Guia Micro Alim Mod II 2012

Microbiologa de
Alimentos

Mdulo II

Area Bromatologa
Dpto. Qumica Orgnica

Lic. en Ciencia y Tecnologa de Alimentos
2
MICROBIOLOGIA DE LOS ALIMENTOS

MODULO I: MICROBIOLOGIA GENERAL

I. Introduccin
Diversidad microbiana: bacterias, algas, hongos, protozoos. Conceptos de virus y priones.
Ubicacin de los microorganismos en los tres dominios del rbol filogentico universal (Bacteria, Archae, Eucarya).
Los microorganismos en el medio ambiente (hbitats, poblaciones, comunidades).
Requerimiento de un laboratorio para estudios microbiolgicos. Operaciones bsicas. Tcnica asptica. Cultivo
puro.

II. Biologa celular microbiana: la clula procariota
Morfologa y tamao de las bacterias. Composicin y funcin de las estructuras celulares: material gentico,
envolturas (membrana citoplasmtica, pared celular, envoltura externa en bacterias Gram negativas y otras
estructuras superficiales: cpsula, capa mucosa y capa S, estructuras citoplasmticas: ribosomas y grnulos
citoplasmticos, apndices: flagelos, fimbrias, pili sexual). Conceptos bsicos de gentica bacteriana: herencia,
intercambio y adquisicin de informacin gentica. Esporas bacterianas: estructura y propiedades. Formacin de
endosporas y germinacin. Las bacterias como agentes patgenos. Mecanismos generales de patogenicidad.
Concepto de factores de virulencia.

III. Biologa celular microbiana: Hongos filamentosos y hongos unicelulares
Caractersticas generales de los hongos. Hongos filamentosos, hongos unicelulares y setas. Estructuras celulares:
composicin y funcin. Principales criterios utilizados en la clasificacin de hongos. Principales gneros asociados a
biodeterioro de alimentos. Las levaduras en la industria alimentaria.

IV. Nutricin y metabolismo
Nociones de metabolismo y energtica celular. Mecanismos de obtencin de energa: fermentacin, respiracin
aerbica y anaerbica, fotosntesis. Utilizacin de la energa en biosntesis. Composicin qumica de las clulas.
Requerimientos nutricionales: fuente de carbono, nitrgeno, azufre, etc. Factores orgnicos de crecimiento. Medios
de cultivo. Concepto y utilidad. Medios sintticos y complejos. Medios selectivos y diferenciales, medio mnimo y
medio enriquecido. Concepto de sistema cerrado y cultivo continuo.

V. Crecimiento microbiano
Ciclo celular bacteriano. Divisin celular. Definicin de crecimiento. Mtodos empleados en la medicin del
crecimiento. Curva de crecimiento: fases, velocidad de crecimiento. Factores que afectan el crecimiento y sobrevida
de los microorganismos (contenido de nutrientes, pH, actividad de agua, potencial redox, humedad relativa,
atmsfera, temperatura).

VI. Muerte de los microorganismos
Control de crecimiento microbiano: agentes fsicos y qumicos. Esterilizacin, desinfeccin y sanitizacin. Curvas
de muerte. Parmetros. Eliminacin de priones.
Agentes desinfectantes: clasificacin desde el punto de vista qumico. Cintica de accin desinfectante, constantes
del proceso: velocidad de muerte, coeficiente de concentracin y temperatura. Mtodos de ensayo de agentes
desinfectantes, controles de potencia y efectividad. Valoracin.

VII. Taxonoma
Nomenclatura e identificacin de microorganismos. Utilizacin de pruebas bioqumicas y tcnicas moleculares para
la deteccin e identificacin de microorganismos. Clasificacin de los microorganismos. Sistemas de identificacin
clsicos y numricos. Concepto de taxonoma e identificacin polifsica.
Nociones de epidemiologa molecular. Utilizacin en el seguimiento de cadenas de contaminacin y caracterizacin
de microorganismos empleados en produccin.
Colecciones de cultivo. Preservacin de microorganismos.

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MODULO II: MICROBIOLOGIA APLICADA A LOS ALIMENTOS

VIII. Microorganismos y alimentos
Importancia de los microorganismos en la alteracin y conservacin de los alimentos. Los microorganismos como
agentes de biodeterioro y de enfermedades transmitidas por los alimentos (ETAs). Rol de los microorganismos en la
elaboracin de alimentos.

IX. Principales grupos bacterianos de inters en los alimentos
Cocos Gram positivos (estreptococos y estafilococos), enterobacterias, bacilos Gram positivos formadores de
endosporas, bacterias del cido lctico, bacterias del cido actico. Microorganismos proteolticos y lipolticos.
Microorganismos indicadores.

X. Ecologa microbiana de los alimentos
Factores que afectan el crecimiento y supervivencia de los microorganismos en los alimentos. Factores intrnsecos,
extrnsecos, implcitos y de procesamiento. Los alimentos como ecosistemas. Mecanismos de adaptacin de los
microorganismos a diferentes factores de estrs. Homeostasis. Interaccin de factores. Teora de las barreras
mltiples.

XI. Enfermedades transmitidas por los alimentos
Agentes bacterianos de enfermedades transmitidas por los alimentos: Staphylococcus aureus, Clostridium
perfringens, Clostridium botulinum, Bacillus cereus, Salmonella, Shigella, Escherichia coli (diferentes tipos),
Yersinia enterocolitica, Listeria monocytogenes, Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus, Campylobacter y otros
patgenos menos frecuentes. El microorganismo y sus caractersticas. Aislamiento e identificacin. Mecanismos de
patognesis. Caractersticas de la enfermedad. Alimentos involucrados. Incidencia. Prevencin y control.
Epidemiologa de las enfermedades transmitidas por los alimentos.

XII. Enfermedades transmitidas por los alimentos
Agentes no bacterianos de enfermedades transmitidas por los alimentos. Hongos toxicognicos. Parsitos. Virus.
Agentes de encefalopatas espongiformes (priones).

XIII. Deterioro microbiano de los alimentos
Microflora natural de diferentes tipos de alimentos. Fuentes de contaminacin. Asociaciones microbianas
caractersticas. El deterioro como consecuencia del metabolismo microbiano. Alteraciones microbianas de la leche y
productos lcteos. Deterioro de carnes frescas y procesadas, aves, pescados y huevos. Alteraciones microbianas de
los alimentos vegetales: frutas, hortalizas y cereales.

