PREPARACIN DE MUESTRAS BIOLGICAS Y MATRICES ALTERNATIVAS EN UN LABORATORIO DE TOXICOLOGA FORENSE

MARA JESS TABERNERO DUQUE (e-mail: mj.tabernero@usc.es)

INSTITUTO DE MEDICINA LEGAL (FACULTAD DE MEDICINA) SERVICIO DE TOXICOLOGA: Dra. ANA MARA BERMEJO BARRERA Dra. MARA JESS TABERNERO DUQUE Dr. IVN LVAREZ FREIRE PAMELA CABARCOS FERNNDEZ

INVESTIGACIN TOXICOLGICA: GENERALIDADES

METODOLOGA ANALTICA:

Fase de cribado Fase de confirmacin

Cuantificacin de las sustancias encontradas

Estudio de alcoholemia de forma sistemtica

Anlisis de indicios, en su caso.

INVESTIGACIN TOXICOLGICA Factores que la modifican

Informacin recibida
Tipo de muestra biolgica

Disponibilidad de tcnicas analticas

Tiempo disponible

MUESTRAS BIOLGICAS: TIPOS Y CARACTERSTICAS

MUESTRAS BIOLGICAS

Sangre

Orina
Bilis Humor vtreo Contenido gstrico Hgado

Saliva
Pelo Meconio

SANGRE

nica muestra cuya concentracin se relaciona con el estado clnico Concentraciones bajas de txico

Composicin compleja
Necesita preparacin previa de la muestra Aconsejable recogerla de venas perifricas o cavidades cardacas Cantidad aconsejable de 50 a 100 mL

Adicionar conservante

ORINA

Altas concentraciones de drogas y metabolitos Idnea para inmunoensayos Disponibilidad de muestra suficiente Un resultado positivo ha de ser interpretado

Un resultado negativo no es excluyente

A veces en cadveres necesita centrifugacin previa No necesita adicin de conservantes Cantidad variable

BILIS

Altas concentraciones de txicos

Especial inters en intoxicaciones por opiceos

Composicin muy compleja Necesidad de preparacin previa de la muestra Aconsejable conservar con fluoruro sdico Volumen variable

HUMOR VTREO

Solucin isotnica de sales

Muestra ms resistente a la putrefaccin

Poco volumen de muestra (1-2 mL)

Bajas concentraciones de droga

Conviene aadir fluoruro potsico

CONTENIDO GSTRICO

De inters cuando se sospecha ingestin
Recogido en su totalidad y pesado Altas concentraciones de txico inalterado Se debe interpretar bien el resultado cuantitativo

Laborioso proceso de extraccin Si no existe, sustituir por estmago

HGADO

Altas concentraciones de drogas y metabolitos

Efecto matriz importante

Dato complementario a la concentracin

sangunea

Cantidad aconsejada 100 g.

Preferentemente lbulo derecho

Limitada interpretacin de resultados

MUESTRAS ALTERNATIVAS: SALIVA, PELO Y MECONIO

TIEMPOS DE DETECCIN

PELO

DE 1 SEMANA HASTA AOS

SUDOR

2-3 DAS

ORINA

2-3 DAS

SALIVA

24 HORAS

SANGRE
N DAS

24 HORAS 0,1 1 10 100 1000

TIEMPOS DE APARICIN Y DESAPARICIN DE LAS DROGAS.

COMPARACIN DE LAS DIFERENTES MUESTRAS BIOLGICAS

SALIVA

Fcil de recoger Difcil adulteracin Posible correlacin con niveles plasmticos Bajas concentraciones de txicos Posibilidad de sustitucin por la sangre

SALIVA
FLUJO SALIVAR: 500 A 1500 mL/da

Neurotransmisores y hormonas Ritmo circadiano Actividad fsica Estados de salud individual

De 0 mL/min a 6 mL/min (bajo estimulacin)

VENTAJAS DE LA SALIVA

Recogida no invasiva, rpida y sencilla Difcil adulteracin Composicin menos compleja que el plasma o la sangre Contiene la fraccin libre de droga Posible correlacin con niveles plasmticos Existen test rpidos screening preliminar comercializados para

