MTODOS EN FISIOLOGA ANIMAL

Fisiologa: estudio de la naturaleza Anatoma. Estudio de las funciones de los organismos vivos desde un punto de vista biofsico. Hoy en da hay diferentes ramas de fisiologa: vegetal, animal, humana La fisiologa animal es una fisiologa comparada entre los diferentes animales. Adems de ramas, hay ciencias relacionadas con la fisiologa, como pueden ser: anatoma, farmacologa o la fisiopatologa.

MTODO CIENTFICO
1. Observacin y descripcin de un fenmeno. 2. Formulacin de hiptesis para explicar el fenmeno. 3. Uso de la hiptesis para formular predicciones. 4. Uso de la experimentacin para comprobar/desmentir la hiptesis. Experimento. Situacin controlada en l que el investigador manipula una variable y observa el efecto de esta manipulacin sobre otra variable, mientras todas las dems condiciones se mantienen constantes.

NIVELES DE ESTUDIO
Individuo (comportamiento), compitiendo con la psicologa y la medicina. Sistema, compitiendo con anatoma e histologa. rgano, compitiendo con anatoma e histologa. Clula, compitiendo con biologa celular. Molcula, compitiendo con biologa molecular y bioqumica. Trabajar con seres vivos conlleva una responsabilidad tica. Las preparaciones en esta ciencia pueden ser: in vitro, in vivo, in silico. Existen dos tcnicas exclusivas de la fisiologa: electrofisiologa e imagen funcional.

EXPERIMENTACIN EN FISIOLOGA: CUESTIONES TICAS

Hay diferencias sustanciales entre la experimentacin con seres humanos y animales. Los seres humanos: son considerados sujetos activos de derecho, con derechos inalienables (vida, salud), son aplicables a toda la especie (sexo, religin). Estn absolutamente regulados (Declaracin de Helsinki, 1952). Es un conjunto de recomendaciones hechos por mdicos de muchos pases, producido por la OMS. ste documento arranca con el final de la 2 Guerra Mundial y se acord entre los delegados de muchos pases. Los animales: son considerados objetos pasivos de derecho, slo se les conceden derechos en base a su utilidad. Estn laxamente regulados por Animal Act (1976). Documento ingls que arranca con el acto de crueldad de 100 aos antes. Desarrolla toda una serie de ideas cuya finalidad es proteger a los animales de una crueldad innecesaria.

EXPERIMETNACIN CON SERES HUMANOS

Voluntarios sanos. Se les propone alguna motivacin para participar. Los estudiantes son de fcil acceso (grupo grande, homogneo y de fcil motivacin). Los soldados y presos tambin. No se pueden hacer intervenciones que puedan poner en peligro su salud. Slo medidas, preguntas, tratamientos slo en casos muy concretos se puede inducir una enfermedad. Enfermos. Se estudian tratamientos qumicos, farmacuticos, teraputicos se les ofrece la posibilidad de que su enfermedad mejore o empeore. En todo caso requiere: Consentimiento informado (papel explicativoefectos secundarios, beneficios) Sometimiento a comisiones ticas Libertad para abandonar el experimento Que no sea amateur Que haya un proyecto (propsito, objetivo, mtodos, resultados esperables, nmero de sujetos, financiacin) Existencia de comisin tica (5.7 personas, con conocimiento pero menos implicados) para la valoracin de posibles riesgos. Slo se pueden usar tcnicas no invasivas

Declaracin de Helsinki: ha ido colocando la mayora de los cdigos penales de los pases. Ventajas: comunicacin y relevancia biomdica. Inconvenientes: limitaciones de la intervencin, interferencia con el experimentador (efecto placebo, Psicolgico?) y dificultades de estandarizacin.

EXPERIMENTACIN CON ANIMALES

In vivo: vivos In vitro: tejidos En todo caso se requiere: sometimiento a comisiones ticas (nmero, especie, justificacin) y justifi cacin suficiente para realizar el experimento. Se pueden usar tcnicas invasivas Animal Act: se basa en las tres R de Russel: reduccin, refinamiento, reemplazo. Legislatura Europea Real Decreto (1991) el primero. Licencias.