XIV. Control microbiolgico de los alimentos
Programas de muestreo para el anlisis microbiolgico de los alimentos. Planes de dos clases. Planes de tres clases.
Eleccin del plan de muestreo en funcin de la severidad frente a diversos riesgos microbiolgicos. Concepto de
categora. Aplicacin de los criterios microbiolgicos para diferentes tipos de alimentos e ingredientes.

XV. Microbiologa predictiva
Modelos matemticos para predecir el comportamiento de los microorganismos en los alimentos. Uso de los
modelos y su relacin con la vida til y la inocuidad de los alimentos. Evaluacin del riesgo microbiolgico.

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BIBLIOGRAFIA

Brock, T.D. & Madigan, M.T. Microbiologa, 6 Edicin. Prentice Hall Hispanoamericana. Mxico, 1993.

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Ed. University of
Toronto Press, 1978.

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Ed. Blackwell Scientific Publications, Oxford, 1986.

ICMSF Microorganisms in Foods. 5. Microbiological Specification of Food Pathogens, Blackie, London, 1996.

Adams, M.R. & Moss, M.O. Food Microbiology. The Royal Society of Chemistry, Cambridge, 1995.

Doyle, M.P., Beuchat, L.R. & Montville, T.J. (Eds.). Food Microbioloy. Fundamentals and Frontiers. ASM Press,
Washington D.C., 1997.

Frazier, W.C. & Westhoff, D.C. Microbiologa de los Alimentos, Editorial Acribia, Zaragoza, 1993.

Pitt, J.I. & Hocking, A.D. Fungi and Food Spoilage. 2
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Beuchat, L.R. (Ed.). Food and beverages mycology. 2
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Vanderzant, C. & Splittstoesser, D. (Eds.). Compendium of methods for the microbiological examination of foods
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Ed. APHA, 1992.

Mossel, D.A.A. & Moreno Garca, B. Microbiologa de los Alimentos. Ed. Acribia, Zaragoza, 1985.

Bourgeois, C.M., Mescle, J.F. & Zucca, J. Microbiologa Alimentaria, Volumen I y II. Ed. Acribia, Zaragoza,
1994.

Eley, R. (Ed.). Intoxicaciones alimentarias de etiologa microbiana. Ed. Acribia, Zaragoza, 1990.
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MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS

INDICE DE CONTENIDOS

TRABAJO PRACTICO N 1: Staphylococcus aureus, Salmonella, Clostridium perfringens ............................... 6
Staphylococcus aureus ............................................................................................................................................ 6
Salmonella spp. ....................................................................................................................................................... 7
Clostridium perfringens ........................................................................................................................................ 10
TRABAJO PRACTICO N 2: Anlisis microbiolgico de agua........................................................................... 14
TRABAJO PRACTICO N 3: Anlisis microbiolgico de quesos ........................................................................ 17
Listeria monocytogenes.............................................................................................................................................. 25
Escherichia coli O157:H7 ......................................................................................................................................... 28
GUIAS DE ESTUDIO .............................................................................................................................................. 31
FUNDAMENTOS TERICOS ............................................................................................................................... 37
MUESTREO PARA ANALISIS MICROBIOLOGICOS................................................................................. 37
RECOLECCION Y MANIPULEO DE LAS MUESTRAS............................................................................... 41
BACTERIAS AEROBIAS MESOFILAS TOTALES ....................................................................................... 42
PROCEDIMIENTOS GENERALES PARA EL RECUENTO EN PLACA DE BACTERIAS AEROBICAS
TOTALES............................................................................................................................................................. 43
NUMERO MAS PROBABLE............................................................................................................................. 48
BACTERIAS COLIFORMES, COLIFORMES A 45C Y E. COLI................................................................. 50
BACTERIAS PSICROTROFICAS.................................................................................................................... 51
DIRECCIONES UTILES......................................................................................................................................... 53
ANEXO: NDICE ..................................................................................................................................................... 54
TABLAS................................................................................................................................................................ 57
METODOS DE TINCION................................................................................................................................... 67
SOLUCIONES Y REACTIVOS.......................................................................................................................... 70
MEDIOS DE CULTIVO...................................................................................................................................... 72
REGLAS BSICAS DE HIGIENE Y SEGURIDAD PARA ALUMNOS DE LABORATORIOS DE
QUMICA Y BIOLOGA - PAUTAS DE ACTUACION EN CASOS DE EMERGENCIAS ......................... 116

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TRABAJO PRACTICO N 1

Staphylococcus aureus, Salmonella, Clostridium perfringens

Staphylococcus aureus

Preparacin de la muestra
Se entregar a los alumnos un homogenato preparado con 10 g de leche en polvo ms 90 ml de
agua peptona 0,1% sobre el cual se realizar el recuento del microorganismo.

Aislamiento
Se sembrar 0,1 ml del homogenato por duplicado en cajas de agar Baird-Parker. La siembra se
efectuar en superficie. Incubar a 37C, 48 h. Las colonias tpicas se pasarn a tubos de BHI
(Brain Heart Infusion) inclinado. Las colonias tpicas de S. aureus son circulares, suaves,
convexas, de 2 a 3 mm de dimetro en placas poco crecidas, de grises a negras, rodeadas de un
halo opaco y, frecuentemente de un halo claro ms externo. Ocasionalmente se encuentran cepas
no lipolticas que no presentan halos. La apariencia puede ser seca y el color menos intenso si
proviene de un alimento congelado o desecado.

Pruebas de identificacin

De los cultivos aislados del alimento se realizar:
1) Tincin de Gram.

2) Prueba de la Catalasa:
Se emulsiona un ansa de cultivo en una gota de H
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O
2
10% sobre portaobjetos. La efervescencia
causada por la liberacin de O
2
indica la presencia de catalasa.

3) Siembra por estras en Agar Manita (Medio 110 para estafilococos) de las cepas de
Staphylococcus. Incubar a 37C, 48 h. Revelar con prpura de bromocresol para la fermentacin
del manitol. Revelar con solucin saturada de sulfato de amonio o con HCl diluido para
evidenciar la gelatinlisis.

4) Prueba de la Coagulasa:
Colocar 0,5 ml de plasma citratado de conejo o humano, diluido en solucin fisiolgica, en un
tubo de ensayo pequeo. Agregar un ansa de cultivo o 0,5 ml de cultivo en caldo e incubar a
37C.
La aparicin de grumos o cogulos en el trmino de 1 a 4 horas indica que la cepa es coagulasa
(+).
El cogulo formado debe ser firme y organizado (3+) o que no se cae al invertir el tubo (4+).
Paralelamente hacer un blanco sin sembrar y un testigo con cepa de estafilococo coagulasa (+).