DESVENTAJAS DE LA SALIVA

Volumen muy limitado Concentraciones de analito muy bajas Posible contaminacin (inhalacin/ingestin

reciente de drogas)
La concentracin del analito vara con el

mtodo de recogida Mtodos de anlisis no estandarizados Ventana de deteccin muy inferior a la de la

orina

TOMA DE MUESTRA DE FLUIDO ORAL

SALIVETTE (Almacenamiento en el propio dispositivo) a -18 C

ORASURE (1 mL de Saliva)

ORALSCREEN (Screening en 15 minutos)

OTROS DISPOSITIVOS

DRAGER DRUGTEST DRUGWIPE

PELO: CARACTERSTICAS

Demuestra consumos anteriores a la toma de muestra

Estudio de modelo individual de

drogodependencia Recogida de muestra no traumtica No precisa condiciones especiales de conservacin

Cantidad mnima 100 mg.

Cualquier localizacin es vlida til para estudios epidemiolgicos

INCORPORACIN DE LAS DROGAS AL PELO

TOMA DE MUESTRA DE CABELLO

FACTORES DE LA INCORPORACIN Y RETENCIN DE LAS DROGAS EN PELO

1.- FACTORES QUE DEPENDEN DEL PELO:
Cutcula, mdula, etc Color del pelo (Melanina) 2.- FACTORES QUE DEPENDEN DE LA DROGA:

Estructura qumica
Lipofilia Afinidad por la melanina Capacidad de penetracin a travs de la membrana

CAPACIDAD INCORPORATIVA LAS DROGAS

DE

LIMITACIONES ANLISIS DE PELO

Posibilidad de falso positivo por

contaminacin externa.
Sin correlacin dosis/concentracin. Gran variabilidad individual. Lenta Eliminacin tras abstinencia total. Dosis Mnima Detectable:

No definida.

Negativo no siempre excluye un consumo.

PROCESADO DE LA MUESTRA

Pretratamiento de la muestra:

Longitud y segmentos Lavado de la muestra Pulverizacin y pesada

Extraccin de las drogas

PROCEDIMIENTOS DE LAVADO

Sucesivos lavados de metanol y anlisis
Detergentes metanol Diclorometano Dodecilsulfato sdico al 0,1 % y agua de pH neutros, agua y

Agua caliente, agua con acetona

Isopropanol a 37 C durante 15, tampn fosfato (pH=5,5) durante 30.

MECONIO

MECONIO

MECONIO

MECONIO

Primera materia fecal del RN Se empieza a formar en la 12 semana de embarazo. Depsito de todas las Ventajas Fcil recogida No invasivo Informacin sobre exposicin fetal crnica a diversas sustancias Inconvenientes

sustancias a las que el feto est expuesto durante los 6 ltimos meses de embarazo.

El

75%

se

forma

en

las

ltimas 8 semanas.
Se elimina entre los das 1 y 5 tras el nacimiento.

Matriz compleja, muestra no homognea Dificultad en el pretratamiento de la muestra Posible contaminacin urinaria No siempre se dispone de la suficiente cantidad

NUEVOS MARCADORES BIOLGICOS

IDENTIFICACIN DE EMBARAZOS EXPUESTOS AL ALCOHOL (I)

El consumo de alcohol en el embarazo es

daino para el feto en desarrollo.

La

identificacin al

temprana fetal

de

los

nios las

expuestos

alcohol

reduce

discapacidades secundarias.

Se calcula que 1% de los neonatos est expuesto al alcohol en el perodo prenatal, pero es difcil identificar estos casos.

IDENTIFICACIN DE EMBARAZOS EXPUESTOS AL ALCOHOL (II)

NUEVOS BIOMARCADORES: muy tiles en la

monitorizacin de la Abstinencia en casos clnicos adopcin divorcio). y de forenses (tratamientos de procesos de de deshabituacin, licencias menores, conduccin,

Se

investigan

nuevas

matrices

biolgicas

(Meconio y Cabello ) y nuevos marcadores:

(Etilglucurnido y FAEES) que amplan el

tiempo de deteccin.

FAEES (STERES ETLICOS DE LOS CIDOS GRASOS)

Productos
menores no oxidativos del metabolismo del alcohol. Se forman por conjugacin del etanol con el cido glucurnico.