DA A DA EN LA EXPERIMENTACIN FISIOLGICA
Comisiones ticas: da peso importante. Sistemas de proyectos y licencias: financiacin

EXPERIMENTACIN IN VIVO
Permiten estudios: organismos completos, relaciones entre sistemas y/o rganos, sistemas fisiolgicos concretos Preparaciones: Animal intacto el animal no tiene anestesia. Preparaciones agudas: el animal est anestesiado. Preparaciones crnicas tica: Reduccin: aplicar menos animales para obtener la misma informacin y aumentar la informacin obtenida por el animal. Revisiones bibliogrficas para evitar duplicaciones de ensayos. Realizacin de ensayos piloto. Modelos de animales con una sensibilidad superior y ms especfica (transgnicos). Uso de estrategias secuenciales e integradas en el ensayo. Refinamiento: aumentar el bienestar o reducir y aliviar el dolor o malestar (tica). Disminuir la variabilidad de los ensayos (razones cientficas). Mejoras de estabulacin. Uso adecuado de analgsicos. Necesidad y duracin de las restricciones de comida y agua. Utilizar tcnicas incruentas. Eutanasia ms apropiada, personal especializado para su manejo.

ANIMAL INTACTO (estudios de comportamiento, dietas, estudios de toxicidad e imagen funcional)

Slo se permite el uso de tcnicas no invasivas. Requiere diseos experimentales complejos. Reducir al mximo la influencia del investigador. Controlar entorno y manejo de animales, elegs especie Estudios con humanos. Comportamiento: ansiedad, aprendizaje, sensibilidad mecnica, alteraciones motoras, debilidad, descoordinacin Dietas-jaulas metablicas: control de la ingesta del animal, de comida y agua. Anlisis de variables: peso, anlisis de sangre, presin arterial Recogida de orina y heces. Se usa para: efectos diurticos de un frmaco, digestin de alimentos, efecto de dieta sobre colesterol Toxicidad:

Toxicidad aguda: dosis nica y muy elevada (muerte del animal con una dosis total de 50). Toxicidad subaguda: administracin diaria 15 das y 4 semanas, varias dosis. Dos especies animales (una no roedora). Control diario de aspecto, comportamiento, peso, consumo de agua y alimento, ECG Estudios de toxicidad subcrnica y crnica: subcrnica 3 meses, crnica 6-12 meses. Segn el uso teraputico que vaya a tener la sustancia. Forma de administracin mezclada con el alimento. Dos especies (una no roedora). Estudios de cancerognesis: efecto de expansin de tumores prolongada (entre 18 y 24 meses). Estudios de toxicologa: conclusiones sobre el metabolismo del producto segn la dosis, reparto y tiempo del tratamiento. Mutagnesis: ensayos in vitro (clulas) y un ensayo in vivo (hematopoyesis). Estudios sobre la reproduccin: Fertilidad: 60 das pre-apareamiento macho y 15 das en las hembras. Leratogenia: das 8 a 21 de embarazo, desde la implantacin hasta el parto. Toxicidad pre y post natal: efectos sobre el desarrollo de los embriones, el parto y la lactancia.

TCNICAS DE IMAGEN (resonancia magntica, homografa)

Estudiar el funcionamiento de vasos sanguneos Actividad en diferentes regiones del cerebro Funcionamiento de rganos (corazn)

PREPARACIONES AGUDAS (control nervioso del ritmo cardiaco, relacin entre el ncleo A y B del cerebro, efecto
de un frmaco sobre el sistema cardiovascular) Se usan tcnicas invasivas (inmovilizacin, canulacin) El control es el mismo animal (muy excepcionalmente estudios con humanos). Ventajas: mantener y monitorizar el estado del tejido, microambiente inico y celular animal, conexiones intactas, y estabilidad mecnica. Inconvenientes: respiracin asistida, mantenimiento de T, afectacin de sistema de estudio (anestesia) y deterioro de la preparacin con el tiempoMicroneurografa y electromiografa: fenmenos moderadamente rpidos, funcionamiento en animal anestesiado. Comprobacin. INTACTO AGUDO HOMEOSTASIS Intacta Alterada CALIDAD PREPARACIN ptima Se deteriora TCNICAS No invasiva Invasivas DATOS OBTENIDOS Generales Precisos

