, geralmente relacionados com os sinais clnicos observados (Tabela 2):

Tabela 2 - Designao para o scrapie consoante os diferentes pases Nome para o scrapie Cuddie Trot, Scratchie, Yeukie pine Doena de Basqvilla, Prurigo lumbar Drab(en), Dreb/Deeb, Drehkrankheit, Gaubber/Gnauper, Gnuberkrankheit, Knopper, Knupper, Kreutzschlagen, Petermannchen, Reiberkrankheit, Reiber-Uebel Ruppe, Scabies dorsalies, Schrucken, Spruckigkeit, Tempermanner, Traberkrankheit, Wetzkrankheit, Zitterkrankheit Goggles, Rickets, Rub/Rubbers, Rubbing disease, Shakings, Schrewcroft, Shrugginess, Trotting disease Khujali, Mukoo La maladie convulsive, La maladie folle, La maladie troteurs, La prurigo lombaire, La tremblante Rida Trzsawka Tremor epizotico Inglaterra ndia Frana Islndia Polnia Portugal Alemanha Pas Esccia Espanha

1.2. Sinais clnicos do scrapie H uma mudana geral no comportamento e temperamento semanas antes de sinais mais especficos surgirem, embora nalguns casos a condio de um animal afetado poder piorar rapidamente ou ocorrer a morte sbita. Os animais com scrapie apresentam o conjunto de sinais que se seguem, embora o prurido seja menos evidente no scrapie atpico. Nenhum dos sinais seguintes define o scrapie por si s (DEFRA, Agricultural Departments of Great Britain, 2009). Mudanas no comportamento Excitabilidade; Orelhas cadas; Nervosismo aumentado; Ficar para trs em relao ao rebanho; 3

Agressividade; Depresso

Prurido Roar repetidamente a cabea e o corpo contra objetos como cercas, postes e prateleiiras de feno; Roar repetidamente os flancos; Mordiscar ou ranger os dentes enquanto se roam ou quando friccionados com firmeza no dorso; Coar repetidamente o ombro ou as orelhas com o membro plvico. Mordiscar as extremidades, os membros plvicos ou outras partes do corpo; Perda excessiva de l ou leses cutneas.

Mudanas na postura e no movimento Tremor principalmente da cabea; Marcha anormal com levantar excessivo do membro (hipermetria); Descoordenao motora severa; Tropear; Estao anormal; Membros posteriores dbeis; Incapacidade para suportar o prprio peso.

Sinais clnicos tardios Perda de peso; Decbito permanente; Morte.

1.3. Etiologia - hiptese do prio Durante o sculo XX, surgem diferentes teorias acerca da etiologia das TSE. Assim, diferentes agentes foram apontados, sendo denominados por ordem cronolgica: Sarcosporoidia (1914) Um vrus filtrvel (1938) Um lentivrus (1954) Um polissacardeo replicvel (1966) Uma protena (1967) Um fragmento de membrana replicvel (1967) Um complexo de polissacridos de DNA (1968) 4

Um viroide (1972) Um lpido (1978) Spiroplasma sp (1979) Um virino (1979) Um prio (1982) Um vrus (1984) cidos nucleicos mitocondriais (1989) Um holoprio, PrPsc (PrPc na conformao no patolgica do scrapie, o apoprio) e um cido nucleico (dispensvel), o coprio. (1991)

Inicialmente, pensou-se que o agente causador das TSEs fosseum vrus, apesar de possur caractersticas muito diferentes da maioria das famlias de vrus conhecidas e de nunca ter sido observado ao microscpio electrnico. A designao de vrus lentos surgiu por se verificar que originavam doenas com um perodo de incubao muito longo. Exibiam tambm outras diferenas como a impossibilidade de deteo de cidos nucleicos e a resistncia a muitos agentes virucidas. Griffith, em 1967, prope a existncia de um novo agente, exclusivamente proteico e com capacidade replicativa. Prusiner, em 1982, retoma a hiptese ao isolar e purificar o agente a partir de tecido cerebral de hamster infetado e denomina-o prio acrnimo de small proteinaceous infectious particles. A prova da inexistncia de qualquer material gentico nas protenas prinicas dada por observaes de que permanecem ativas mesmo aps tratamentos eficazes na degradao de cidos nucleicos, como a exposio a radiaes ionizantes e ultravioletas, ou a incubao em presena de nucleases. Como tambm no provocam resposta inflamatria ou imunitria especficas, o diagnstico baseia-se na deteo da protena prinica nos tecidos em exames post-mortem. A observao de que o prio no provoca qualquer resposta imunitria induz que se trata de uma protena fisiolgica do crebro e outros tecidos que, em certas circunstncias, perde a sua funo normal por alterao da sua conformao (Westergard, Christensen & Harris, 2007).

1.3.1.Caractersticas da protena prinica O prio apresenta elevada resistncia aos mtodos de desinfeo e esterilizao mais comunmente utilizados, sendo dificilmente inativado. A inativao alcanada por incubao a 20C, durante 1 hora com hipoclorito de sdio a 20000 ppm, ou por autoclavagem a uma temperatura superior a 134C, durante 1 hora presso de 3 atm (Donne et al., 1997).

A protena prinica codificada por um gene presente na maioria das espcies de mamferos. Apresenta duas isoformas a isoforma fisiolgica- protena prinica celular (PrPc) e a isoforma patolgica- protena prinica resistente (PrPres ou PrPsc). A primeira, a isoforma normal, foi isolada em tecidos de ovinos, bovinos, ratos, viso e humanos e prpria de cada espcie. Apesar desta especificidade, observa-se uma homologia de 80-90% entre as isoformas fisiolgicas interespecficas. Diferentes autores sugerem que quanto mais prxima a estrutura das protenas fisiolgicas entre espcies diferentes, maior o risco de uma isoforma patolgica para uma espcie tambm o ser para outra (Hope et al., 1999). Esta hiptese confirmada pela observao de que a protena prinica associada BSE s difere em 7 aminocidos da protena correspondente nos ovinos, o que teria permitido ao agente do scrapie ultrapassar a barreira de espcie, causando a BSE nos bovinos (Hope et al., 1999). Ainda assim, este facto ainda no est provado, at porque existem algumas evidncias experimentais de que poder ter sido uma das formas atpicas de BSE, recentemente identificadas a ter-se alterado para a forma clssica (Hope at al., 1999). A forma patolgica PrPsc induz a alterao da forma fisiolgica PrPc que adquire uma conformao anormal. As caractersticas destas duas isoformas esto indicadas na Tabela 3. As protenas prinicas so ento caracterizadas pela capacidade de apresentarem duas formas tridimensionais, uma das quais causando doena quando agregada. A hiptese de Prusiner de 1997 afirma que esta agregao causa danos neurolgicos especficos como os caractersticos das encefalopatias espongiformes transmissveis. Os mecanismos responsveis pela alterao de conformao e agregao permanecem por esclarecer cabalmente.

Tabela 3 - Isoformas fisiolgica PrPc e patolgica PrPsc PrPc Designao isoforma fisiolgica isoforma normal Localizao membrana celular PrPsc isoforma patolgica isoforma anormal citoplasma em lipossomas e extracelular Peso molecular Tamanho da cadeia Estrutura primria Estrutura secundria 33-35 KDa 256 aa idntica 42% hlices alfa 3% folhas beta Solubilidade solvel em detergentes 27-30 KDa 256 aa idntica 43% folhas beta 30% hlices alfa insolvel em detergentes, polimerizando-se em fibrilhas Digesto por proteinase K sensvel resistente

1.3.2. Visualizao da protena prinica A prtica cientfica est muito dependente da visualizao direta que suporta os conceitos propostos. Assim, embora Prusiner (1982) tenha usado a Bioqumica para desenvolver a sua tese, so as representaes tridimensionais em computador das estruturas tercirias das protenas normal e patolgica a base para este modelo (j no uma mera hiptese, uma vez que tem confirmao experimental e capacidade para aplicao noutras reas de estudo). Como sabemos, a estrutura primria das protenas dada pela sequncia dos aminocidos, o seu arranjo em hlices-alfa ou folhas-beta define a estrutura secundria. Estas duas estruturas podem ser facilmente definidas sem recurso a uma representao grfica. A estrutura terciria e sua cintica, porm, j s podem ser descritas na sua complexidade com recurso a ferramentas de visualizao grfica (a estrutura secundria s indicia o arranjo da terciria). O processo de protein folding corresponde aquisio da estrutura terciria. A estrutura secundria da PrP foi proposta por Prusiner em 1992. Prusiner e a sua equipa usaram pptidos de sntese compostos por hlices-alfa. A maioria destes pptidos (75%) formou placa amilide, tpica da doena de Alzheimer, e composta maioritariamente por folhas-beta. Daqui, chegaram ideia de que uma alterao putativa na conformao entre a PrPc e a PrPscseria devida transformao na estrutura secundria de hlices-alfa para folhasbeta.

Na figura 1 podemos observar o esquema de formao da PrPsc segundo Prusiner. Figura 1 - Formao da PrPsc segundo Prusiner (1992)

A estrutura tridimensional da PrPc tem sido utilizada para descrever a alterao conformacional nos seus aspetos dinmicos. A flexibilidade de uma protena de difcil descrio. Nos ltimos 50 anos, os investigadores preocuparam-se mais em descrever as estruturas dos polipptidos, tendo negligenciado as suas propriedades dinmicas. Assim, a PrPc tem vindo a ser representada em diagramas que mostram as partes mais rgidas do polipptido bem como as mais adaptveis ou flexveis (Donne et al., 1997). Estes diagramas caracterizam a PrPc, sendo resultado da pesquisa e, condicionam tambm a forma como os investigadores definem o seu objeto. 1.3.3.A infeco pela PrPsc: mecanismos moleculares medida que foi sendo esclarecido que a informao gentica no era relevante para a compreenso das doenas prinicas, outras hipteses foram surgindo para explicar a propagao da PrPsc. Em 1996, Aguzzi e Weissman mostraram que a PrPc era necessria para a infeco pela PrPsc. Desistiram, ento, da hiptese da informao (gentica) e criaram uma nova a do efeito de domin.