Metabolitos

txicos y pueden determinarse en varias muestras biolgicas (sangre, grasa, pelo, diferentes tejidos postmortem y meconio). Se acumulan en los tejidos grasos.

Los

ms utilizados son: Palmitato, Estearato y Oleato.

EtilPalmitoleato,

ETILGLUCURNIDO (I)

Se produce despus de que el 90-95% del alcohol sea eliminado. En el biotransforma el Etanol a hgado se Etilglucurnido

(conjugacin con cido glucurnido).

Representa slo el 0.5% del alcohol total

eliminado. Es NO VOLTIL y SOLUBLE EN

AGUA

Se

detecta

incluso

TRAS

LA

COMPLETA

ELIMINACIN DEL ETANOL de los fluidos biolgicos.

ETILGLUCURNIDO (II)

Puede ser detectado en fluidos biolgicos y

tejidos como sangre, orina y pelo.

Es un marcador muy ESPECFICO (no es detectable a menos que se haya consumido

alcohol) y su VENTANA DE DETECCIN

alcanza las 1-80 horas postconsumo en orina y hasta 18 horas postconsumo en

sangre.

FOSFATIDILETANOL
Uno de los ms recientes biomarcadores. Es
un grupo de fosfolpidos que se forma por accin de la fosfolipasa D, slo en presencia de etanol.

Se

determina

en

sangre

total.

Alta

especificidad y bajo grado de degradacin: el pico de vida media en sangre aparece a los 4 das del consumo, y es detectable hasta 14 das despus.

TCNICAS DE EXTRACCIN

PROCESADO DE LA MUESTRA

Pretratamiento pesada,) de la muestra: (Lavado,

homogeneizado, centrifugado, pulverizacin,

Cabello Meconio Saliva Bilis Contenido gstrico Vsceras

Extraccin de las drogas

TCNICAS DE EXTRACCIN

Extraccin lquido-lquido Extraccin slido-lquido

Microextraccin en fase slida: SPME

Extraccin asistida por Microondas: MAE

EXTRACCIN SLIDO LQUIDO

-FASES DE UNA SPE:

Seleccin del mecanismo de adsorcin y

adsorbente. Pretratamiento de la muestra Acondicionamiento de la columna Estabilizacin de la columna

Aplicacin de la muestra
Elucin de las interferencias Elucin del analito

EXTRACCIN SLIDO LQUIDO

ANALITO INTERFERENCIAS

MICROEXTRACCIN EN FASE SLIDA (SPME) :

Fibra de slice fundida con distintos
tipos de recubrimientos.

Ventajas: bajo coste, sencillez,

requiere pequeos volumenes de muestra y es facilmente transportable.

Dos modos de trabajo: inmersin

espacio de cabeza.
agitacin, tipo de recubrimiento... 1. Exposicin de la fibra a la muestra 2. Desorcin en el inyector

Factores: pH, tiempo, temperatura, Proceso en dos etapas:

MICROEXTRACCIN EN FASE SLIDA (SPME) :

mbolo

Cuerpo de la jeringa

Muelle Septum

Cuerpo ajustable

Ferrula

Aguja protectora

Aguja protectora Pieza de fijacin de la fibra

Fibra de slice recubierta del material extractante

MICROEXTRACCIN EN FASE SLIDA (SPME) :

TIPOS DE FIBRAS:
PDMS: Polidimetilsiloxano (7, 30 100 m) PA: Poliacrilato CW/DVB: Carbovax/divinilbenzeno PDMS/DVB: Polidimetilsiloxano/divinilbenzeno

CW/TPR: Carbovax/resina temperada

CAR/PDMS: Carboxen/polidimetilsiloxano DVB/PDMS/CAR: Divinilbenzeno/polidimetilsiloxano/carboxeno

MICROEXTRACCIN EN FASE SLIDA (SPME) :

EXTRACCIN DIRECTA POR INMERSIN: Para analitos poco voltiles Se deben evitar las muestras excesivamente cidas o alcalinas

En Sangre y Saliva, es mejor diluir la muestra.