PREPARACIONES CRNICAS
Control cerebral de la actividad motora Actividad muscular/cardiaca diferente ejercicio Constantes vitales, T Tcnicas de imagen Se usan tcnicas invasivas pero no durante el experimento. El control se realiza sobre el animal (muy excepcionalmente estudios con humanos). Electrofisiologa: estudia cmo las corrientes continuas de los campos elctricos pueden ser aplicados al cuerpo para controlar el comportamiento celular. Aplicacin de frmacos. Telemetra: implantes telemtricos para medir presiones arteriales. Transmiten datos desde el animal al receptor mediante ondas de frecuencia. Un receptor telemtico que envelos datos a la matriz se sita bajo la jaula del animal. Un medidor de presin ambiental se necesita para obtener medidas precisas de la presin. Una corriente de 110 o 120 VAC Una matriz de intercambio de datos que puede procesar informacin de hasta 20 receptores. Un ordenador que recoge y almacena los datos. Contiene software de anlisis especfico. Registro de variables fisiolgicas de animales conscientes y con libertad de movimientos. Evita artefactos debidos al estrs y proporciona un ambiente libre de la influencia del investigador. Esta tcnica resulta especialmente til en el campo de la farmacologa y la fisiologa.

Sensores implantables de tamao muy pequeo, que se pueden alojar en el organismo y que interfieren mnimamente en la fisiologa y el comportamiento normales del animal estudiado. Cada sensor es capaz de registrar una o ms variables (electrocardiograma, la frecuencia cardiaca y la temperatura). El sensor est constituido por un emisor de seal y una batera. Las seales emitidas pueden ser captadas por un equipo receptor fijo o porttil. Existen modelos de sensores que permites su implantacin en animales de tamao muy variable, desde ratas hasta perros o cerdos.

EXPERIMENTACIN IN VITRO
Ventajas: tica y moralmente ms aceptables Nmero menor de animales Material biolgico muy homogneo Posibilidad uso de material humano (extrapolacin) Estudios farmacolgicos sobre tipos celulares aislados Facilitan estudios especializados (electrofisiologa, captacin, transformacin y eliminacin de sustancias) Ms objetivables y cuantificables Mayor reproducibilidad Mayor precisin en el control de la concentracin (dosificacin) Control absoluto del perodo de contacto Mayor rapidez Coste econmico menor?? Menos instalaciones. Menos cantidades de los productos ensayados Generan menos cantidad de residuos Inconvenientes: La carencia de las interacciones existentes entre los distintos rganos de un ser ntegro Homeostasis artificial La limitada duracin de la actividad fisiolgica. Dificultad para estudios a largo plazo. La complejidad de la extrapolacin, sobre todo cuando no se dispone de informacin sobre las concentraciones efectivas in vivo La necesidad de usar ms de un sistema de ensayo: bateras Las dificultades para ensayar sustancias poco solubles, voltiles, gaseosas o que se descomponen rpidamente en contacto con el medio de cultivo La posibilidad de obtener resultados errneos debidos al ensayo en condiciones no adecuadas o cuando el compuesto las modifica por s mismo (cambios de pH, osmolaridad) Procedimiento: EX - VIVO--------------------- CULTIVO CELULAR Eleccin del animal (edad) Anestesia (ter, CO2 inyectables) Diseccin (esterilidad, material adecuado) Conformacin del tejido (slo un tipo de clulas, ganglio) Conservacin (ambiente, incubadora, lquidos)

TCNICAS EX VIVO
Extraccin del tejido. Necesitamos una lupa, instrumental adecuado, luz fra, hielo y en ocasiones anestesia. Mantenimiento del tejido. Bao de rganos, un pH adecuado, una oxigenacin y regulacin de pH y liquido intersticial. Ejemplos y aplicaciones. Electrofisiologa, imagen calcio, liberacin de sustancias, amperometra

CULTIVOS CELULARES
CULTIVO PRIMARIO. Se necesita: material estril (autoclave), campana de flujo, medio de cultivo (estril, antibiticos) y el animal adecuado. Operacin quirrgica, disgregacin enzimtica (tripsina, colagenasa, ADNasa), disgregacin mecnica, separacin y dilucin de las clulas, sembrado en pocillo/placa y mantenimiento (pH, CO2, T, antibiticos)

Ejemplos: clulas para trasplantes, txicos, mutgenos, sinaptognesis, expresin de protenas, liberacin de sustancias, interacciones con matriz, contactos celulares, imagen calcio, screening Electrofisiologa: interaccin neurona-gla, contacto neurona-neurona, estudios de canales inicos (expresin heterloga) y funcionamiento de receptores. EX VIVO Sistema-celular +/Jvenes-adultos Original SENCILLO (oxgeno, pH, iones) 1 da CULTIVOS Celular-molecular Prenatales-jvenes Artificial COMPLEJO (antibiticos, hormonas, nutrientes) Semanas o meses

NIVEL DE ESTUDIO TICA ANIMALES FORMA DE TEJIDO MANTENIMIENTO DURABILIDAD

MODELOS COMPUTACIONALES
Un modelo computacional es un programa de ordenador que incorpora uno o varios algoritmos para calcular el valor de VD en funcin de VI. Proporciona informacin (visual) de VD en base a los valores proporcionados. Algoritmo: conjunto ordenado y finito de operaciones que permite hallar la solucin al problema.