Estas novas descobertas (o facto de que a PrPc necessria para a infeco por scrapie) podem ser explicadas pela hiptese do efeito domin em que a disseminao dos pries do scrapie no Sistema Nervoso Central (SNC) ocorre per continuitatem e por converso de PrPc em PrPsc por influncia de PrPsc adjacente (Brandner et al., 1996). Esta mudana de paradigma foi to importante que foi elaborado um modelo a partir dela. Em 2000, um novo estudo ilustra a neuroinvaso no Sistema Nervoso Perifrico (SNP) sugerindo uma forma de transporte em que a PrPc localizada no SNP convertida em PrPscper continuitatem e de forma centrpeta at ao SNC (Glatzel, Giger, Braun&Aguzzi, 2000). Outra metfora a da ma podre tentando ilustrar como uma propriedade se pode transmitir sem fluxo de informao. Como uma ma podre, uma vez no crebro, a forma mutante da protena prinica transforma a protena normal em mais cpias da forma infecciosa (Glatzel et al., 2000). Como temos visto at aqui, e de acordo com o atualmente aceite, a PrPsc uma isoforma particular da protena celular PrPc, com fraca solubilidade em detergentes, alta resistncia digesto por proteases, e tendncia a formar agregados (a PrPsc composta maioritariamente por folhas-beta que criam dipolos elctricos com propenso para formar agregados amilides). A diferena funcional entre as duas isoformas explicada pelas diferenas na sua estrutura secundria1. Aps a entrada da forma infecciosa da PrP num organismo, ou da sua ocorrncia espontnea, a PrPc convertida em PrPsc pela protena infecciosa. Nas formas hereditrias das doenas prinicas, e no nosso caso da doena em anlise, no scrapie clssico, h uma maior disposio das protenas para a converso na forma patognica. H dois modelos propostos para a explicar o rearranjo da PrPc em PrPsc.O primeiro modelo proposto o do heterodmero, a transio da molcula de PrPc para PrPsc induzida pela ligao ao monmero da PrPsc (Cohen, 1994) formando um dmero. Aps a aquisio de propriedades prinicas pela PrPc, o dmero sofre dissociao em dois monmeros PrPsc livres para participarem noutros rearranjos conformacionais. Este processo sugere uma reaco em cadeia e garante a converso da maioria das molculas de PrPc na forma patognica. A formao de agregados de PrPsc, neste modelo, considerada um processo secundrio no relacionado com a alterao conformacional. O segundo modelo, o da polimerizao, sugere que a alterao conformacional PrPcPrPsc e a formao de agregados esto relacionadas: a PrPc convertida em PrPsc enquanto se liga ao oligmero de PrPsc (Keh-Ming et al., 1993). Este modelo foi confirmado por estudos in vitro que demonstram que s

Vide tabela 3, pp.7 deste trabalho para pormenores acerca das diferentes estruturas secundrias das duas isoformas da protena prinica.

agregados de grande peso molecular, e no monmeros, possuem a capacidade de formar novas formas infecciosas da protena. O gene que codifica para a PrPc encontra-se presente em diferentes mamferos e em galinhas, tendo sido preservado pela presso de seleo evolutiva. A sua presena e expresso em animais doentes e saudveis no esto dependentes da ocorrncia de infeco prinica (PrPsc). Porm, animais a quem se suprimiu o gene para a PrPc apresentaram maior resistncia infeco e animais a quem se favoreceu a expresso deste gene desenvolveram doena mais rapidamente. Este facto veio apoiar a tese prinica e a natureza proteica dos pries. Uma caracterstica importante dos pries como agentes infecciosos a existncia de barreiras para a sua transferncia interespecfica, apesar da muita semelhana entre a estrutura primria da PrPc dos diferentes mamferos (Prusiner, 1997). Todavia, estas barreiras no impedem a infeo, simplesmente tornam-na mais lenta entre espcies diferentes. As barreiras esto relacionadas com as diferentes estruturas primrias das PrPc dos diferentes mamferos: as PrPsc de hamster no so transferidas com eficincia para ratos, mas so-no com eficincia para ratos transgnicos que expressam PrPc de hamster (Tanaka, Chien, Yonekura & Weissman, 2005). Presentemente, no h teraputica para as doenas prinicas. Algumas das hipteses mais promissoras relacionam-se com a diminuio do nvel de expresso do gene para a PrPc (mas a que custos?), a preveno da converso da PrPc em PrPsc, e a ativao de factores de destruio dos agregados de PrPsc. Os estudos usando animais de laboratrio e eucariotas mais simples como as leveduras tero um papel importante no desenvolvimento de abordagens teraputicas para as doenas prinicas. Os investigadores assumem que a compreenso da alterao conformacional em leveduras vai contribuir para o estudo das PrP dos mamferos. As leveduras reproduzem-se em poucas horas e so de mais fcil maneio. A levedura mais usada na sustentao do modelo prinico a Saccharomyces cerevisiae (Tabelas 4 e 5) (Fernandez-Bellot & Cullin, 2001).

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Tabela 4 Designao das protenas prinicas de mamferos de acordo com a forma de doena Doena Hospedeiro Prio Isoforma PrP Scrapie, Tremor Epizotico Encefalopatia transmissvel do vison (TME) Doena Emaciante Crnica (CWD) Encefalopatia Espongiforme Bovina (BSE) Encefalopatia Espongiforme Felina (FSE) Encefalopatia dos Exticos Ungulados (EUE) Kuru Doena de Creutzfeldt-Jacob (CJD) Variante da Doena de Creutzfeldt-Jacob (vCJD, nvCJD) Sndrome de GerstmannStraussler-Scheinker (GSS) Insnia Familiar Fatal (FFI) Ovinos (Ovis aries) e Caprinos (Capra hircus) Viso Prio scrapie OvPrPsc MkPrPsc

Prio TME

Veado-mula, alce Bovinos (Bos taurus)

Prio CWD Prio BSE

MDePrPsc BovPrPsc

Gatos (Felis silvestris catus) Nyala e grande Kudu

Prio FSE

FePrPsc NyaPrPsc

Prio EUE

Homem Homem

Prio Kuru Prio CJD

HuPrPsc HuPrPsc BovPrPsc

Homem

Prio BSE

Homem

Prio GSS

HuPrPsc

Homem

Prio FFI

HuPrPsc

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Tabela 5 - Pries Fngicos Protena Ure2p Sup35p Rnq1p HET-S Hospedeiro Saccharomyces cerevisiae Saccharomyces cerevisiae Saccharomyces cerevisiae Podospora Anserina Nome do Prio Prio URE 2+ Prio PSI+ Prio PIN+ ou RNQ+ Prio Het-s

Os diferentes modelos de replicao da protena prinica descrevem a converso da PrPc em PrPsc como um evento de natureza autocataltica que no requer quaisquer fatores adicionais para a sua ocorrncia. Este facto foi confirmado por experincias in vitro. Porm, o aparecimento e manuteno da PrPsc in vivo podem depender da interao com outras protenas. Alguns autores defendem a existncia de uma protena de mamfero no identificada ainda, capaz de interagir com a PrPc estimulando a sua converso na forma patognica. Os estudos em leveduras revelam a existncia de chaperones necessrias manuteno da conformao patognica da protena. Demonstrou-se que a manuteno do prio PSI+ depende da actividade de uma protena chaperone Hsp104p: a ausncia ou a expresso aumentada desta elimina PSI+ (Bardill, Dulle & Fisher, 2009). 1.3.4. Funo biolgica da PrPc Apesar de muito se saber sobre a funo da protena prinica como agente de vrias doenas, a sua funo fisiolgica permanece por esclarecer inteiramente. Os fragmentos da sequncia da PrPc tm sido bastante conservados evolutivamente (Rivera-Milla, Oidtmann & Panagiotidis, 2006), sugerindo importantes papis biolgicos para a protena. A PrPc expressa cedo na embriognese, e no adulto est presente em maior quantidade nos neurnios do crebro e medula espinhal (Manson et al., 1992). A PrPc tambm encontrada em menor nmero nas clulas da glia do SNC e tambm em clulas perifricas. (Moser, Colello, Pott & Oesh, 1995). A PrPc exerce uma atividade citoprotetora, particularmente contra a apoptose celular. Esta atividade foi demonstrada em clulas de mamferos e de leveduras. A PrPc tambm uma protena de ligao ao cobre (Brown et al., 1997). A maioria da PrPc est localizada na superfcie celular e da que se preveja que participe na sinalizao transmembranar. A PrPc tambm est envolvida na regulao sintica. Esta hiptese consistente com o facto de que a patologia sintica ser uma ocorrncia frequente nas doenas prinicas. A PrPc interage com protenas envolvidas na adeso celular.

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As protenas prinicas fngicas parecem ser um modelo adequado para o estudo do fenmeno prinico. As suas principais vantagens sobre as PrP de mamferos so a sua disponibilidade e a possibilidade de multiplicao rpida e segura em contexto laboratorial. Os pries e as placas amilides esto associados a doenas de mamferos. Porm, em leveduras e no fungo Podospora, a converso da protena celular em protena patognica tem um valor adaptativo. Esta converso parece ocorrer com maior frequncia do que as mutaes. A reverso PrPscPrPc parece ocorrer tambm com maior frequncia do que a reverso de mutaes: ao contrrio do que acontece nas mutaes, o fentipo das protenas prinicas patognicas mantm a informao original da protena celular. Isto tem grande importncia adaptativa, uma vez que falamos de organismos unicelulares para quem a resposta a mudanas ambientais atravs da alterao fenotpica essencial. A informao sobre o fentipo timo padro preservada e h possibilidade de regresso a este (Reed, Waples, Schindler, Hard & Kinnison, 2010).

1.4. Formas de scrapie Os estudos de demonstrao experimental tm evidenciado a variabilidade biolgica dos isolados de scrapie, caracterizados depois de subpassagens em ratinhos atravs de distintos perodos de incubao e de diferente distribuio das leses cerebrais, definindo diferentes estirpes (Yokoyama et al., 2010). Em 1998, um tipo diferente de scrapie foi identificado num ovino na Noruega e da a designao de scrapie atpico/Nor98 (Benestad, Arsac, Goldmann, Noremark, 2008). Desde a implementao, na Europa em 2002, de um programa abrangente de vigilncia para as TSEs em pequenos ruminantes, que tem surgido um nmero crescente de scrapie atpico/Nor98 na maioria dos pases europeus, um caso nas ilhas Falkland e nos Estados Unidos da Amrica. Verificou-se um caso no Reino Unido num estudo retrospetivo que continha material a partir de 1987 (Webb et al., 2009). As estirpes de TSE so definidas como partculas infecciosas que exibem caractersticas biolgicas e bioqumicas distintas et por cause, aps inoculao, causam doenas prinicas com caractersticas bem definidas como o espetro de hospedeiros, perodos de incubao, alteraes neuropatolgicas, patognese das doenas e sinais clnicos, bem como as caractersticas biolgicas da correspondente PrPsc. A informao necessria para determinar a estirpe da TSE dependente da conformao da protena patolgica PrPsc. Diferentes tipos de TSEs afetam os ovinos e os caprinos. Para alm da forma clssica de scrapie, ambas as espcies so susceptveis a infees experimentais pelo agente da encefalopatia espongiforme bovina (BSE).