El aumento de temperatura (40-70 C) y la adicin de NaCl favorecen el anlisis Menor duracin de la fibra que con el espacio de cabeza. EXTRACCIN POR ESPACIO DE CABEZA HS-SPME Para compuestos voltiles y semivoltiles Hay que calentar la muestra para provocar la volatilizacin de los analitos (40-80 C) Mayor duracin de la fibra que en la extraccin por inmersin Menor sensibilidad para sustancias poco voltiles

MICROEXTRACCIN EN FASE SLIDA (SPME) :

DESORCIN TRMICA:
SPME-GC

LQUIDA:

SPME- CE SPME- HPLC

SPME

OVEN
Abundance I o n 8 7 . 0 0 (8 6 . 7 0 t o 8 7 . 7 0 ): E S T A B I L I D A D C O R T O P L A Z O S A N G R E . D I o n 8 7 . 0 0 (8 6 . 7 0 t o 8 7 . 7 0 ): B L A N C O S A N G R E . D

Temp Initial temp Initial time

206

206 100 1.00

75 70 65 60 55 50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0

Perfectfit

8 .8 5 T im e -->

8 .9 0

8 .9 5

9 .0 0

9 .0 5

9 .1 0

9 .1 5

9 .2 0

HP

Hewlett Packard

5973 Mass Selective Detector

Stop

Pre run

Start

5973 Mass Selective Detector

Muestra

Desorcin 1-2

EXTRACCIN ASISTIDA POR MICROONDAS (MAE)

Se emplea la energa de microondas para calentar los disolventes que estn en contacto con una muestra de forma tan eficiente que los tiempos de extraccin se reducen drsticamente.

VENTAJAS:
utiliza poco disolvente volumen de

permite el control de los parmetros de extraccin en todo momento permite el procesado de varias muestras a la vez presenta recuperaciones similares e incluso superiores a procesos de extraccin convencionales

EXTRACCIN DE LAS DROGAS: PELO:

Hidrlisis alcalinas: Compuestos anfetamnicos y cannbicos, y Antidepresivos tricclicos. NaOH entre 1 y 2,5 M

Hidrlisis cidas: Compuestos cocanicos y opiceos HCl de baja molaridad (0,1-0,6M)

Hidrlisis enzimticas: Compuestos cocanicos y opiceos Pronasa o proteinasa K

Hidrlisis con solventes: til para realizar un barrido toxicolgico. Menor capacidad de extraccin Metanol o etanol

OTROS DISOLVENTES DE EXTRACCIN y DERIVATIZACIN

FENTANILO Y SULFENTANILO: Extraccin con TERBUTILMETIL

TER

(posterior

Derivatizacin

con

EtilAcetato

Anhdrido

Pentafluoropropinico)

OTROS COMPUESTOS QUE PRECISAN DERIVATIZACIN:

COCANA (BEG y EME): BSTFA-TMCS OPICEOS: Codena, Morfina y MAM: BSTFA-TMCS ANFETAMINAS: EtilAcetato y Anhdrido Pentafluoropropinico

ANTIDEPRESIVOS SSRIs: Extraccin con TERBUTILMETIL TER. Posteriormente:

CON DERIVATIZACIN: Fluoxetina, Norfluoxetina, Sertralina y Paroxetina.

SIN DERIVATIZACIN: Venlafaxina, Mirtazapina y Olanzapina

TCNICAS DE ANLISIS

ANLISIS INSTRUMENTAL

Mtodos inmunolgicos: INMUNOENSAYO EN ORINA Cocana, (Screening Opiceos, para determinacin de Anfetaminas, Cannabis,

Benzodiacepinas y Metadona).

Cromatografa de gases/espectrometra de masas: Cuantificacin y Confirmacin de casos positivos.

Otras tcnicas: HPLC, LC/MS, Electroforesis capilar, Microscopia de infrarrojos,...

INTERPRETACIN DE RESULTADOS

INTERPRETACIN DE RESULTADOS: PELO

1. Criterios para evitar dar falsos positivos 2. Relacin cantidad detectada/dosis consumida 3. Tiempo transcurrido entre aparicin y
desaparicin de la droga del pelo

4. Dosis mnima de droga detectada

5. Influencia de la raza y color del pelo

6. Influencia de tratamientos cosmticos

INTERPRETACIN DE RESULTADOS: PELO (Contaminacin Externa)

Lavado riguroso de la muestra Anlisis de los lavados

Anlisis de metabolitos
Cocientes drogas/metabolitos 10

Establecer valores de corte (cut-off)

INTERPRETACIN DE RESULTADOS: PELO

SCREENING
VALORES DE CUT-OFF (ng/mg) Cannabinoides (THC) Morfina 6-Acetilmorfina Cocana MDMA, Metanfetamina, Anfetamina, MDEA, MDA 0.1 0.2 0.2 0.5 0.2

CONFIRMACIN
VALORES DE CUT-OFF (ng/mg) Cannabinoides (THC) Cannabinoides (THC-COOH) Morfina 6-Acetilmorfina Cocana Metabolitos Cocana (EME, BEG) MDMA, Metanfetamina, Anfetamina, MDEA, MDA 0.1 0.2 pg/mg 0.2 0.2 0.5 0.05

0.2

CONSUMO EXCESIVO DE ALCOHOL: EtG : 30 pg/mg FAEE : 0'5 ng/mg.

SOHT: SOCIETY of HAIR TESTING

INTERPRETACIN DE RESULTADOS: PELO (Controles de consumo)

12 10 8 6 4 2 0 I II III IV V 500 400 300

morfina

200 100 0 I II III IV V

cocana

4 3 2 1 0 I II III IV

500 400 300

morfina

200 100 0 I II III IV V

cocana

INTERPRETACIN DE RESULTADOS: PELO (Controles de consumo)

70 60 50 40 30 20 10 0 15 10

COCANA
5 0

MORFINA

III

VII

IX

XI

III

VII

IX

XI

1000 800 600 400 200 0 I II III IV COCANA

2,5 2 1,5 1 0,5 0 I II III IV

MORFINA

INTERPRETACIN DE RESULTADOS: SALIVA

RELACIN SALIVA/PLASMA:

S/P < 1 Drogas cidas con pK< 8,5 S/P > 1 Drogas bsicas S/P = 1 Drogas neutras

Hay que tener en cuenta la INFLUENCIA del Flujo salivar

INTERPRETACIN DE RESULTADOS: SALIVA

SCREENING
VALORES DE CUT-OFF (ng/mL) Cannabinoides Cocana y metabolitos 4 20

CONFIRMACIN
VALORES DE CUT-OFF (ng/mL) Tetrahidrocannabi nol Cocana o BEG Morfina o codena 6monoacetilmorfina Anfetamina Metanfetamina MDMA MDA MDEA Fenciclidina 2 8 40 4 50 50 50 50 50 10

Opiceos
Anfetaminas MDMA Fenciclidina

40
50 50 10

SAMHSA: Substance Abuse Mental Health Service Administration

IDENTIFICACIN DE COMPUESTOS: CANNABINOIDES (SPME)

Cromatograma de 9-THC, CBD Y CBN en modalidad SCAN

Espectro de masas del 9-THC

Cromatograma de 9-THC-D3 en modalidad SCAN

Espectro de masas del 9-THC-D3

IDENTIFICACIN DE COMPUESTOS: CANNABINOIDES (SPME)

Espectro de masas del CBD

Espectro de masas de CBN

APLICACIN A CASOS REALES

CANNABINOIDES EN PELO

Cromatograma de un caso real de cannabinoides en pelo

APLICACIN A CASOS REALES

CANNABINOIDES EN SALIVA (SPME)

Cromatograma de un caso real de cannabinoides en saliva

APLICACIN A CASOS REALES

(b) Cromatograma de una muestra de pelo blanco aadiendo EtG (1 ng/mg).

ETILGLUCURNIDO EN CABELLO: (Extraccin con MAE)

(c) Cromatograma de una muestra real (EtG:0.53 ng/mg)

APLICACIN A CASOS REALES

Cromatograma de una muestra de orina con patrn de EtG (50 gml1)

ETILGLUCURNIDO EN ORINA: (Extraccin con MAE)

Cromatograma de una muestra real (EtG: 71.69 gml1)

APLICACIN A CASOS REALES

Abundance 1500000 1400000 1300000 1200000 1100000 1000000 900000 800000 700000 600000 500000 400000 300000 200000 100000 0 Time-->
18 5 24 0

SANGRE :
24 3

- Cocana: < LOQ - BEG: 0.55 g/mL

18 2

14.00

15.00

16.00

17.00

18.00

19.00

20.00

21.00

22.00

COCANA EN SANGRE y MECONIO:

Abundance 1600000 1500000 1400000 1300000 1200000 1100000 1000000 900000 800000 700000 600000 500000 400000 300000 200000 100000 0 Time-->
18 2

MECONIO:
18 5

- Cocana: 1.250 ng/mg - BEG: 0.99 ng/mg

24 0 24 3

14.00

15.00

16.00

17.00

18.00

19.00

20.00

21.00

22.00

APLICACIN A CASOS REALES

FAEES (STERES ETLICOS DE LOS CIDOS GRASOS)

Etilmiristato

Etilpalmitato Etilestearato

Cromatograma de un consumidor abusivo de alcohol

APLICACIN A CASOS REALES FENTANILO Y ANLOGOS EN ORINA

-IONES DE LOS COMPUESTOS:
- FENTANILO: 245, 151, 194; FENTANILO-D5: 250. (TR: 17.70) - NORFENTANILO: 322, 150, 229 (TR: 12.71) - SUFENTANILO: 289, 140, 187 (TR: 18.73)

- ALFENTANILO: 289, 222, 268 (TR:

21.27)

APLICACIN A CASOS REALES FENTANILO Y ANLOGOS EN ORINA

APLICACIN A CASOS REALES SSRIs (MIRTAZAPINA)EN SANGRE

[MIRTAZAPINA]: 0.069 g/mL [PAROXETINA]: 0.125 g/mL [NORDIACEPAN]: 0.016 g/mL

APLICACIN A CASOS REALES SSRIs (PAROXETINA)EN SANGRE

[MIRTAZAPINA]: 0.069 g/mL [PAROXETINA]: 0.125 g/mL [NORDIACEPAN]: 0.016 g/mL

APLICACIN A CASOS REALES NORDIACEPAN EN SANGRE

[MIRTAZAPINA]: 0.069 g/mL [PAROXETINA]: 0.125 g/mL [NORDIACEPAN]: 0.016 g/mL

APLICACIN A CASOS REALES: ANLISIS DE DROGAS EN MECONIO (I)

Representacin grfica de la disminucin de cocana y opiceos en muestras de un Meconio obtenido en tres das sucesivos.

4 3
ng/mg
MORPINE CODEINE BENZOYLECGONINE COCAINE

2 1 0 DAY 1 DAY 2 DAY 3

APLICACIN A CASOS REALES: ANLISIS DE DROGAS EN MECONIO (II)

Cromatograma de la muestra de Meconio obtenida el primer da

APLICACIN A CASOS REALES:

ANLISIS DE COCANA EN PELO

APLICACIN A CASOS REALES:

ANLISIS DE COCANA EN PELO

APLICACIN A CASOS REALES:

ANLISIS DE COCANA EN PELO

APLICACIN A CASOS REALES:

ANLISIS DE COCANA EN PELO

APLICACIN A CASOS REALES:

ANLISIS DE OPICEOS EN PELO

APLICACIN A CASOS REALES:

ANLISIS DE OPICEOS EN PELO

APLICACIN A CASOS REALES:

ANLISIS DE OPICEOS EN PELO

APLICACIN A CASOS REALES:

ANLISIS DE OPICEOS EN PELO

APLICACIN A CASOS REALES:

ANLISIS DE OPICEOS EN PELO

APLICACIN A CASOS REALES:

ANLISIS DE METADONA EN PELO

APLICACIN A CASOS REALES:

ANLISIS DE ORINA

APLICACIN A CASOS REALES: ANLISIS DE UNA JERINGUILLA

APLICACIN A CASOS REALES: ANLISIS DE UNA JERINGUILLA

APLICACIN A CASOS REALES:

ANLISIS DE SUSTANCIA PULVERULENTA

PREPARACIN DE MUESTRAS BIOLGICAS Y MATRICES ALTERNATIVAS EN UN LABORATORIO DE TOXICOLOGA FORENSE

MARA JESS TABERNERO DUQUE

(e-mail: mj.tabernero@usc.es)
INSTITUTO DE MEDICINA LEGAL (FACULTAD DE MEDICINA)
SERVICIO DE TOXICOLOGA C/SAN FRANCISCO S/N 15782 SANTIAGO DE COMPOSTELA