CONSTRUCCIN
OBSERVACIN DE LA REALIDAD Y DEFINICIN DEL PROBLEMA. DEFINICIN CUANTITATIVA (identificar valores, relaciones de dependencia entre ellas). FORMULACIN MATEMTICA FORMULACIN DE PROGRAMACIN (algoritmo). SISTEMA DE VISUALIDACIN (DISPLAY) (valor numrico, curvas/grficas y red virtual).

NIVEL DE ESTUDIO
CUALQUIER SISTEMA FISIOLGICO: modelo de sistema nervioso, modelo de corazn, modelo de rin, modelo del sistema digestivo, modelo de msculo. CUALQUIER NIVEL DE ESTUDIO: modelo de canal inico, modelo de neurona, modelo de red neuronal, modelo de sistema nervioso, modelo de comportamiento. LMITES: conocimiento previo de la materia y poder computacional.

APLICACIONES
Estudiar relaciones complejas entre las variables. Hacer predicciones. Determinar valores de parmetros. Estudiar fenmenos inaccesibles (tiempo, recursos) Modelos pedaggicos (fenmeno y procedimiento simplificados (sencillez). Consigue evitar el uso de animales.

ELECTROFISIOLOGA I
POTENCIALES BIOELCTRICOS
Membrana lipdica. Fosfolpidos con la zona polar hacia el exterior. Es una membrana restrictiva, y para que haya intercambio es necesario otros componentes (protenas, canales). Transporte a travs de membrana. Un canal especfico para que el in pase.

GRADIENTE ELECTROQUMICO potencial de reposo debido a las desigualdades en la distribucin de iones

dentro y fuera de la clula.

POTENCIAL DE ACCIN cambios sbitos en la concentracin de iones. Clulas excitables. Para ello es necesaria la
contraccin muscular, transmisin sinptica o la liberacin de hormonas.

TCNICAS ELECTROFISIOLGICAS
Hay varios estudios que se pueden llevar a cabo de forma invasiva y no invasiva. Las TCNICAS NO INVASIVAS abarcan: EEG (electroencefalograma), EMG (electromiografa), ECG (electrocardiografa) y EOG (electrooculografa). Tcnica sencilla, no proporciona datos detallados y en electrofisiologa se emplea con electrodos cutneos. Las TCNICAS INVASIVAS abarcan: potenciales de campo, registros extracelulares, registros intracelulares y pach-clamp o voltaje-clamp. Tcnica compleja, proporciona datos precisos y en electrofisiologa se emplea con electrodos insertados.

NO INVASIVAS. CARACTERSTICAS
El campo elctrico generado por una sola clula es muy pequeo. Las tcnicas de superficie slo detectan actividad sincrnica. El campo elctrico atraviesa fases de resistencia elctrica variable. La localizacin del origen de los potenciales es difcil.

EQUIPO DE REGISTRO Y ELECTRODOS Electrodos: Podemos hacer registros inter- o intracelulares. Pueden ser sensores que estudian una regin o varias regiones a la vez. Hay que acondicionar la seal, amplificarla, filtrarla y se puede hacer en un osciloscopio (analgico) o en un ordenador (digitalizando la seal). Mesa muy fuerte, elevada, con sistema neumtico para que asle los movimientos y vibraciones. Aparato para inmovilizar al animal. Micromanipulador. ELECTROCARDIOGRAFA actividad elctrica por la despolarizacin al contraerse el corazn. ELECTROENCEFALOGRAMAS estudios de los impulsos nerviosos producidos en la cabeza, mediante electrodos
colocados directamente en la cabeza.