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Em 2005, a Autoridade Europeia para a Segurana Alimentar (EFSA) publicou uma classificao das TSEs em pequenos ruminantes, dividindo-os em trs categorias de diagnstico: scrapie clssico, BSE em pequenos ruminantes, e scrapie atpico / Nor98 (Tabela 6). Tabela 6 - Categorizao das TSEs em pequenos ruminantes (adaptao da EFSA (2005)) Tipo de TSE Western Immunoblotting Condies severas Condies de digesto pela moderadas de Proteinase K digesto pela Proteinase K
Trs bandas acima dos 15 kDa Trs bandas acima dos 15 kDa

Histopatologia e Imunohistoqumica

Notas

Scrapie Clssico

Vacuolizao da substncia cinzenta. Marcao especfica da medula oblonga envolvendo o ncleo motor dorsal do nervo vago (DMNV) Vacuolizao da substncia cinzenta. Marcao especfica da medula oblonga envolvendo o DMNV

Afeta gentipos suscetveis dos 2 aos 5 anos de idade.

BSE em Pequenos Ruminantes

Atpica/ Nor 98

Trs bandas. Dominncia da banda di-glicosilada. Fraca ou ausente marcao com anticorpos anti-PrP dirigidos para a parte N-terminal da PrP. Banda no glicosilada mais baixa do que no scrapie clssico. Negativo ou mostrando um perfil distinto de outras TSE.

Bandas mltiplas com a banda abaixo dos 15 kDa.

No h envolvimento do DMNV. Marcao especfica no nervo trigmio. Marcao especfica mais intensa nos crtices cerebelar e cerebral.

Afeta ovinos a partir dos 4 anos. Maior suscetibilida de dos alelos AHQ, AF141RQ, e ARR. Mais frequente em casos isolados no rebanho.

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Relativamente s caractersticas do scrapie atpico em caprinos ainda no esto descritas com preciso, estando reportados apenas alguns casos (Seuberlich et al., 2007; Sofianidis et al., 2008). Apesar de no haver diferenas na estrutura molecular da PrPsc isolada desta espcie animal quando comparada com ovinos com scrapie atpico, notaram-se diferenas na distribuio das leses histopatolgicas e na deposio da PrPsc- particularmente no crtex cerebelar, um local privilegiado de deposio da PrPsc no scrapie atpico em ovinos, encontrava-se praticamente intacto no caso descrito por Seuberlich e colaboradores (2007). Neste animal foram detetadas leses graves e deposio de PrPsc em estruturas cerebrais mais rostrais como o tlamo e mesencfalo. Os testes de triagem e imunohistoqumica para as TSEs utilizando o cerebelo e o obex, as regies de eleio para o diagnstico de TSEs em ovinos e caprinos, apresentaram-se negativos ou fracamente positivos. Isto sugere que tais casos podero ter escapado vigilncia no passado e podero voltar a s-lo no futuro se os procedimentos e testes no forem modificados em conformidade com os novos dados.

1.4.1. Sinais clnicos do scrapie atpico/Nor98 em ovinos A grande maioria dos ovinos com scrapie atpico/Nor98 foi diagnosticada atravs de programas de vigilncia ativa em ovinos aparentemente saudveis ou ovinos mortos sem causa aparente. Daqui podemos sugerir que os sinais clnicos, quando presentes, podem ser diferentes ou menos pronunciados do que aqueles verificados no scrapie clssico. Estes factos tambm podem decorrer da epidemiologia da doena, sendo que por apenas um animal que mostra sinais da doena o produtor vai evitar chamar o veterinrio responsvel. Na tabela 7, indica-se a forma de morte de ovinos consoante o tipo de scrapie, verificando, por exemplo, que a maioria dos ovinos afetados pela forma clssica abatida seletivamente, denunciando a presena de sinais clnicos, enquanto, que os animais afectados pela forma atpica so a maioria das vezes encontrados mortos sem causa aparente.

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Tabela 7 - Forma de morte de ovinos consoante o tipo de scrapie na Alemanha (Lhken et al., 2007) Forma de morte Ovinos positivos para o scrapie clssico n Abate para consumo Encontrados mortos Eutanasiados Abate Compulsivo Total 0 23 2 80 105 % 0 22.0 1.9 76.1 100.0 Ovinos positivos para o scrapie atpico n 23 55 4 2 84 % 27.3 65.5 4.8 2.4 100.0

O sinal clnico mais evidente nos animais afetados pela Nor98 a ataxia (Konold et al., 2007) Para alm deste, surge a ansiedade e perda de condio corporal. A ataxia dos membros posteriores tambm foi relatada em dois casos suecos, sendo que um deles apresentava rigidez e fraca condio corporal, enquanto outros casos suecos no mostraram quaisquer sinais clnicos como referido pelo produtor. Na Irlanda, dois casos suspeitos apresentavam os mesmos sinais clnicos: incoordenao motora, perda de peso e comportamento nervoso (Konold et al., 2007). O caso nas ilhas Falkland mostrava fraca condio corporal e comportamento fora do normal, mordendo com persistncia o membro posterior e tendo cado quando tentava correr (Konold et al., 2007). Os dois casos detetados no Reino Unido mostraram tambm ataxia e atraso no reposicionamento dos membros plvicos. Ambos evidenciavam sinais de doena cerebelar, mas os sinais no eram idnticos (hipermetria no primeiro caso, ataxia, cabea trmula, e resposta anormal ameaa no segundo caso). Adicionalmente, o primeiro caso exibia nervosismo, enquanto o segundo mostrava apatia, especulando-se que estas diferenas talvez se devessem a diferentes cursos clnicos, facto sustentado pelo maior nvel de PrPsc evidenciado por Western Immunobloting no crebro do segundo caso (Konold et al., 2007). No foi detetado prurido em nenhum dos casos, mas um dos casos clnicos do Reino Unido mostrou resposta positiva ao teste do arranho (scratch response).

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1.4.2. Distribuioda PrPsc no scrapie atpico/Nor98 Em casos de scrapie atpico/Nor98, a deposio de PrPsc por exame imunohistoqumico surge como um pontilhado fino ou sob a forma de depsitos granulares tanto na substncia branca como na substncia cinzenta. Ainda no foram relatados depsitos intraneuronais ao contrrio da maioria dos casos de scrapie clssico (Benestad et al., 2008). No tronco cerebral tm sido descritos casos totalmente negativos ao nvel do bex, enquanto outros casos tm revelado marcao mnima somente no trato espinal do ncleo do nervo trigmio e no ncleo do trato solitrio (Orge et al., 2004). A estrutura primariamente afetada no scrapie clssico, o ncleo motor dorsal do nervo vago (DMNV) nunca surge afetado no scrapie atpico/Nor98. Para alm da marcao do trato espinal do ncleo do nervo trigmio, notou-se marcao globular pronunciada em tratos da substncia branca, bem como na formao reticular e ncleo ambguo. Em geral, a marcao especfica para a PrPsc na medula oblonga menor no scrapie atpico/Nor98 do que em casos clssicos de scrapie. Ao contrrio do que acontece no scrapie clssico, os crtices cerebrais e cerebelares so os que evidenciam maior marcao especfica nos crebros dos ovinos afetados pela scrapie atpico/Nor98. Alguns casos de scrapie atpico/Nor98 revelaram marcao linear e perineuronal tpica do scrapie clssico na substantia nigra (Benestad et al., 2008). Tambm importante a presena de agregados multifocais e tipo placa encontrados no tectum e corpo geniculado lateral do mesencfalo, e em tratos da substncia branca do crtex cerebral (Figura 2). A PrPsc no detetada em tecidos perifricos de casos de scrapie atpico/Nor98 ao contrrio do que acontece no scrapie clssico (Benestad et al., 2008).

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Figura 2 - Imunohistoqumica para a PrPsc usando mAb anticorpo F89|/160.1.5 em dois casos de scrapie atpico/Nor98na Noruega (Benestad et al., 2008)

A- Depsitos perineuronaise no neurpilo de PrPsc na substantia nigra; notar a ausncia de marcao intraneuronal. B Agregados tipo placa no crtex cerebral.

1.4.3. Epidemiologia do scrapie atpico/Nor98 O scrapie atpico/Nor98 foi detetado pela primeira vez na Noruega em 1998 e foi considerado um problema exclusivamente noruegus. Devido suspeita de BSE em ovinos e caprinos implantou-se um plano de vigilncia intensivo e ativo para as TSEs em pequenos ruminantes pelo uso de testes rpidos em 2002. Este plano de vigilncia ativa permitiu a deteo da scrapie atpico/Nor98 na maioria dos pases europeus bem como nas ilhas Falkland e na Amrica do Norte. O scrapie atpico/Nor98 representa uma parte significativa de casos de TSEs identificados na Unio Europeia e a sua prevalncia varia entre 5 a 8 pequenos ruminantes por 10 000 testados por ano (Fediaevsky, Gasqui, Calavas & Ducrot, 2008). A epidemiologia do scrapie atpico/Nor98 no est ainda completamente esclarecida e ainda no certo se naturalmente transmissvel ou no. Enquanto a maioria dos casos tem sido detetada em ovinos, um nmero limitado de scrapie atpico em caprinos tem sido relatado em Frana, Itlia e Sua. A maioria dos casos deste tipo de scrapie tem sido detetada, como j referido, atravs de programas de vigilncia ativa tendo como amostras animais encontrados mortos e animais em matadouro. Os programas de vigilncia ativa dentro da Unio Europeia abrangem animais acima dos 18 meses de idade (determinada pelo exame da dentio). Na maioria dos pases os ovinos no so individualmente identificados, sendo que o ano de nascimento nem sempre est disponvel para cada caso detetado. Para 84 casos em 9 pases a idade mdia dos animais 18

foi de 6.5 anos (Mitchell et al., 2010). Numa base de dados germnica, incluindo 60 casos atpicos, quase 60% dos animais tinha mais de 5 anos, mais de 25% tinham mais de 10 anos, e foram detetados casos de 20 anos (Mitchell et al., 2010) (Tabela 8).

Tabela 8 - Idade de ovinos positivos para os diferentes tipos de scrapie na Alemanha (Lhken et al., 2007) Idade (ano) n <3 3-5 6-7 8-10 >10 Total 2 16 2 0 0 20 Animais positivos para o scrapie clssico % 10.0 80.0 10.0 0 0 100.0 n 5 20 9 10 16 60 Animais positivos para o scrapie atpico % 8.3 33.3 15.0 16.7 26.7 100.0

Inicialmente, pensou-se que o scrapie atpico/Nor98 seria uma estirpe diferente de scrapie clssico, mas foi posteriormente identificado como uma nova estirpe de TSEs que afeta pequenos ruminantes e claramente distinta do scrapie clssico e da BSE em ovinos. A vigilncia intensiva para as TSEs na Europa revelou que a doena est bastante disseminada e normalmente ocorre com casos isolados dentro de um rebanho. Os dados epidemiolgicos acumulados durante os ltimos anos tambm conduzem a esta separao entre scrapie clssico e scrapie atpico/Nor98 (Lhken et al., 2007). Na tabela 9 pode confirmar-se que a ocorrncia espordica de casos isolados de scrapie atpico num rebanho mais frequente, quando comparamos com a ocorrncia da forma clssica.