5) Prueba de la Termonucleasa:
Las placas de Baird-Parker en las que se observan colonias tpicas se colocan en estufa de 60C
durante 2 h para inactivar las nucleasas termosensibles. Luego de la inactivacin verter en cada
placa 10 ml de TDA (agar con ADN y azul de toluidina) fundido. Incubar a 37C durante 1 o 2
h. La hidrlisis del DNA se evidencia por la aparicin de halos claros alrededor de las colonias.
7
Salmonella spp.

Enriquecimiento no selectivo
Se incubar un homogenato realizado con 25 g de leche en polvo y 225 ml de Caldo Lactosado
16 h a 37
o
C.

Enriquecimiento selectivo
Se efectuar en paralelo en dos medios de cultivo. Se sembrar 1 ml del caldo de
enriquecimiento no selectivo en 10 ml de Caldo Selenito Cistina y en 10 ml de Caldo
Tetrationato respectivamente. Se incubar el Caldo Selenito Cistina 18 h a 37
o
C y el Caldo
Tetrationato 18 h a 43C.

Aislamiento
Medios slidos de aislamiento. Observacin de colonias tpicas.
A partir de cada tubo del enriquecimiento selectivo sembrar por estra en:
1) Agar XLD (Xilosa Lisina Desoxicolato)
2) Agar Bismuto-Sulfito
3) Agar Verde Brillante (BPLS)
Incubar las placas invertidas a 37C durante 24 h. Observar las colonias resultantes.

Las colonias tpicas de Salmonella spp. son:
Agar XLD: colonias pequeas, color rosa con o sin centro negro.
Agar Bismuto-Sulfito: colonias con centro negro, borde claro, precipitado negro con brillo
metlico alrededor (ojo de conejo u ojo de pez).
Agar Verde Brillante: colonias pequeas, translcidas o incoloras. El medio a su alrededor vira
al rojo.
Las colonias tpicas se transfieren a Agar Nutritivo inclinado y se incuban a 37C durante 24 h.

A partir de cada cultivo puro
1) Realizar tincin de Gram.
2) Prueba de oxidasa.
3) TSI. Sembrar por puncin y en superficie. Incubar a 37C, 24 h.
4) LIA. Sembrar por puncin y en superficie. Incubar a 37C, 24 h.
5) Caldo urea. Sembrar e incubar a 37C 24 h.
6) Prueba de la -galactosidasa: a partir de un cultivo en agar inclinado, tomar un ansa bien
cargada y emulsionarla en 0,2 ml de solucin salina fisiolgica hasta conseguir una suspensin
densa. Colocar un disco de ONPG. Incubar a 37C por 20 minutos. Observar hasta las 4 horas de
incubacin para dar un informe negativo. El color amarillo indica que la reaccin es positiva.
7) Produccin de Indol. Inocular un tubo de caldo triptona. Incubar 24 h a 37C.
Investigacin de Indol Tcnica de Kovacs:
Agregar al cultivo 0,2-0,3 ml de reactivo y agitar. Esperar unos minutos.
Coloracin roja en la parte superior del tubo indica formacin de Indol (+).
8) Produccin de acetil metil carbinol y/o rojo de metilo. Inocular un tubo de caldo Clark y
Lubs (RMVP). Incubar 24 h a 37C.
Investigacin de acetil metil carbinol Tcnica de Voges Proskauer:
Separar una alcuota del cultivo en un tubo y agregar, respetando el orden:
8
- 0,6 ml de -naftol al 5% y
- 0,2 ml de KOH al 40%
Agitar el tubo suavemente para exponer el medio al oxgeno atmosfrico y oxidar la acetona
(acetil metil carbinol) y permitir el desarrollo de color. Dejar descansar por lo menos 10-15
minutos. De ser necesario agregar unos cristales de creatina.
El mximo desarrollo de color se observa luego de dos horas.
Color rosado en la superficie: produccin de acetona (+), VP (+).
Color amarillo o cobrizo: no produccin de acetona, VP (-).

Investigacin de acidez Prueba del Rojo de Metilo:
Incubar 48 h ms a 35C despus de la prueba de Voges-Proskauer. Agregar 5 gotas de
reactivo rojo de metilo al cultivo y observar inmediatamente.
Color rojo indica acidez (+).
Caractersticas del indicador Rojo de Metilo:
pH< 4,4 rojo
4,4 < pH < 6 rango de viraje del indicador
pH> 6 amarillo

Resultados tpicos de Salmonella spp.:
1) Bacilo coco Gram negativo sin esporas
2) Oxidasa (-)
3) TSI: profundidad: amarillo o negro, con o sin ruptura del agar por formacin de gas/
superficie inclinada: rojo o sin variacin. La mayora de las cepas de Salmonella son lactosa
(-) y sacarosa (-).
4) LIA: profundidad: violeta o negro (negro en la mayora de los casos) /superficie inclinada:
violeta. Salmonella es lisina decarboxilasa (+). Excepcin: Salmonella paratyphi A:
profundidad: amarillo /superficie inclinada: violeta.
5) Caldo Urea: medio sin cambio de color. Salmonella es siempre ureasa negativa.
6) -galactosidasa: (-), sin cambio de color. (El (+) se manifiesta por la aparicin de color
amarillo).
7) Indol (-).
8) Voges Proskauer (-) Rojo de Metilo (+).

Identificacin serolgica de Salmonella spp.

Toda cepa sospechosa de Salmonella debe identificarse bioqumicamente antes de efectuar el
anlisis serolgico. De lo contrario aglutinaciones positivas podrn ser originadas por otros
grmenes que poseen estrecha relacin antignica (Arizona - Citrobacter).
Sueros polivalentes somticos de Salmonella
Los sueros polivalentes somticos son 6: OS-A, OS-B, OS-C, OS-D, OS-E, OS-F.
Cabe sealar que los sueros OS-A y OS-B permiten identificar alrededor del 98% de los
serotipos ms frecuentes de Salmonella.

Tcnica:
Aglutinacin somtica:
-Preparacin del antgeno: utilizar un cultivo de estras de 24 h de incubacin a 37C. Suspender
el crecimiento de la estra con 1 ml de solucin fisiolgica.
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-Reaccin: sobre lmina de vidrio depositar una gota de c/u de los 2 sueros polivalentes
somticos y los monovalentes. Colocar al lado de cada suero, una gota de suspensin antignica.
Mezclar con un ansa previamente flameada y enfriada.
-Lectura: debe ser inmediata y no despus de 5 minutos. Las reacciones tardas o dudosas no
deben considerarse.
Aglutinacin flagelar:
-Preparacin del antgeno: a partir de una colonia de Salmonella, hacer un cultivo de 24 h en
caldo. Luego agregar igual volumen de solucin formolada al 5%.
-Reaccin: en distintos tubos de ensayos colocar una gota de cada uno de los sueros polivalentes
y monovalentes ciliares. Agregar en cada uno 0,5 ml de la suspensin antignica. Incubar en
bao mara a 50C.
-Lectura: se efectuar al cabo de una hora de incubacin. Debe considerarse nicamente la
aglutinacin de tipo ciliar (flculos esponjosos, fcilmente disociables).

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Clostridium perfringens

Preparacin de la muestra
Se entregar a los alumnos un homogenato preparado con 10 g de leche en polvo ms 90 ml de
agua peptona 0,1% sobre el cual se realizar el recuento del microorganismo.

Aislamiento
Transferir 1 ml del homogenato a cada una de 2 placas con 10 ml de Agar TSC (Triptona-sulfito-
cicloserina) o TSN (Triptona-sulfito-neomicina) o SPS (sulfito-polimixina-sulfadiazina).
Adicionar 15 ml ms de agar y mezclar. Incubar a 37C, 48 h en anaerobiosis.
Colonia tpica: colonia negra aislada.
Las colonias tpicas se transfieren a Caldo tioglicolato y se incuban a 37C, 24 h en anaerobiosis.

A partir de los cultivos aislados del alimento se realizar:

1) Coloracin de Gram: realizar la tcnica descripta en la gua de reactivos y medios de cultivo.
Observar forma y tincin de las clulas vegetativas, forma y disposicin de las esporas.

2) Coloracin de esporas: realizar la coloracin de verde de malaquita. Observar las esporas.

3) Utilizacin de azcares: sembrar 0,2 ml del cultivo en cada uno de los tubos de caldo con
azcares (salicina-rafinosa-etc.), sin burbujear. Incubar 48 h a 37C. Agregar unas gotas de
indicador. Observar acidez y/o gas.

4) Reduccin de nitrato/movilidad: sembrar una ansada por puncin en un tubo de agar
semislido de nitrato. Incubar 24 h a 37C. Agregar unas gotas de los reactivos. Observar los
resultados.

5) Hidrlisis de la gelatina: sembrar 0,2 ml del cultivo en el fondo de un tubo con agar gelatina-
lactosa, sin burbujear. Incubar 24 h a 37C. Enfriar en hielo y observar el resultado.

6) Leche: sembrar 0,2-0,5 ml del cultivo en un tubo con leche. Incubar 24 h a 37C. Observar
coagulacin y degradacin del cogulo, por digestin de casena. Observar formacin de gas.

7) Esporulacin: sembrar 0,2 ml del cultivo en caldo Duncan-Strong al fondo y sin burbujear.
Incubar 24 h a 37C. Realizar tincin de esporas.

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14

Anlisis microbiolgico de agua

Toma de muestra y preparacin de las diluciones
Utilizar frascos estriles de capacidad adecuada para la cantidad de agua necesaria para realizar los
anlisis. Si se supone la presencia de cloro o cloraminas en el agua, agregar 100 mg de tiosulfato de
sodio por litro de muestra en los frascos antes de su esterilizacin. Si pudieran hallarse presentes
metales pesados proceder de igual forma empleando 572 mg de EDTA por litro de muestra. Realizar
diluciones decimales sucesivas empleando como diluyente agua peptona 0,1% (9060. St. Meth. 18th Ed.
1992).

Recuento total de bacterias aerobias mesfilas
Sembrar en Agar para Recuento en Placa (APC). En la mayora de las aguas potables los recuentos
adecuados se logran sembrando 1 y 0,1 ml del agua tal cual y 1 y 0,1 ml de la dilucin 1/100. Realizar
como mnimo dos diluciones sucesivas por duplicado. Incubar a 37
o
C por 24 h. Informar UFC de
aerobios mesfilos/ml. (9215. St. Meth. 18th. Ed.1992).

Determinacin de coliformes totales por la tcnica de fermentacin en tubos mltiples (NMP)
Esquema del mtodo 9221. St. Meth. 18th. Ed. 1992.

Inocular tubos de fermentacin para NMP
con Caldo Lauril Sulfato. Incubar por 24 h a 35
o
C.

(1) (2)
Crecimiento con produccin de gas Crecimiento sin produccin gas
Transferir para confirmacin a Caldo Verde Incubar 24 h +
Brillante Bilis Lactosa. Incubar 48 h a 35
o
C.

(a) (b)
Produccin de gas + Produccin de gas -
PRESENCIA DE AUSENCIA DE
COLIFORMES COLIFORMES

Ensayo presuntivo
Se inoculan series de 5 tubos de por lo menos 3 diluciones decimales sucesivas (Generalmente 10, 1 y
0,1 ml). Si el inculo es igual o mayor a 10 ml se utiliza el medio de concentracin adecuada para no
diluir los nutrientes. Se incuban 24-48 h a 35
o
C.

Ensayo de confirmacin
Los tubos producen gas y/o crecimiento abundante se transfieren con ansa a tubos de fermentacin de
Caldo Verde Brillante Bilis Lactosa. Se incuban 48 h a 35
o
C.

Determinacin de E. coli por el mtodo de filtracin por membrana
Se filtra por membrana la cantidad necesaria de agua y se coloca el filtro en 25 ml de Caldo Lauril
Sulfato. Se incuba 4 h a 30
o
C y 14 h a 44
o
C (Directiva 95/131 CEE).
Produccin de gas y/o crecimiento abundante se confirma estriando en agar Endo.
15
A las colonias aisladas se les realizan las pruebas de IMViC y/o set de pruebas mltiples. Se informa
ausencia o presencia de E. coli en el volumen filtrado.

Determinacin de P. aeruginosa (Norma DIN 38411)
-Enriquecimiento:
a) Filtrar por membrana la cantidad adecuada de agua y colocar el filtro en 25 ml de Caldo Verde de
Malaquita.
b) Colocar la cantidad adecuada de agua en igual volumen de Caldo Verde de Malaquita doble
concentrado.
Incubar 48 h a 37
o
C.
-Aislamiento: Si se observa crecimiento en el caldo de enriquecimiento sembrar por estra en placas de
Agar Cetrimida. Incubar 48 h a 42
o
C.
-Confirmacin: de las colonias de agar cetrimida sembrar en:
Agar F (formacin de fluorescena), Agar P (formacin de piocianina) y Agar Acetamida.
Realizar la prueba de oxidasa.

PATRON MICROBIOLOGICO

Requerimientos Microbiolgicos del CAA
Art. 982 Agua potable de suministro pblico y de uso domiciliario.
Art. 983 Agua de bebida potabilizada envasada.
Bacterias mesfilas (APC 24 h a 37C): mx. 500 UFC/ml
Bacterias coliformes (NMP 48 h a 37C en Caldo Lauril Sulfato o Caldo Mac Conkey): igual o menor
que 3/100 ml.
E. coli: ausencia en 100 ml
P. aeruginosa: ausencia en 100 ml

16
ANALISIS MICROBIOLOGICO DE AGUA POTABLE

NOMBRE Y DIRECCION DEL LABORATORIO:

Fecha de informe:

DATOS DEL SOLICITANTE
Nombre:
Direccin:
TE/Fax:
Correo electrnico:

DATOS DE LA MUESTRA
Tipo de muestra:
Lugar de toma de muestra:
Caractersticas de la muestra*:
Fecha de toma de muestra:
Fecha de inicio de anlisis:
*Consignar datos relevantes, por ejemplo si es refrigerada, congelada, temperatura de recepcin,
si tiene signos de alteracin, etc.

RESULTADOS DE LOS ANALISIS

Recuento total de bacterias aerobias mesfilas (Met., 9060 St. Meth 18th Ed. 1992):
Recuento de coliformes totales NMP (Met. 9221 St. Meth 18th Ed. 1992):
Determinacin de E. coli en 100 ml (Directiva 95/131 CEE):
Determinacin de P. aeruginosa en 100 ml (Norma DIN 38411):

CONCLUSIONES

FIRMA Y ACLARACION DEL ANALISTA
17

Anlisis microbiolgico de quesos

a) Toma de muestra (FAO, Manual para el control de calidad de los alimentos. 4. Anlisis
Microbiolgico. 1981)
Las muestras se toman de los recipientes originales sin abrir, o de porciones representativas de
los recipientes abiertos, utilizando para ello instrumentos apropiados, como cucharas, cuchillos o
esptulas esterilizadas. Las muestras se deben proteger de la contaminacin, enfriar a 0-4,4C y
enviar rpidamente al laboratorio para ser examinadas. De los quesos duros y semiduros se
deben tomar por lo menos cinco muestras de diferentes partes del queso, cada una de cinco
gramos como mnimo.

b) Preparacin de la muestra y diluciones (FAO, Manual para el control de calidad de los
alimentos. 4. Anlisis Microbiolgico. 1981)
Se depositan aspticamente 10 g de queso en un recipiente estril y se aaden 90 ml de solucin
de citrato de sodio al 2% previamente calentada (40-45C). Se dispersa completamente en el
Stomacher o se mezcla durante dos minutos. Se obtiene la dilucin 1:10.
Se realizan las diluciones necesarias. Se transfiere 1 ml de la primera dilucin bien mezclada y
se agregan 9 ml citrato de sodio al 2%. Agitar para homogeneizar. Repetir esta operacin para
obtener las diluciones sucesivas.

c) Metodologa de anlisis.

c 1) Recuento de coliformes a 30C
c 2) Recuento de coliformes a 45C
c 3) Recuento de E. coli
c 4) Recuento de mohos y levaduras
c 5) Recuento de Staphylococcus aureus
c 6) Determinacin de Salmonella en 25 g

c 1) Recuento de coliformes totales (FIL 73 A:1985)
El recuento de coliformes totales puede realizarse por recuento en placa con medio slido o en
medio lquido (por la tcnica de NMP: nmero ms probable).

c 1.1) Recuento en placa. Agar Bilis Rojo Violeta- lactosa (ABRV-lactosa)
Sembrar por duplicado 1 ml de las diluciones (-1), (-2), (-3) en placas de Petri. Agregar
aproximadamente 12 ml de agar ABRV fundido a 44-46C. Mezclar. Dejar solidificar
completamente y agregar entonces 4 ml ms de medio fundido. Dejar enfriar e incubar las placas
invertidas a 30C por 22-26 h.
Seleccionar las diluciones que presenten entre 15 y 150 colonias. Contar las colonias rojas
oscuras con dimetro de por lo menos 0,5 mm, caractersticas de bacterias coliformes.
Confirmacin: Tomar entre 5 y 10 colonias del ABRV y transferirlas a tubos de fermentacin
con caldo Verde Brillante Lactosa 2% de Sales Biliares (cada colonia a un tubo distinto). Incubar
a 30C por 22-26 h. Se consideran positivas aquellas colonias que den produccin de gas.
El resultado se calcula en base al nmero de colonias confirmadas. Se expresa como UFC de
coliformes totales/g.
18
La confirmacin de las colonias es especialmente recomendable para el caso de alimentos que
contengan otros azcares distintos de lactosa.

c 1.2) Tcnica del nmero ms probable (NMP).

Prueba presuntiva
Inocular por triplicado 1 ml de cada una de las diluciones (-2), (-3), (-4), (-5) en tubos de
fermentacin con caldo Verde Brillante Lactosa 2% de Sales Biliares. Incubar a 30C por 48 h.
Se consideran positivos aquellos tubos que presenten formacin de gas en la campanita de
Durham.

Prueba de confirmacin
Estriar cada tubo presuntamente positivo en agar EMB (agar eosina azul de metileno). Incubar a
30C por 22-26 h. Se consideran colonias de coliformes las de aspecto oscuro/rojo/rosado y/o
mucoso, con o sin brillo metlico.
Registrar el nmero de tubos positivos de cada dilucin. Seleccionar la combinacin de
diluciones positivas que resulte ms apropiada. Con la ayuda de una tabla de Nmero Ms
Probable (NMP), calcular el NMP de coliformes totales/g de muestra, teniendo en cuenta los
tubos positivos y las diluciones empleadas.

c 2) Recuento de coliformes a 45C (APHA, 1992)
A partir de los tubos positivos c.1.2 (coliformes a 30C, por NMP), inocular un tubo de
fermentacin de caldo EC. Incubar 24 h a 45C. La produccin de gas en la campanita de
Durham confirma coliformes a 45C.
Registrar el nmero de tubos positivos de cada dilucin. Seleccionar la combinacin de
diluciones positivas que resulte ms apropiada. Con la ayuda de una tabla de Nmero Ms
Probable (NMP), calcular el NMP de coliformes a 45C/g de muestra, teniendo en cuenta los
tubos positivos y las diluciones empleadas.

c 3) Recuento de Escherichia coli (Bacteriologycal Analytical Manual, 1998. Actualizado a
2001)
Estriar una ansada de cada uno de los tubos positivos en EC en placas de EMB. Incubar 18- 24 h
a 35C.
Examinar las placas para observar colonias tpicas de Escherichia coli, con centro oscuro y
planas, con o sin brillo metlico. Transferir colonias tpicas a tubos de agar nutritivo inclinado e
incubar 24 h a 35C. Sobre estos cultivos, efectuar pruebas morfolgicas y bioqumicas de
confirmacin (IMViC y produccin de gas de lactosa) o set de pruebas mltiples.
Caractersticas morfolgicas y pruebas bioqumicas
Sobre cada cultivo puro realizar:
1 - Tincin de Gram.
2 - Prueba de oxidasa.
3 - Prueba de indol.
Inocular un tubo de caldo triptona. Incubar 24 h a 35C.
Investigacin de Indol -Tcnica de Kovacs:
Agregar al cultivo de 0,2-0,3 ml de reactivo y agitar. Esperar unos minutos.
Coloracin roja en la parte superior del tubo indica formacin de Indol (+).
19
4 - Prueba de Voges Proskauer y de Rojo de Metilo.
Inocular un tubo de caldo Clark y Lubs (RMVP). Incubar 48 h a 35C.
Investigacin de acetil metil carbinol - Tcnica de Voges-Proskauer
Separar una alcuota del cultivo en un tubo y agregar, respetando el orden:
- 0,6 ml de - naftol al 5% y
- 0,2 ml de KOH al 40%
Agitar el tubo suavemente para exponer el medio al oxgeno atmosfrico y oxidar la acetona
(acetil metil carbinol) y permitir el desarrollo de color. Dejar descansar por lo menos 10-15
minutos. De ser necesario agregar unos cristales de creatina.
El mximo desarrollo de color se observa luego de dos horas.
Color rosado en la superficie: produccin de acetona (+), VP (+).
Color amarillo o cobrizo: no produccin de acetona, VP (-).

Investigacin de acidez - Prueba del Rojo de Metilo:
Incubar 24 h ms a 35C despus de la prueba de Voges-Proskauer. Agregar 5 gotas de
reactivo rojo de metilo al cultivo y observar inmediatamente.
Color rojo indica acidez (+).
Caractersticas del indicador Rojo de Metilo:
pH < 4,4 rojo
4,4 < pH < 6 rango de viraje del indicador
pH > 6 amarillo

5 - Prueba de citrato.
Inocular por estra un tubo de agar Citrato Simons. Incubar 24 h a 37C.
Investigacin de utilizacin de citrato: Los microorganismos que son capaces de utilizar el
citrato producen cambio de color en el medio (de verde a azul). Se considera citrato (+) el
desarrollo de color azul.

Resultados tpicos de Escherichia coli:
Bacilo coco Gram negativo sin esporas
Oxidasa (-) Voges Proskauer (-)
Indol (+) algunas cepas (-) Citrato (-)
Rojo de Metilo (+)

Escherichia coli puede presentar IMViC: ++-- (biotipo 1) o -+-- (biotipo 2), muy poco
frecuente.

c 4) Recuento de mohos y levaduras (Bacteriologycal Analytical Manual, 1998. Actualizado
a 2001)

Mtodo de siembra en superficie.
Pipetear aspticamente 0,1 ml de las diluciones (-1) y (-2) en placas con agar YGC o DRBC y
esparcir el inculo con esptula de vidrio, previamente flameada y enfriada.
Si se trata de alimentos con actividad de agua inferior a 0.95, se recomienda emplear agar DG18.
Plaquear cada dilucin por duplicado.
Incubar las placas en oscuridad a 25C. No invertir las placas ni apilar ms de 3 placas.
Contar las placas a los 5 das de incubacin. Si no hubiera crecimiento, reincubar otras 48 h.
Contar placas que contengan entre 10-150 colonias.
20
El lmite superior para un buen recuento depender del tipo de crecimiento que prevalezca,
hongos o levaduras, tamao de colonias, y deber ser decidido a discrecin del analista en cada
caso particular.

Notas:
1.- Eventualmente puede realizarse la siembra con el mtodo de vertido en placa (por ejemplo,
con agar YGC - extracto de levadura, glucosa y cloramfenicol). La tcnica de siembra en
superficie se considera ms conveniente que la de vertido en placa. En este ltimo caso, las
colonias de hongos en la superficie crecen ms rpido y, frecuentemente, enmascaran a las que
crecen debajo de la superficie, resultando enumeraciones menos exactas.
2.- El agar DRBC debe ser empleado nicamente en siembra en superficie.
3.- No mover las placas durante la incubacin hasta el recuento.
4.- Preferiblemente, no contar las placas antes de concluir el perodo de incubacin, porque la
manipulacin de placas puede provocar crecimiento secundario por las esporas que se hubieran
desprendido en el movimiento de la placa.
5.- Si se necesitara identificar las especies fngicas, aislarlas en agar PDA (papa dextrosa) o MA
(Agar Malta).

c 5) Recuento de Staphylococcus aureus (FIL 145:1990)
Sembrar por duplicado 0,1 ml de las diluciones (-1) y (-2) en superficie de placas de agar Baird
Parker perfectamente secas. Distribuir con una esptula de Drigalsky cuidadosamente (tener la
precaucin de enfriar bien la esptula para no matar los microorganismos). Dejar secar las placas
tapadas sin invertir a temperatura ambiente por aproximadamente 15 minutos. Una vez secas,
incubarlas invertidas a 371C durante 24-48 h.
Tomar para enumerar placas con no ms de 150 colonias. Seleccionar un nmero representativo
de colonias tpicas y atpicas; y transferirlas a tubos de caldo infusin cerebro-corazn. Incubar a
37C 35C por 20 a 24 h.
Las colonias tpicas son negras, brillantes y convexas rodeadas de una zona clara, generalmente
un halo opaco rodea a la colonia por dentro de la zona clara.

Identificacin y confirmacin
Sobre los cultivos puros de 20-24 horas, realizar:
1 - Tincin de Gram
2 - Catalasa
3 - Coagulasa (comparar con cepa patrn)
Agregar 0,1 ml del cultivo a aproximadamente 0,3 ml de plasma de conejo reconstituido en
un tubo estril. Incubar a 35-37C. Examinar despus de 4 a 6 horas. El cogulo formado
debe ser firme y organizado (3+) o que no se cae al invertir el tubo (4+).
Realizar un control empleando 0,1 ml de caldo BHI estril en lugar del cultivo. Para que el
ensayo sea vlido, no debe observarse ningn signo de coagulacin.
4 - Complementariamente puede realizarse la prueba de la termonucleasa sobre la misma placa
de Baird Parker.

S. aureus coagulasa positiva son cocos Gram positivos, catalasa positivo, coagulasa positivo (3 o
4+) y termonucleasa positivo.

Informar UFC de S. aureus coagulasa positivo/g de muestra.

21
c 6) Determinacin de Salmonella (FIL 93 A: 1985)
Preenriquecimiento en medio lquido
Pesar aspticamente 25 g de muestra en un erlenmeyer u otro recipiente asptico. Agregar 225
ml de agua peptonada tamponada a 45C. Mezclar hasta lograr una buena dispersin. Asegurarse
que la temperatura no supere los 45C. Incubar a 37C durante 16-20 h.
Enriquecimiento en medio lquido
Transferir 10 ml de enriquecimiento a 100 ml de caldo tetrationato (Mller Kauffmann). Incubar
a 430,5C durante 18-24 h.
Transferir 10 ml del preenriquecimiento a 100 ml de caldo selenito-cistina. Incubar a 371C
durante 18-24 h.
Aislamiento en medio slido
A partir de cada uno de los enriquecimientos estriar una placa de agar Verde Brillante-Rojo
Fenol (agar BPLS) y una de agar Bismuto Sulfito (cuatro placas en total). Incubar las placas
invertidas a 371C durante 20-24 h.
De ser necesario, seguir incubando los caldos de enriquecimiento 18-24 h ms y volver a estriar
en los medios de aislamiento.
Si al cabo del perodo de incubacin el crecimiento en las placas fuera escaso, reincubar por 18-
24 h adicionales a la misma temperatura.
Examinar las placas para investigar la presencia de colonias tpicas de Salmonella. En agar
BPLS, las colonias son rosadas y el medio circundante rojo brillante. En agar Bismuto Sulfito,
las colonias tpicas son marrones a negras con brillo metlico. Algunas cepas forman colonias
verdosas.
Identificacin y confirmacin
De cada placa seleccionar cinco colonias sospechosas. Estriar en una placa de agar nutritivo para
que desarrollen colonias aisladas. Incubar a 371C durante 18-24 h. Al cabo de la incubacin,
seleccionar colonias aisladas para proseguir con las pruebas de confirmacin bioqumica y
serolgica.
Sobre el cultivo puro realizar:
- tincin de Gram
- oxidasa
Inocular los cultivos que resulten coco-bacilos Gram negativos y oxidasa negativos en los
siguientes medios.
- TSI: en superficie y en profundidad
- Medio LIA
- Medio para ureasa (puede ser BAM)
- -galactosidasa
- Reaccin de Voges Proskauer
- Reaccin de indol
De ser posible confirmar el resultado con un sistema de pruebas mltiples.

Confirmacin serolgica (Aglutinacin somtica)
Emplear una cepa patrn de Salmonella para controlar los medios de cultivo y los medios
empleados en las pruebas de confirmacin e identificacin.
Preparacin del antgeno: utilizar un cultivo de estras de 24 h de incubacin a 37C. Suspender
el crecimiento de la estra con solucin fisiolgica.
22
Reaccin: sobre lmina de vidrio depositar una gota de c/u de los 2 sueros polivalentes somticos
y los monovalentes. Colocar al lado de cada suero, una gota de suspensin antignica. Mezclar
con un ansa previamente flameada y enfriada.
Lectura: debe ser inmediata y no despus de 5 minutos. Las reacciones tardas o dudosas no
deben considerarse.
Informar ausencia o presencia de Salmonella en 25 g.
23
ANALISIS MICROBIOLOGICO DE ALIMENTOS

NOMBRE Y DIRECCION DEL LABORATORIO
....................................................................................................................................................................
Fecha de informe:............................................................................................................................................

DATOS DE CLIENTE
Nombre:......................................................Direccin................................................................................
TE/Fax:.....................................Correo electrnico:.............................................................................

DATOS DE LA MUESTRA
Tipo de muestra:.................................................................Marca...................................................................
Fecha de elaboracin y/o de vencimiento:.......................................................................................................
Lugar de elaboracin:.........................................N de lote.............................................................................
Caractersticas de la muestra*..........................................................................................................................
Fecha de toma de muestra:.................................Fecha de inicio de anlisis:..................................................
*Consignar datos relevantes, por ejemplo si es refrigerada, congelada, temperatura de recepcin, si tiene
signos de alteracin, etc.

RESULTADOS DE LOS ANALISIS
Recuento de coliformes a 30C Recuento en placa (FIL 73 A:1985):...........................................................
Recuento de coliformes a 30C NMP (FIL 73 A:1985):................................................................................
Recuento de coliformes a 45C (APHA 1992, cap.24):..................................................................................
Recuento de E. coli (BAM, 1998, act 2001):...................................................................................................
Recuento de mohos y levaduras (BAM, 1998, act 2001):...............................................................................
Recuento de Staphylococcus aureus coagulasa positiva (FIL 145:1990): .
Determinacin de Salmonella spp. en 25 g (FIL 93 A:1985):.........................................................................
Determinacin de Listeria monocytogenes en 25 g (FIL 143:1990):..............................................................

CONCLUSIONES DE LA MUESTRA
..........................................................................................................................................................................
..........................................................................................................................................................................
..........................................................................................................................................................................
..........................................................................................................................................................................

RESULTADOS DEL LOTE

Muestra
Determinaciones
I II III IV V
Coliformes a 30C/g
Coliformes a 45C/g
S. aureus/g
Salmonella/25 g
Listeria
monocytogenes/25 g

Conclusin del lote
..........................................................................................................................................................................
..........................................................................................................................................................................
Firma y cargo del responsable

24
PATRON MICROBIOLOGICO DE QUESOS
Res GMC 69/93 - Requisitos microbiolgicos para quesos (Incorporado al Cdigo
Alimentario Argentino por RES MS y AS N 3 del 11.01.95
(GMC: Grupo Mercado Comn, MERCOSUR; MS y AS: Ministerio de Salud y Accin Social)

3.3. Quesos cuartirolo, cremoso, criollo y Minas Frescal (46%< humedad < 55%):

Microorganismos Criterio de Aceptacin
Categora
ICMSF
Mtodos de ensayo
Coliformes/g (30C) n=5; c=2; m=10000; M=100000 5 FIL 73A: 1985
Coliformes/g (45C) n=5; c=2; m=1000; M=5000 5 APHA 1992, c. 24 (1)
Staphylococcus
coagulasa positiva/g
n=5; c=2; m=100; M=1000 5 FIL 145: 1990
Salmonella spp./25 g n=5; c=0; m=0 10 FIL 93A: 1965
Listeria monocytogenes/
25 g
n=5; c=0; m=0 10 FIL 143A: 1990
25

Listeria monocytogenes

Determinacin de Listeria monocytogenes (FIL 143: 1990)
Enriquecimiento primario:
Pesar aspticamente 25 g de muestra en un erlenmeyer u otro recipiente asptico. Agregar 225
ml de caldo de enriquecimiento (triptona soja con acriflavina, cicloheximida y cido nalidxico)
a 45C. Mezclar hasta lograr una buena dispersin. Asegurarse que la temperatura no supere los
45C. Incubar por 48 h a 30C.
Aislamiento en medio slido
A partir del caldo de enriquecimiento, estriar una placa de agar Oxford para obtener colonias
aisladas. Incubar las placas invertidas por 48 h a 37C. Las colonias tpicas de Listeria spp. estn
rodeadas de una zona marrn oscura o negra por hidrlisis de la esculina.
Resulta conveniente agregar otro agar de aislamiento. Estriar tambin una placa de agar
PALCAM: se incuba a 35C por 24-48 h. Las colonias tpicas de Listeria spp. son de color gris
verdoso con halo negro-parduzco (por hidrlisis de la esculina), sobre fondo rojo (porque no
fermenta manitol)
Identificacin de gnero Listeria
- Crecimiento tpico en agar triptona de soja - extracto de levadura
Seleccionar cinco colonias tpicas de cada placa de aislamiento y estriarlas en placas de agar
triptona de soja-extracto de levadura (las placas deben ser muy finas) para obtener colonias
aisladas. Incubar por 24 h a 37C o hasta que se desarrolle un buen crecimiento.
Examinar las placas con iluminacin de Henry.

Observacin de la placa con iluminacin de Henry

Al ser examinadas con luz de Henry, las colonias de Listeria spp. Muestran un color azul y una
superficie granular.
- Tincin, morfologa y caractersticas bioqumicas tpicas del gnero Listeria.
1) Realizar la tincin de Gram. Listeria spp. son bacilos asporgenos, cortos y delgados Gram
positivos.
Observar desde
Trpode Espejo
Haz de luz blanca
26
2) Prueba de la catalasa. Picar una colonia tpica y suspenderla en una solucin de H
2
O
2
al 3% en
una placa de vidrio (portaobjeto, por ejemplo). Listeria spp. son catalasa positiva y se observa
desprendimiento de burbujas de gas (oxgeno).
3) Otra caracterstica tpica es la movilidad de los cultivos incubados a 25-30C. Se puede
observar en un preparado en fresco suspendiendo una colonia tpica en solucin salina al 0,85%
(bacilos delgados y cortos con dbil rotacin y movimiento en forma de volteo). Tambin se
comprueba la movilidad, inoculando por puncin un agar movilidad (o agar SIM) e incubando
hasta 5 das a 25C. Se observa una movilidad tpica en forma de paraguas.

Transferir a agar triptona de soja con extracto de levadura las colonias que resulten ser cepas
bien aisladas y puras, bacilos cortos Gram positivos no formadores de esporas, catalasa (+) y de
movilidad caracterstica para proseguir con la identificacin.

Hemlisis. (Seleccin de especies hemolticas de Listeria)
Secar bien la placa de hemlisis antes de sembrar. Dibujar una grilla en la parte de abajo de la
placa de forma que queden entre 20 y 25 espacios por placa. Sembrar por puncin los cultivos
seleccionados anteriormente, uno en cada espacio, identificndolos. Conservar los cultivos puros
en agar triptona de soja con extracto de levadura.
Simultneamente inocular controles positivos y negativos (L. monocytogenes, L. ivanovii, L.
innocua). Despus de 48 h de incubacin a 37C, examinar las placas. L. monocytogenes
presenta zonas delgadas y dbiles de aclaracin (-hemlisis); L. ivanovii generalmente forma
una zona ancha y claramente delineada de -hemlisis y L. innocua no debe formar zona de
aclaracin alrededor de la puncin. Utilizar una luz brillante para examinar la hemlisis de los
cultivos en estudio y de los controles.

Identificacin de L. monocytogenes. Diferenciacin de otras especies hemolticas
A partir de los cultivos puros en agar triptona de soja extracto de levadura que hayan demostrado
hemlisis caracterstica de L. monocytogenes, transferir a caldo triptona de soja con extracto de
levadura e incubar 24 h a 37C. Este ser el inculo a emplear para las siguientes
determinaciones:
1) Fermentacin de ramnosa y de xilosa
Sembrar tubos de caldo de fermentacin de ramnosa y de xilosa. Incubar 7 das a 37C (las
reacciones positivas, viraje del indicador por produccin de cido, suelen verse entre las 24 y las
48 h de incubacin)
2) Test de Camp
Se realiza sobre una placa de agar sangre. Se inocula en forma de fina estra un cultivo fresco de
Staphylococcus aureus (S) y otra lnea paralela de un cultivo fresco de Rhodococcus equi (R). Se
requiere un inculo delgado y parejo, que se puede sembrar con un ansa recta o de rulo formando
un ngulo recto con el agar. De la misma forma, se estran transversalmente y sin llegar a
atravesar las estras ya hechas, los cultivos en estudio y los controles de Listeria monocytogenes,
L. seeligeri, L. ivanovii (las tres hemolticas) y L. innocua (no hemoltica) (ver esquema).
Una reaccin Camp positiva se observa por aumento de la hemlisis en la zona cercana a S.
aureus o R. equi. De cualquier forma la apariencia del resultado positivo depende del cultivo.
Una reaccin positiva con R. equi se ve como una zona ancha (5 a 10 mm) de hemlisis con
forma de punta de flecha. Se deben tomar como negativas las reacciones que den zonas angostas
(alrededor de 1 mm) de dbil hemlisis en la interseccin con R. equi. Una reaccin positiva con
S. aureus se ve como una zona pequea y redondeada de incremento de hemlisis que se
27
extiende solamente unos 2 mm desde la cepa de ensayo y entre la zona de dbil hemlisis debida
al crecimiento de la estra de S. aureus.

Resultados caractersticos de las especies hemolticas

Especies Camp Test Xilosa Ramnosa

S. aureus R. equi

L. monocytogenes + - - +
L. seeligeri + - + -
L. ivanovii - + + -

Se pueden realizar las siguientes pruebas complementarias: (reaccin caracterstica de Listeria
spp.)
- Hidrlisis de esculina (+)
- Utilizacin de glucosa: medio O/F (+)
- Fermentacin de manitol (-)
- Reduccin de nitrato (-)
- Rojo de Metilo-Voges Proskauer (+/+)
- