Clonacindegenes

ClonacindelDNA
DNAforneo(secuenciaquese deseaclonar) Vectordeclonacin(vehculo) Organismohusped(E.Coli) Seleccindevectores
http://www.dnatube.com/video/556/Plas mid-Vector-Construction http://www.dnatube.com/video/4036/PCR Cloning

Vector hbrido

Obtencindelasecuenciaqueseclona
Ungen AislamientoapartirdelmRNA (yanotieneintrones):usode latranscriptasa inversaquehacecDNA apartirdelconjunto demRNA deltejido(LibreradecDNA) Fragmentosdelgenomapordigestinconenzimasde restriccin:SeobtieneunaLibreraGenmica,juegocompleto defragmentosclonadosdelgenomadelorganismo FragmentosdePCRamplificadoconpartidoresespecficospara lasecuenciaquesebuscaydesdeelcDNA extradodeltejidoen dondeelgenseestexpresando

Libreragenmica

AmplificacindeunfragmentoporPCR

Acta

Luego de 30 ciclos, una copia del fragmento se ha amplificado 109 veces: 30 2 =1.073.741.824 copias del fragmento de inters

Vectordeclonamiento

Caractersticas generales de un vector de expresin (procaritico)

-

promotor fuerte (inducible)

- sitio de clonamiento multiple (MCS)

o policonector (sitio con muchas secuencias reconocidas por enzimas de restriccin)

- seal de trmino de la transcripcin - sitio de unin del ribosoma (RBS) - origen de replicacin - marcador de seleccin:

Los ms usados son los antibiticos

FormacindelVectorhbrido
Fragmentosde distintas procedenciasque seuneninvitro trascortarsecon lamismaenzima derestriccin. Ligasa sellazona hbrida

Vectoresde clonacin
Fago (Lambda) Csmido Plsmido(215kb) Plsmidohbridoo Plsmidorecombinanteo DNArecombinante

ClonacinysecuenciacindelDNA

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Husped:E.coli
Fcildecrecerenmediosdecultivo simples Tiempoprpidodecrecimiento,con divisincelularentre2030minutos Sugenticaesconocidamuybien,puesse secuencicompletamentesugenoma Sepuedeintroducirmaterialgentico forneoenvectores,plsmidosoADNde fagocomocopiasdematerial extracromosomal

Seleccindevectoresrecombinantes
Plsmido:resistenciaaantibiticos

Cmo reconocer qu bacterias incorporaron el plsmido recombinante y cuales no?

Slo crecen las bacterias que tienen la resistencia a la ampicilina (otorgada por el plsmido)

Obtencindelgendeintersapartirdeunagenoteca

Depender del tipo de librera que se utilice (de cDNA o genmica), el tipo de gen que se obtiene: el ADNcopia (cDNA) que ser igual a ARNm, no tiene intrones o el GEN completo, tal como est en ADN y seguramente fragmentado en varias colonias positivas

Propagacincelular

Vectoreseucariticos
Permiteobtenerlasmximasventajasdegeneseucariotas Vectoresdelevaduras:cromosomasartificialesdelevaduras(YACs): Plsmidos+Secuenciareplicadora+centrmerodelevadura+ (telmerolevadura) Puedeincorporarmsde500kbdeDNA
Resistenciaaantibitico(p.e., ampr) Origendereplicacindel DNAdelevadura(ARS)

Origendereplicacin bacteriano(ori)

Regincentromrica(CEN)

Linealizacin(con endonucleasas)yadicinde extremostelomricos

Telmero

ampr

ori

CEN

ARS

Telmero

Caractersticas generales de un vector de expresin (eucaritico)

promotor fuerte (inducible)

- sitio de clonamiento multiple (MCS) - seal de trmino de la transcripcin - seal de poliadenilacin -sitio de unin del ribosoma (RBS) - origen de replicacin - marcador de seleccin en bacterias
PA

y en clulas eucariticas

Invitrogen

PA