ANLISIS VISUAL ritmos bsicos, picos, ondas, intervalos, fenmenos especiales. ANLISIS COMPUTACIONAL
Cartografa cerebral: distribucin topogrfica de la actividad en la corteza cerebral obtenida con electroencefalografa. Aunque no es capaz de mostrar ms informacin que la EEG en la que se basa, representa los datos de una forma ms detallada. Azul/negro: bajo nivel de energa Rojo/blanco: alto nivel de energa Se aplica en diagnsticos clnicos (cardiopatas, epilepsias o comas) y en investigacin (sueo o percepcinpotenciales evocados).

ELECTROFISIOLOGA II
Invasivas: tcnicas en las que el electrodo se introduce dentro del tejido. Registros intracelulares: se detectan cambios en el potencial elctrico desde el exterior de la clula. Para ello necesitamos: electrodo grueso de vidrio o metlico. En un conjunto de neuronas, se introduce el electrodo para medir el potencial de campo del medio externo. En el caso de los capilares de vidrio, tenemos que rellenarlos con un fluido conductor (el mismo en el que est en tejido). Podemos conocer la zona donde ha medido el electrodo. El electrodo llega hasta una neurona identificada en lo que analizaremos su potencial de accin (-) y despus se repolariza (+). Registros intracelulares: siempre es necesario un electrodo de referencia, para poder ver cuntos potenciales de accin se han producido en la clula (microV), adems del que hay en el interior celular que permite ver el potencial de reposo de la clula (ventaja).

Electrodos con puntas muy finas cuya resistencia es muy grande. El electrodo de referencia lo rellenamos con acetato potsico que conduce muy bien la electricidad (no se introduce en la clula). El mismo electrodo registra el voltaje e introduce corrientes despolarizadoras. Seales generales (microV). Invasivo: posibilidad de dao tisular (in vitro) Reduce la influencia sobre el fluido intracelular y la capacidad de aplicacin de corriente (electrodo pequeo) Mayor complicacin a la hora de realizarlo, pero aporta mejor informacin ms concreta que los registros extracelulares.

REGISTROS DE CORRIENTES
Voltaje-clamp o pinzamiento de voltaje: conocemos y controlamos el voltaje o potenciarlos midiendo la corriente de la clula (corriente de iones). Desde un potencial de reposo podemos pasar a otro por encima del umbral, haciendo que se produzca un potencial de accin. Registramos las corrientes de iones.

Corriente que necesita nuestra regulacin para mantener el voltaje que hemos elegido. Pero al contrario que el potencial de accin, es la inversa de la corriente producida por la clula).

Patch-clamp: desubriero que si pegamos un electrodo a la membrana se fusiona con ella, consiguiendo que no se escapen seales elctricas. Podemos trabajar con un solo electrodo. Recibieron un novel por poder estudiar un canal celular de forma controlada (1991). Dentro de esta tcnica tenemos acceso a diferentes acciones: Romper la zona de membrana teniendo acceso al interior celular o conseguir un trocito de la membrana (extraerla hacia fuera). Conseguir un trozo de membrana rota teniendo lo de dentro hacia fuera.

SIMILITUDES

REGISTROS PATCH VS INTRACELULAR DIFERENCIAS (por el tipo de electrodos)

Mejor influencia sobre el fluido intracelular Gran capacidad de aplicacin de corriente Caractersticas de los microelectrodos de vidrio: PUNTAS: 1m (<0.1m) RESISTENCIAS: 2-10 M (~100 M) Electrodo de registro relleno de solucin intracelular (AcK 3M)

Mismo electrodo registra y estimula Buena relacin seal-ruido (mejor Patch) INVASIVO: posibilidad de dao tisular. Registros in vitro (in vivo!) Referencia en el bao Requiere buena estabilidad mecnica.

MARCAJE INTRACELULAR consiste en introducir dentro de la clula que estamos estudiando, un compuesto para
localizarlo, como puede ser un tinte, que aparecer marcado por mtodos de histoqumica.

SIMILITUDES

REGISTROS PATCH VS INTRACELULAR DIFERENCIAS (por el tipo de electrodos)

Mejor influencia sobre el fluido intracelular Gran capacidad de aplicacin de corriente Caractersticas de los microelectrodos de vidrio: PUNTAS: 1m (<0.1m) RESISTENCIAS: 2-10 M (~100 M) Electrodo de registro relleno de solucin intracelular (AcK 3M)

Mismo electrodo registra y estimula Buena relacin seal-ruido (mejor Patch) INVASIVO: posibilidad de dao tisular. Registros in vitro (in vivo!) Referencia en el bao Requiere buena estabilidad mecnica.