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Tabela 9 - Animais positivos para os diferentes tipos de scrapie em rebanhos na Alemanha (Lhken et al., 2007) Animais positivos para o scrapie por rebanho N 1 2 3 4 5 8 15 17 57 Total Rebanhos positivos para o scrapie clssico n 7 2 1 1 1 1 1 1 1 16 % 43.8 12.5 6.3 6.3 6.3 6.3 6.3 6.3 6.3 100.0 n 81 5 2 0 0 0 0 0 0 88 Rebanhos positivos para o scrapie atpico % 92.0 5.7 2.3 0 0 0 0 0 0 100.0

Apesar desta estirpe estar agora mais bem caracterizada, a sua origem ainda desconhecida e sero necessrios mais estudos de transmisso e anlise de dados epidemiolgicos em situao de campo, para melhor se esclarecer a patognese desta estirpe e compreender a totalidade da sua epidemiologia e os possveis aspetos zoonticos. 1.4.4. A gentica da PrPsc associada ao scrapie atpico/Nor98 A acumulao da forma patognica (PrPsc) a chave para a compreenso das TSEs, e a sua presena usada como mtodo de diagnstico. H vrios fentipos reconhecidos destas doenas que se diferenciam pelo tempo de incubao, distribuio da PrPsc e padro de deposio desta. O hospedeiro tambm contribui para o fentipo da doena com o gene prnp que codifica para a protena PrPc, sendo um sentenciador para a suscetibilidade ao scrapie e respetivo fentipo. Os ovinos homozigticos e heterozigticos para o alelo ARR so considerados resistentes ao scrapie clssico e BSE. Esta resistncia constituiu a base de uma poltica de seleo gentica em larga escala em que se pretendeu o controlo das TSEs, aumentando a frequncia do alelo ARR e colocando nos rebanhos afetados animais ARR.

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No scrapie atpico/Nor98 a suscetibilidade gentica bastante diferente daquela observada nas TSEs clssicas, so os animais AHQ e AFRQ os mais suscetveis. Os animais ARR heterozigticos e homozigticos tambm so afetados. Os ovinos com scrapie atpico/Nor98 tm muitas vezes um polimorfismo na posio 141 do gene para a PrP que codifica fenilalanina (F) em vez da Leucina (L), o que parece conferir suscetibilidade infeo por scrapie atpico/Nor98 (Pongolini, 2009). Na tabela 10, esto referidos os gentipos de 241 casos de scrapie atpico/Nor98 de 4 pases (Arsac et al., 2007; Lkhen et al., 2007; Moum et al., 2005) Tabela 10 - Gentipos da PrPsc associada ao scrapie atpico/Nor98 Gentipo (136/141/154/171) ALRQ/ALHQ ALHQ/ALRR AFRQ/ALRR ALHQ/ALHQ AFRQ/AFRQ AFRQ/ALRQ AFRQ/ALHQ ALRR/ALRR ALRQ/ALRQ ALRQ/ALRR AFRQ/VLRQ ALHQ/ALRH ALHQ/VLRQ ALRH/ALRR ALRH/ALRH AFRQ/ALRH ALRQ/ALRH ALRQ/VLRQ ALRH/VLRQ ALRR/VLRQ VLRQ/VLRQ Observaes (n=241) 34 32 31 29 23 23 21 21 8 8 5 3 1 1 1 0 0 0 0 0 0 Frequncia (%) 14.1 13.3 12.9 12.0 9.5 9.5 8.7 8.7 3.3 3.3 2.1 1.3 0.4 0.4 0.4 0 0 0 0 0 0

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Mais de uma dcada aps a descoberta do scrapie atpico/Nor98 (Benestad et al., 2003), h ainda muitas questes por resolver acerca da gentica da PrP e suscetibilidade doena. Est provado porm que o scrapie atpico afeta animais com gentipos da PrP diferentes dos do scrapie clssico. Pode ocorrer que o scrapie atpico/Nor98 esteja a ocupar um nicho de ovinos geneticamente resistentes ao scrapie clssico. Poder ser indicador de competio entre estirpes, e excluso da dupla infeo. Estes factos ainda no so definitivos. H ainda a possibilidade alternativa de que o scrapie atpico/Nor98 ocorra espontaneamente (espordica, no contagiosa), porque em geral tm ocorrido mais casos isolados de scrapie atpico/Nor98 (Tranulis, Benestad, Baron & Kretzschmar, 2011). O scrapie atpico/Nor98 seria a primeira TSE com esta classificao: a CJD espordica (sCJD) em humanos tambm no se lhe conhece a origem. Os casos de sCJD so no-relacionados, no-familiares, e no aparentam alguma associao gentica entre si. Ocorrem em locais arbitrrios e independentemente de outras TSEs (Mead et al., 2009). Uma das primeiras descries completas da gentica da PrP para o scrapie atpico/Nor98 foi determinada por Moum et al. em 2005. Apresentou 4 codes (codes 136, 141, 154 e 171) em 38 casos de Nor98 reunidos entre 1998 e 2004, chegando a 4 concluses maiores. Primeiramente, todos os animais eram homozigticos para alanina no codo 136 (AA136 para a PrP). O alelo VRQ que confere a maior suscetibilidade ao scrapie clssico na Noruega (Tranulis. et al., 2011) estava completamente ausente dos casos de Nor98, embora presente em indivduos de rebanhos saudveis. Em segundo caso, havia predominante representao de animais portadores do alelo AHQ em gentipos HH154homozigticos e HR154heterozigticos. A terceira concluso diz-nos que o alelo AF141RQ parece conferir maior suscetibilidade do que o alelo AL141RQ. De facto, o alelo AF141RQ confere maior risco do que o alelo AHQ. A elevada frequncia do alelo ARR em animais heterozigticos afetados tambm surpreendeu. Este alelo bastante raro em casos de scrapie clssico. A idade mdia do incio da doena foram os 6 anos, mas no foi encontrada nenhuma associao entre idade e gentipo. Poder ser, ento, que esta idade mdia, superior quela do scrapie clssico se deva a gentipos distintos. Outros estudos sobre o scrapie atpico/Nor98 da Alemanha (Lhken et al., 2006), Frana (Arsac et al., 2007), e do Reino Unido (Bruce et al., 2007; Saunders, Cawthraw, Mountjoy, Hope & Windl, 2006) chegaram mesma concluso de que este tipo de scrapie est fortemente associado com os codes 141 e 154 para a PrP (Tabela 10). A suscetibilidade dos homozigticos RR171 levanta enorme preocupao pelos planos de erradicao e criao em membros da EU que criaram uma elevada frequncia de animais ARR/ARR como forma de erradicar o scrapie clssico. 22

Tal como nos ovinos, os caprinos com os gentipos que codifiquem para a PrP HH154e HR154 parecem ser alvo do scrapie atpico/Nor98, embora ainda seja cedo para estabelecer esta associao estatstica. Ainda faltam experincias em ovinos e ratinhos transgnicos para averiguar os gentipos suscetveis. Talvez ento se possa explicar porque o gentipo VRQ/AHQ apresenta fraco risco para ambos os tipos de scrapie, apesar de conter dois alelos com maior suscetibilidade para os scrapies clssico e atpico/Nor98, respetivamente (Moum et al, 2005). At ao momento, a maioria dos casos ocorre ento em ovinos mais velhos e em gentipos para a PrP associados relativa resistncia ao scrapie clssico, nomeadamente, aqueles que contm ARR e AHQ ou AF 141RQ. 1.4.5. Transmisso e Patogenia de scrapie atpico/Nor98 Desde a descoberta do scrapie atpico e sua subsequente identificao, sobretudo atravs de vigilncia ativa, em diversos pases (alguns sem nenhuma histria de encefalopatias espongiformes transmissveis como a Nova Zelndia e a Austrlia), tem-se discutido se esta TSE de facto espontnea ou adquirida. Os estudos epidemiolgicos indicam que o scrapie atpico/Nor98 no aparenta ser transmitido entre animais em condies naturais (Androletti, Orge, Benestad, Beringue & Litaise, 2011). Nas TSEs, maioritariamente aceite que a ingesto de material infetado, (transmisso por via oral) seja o componente chave de transmisso em algumas TSEs, como a Kuru, a variante da doena de Creutzfeldt-Jacob, a encefalopatia espongiforme bovina, e a encefalopatia transmissvel do viso (Chesebro, 2003). A populao ovina tem demonstrado suscetibilidade a estirpes particulares de TSEs que varia de acordo com os polimorfismos do gene que codifica a protena prinica dos ovinos. A transmisso experimental de scrapie atpico a ovinos aps inoculao intracerebral tem estado relacionada a um gentipo particular (A136H154Q171,A136H154Q171) (Simmons et al., 2010). A distribuio tecidular da protena patolgica (PrPsc) em ovinos infetados pela encefalopatia espongiforme bovina fez levar a cabo medidas de sade pblica de monta, baseada no conhecimento da patognese e distribuio da PrPsc em tecidos edveis, e sua consequente remoo de carcaas de animais acima de uma certa idade. O scrapie clssico pode tambm mostrar distribuio ubqua da PrPsc nos tecidos perifricos. Os dados mais recentes relativos ao scrapie atpico indicam que os tecidos perifricos de animais naturalmente infetados com esta forma de scrapie podem hospedar capacidade infecciosa mesmo na ausncia de PrPsc detetvel (Androletti et al., 2011). Porm, no certo se esta capacidade infecciosa se estabelece antes ou depois da propagao do agente no sistema nervoso central. 23

A informao acerca da distribuio tecidular do scrapie atpico/Nor98 no hospedeiro ainda limitada. Contudo, os dados indicam que a PrP patolgica no tem sido detetada em tecidos perifricos, embora haja infecciosidade, sugerindo que este agente infeccioso parece restrito ao SNC, evidenciando notvel neurotropismo. Esta caracterstica indica que o risco de infeo por scrapie atpico/Nor98 pela dieta possa ser considerado baixo. Este neurotropismo sustenta a hiptese de que o agente do scrapie atpico/Nor98 dificilmente se transmite para o ambiente e entre indivduos. A deteo da PrPsc est normalmente correlacionada com a presena de infetividade (McKinley, Bolton, Prusiner, 1983, Elsen et al. 1999), mas a capacidade infecciosa j foi demonstrada na ausncia de detetvel PrP resistente proteinase K (Lasmezas et al., 1997). Todavia, a PrPsc atualmente considerada como o nico marcador bioqumico das TSEs. J foram identificadas vrias estirpes de scrapie tendo em conta a distribuio pelos tecidos do hospedeiro, diferentes perodos de incubao, perfis lesionais, neuropatologia e resistncia protease. Ao contrrio do que acontece no scrapie clssico, em que vrias estirpes j foram identificadas, no scrapie atpico/Nor98 nenhuma subestirpe foi identificada at data. O scrapie atpico/Nor98 surge como doena no contagiosa, espordica e neurodegenerativa dos ovinos mais velhos. Numerosos estudos epidemiolgicos sugerem uma etiologia espontnea, possivelmente geneticamente determinada, influenciada pelo ambiente, e/ou fatores metablicos. Na maioria dos casos h apenas um caso de scrapie atpico/Nor98 num rebanho, o que conduziu suspeita da sua condio no naturalmente infecciosa. A transmisso oral a murganhos e roedores da espcieMyodes glareolus tambm falhou (Griffiths et al., 2010). Todavia, o scrapie atpico/Nor98 foi transmitido por via intracerebral a ratinhos transgnicos expressando o gene prinico de ovinos (Arsac, Btemps, Morignat, Fraudet & Bencsik, 2009) e de sunos (Espinosa et al., 2009). A transmisso intracerebral de scrapie atpico tambm foi bem sucedida em ovinos (Simmons et al., 2007). Nesta espcie esta forma de scrapie foi transmitida por via oral (Simmons et al., 2010), o que demonstra que se trata mesmo de uma TSE. 1.4.6. Ocorrncia de scrapie atpico/Nor98 antes de 1998 A confirmao do diagnstico das TSEs baseia-se na deteo de PrPsc pelas tcnicas de imunohistoqumica (IHC) e Western Immunobloting. Nos casos de scrapie clssico os depsitos de PrPsc distribuem-se de forma mais disseminada e com diferente morfologia. Observam-se tambm depsitos de PrPsc no ncleo motor dorsal do nervo vago. O tipo de deposio de PrPsc no scrapie atpico bastante diferente, com somente 3 formas (granular, linear e perineuronal). O scrapie clssico e atpico tambm diferem na sua disposio 24

neuroanatmica, sendo que a regio rostral do crebro mais afetada pelo scrapie atpico e a caudal mais afetada pelo scrapie clssico. A PrPsc no scrapie atpico tambm origina diferentes perfis usando a tcnica de Western Immunobloting, com a presena de uma banda proteica de aproximadamente 12 kDa (Benestad et al., 2003; Buschmann, Biacabe, Ziegler, Benesik, 2004). Estas metodologias foram as utilizadas nos dois estudos retrospectivos reportados, ambos efectuados no Reino Unido. O primeiro identificou um ovino com scrapie atpico/Nor98 do ano de 1989 (Bruce et al., 2007), e o segundo estudo um caso datado de 1987 (Webb et al., 2009). Neste segundo estudo (Tabela 11) o caso de scrapie atpico identificado correspondia a um ovino suspeito de scrapie ou listeriose que apresentava comportamento bizarro. altura no se observou vacuolizao ao exame histopatolgico e da se excluiu o diagnstico de scrapie. Mais tarde a imunopatologia revelaria um diagnstico consistente com o scrapie atpico, sendo o gentipo AHQ/AHQ, um dos gentipos mais associados ao scrapie atpico e com alguma resistncia ao scrapie clssico (Simmons et al., 2010).

Tabela 11 - Nmero de animais testados por imunohistoqumica (IHC) entre 1980 e 1989 no Reino Unido (Webb et al., 2009) Ano N de animais negativos para o scrapie N de animais positivos para o scrapie N de amostras imprprias para diagnstico 1980 1981 1982 1983 1984 1985 1986 1987 1988 1989 Total 3 1 10 69 (3) 139 132 145 (7) 197 (12) 223 (19) 236 (7) 1155 14 0 5 10 19 15 24 34 23 29 173 0 0 2 3 4 2 12 17 4 13 57

O n de caprinos encontra-se entre parntesis

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A anlise estatstica de animais encontrados mortos e em matadouro indicam que o scrapie atpico poder ser uma doena espontnea com pouca ou nenhuma transmissibilidade entre ovinos. De facto, casos adicionais de scrapie atpico em rebanhos rara, embora a transmisso experimental da doena tenha sido provada (Le Dur et al., 2005, Simmons et al., 2007). O scrapie atpico j no considerado raro relativamente ao scrapie clssico na maioria dos pases europeus (Moore, 2008). Apesar de no se saber o potencial zoontico do scrapie atpico, a ausncia de doena humana com caractersticas semelhantes ao scrapie atpico pode ser interpretada com maior otimismo se houver prova de que a exposio a este tipo de scrapie no um fenmeno recente.

1.4.7.A situao de Portugal Portugal foi um dos primeiros pases europeus a descrever a existncia de scrapie atpico. Num estudo em que mais de 30 000 pequenos ruminantes foram testados para as TSEs, identificaram-se sete casos de scrapie atpico. No foi identificado nenhum caso de scrapie clssico, assim como sucedeu em estudos anteriores. Este facto surpreendeu dado que em vrios pases europeus o scrapie clssico enzotico, inclusiv em Espanha (Orge et al., 2004). Entre os anos de 2003 e 2008, 375 459 pequenos ruminantes foram testados: o scrapie atpico foi identificado em 328 pequenos ruminantes (326 ovinos e dois caprinos). O perfil eletrofortico da PrPsc mostrou-se idntico quele observado na Nor98, com 3 ou 5 bandas entre os 30 e os 12 kDa, confirmando que em Portugal o scrapie atpico o Nor98 (Orge et al., 2010). A genotipagem para o prnp nos casos de scrapie atpico revelou uma variedade de gentipos, incluindo ARR/AFRQ, ARR/ARR, ARQ/AFRQ e AFRQ/AFRQ. Estes resultados vieram confirmar a prvia associao a gentipos raramente atribudos ao scrapie clssico (Orge et al., 2004). Ainda neste estudo, 12 ovinos resultaram positivos para o scrapie clssico por teste rpido, histopatologia e Western Immunobloting, representando a identificao pela primeira vez desta doena em Portugal. Foi observada vacuolizao neuronal no ncleo motor dorsal do nervo vago e vacuolizao do neurpilo ventralmente a esse ncleo , tpicas de scrapie clssico. Todos os casos mostraram marcao intracelular especfica (intraneuronal e intraglial) e deposio extracelular em grnulos coalescentes, perineuronal e linear (Orge et al. 2010). Enquanto o scrapie atpico/Nor98 se encontra disperso pelo pas, o scrapie clssico acha-se confinado a dois rebanhos vizinhos de produo leiteira no interior- centro do pas.

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O scrapie atpico ento a TSE predominante em pequenos ruminantes no nosso pas, diferentemente de outros pases europeus aonde o scrapie clssico se tem revelado enzotico ao longo de dcadas (Orge et al., 2010).

1.4.8. Estratgias de controlo A Comisso Europeia estabeleceu trs estratgias para os dois tipos de scrapie: 1) stamping out: todos os animais de rebanhos positivos so abatidos e todos os adultos ou uma amostragem so testados; 2) abate seletivo: os animais so genotipados e aqueles com gentipos mais propensos ao scrapie clssico so destrudos e testados; 3) vigilncia intensiva da explorao em que, durante 2 anos os animais adultos so testados, enviados para o matadouro e os encontrados mortos na explorao. A Itlia aplicou um abate seletivo alargado em rebanhos positivos para o scrapie clssico. Dentro dos trs tipos de estratgias, registamse diferenas consoante os pases. Algumas vezes os animais de rebanhos suspeitos tal como os de rebanhos contguos so includos na estratgia de controlo. A idade mnima de animais testados tambm varia. A proporo de animais testados de entre os animais destrudos difere e, diferentes gentipos so escolhidos durante o abate seletivo e consequentemente testados. Tambm houve diferenas ao longo do tempo dentro dos prprios pases. O stamping out foi aplicado em 5 pases para o scrapie clssico e em 7 pases para o scrapie atpico. O abate seletivo foi aplicado em 6 pases para o scrapie clssico e em 8 pases para o scrapie atpico. A vigilncia intensiva foi aplicada num nico pas para o scrapie clssico e em 7 pases para o scrapie atpico. O controlo de movimentao animal aplicado inicialmente aos rebanhos com scrapie atpico foi recentemente levantado, visto que no representa factor de risco para este tipo de scrapie. Tambm se ir preconizar a certificao de rebanhos para o scrapie clssico, que permitir valoriz-los nas trocas intra e extracomunitrias (Regulamento (CE) n 630/2013 da Comisso, de 28 de junho de 2013).

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2. PARTE II. TRABALHO EXPERIMENTAL Este trabalho experimental foi desenvolvido nos setores de diagnstico

anatomohistopatolgico e de TSEs do laboratrio de Patologia do INIAV, durante o perodo de 1 de Junho de 2010 a 04 de Abril de 2011.

2.1. Objetivos Atravs de estudos retrospetivos no Reino Unido, foi confirmada a existncia de casos de scrapie atpico antes de 1998 (Bruce et al., 2007; Webb etal., 2009), sugerindo que esta forma no nova e que estar relacionada com o aumento da vigilncia e da maior sensibilidade dos meios de diagnstico. Com o presente estudo pretendeu-se determinar a potencial ocorrncia de scrapie em Portugal antes de 2002, reexaminando, pelos atuais mtodos de diagnstico, amostras de pequenos ruminantes arquivadas entre 1995-2002. Tambm se pretendeu contribuir para a caracterizao epidemiolgica desta doena no nosso pas.

2.2.Material e Mtodos 2.2.1.Caracterizao da amostragem Para este estudo foram selecionadas amostras de pequenos ruminantes includas no projeto PAMAF IED 3021 intitulado Estudo da Patologia do Sistema Nervoso Central nos Pequenos Ruminantes, bem como de outros casos de ovinos e caprinos com sintomatologia nervosa arquivados no setor de diagnstico anatomohistopatolgico, Laboratrio de Patologia do INIAV, entre os anos de 1995 e 2002. O projeto PAMAF foi desenvolvido entre 1995-1998 em pequenos ruminantes com sinais clnicos de ndole nervosa, cujo exame histopatolgico para pesquisa de leses de scrapie no revelou a vacuolizao caracterstica para esta doena. A amostragem consistiu em blocos de parafina das seguintes regies anatmicas do sistema nervoso central,por serem as mais afetadas pelo scrapie atpico, o de maior prevalncia em Portugal: - bex; - ponte; - mesencfalo; - cerebelo; -crtex cerebral. .

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Destes pequenos ruminantes selecionaram-se 305 animais, tendo sido encontrados 877 blocos de parafina correspondentes a 155 animais (150 ovinos e 5 caprinos). Nenhum bloco foi encontrado para anlises com data de entrada do ano 2000. No presente trabalho, todas estas amostras foram submetidas tcnica de imunohistoqumica para a deteo de PrPsc. Na tabela em anexo (Tabela 14), descreve-se a amostragem na sua totalidade por ordem cronolgica, desde 1995 a 2002, bem como o nmero de blocos de parafina encontrados para cada animal; a espcie correspondente; a idade e a explorao, quando identificada, bem como os resultados relevantes obtidos para o SNC. Em termos de distribuio geogrfica dos animais analisados, a correspondncia por Direo Regional de Agricultura (DRA), encontra-se indicada na tabela seguinte (Tabela 12):

Tabela 12 - Descrio geogrfica da amostragem de acordo com a DRA de origem dos animais DRA Nmero de animais Nmero de blocos de parafina DRA Norte DRA Centro DRA Lisboa e Vale do Tejo DRA Alentejo DRA Algarve Total 94 (90 ovinos, 4 caprinos) 2 (ovinos) 155 (150 ovinos, 5 caprinos) 612 (593 ovinos, 19 caprinos) 24 (ovinos) 877 (853 ovinos, 24 caprinos) 0 32 (31 ovinos, 1 caprino) 27 (ovinos)
0

183 (178 ovinos, 5 caprinos) 148 (ovinos)

2.2.2. A tcnica de Imunohistoqumica (IHQ) Este trabalho consistiu na efectivao de 17 ensaios de imunohistoqumica de acordo com o procedimento de ensaio em utilizao no setor de diagnstico das EETs, mtodo acreditado pelo Instituto Portugus de Acreditao (IPAC), o organismo nacional de acreditao requerido pelo Regulamento (CE) n. 765/2008.O IPAC membro da infra-estrutura europeia de acreditao, a European Cooperation for Accreditation (EA), bem como das estruturas mundiais de acreditao, a International Laboratory Accreditation Cooperation (ILAC) e o International Accreditation Forum (IAF).

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Este mtodo de IHQ indireto, recorrendo ao complexo avidina-biotina (ABC) conjugado com a enzima peroxidase. A revelao foi feita com diaminobenzidina (DAB) e perxido de hidrognio, que conferiu cor castanha imunomarcao e a colorao de fundo foi feita com Hematoxilina de Mayer. O anticorpo anti-PrP usado foi o monoclonal (MAb) 2G11 dirigido contra o epitopo 146R154R171-182 da PrP, comercializado pelo Instituto Pourquier. A seleo deste anticorpo baseou-se no facto deste ter evidenciado melhores resultados de imunomarcao para a deteco de PrPsc em casos de scrapie, no mbito da avaliao efetuada pelo projecto europeu FAIR CT 98-7021, em que um dos objectivos foi padronizar a tcnica de imunohistoqumica nos vrios laboratrios de referncia para o diagnstico das TSEs.

As etapas do procedimento de ensaio incluram: a) Execuo de cortes de 4 m de espessura colhidos em lminas adesivadas (Superfrost Plus); b) Secagem dos cortes a 50 C durante a noite; c) Desparafinao dos cortes em dois banhos de xilol 3 minutos (min) cada; d) Rehidratao dos cortes: lcool etlico absoluto (duas vezes, durante 3 min); lcool etlico a 90% (v/v) (durante 1 minuto); lcool etlico 70% (durante 1 min); e) Recuperao antignica: imerso em cido frmico a 98% durante 30 min, seguida de passagem dos cortes em gua corrente (5 min) e em gua destilada (5 min); tratamento trmico a 121C (cmara de presso PASCAL da DakoCytomatation) com tampo citrato (10 mM; pH 6.1) durante 30 min; f) Arrefecimento dos cortes em gua destilada (5 min); g) Incubao com Soluo de Bloqueio da atividade da Peroxidase Endgena (H2O2 a 3% (v/v) em metanol) durante 30 min; h) Passagem dos cortes em gua corrente (5 min); i) Passagem dos cortes em TBS (50 mM TRIZMA base; 0.8% NaCl; pH 7,6) (5min); j) Montagem das lminas nos suportes CoverplateTMShandon e colocao no dispositivo Sequenza; k) Incubao com Soluo de Bloqueio de reaces inespecficas (soro normal de cavalo 20% (v/v) em TBS) temperaturaambiente 30 min; l) Incubao com o anticorpo primrio MAb 2G11 (diluio 1/200 em TBS com 10% (v/v) de soro normal de cavalo) a temperatura ambiente durante 60 min; m) Lavagem com TBS por 3 vezes 5 min; 30

n) Incubao com anticorpo secundrio biotinilado de cavalo anti-murganho (Vector), (diluio 1/200 em TBS com 10% de soro de cavalo) durante 30 min; o) Lavagem com TBS por 3 vezes 5 min; p) Incubao com o complexo avidina-biotina-peroxidase (kit Vectastain ABC Elite,Vector) durante 30 min; q) Lavagem com TBS por 3 vezes 5 min; r) Revelao com DAB e Perxido de Hidrognio(Vector) durante 5 min; s) Lavagem em gua corrente durante 5 min; t) Colorao de contraste com Hematoxilina de Mayer durante 1 min; u) Lavagem em gua corrente (azular); v) Desidratao dos cortes: lcool etlico a 90%; lcool etlico absoluto e xilol durante 1 min cada; a) Montagem das lminas com lamela e meio de montagem Entellan

2.2.3. Condies de Leitura Todos os cortes histolgicos foram observados por microscopia ptica (Microscpio Olympus, BX60F5) e as imagens captadas por um sistema digital atravs do programa de anlise de imagem AnalySIS 3.0, Soft Imaging System Gmbh. Em todos os ensaios de imunohistoqumica foram utilizados um controlo negativo e um positivo. O controlo negativo pertencia a um animal negativo ao teste rpido TeSeE BIORAD sem qualquer padro de imunomarcao. O controlo positivo proveio de um animal com resultado positivo ao teste rpido TeSeE BIORAD, exibindo imunomarcao e um perfil eletrofortico de PrPsc caractersticos do scrapie atpico (confirmados atravs dos mtodos de diagnstico complementar Western ImmunoBlotting e IHQ). De acordo com a regio do SNC, considerou-se caracterstica de PrPsc de scrapie atpico/Nor98 a seguinte imunomarcao (Benestad et al., 2003, 2008; Orge et al., 2004, 2010): - no crtex cerebral partculas ou grnulos, dispondo-se numa distribuio laminar nas camadas internas; - no cerebelo partculas ou grnulos dispersos na camada granulosa e, tambm, na camada molecular com uma distribuio sinptica; - no mesencfalo podem verificar-se partculas ou grnulos dispersos na substncia cinzenta central;

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- na regio do bex no se detecta PrPsc no ncleo motor dorsal do nervo vago e as partculas ou grnulos esto restritos ao neurpilo do ncleo do trato espinhal do nervo trigmeo e/ou do ncleo do trato solitrio; - em qualquer das regies supramencionadas tambm se pode observar na substncia branca grnulos, por vezes, depositados em anel ou semi-anel (designada de imunomarcao globular). A observao de imunomarcao de PrPsc foi efetuada segundo os itens da morfologia, localizao e intensidade, a qual foi subjetivamente estimada de acordo com os seguintes critrios (Hardt et al., 2000): - 0: sem marcao; - 1: fraca; - 2: moderada; - 3: forte marcao.

2.3.Resultados Os resultados do procedimento tcnico de imunohistoqumica encontram-se relatados na tabela 13 por ordem cronolgica, ao longo dos 17 ensaios realizados, sendo descritos o nmero da anlise em causa (n anlise/ano), a espcie correspondente, a rea do sistema nervoso central (SNC) analisada e o resultado imunohistoqumico para cada anlise. Incluram-se ainda no campo do resultado da anlise observaes relevantes, como por exemplo a ocorrncia de artefactos. As anlises repetidas por perda de corte durante os ensaios ou para esclarecimento de artefatos encontram-se assinaladas. A maior parte dos animais analisados correspondeu a anlises do ano 1999 (n=117), contrastando com os restantes anos (1995 n=2; 1996 n=11; 1997 n=3; 1998 n=3; 2001 n=3 e 2002 n=4); o bex, o cerebelo e o crtex cerebral foram as regies neuroanatmicas mais representadas, correspondendo tambm s reas utilizadas para o diagnstico de scrapie atpico/Nor98. Em todos os ensaios, no se detetou qualquer imunomarcao no controlo negativo (Figura 3) e o controlo positivo apresentou a morfologia, a distribuio e a intensidade de imunomarcao de PrPscesperadas (Figuras 4a-d e 5), de acordo com o descrito para a forma atpica/Nor98, pelo que todos os ensaios foram validados. A imunomarcao consistiu numa forte marcao em partculas ou grnulos de marcao observadas ao nvel da camada molecular (Figuras 4a-c), numa marcao globular moderada a

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forte ao nvel da substncia branca do cerebelo (Figura 4d), assim como numa moderada marcao em grnulos na granulosa do cerebelo (Figura 5). Em alguns cortes foram observados alguns artefactos, mas que no entanto no afetaram o mtodo de deteo de PrPsc por imunohistoqumica (Figuras 6;7a e 7b). Em 150 animais testados, no foi detetada imunomarcao caracterstica (0 - sem marcao correspondendo a um resultado Negativo (Neg). Nos restantes 5 animais, todos da espcie ovina, foi observada uma imunomarcao fraca (intensidade 1 de marcao), interpretando-se os resultados como Inconclusivos. (Tabela 13; Figuras 8-14). A referida imunomarcao observada consistiu em partculas dispersas ao nvel da camada molecular do cerebelo dos ovinos 1549/96 (Tabela 3-1 ensaio; Figura 8), 2219/99 (Tabela 317 ensaio; Figuras 9a e 9b) e 2475/99 (Tabela 3-13 ensaio; Figuras 10a e 10b). O ovino 10884/99 apresentou tambm uma fraca imunomarcao em grnulos agregados na camada granulosa do cerebelo (Tabela 3-11 ensaio; Figuras 11a e 11b). No crtex cerebral dos ovinos 11511/99 (Tabela 3-15 ensaio; Figuras 12a e 12b) e 10884/99 (Tabela 3-11 ensaio Figura 13) detetaram-se partculas finas orientadas em linhas. A imunomarcao na substncia branca descrita como caracterstica do scrapie atpico/Nor98 foi apenas observada, tambm de uma forma incipiente, no ovino 1549/96 (Figura 14). Ao nvel do bex no foi detetada qualquer imunomarcao.

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34

35

36

Figura 3 Controlo negativo (anlise 15593/08 do 2 ensaio) bex, ncleo motor dorsal do vago. Ausncia de marcao especfica; x200.

Figura 4a- Controlo positivo cerebelo (anlise 32458/10 controlo do 17 ensaio) A imunomarcao especfica para a PrPsc observada na camada molecular do cerebelo; x40.

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Figura 4b- Controlo positivo camada molecular do cerebelo (anlise 32458/10 controlo do 17 ensaio) A deposio de PrPsc distribui-se na margem da camada molecular; x100.

Figura 4c Controlo positivo-camada molecular do cerebelo (anlise 32458/10 controlo do 17 ensaio) pormenor de 4b. Detalhe da figura 4b para observao dos grnulos de imunomarcao de PrPsc ao nvel da camada molecular do cerebelo caracterstica do scrapie atpico/Nor98, evidenciando alguns agregados (reas assinaladas);x400.

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Figura 4d Controlo positivo cerebelo,substncia branca(anlise 32458/10 controlo do 17 ensaio). Destaca-se aimunomarcao globular dispersa na substncia branca do cerebelo, embora haja moderada marcao ao nvel da camada granulosa; x400.

Figura 5 Controlo positivo cerebelo, camada granulosa (anlise13026/08 controlo do2 ensaio). Detalhe da imunomarcao granular observada ao nvel da camada granulosa; x400.

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Figura 6 Artefactos de congelao substncia branca ao nvel crtexcerebral (anlise 3863/95). Anlise negativa, mas com estrias e vacolos de congelao (reas delimitadas); x100.

Figura 7a Artefactos de marcao no cerebelo (anlise 1546/96). Seco onde se notam duas situaes suspeitas de marcao (setas) que se comprovaram estar fora do plano de corte; x400.

40

Figura 7b Artefactos de marcao observados noutra rea da seco de 7a (anlise 1546/96 cerebelo). A mesma seco, mas noutra rea, notando-se um ponteado (setas) que no marcao especfica para a PrPsc, pois encontra-se num segundo plano de corte;x400.

Figura 8 Imunomarcao no cerebelo do ovino 1546/96. Discreta imunomarcao em partculas (setas) na camada molecular do cerebelo- resultado inconclusivo ; x400.

41

Figura 9a Imunomarcao no cerebelo do ovino 2219/99. Partculas dispersas (setas) na camada molecular - resultado inconclusivo; x400.

Figura 9b Partculas de imunomarcao noutra rea de observao da seco do cerebelo do ovino 2219/99. Discreta imunomarcao em partculas (setas) na camada molecular; x400.

42

Figura 10a Imunomarcao em partculas dispersas (setas) na camada molecular do cerebelo do ovino 2475/99 resultado inconclusivo; x200.

Figura 10b Camada molecular do cerebelo do ovino 2475/99. Pormenor da figura 10a;x400.

43

Figura 11a Imunomarcao em grnulos agregados (setas) na camada granulosa do cerebelo do ovino 10884/99 resultado inconclusivo; x200.

Figura 11b Camada granulosa do cerebelo do ovino 10884/99. Pormenor da figura11a; x400.

44

Figura 12a Imunomarcao no crtex cerebral do ovino 11511/99. Notam-se partculas de imunomarcao distribudas em linhas (seta) ao longo do corteresultado inconclusivo; x400.

Figura 12b Crtex cerebral do ovino 11511/99. Outra rea da seco da figura 12a; x400.

45

Figura 13 Imunomarcao em linhas no crtex cerebral do ovino 10884/99. Resultado inconclusivo; x400.

Figura 14 Imunomarcao na substncia branca do cerebelo do ovino 1546/96. Presena de vrias grnulos de imunomarcao (setas)-resultado inconclusivo; x400.

46

2.4. Discusso O scrapie uma doena muito complexa. Do ponto de vista cientfico, a etipatogenia carece melhor definio, a via de transmisso natural no est completamente esclarecida, no h medidas de preveno eficazes, no h tratamento, nem h testes prticos em vida e efetivos para os animais afetados quer com doena clnica ou assintomticos. neste contexto que este estudo retrospetivo, teve como objetivo determinar a ocorrncia de scrapie em Portugal nas suas diferentes estirpes, antes de 2002, correspondente ao incio da Vigilncia Ativa no espao comunitrio, usando uma tcnica at data no utilizada na deteo de PrPsc - a imunohistoqumica. Embora a amostragem de animais consistisse numa populao de risco, visto que apresentavam sinais clnicos do foro neurolgico, a amostragem de 155 animais poder-se- considerar reduzida para detetar esta afeo, que de baixa prevalncia e que, em Portugal entre 2003 e 2008, foi de 0.0874% (Orge et al., 2010). Curiosamente, no mbito da Vigilncia Passiva para as TSEs (plano que inclui todos os animais que apresentem um quadro clnico suspeito de scrapie), todos os pequenos ruminantes considerados suspeitos clnicos no evidenciaram perfil lesional nem deposio de PrPsc (dados no publicados). Todos os casos positivos de scrapie tm vindo a ser detetados no mbito da Vigilncia Ativa, sem aparente manifestao de sinais clnicos evidentes, apesar da intensidade de deposio de PrPscobservada em alguns casos ser muito intensa, como se pde constatar nos cortes dos controlos positivos utilizados no presente estudo. Desconhece-se o mecanismo pelo qual so desencadeados os sinais clnicos destas doenas. Todavia, nos inquritos epidemiolgicos efetuados, foi possvel a descrio retrospetiva de sinais clnicos observados nalguns casos, sendo a ataxia, a perda de condio corporal e os tremores os sinais mais relatados (Orge et al., 2010). Como diagnstico diferencial para o scrapie, h a considerar vrias outras afeces como: ectoparasitas, pseudoraiva (doena de Aujeszky), raiva, listeriose, pneumonia progressiva ovina (Maedi-Visna), cetose ovina, intoxicao por substncias qumicas ou plantas, e hipomagnesimia. De entre os cinco casos identificados como inconclusivos, 3 anlises pertenciam DRA do Alentejo (casos 1546/96, 10884/99 e 2475/99), regio de Portugal mais afetada pelo scrapie atpico; a anlise 11511/99 DRA de Lisboa e Vale do Tejo e a anlise 2219/99 DRA do Centro, sendo que nestas regies tambm esto descritos casos de scrapie atpico, Relativamente aos sinais clnicos, o caso 1546/96 era suspeito de fotossensibilidade e de encefalite pelo vrus Maedi-Visna, cujos resultados do exame histopatolgico do SNC revelaram edema das clulas de Purkinje, neuronofagia e vacolos e a pesquisa do vrus 47

resultou negativa. Os restantes casos eram suspeitos de scrapie e de listeriose, mas no exame histopatolgico no foram observadas vacuolizao caracterisitica de scrapie nem leses de encefalite Embora seja limitada a informao em relao idade dos ovinos analisados, as duas idades registadas de 3 e 4 anos nos casos 10884/99 e 11511/99, respetivamente, so idades consideradas menos frequentes nos casos de scrapie atpico/Nor98, visto que esta forma de doena tem sido confirmada essencialmente em animais com idade superior a 5 anos. A incipiente imunomarcao observada nos presentes casos poder corresponder a casos iniciais de deposio de PrPsc. Relativamente s exploraes de origem destes ovinos, s foi possvel efetuar rastreio no caso 1546/96 em cuja explorao no foi detetado nenhum caso de scrapie at data. Sabe-se tambm que a forma de scrapie mais prevalente no nosso pas o atpico, sendo que a banda de baixo peso molecular (< 14kD) observvel na tcnica de Western ImmunoBlotting para o scrapie atpico est associada a uma menor resistncia digesto pela proteinase K (PK). Assim, esta aparente fragilidade da PrPsc comparada da PrPsc associada ao scrapie clssico poder contribuir para uma perda de imunomarcao relacionada com o tempo de arquivo. Este aspeto foi previamente avaliado e demonstrou-se que a PrPsc do scrapie atpico continua a ser detetvel em blocos de parafina de arquivo, o mesmo no se verificando a partir de amostras de SNC que estejam fixadas em formol durante pelo menos 1 ano (Orge et al., 2009), pelo que a imunomarcao nestas amostras arquivadas no ter ficado comprometida pelo tempo de arquivo A confirmao da imunomarcao observada e considerada inconclusiva nos 5 casos identificados neste estudo requerer a realizao de ensaios de imunohistoqumica com mais anticorpos anti-PrP e ensaios de deteo de PrPsc por Western Immunobloting a partir de blocos de parafina e, eventualmente, ensaios de infecciosidade em murganhos, caso se observe algum perfil eletrofortico indicativo de PrPsc. Adicionalmente a caracterizao destes casos poder ser completada com a determinao dos gentipos do gene prnp e assim identificar se podero corresponder a gentipos mais associados ao scrapie atpico.

48

2.5. Concluso H registos de scrapie desde o ano de 1750 sob a forma de estudos retrospetivos com base em relatos de pastores ou dos seus empregados. A doena manteve-se alheia ao conhecimento dos veterinrios durante os sculos XVIII e XIX, uma vez que os proprietrios, por receio de perdas econmicas, mantinham os surtos de scrapie encobertos. A transmisso da doena era abordada inicialmente pelos investigadores como sendo de origem hereditria, sexualmente transmissvel ou infetocontagiosa. Aps a demonstrao do scrapie como doena transmissvel em 1936, o agente infeccioso, o prio, identificado 70 anos depois. Na amostragem analisada, embora limitada para uma doena de baixa prevalncia, foi detetada uma imunomarcao sugestiva de PrPsc da forma atpica de scrapie que requerer confirmao por outros mtodos analticos. Tal como no Reino Unido, esta afeco j deveria existir antes de 1998, mas, atendendo s limitaes das tcnicas de diagnstico associada baixa prevalncia e a um quadro clnico partilhado por outras doenas, no ter sido diagnosticada. No caso de se confirmar como especfica a imunomarcao detetada neste estudo, poder-se- dizer que o scrapie atpico j existiria em Portugal antes de 2002, correspondendo o ovino 1546/96 ao mais antigo caso identificado. .

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ANEXO

Tabela 14- Descrio da amostragem utilizada neste estudo retrospetivo Data de entrada Nmero de anlise 17-05-1995 27-12-1995 24-01-1996 25-01-1996 01-01-1996 01-02-1996 15-02-1996 21-02-1996 23-04-1996 24-04-1996 21-05-1996 21-05-1996 21-05-1996 24-02-1997 21-03-1997 3863 10509 1133 342 1546 1542 2062 2667 4145 5087 5089 5091 5361 1500 2224 17 9 2 8 11 8 12 13 3 13 12 13 14 4 4 Nmero de blocos ovino ovino ovino ovino ovino ovino ovino ovino ovino ovino ovino ovino ovino ovino ovino Maedi visna negativo Cenurose cerebral Maedi visna positivo, alcalides positivo Alcalides negativo, doseamento Cu 7.82 mg/Kg Maedi visna positivo Alcalides negativo, doseamento Cu 7.82 mg/Kg VW82E Maedi visna negativo Oestrus ovis VX75A VX75A VX24C Encefalite Espcie Resultados relevantes SNC Explorao

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Tabela 14- Descrio da amostragem utilizada neste estudo retrospetivo (continuao) Data de entrada Nmero de anlise 18-04-1997 17-04-1998 07-08-1998 18-09-1998 02-02-1999 19-02-1999 12-03-1999 12-03-1999 12-03-1999 12-03-1999 12-03-1999 12-03-1999 18-03-1999 19-03-1999 19-03-1999 19-03-1999 19-03-1999 19-03-1999 29-03-1999 3012 3980 6873 7796 1283 1458 2215 2216 2218 2219 2221 2222 2380 2474 2475 2476 2477 2478 2756 12 3 2 2 5 4 10 5 5 3 5 5 14 5 5 5 3 5 5 Nmero de blocos ovino ovino ovino ovino ovino ovino ovino ovino ovino ovino ovino ovino ovino ovino ovino ovino ovino ovino ovino Histopatolgico negativo ao TE Histopatolgico negativo ao TE e listeriose Histopatolgico negativo ao TE e listeriose Histopatolgico negativo ao TE e listeriose Histopatolgico negativo ao TE e listeriose Histopatolgico negativo ao TE e listeriose Histopatolgico negativo ao TE e listeriose Histopatolgico negativo ao TE e listeriose Histopatolgico negativo ao TE Histopatolgico negativo ao TE e listeriose Histopatolgico negativo ao TE e listeriose Histopatolgico negativo ao TE e listeriose Histopatolgico negativo ao TE e listeriose 56 Inconclusivo Espcie Resultados relevantes SNC Explorao

Data de entrada

Nmero de anlise

Nmero de blocos 5 10 5 15 15 4 5 5 5 5 10 5 5 5 5 5 5 5 5

Espcie

Resultados relevantes SNC

Explorao

12-04-1999 12-04-1999 12-04-1999 12-04-1999 12-04-1999 15-04-1999 15-04-1999 15-04-1999 15-04-1999 15-04-1999 15-04-1999 15-04-1999 15-04-1999 22-04-1999 22-04-1999 22-04-1999 2-04-1999 22-04-1999 22-04-1999

3037 3038 3039 3040 3041 3197 3199 3201 3202 3203 3204 3205 3206 3437 3438 3439 3440 3441 3442

ovino ovino ovino ovino ovino ovino ovino ovino ovino ovino ovino ovino ovino ovino ovino ovino ovino ovino ovino

Histopatolgico negativo ao TE e listeriose Histopatolgico negativo ao TE e listeriose Histopatolgico negativo ao TE e listeriose Histopatolgico negativo ao TE e listeriose Histopatolgico negativo ao TE e listeriose Histopatolgico negativo ao TE e listeriose Histopatolgico negativo ao TE e listeriose Histopatolgico negativo ao TE Histopatolgico negativo ao TE e listeriose Histopatolgico negativo ao TE Histopatolgico negativo ao TE Histopatolgico negativo ao TE Histopatolgico negativo ao TE Histopatolgico negativo ao TE Histopatolgico negativo ao TE Histopatolgico negativo ao TE Histopatolgico negativo ao TE Histopatolgico negativo ao TE Histopatolgico negativo ao TE 57

Data de entrada

Nmero de anlise

Nmero de blocos 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 4 5 4 5

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Explorao

22-04-1999 22-04-1999 22-04-1999 22-04-1999 22-04-1999 24-04-1999 28-04-1999 28-04-1999 28-04-1999 28-04-1999 28-04-1999 28-04-1999 28-04-1999 28-04-1999 28-04-1999 04-05-1999 04-05-1999 04-05-1999 04-05-1999

3443 3444 3445 3447 3448 3489 3573 3574 3576 3577 3578 3579 3580 3581 3582 3782 3783 3784 3785

ovino ovino ovino ovino ovino ovino ovino ovino ovino ovino ovino ovino ovino ovino ovino ovino caprino ovino ovino

Histopatolgico negativo ao TE Histopatolgico negativo ao TE e listeriose Histopatolgico negativo ao TE e listeriose Histopatolgico negativo ao TE e listeriose Histopatolgico negativo ao TE e listeriose Histopatolgico negativo ao TE e listeriose Histopatolgico negativo ao TE e listeriose Histopatolgico negativo ao TE e listeriose Histopatolgico negativo ao TE e listeriose Histopatolgico negativo ao TE e listeriose Histopatolgico negativo ao TE e listeriose Histopatolgico negativo ao TE e listeriose Histopatolgico negativo ao TE e listeriose Histopatolgico negativo ao TE e listeriose Histopatolgico negativo ao TE e listeriose Histopatolgico negativo ao TE e listeriose Histopatolgico negativo ao TE e listeriose Histopatolgico negativo ao TE e listeriose Histopatolgico negativo ao TE e listeriose 58

Data de entrada

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Nmero de blocos 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5

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Explorao

04-05-1999 04-05-1999 04-05-1999 04-05-1999 04-05-1999 04-05-1999 04-05-1999 04-05-1999 07-05-1999 07-05-1999 07-05-1999 07-05-1999 07-05-1999 07-05-1999 07-05-1999 13-05-1999 13-05-1999 13-05-1999 13-05-1999

3786 3787 3788 3789 3790 3791 3792 3793 3905 3906 3907 3908 3909 3910 3911 4017 4018 4019 4020

ovino ovino ovino ovino ovino ovino ovino ovino ovino ovino caprino caprino ovino ovino ovino ovino ovino ovino ovino

Histopatolgico negativo ao TE e listeriose Histopatolgico negativo ao TE e listeriose Histopatolgico negativo ao TE e listeriose Histopatolgico negativo ao TE e listeriose Histopatolgico negativo ao TE e listeriose Histopatolgico negativo ao TE e listeriose Histopatolgico negativo ao TE e listeriose Histopatolgico negativo ao TE e listeriose Histopatolgico negativo ao TE e listeriose Histopatolgico negativo ao TE e listeriose Histopatolgico negativo ao TE e listeriose Histopatolgico negativo ao TE e listeriose Histopatolgico negativo ao TE e listeriose Histopatolgico negativo ao TE e listeriose Histopatolgico negativo ao TE e listeriose Histopatolgico negativo ao TE e listeriose Histopatolgico negativo ao TE e listeriose Histopatolgico negativo ao TE e listeriose Histopatolgico negativo ao TE e listeriose 59

Data de entrada

Nmero de anlise

Nmero de blocos 5 4 5 5 5 4 5 5 5 4 5 5 5 5 4 9 5 5 5

Espcie

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Explorao

13-05-1999 13-05-1999 13-05-1999 13-05-1999 13-05-1999 13-05-1999 20-05-1999 20-05-1999 20-05-1999 20-05-1999 20-05-1999 20-05-1999 20-05-1999 20-05-1999 21-06-1999 21-06-1999 21-06-1999 21-06-1999 21-06-1999

4021 4022 4023 4024 4025 4026 4249 4250 4251 4252 4253 4254 4255 4257 5091 5095 5096 5097 5098

ovino ovino ovino ovino ovino ovino ovino ovino ovino ovino ovino ovino ovino ovino ovino ovino ovino ovino ovino

Histopatolgico negativo ao TE e listeriose Histopatolgico negativo ao TE e listeriose Histopatolgico negativo ao TE e listeriose Histopatolgico negativo ao TE e listeriose Histopatolgico negativo ao TE e listeriose Histopatolgico negativo ao TE e listeriose Histopatolgico negativo ao TE e listeriose Histopatolgico negativo ao TE e listeriose Histopatolgico negativo ao TE e listeriose Histopatolgico negativo ao TE e listeriose Histopatolgico negativo ao TE e listeriose Histopatolgico negativo ao TE e listeriose Histopatolgico negativo ao TE e listeriose Histopatolgico negativo ao TE e listeriose Histopatolgico negativo ao TE e listeriose Histopatolgico negativo ao TE e listeriose Histopatolgico negativo ao TE e listeriose Histopatolgico negativo ao TE e listeriose Histopatolgico negativo ao TE e listeriose 60

Data de entrada

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Nmero de blocos 5 5 5 5 5 5 4 5 5 5 5 5 5 4 4 5 5 5 5

Espcie

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Explorao

21-06-1999 04-11-1999 04-11-1999 04-11-1999 04-11-1999 04-11-1999 23-11-1999 23-11-1999 02-12-1999 02-12-1999 02-12-1999 02-12-1999 02-12-1999 02-12-1999 02-12-1999 02-12-1999 02-12-1999 02-12-1999 09-12-1999

5100 9764 9765 9766 9767 9768 10520 10521 10880 10881 10882 10883 10884 10885 10886 10887 10888 10889 11157

ovino ovino ovino ovino ovino ovino ovino ovino ovino ovino ovino ovino ovino ovino ovino ovino ovino ovino ovino

Histopatolgico negativo ao TE e listeriose Histopatolgico negativo ao TE e listeriose Histopatolgico negativo ao TE e listeriose Histopatolgico negativo ao TE e listeriose Histopatolgico negativo ao TE e listeriose Histopatolgico negativo ao TE e listeriose Histopatolgico negativo ao TE e listeriose Histopatolgico negativo ao TE e listeriose Histopatolgico negativo ao TE e listeriose Histopatolgico negativo ao TE e listeriose Histopatolgico negativo ao TE e listeriose Histopatolgico negativo ao TE e listeriose Histopatolgico negativo ao TE e listeriose Histopatolgico negativo ao TE e listeriose Histopatolgico negativo ao TE e listeriose Histopatolgico negativo ao TE e listeriose Histopatolgico negativo ao TE e listeriose Histopatolgico negativo ao TE e listeriose Histopatolgico negativo ao TE e listeriose 61

Data de entrada

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Nmero de blocos 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 4 5 5 5 5 5

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Explorao

09-12-1999 09-12-1999 09-12-1999 09-12-1999 10-12-1999 10-12-1999 10-12-1999 10-12-1999 10-12-1999 13-12-1999 16-12-1999 16-12-1999 16-12-1999 16-12-1999 16-12-1999 22-12-1999 22-12-1999 22-12-1999 2-12-1999

11158 11159 11160 11161 11278 11279 11282 11284 11285 11283 11510 11511 11512 11513 11514 11774 11775 11777 11778

ovino ovino ovino ovino ovino ovino ovino ovino ovino ovino ovino ovino ovino ovino ovino ovino ovino ovino ovino

Histopatolgico negativo ao TE e listeriose Histopatolgico negativo ao TE e listeriose Histopatolgico negativo ao TE e listeriose Histopatolgico negativo ao TE e listeriose Histopatolgico negativo ao TE e listeriose Histopatolgico negativo ao TE e listeriose Histopatolgico negativo ao TE e listeriose Histopatolgico negativo ao TE e listeriose Histopatolgico negativo ao TE e listeriose

Histopatolgico negativo ao TE e listeriose Histopatolgico negativo ao TE e listeriose Histopatolgico negativo ao TE e listeriose Histopatolgico negativo ao TE e listeriose

Histopatolgico negativo para a listeriose Histopatolgico positivo para a listeriose

62

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Nmero de blocos 10 12 4 2 7 2 10

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19-03-2001 19-03-2001 19-03-2001 15-03-2002 16-04-2002 03-05-2002 05-06-2002

3069 3070 3071 2585 3487 3915 4676

ovino ovino ovino ovino ovino ovino ovino

Histopatolgico negativo ao TE e listeriose Histopatolgico negativo ao TE e listeriose Histopatolgico negativo ao TE e listeriose

Histopatolgico negativo ao TE e listeriose

63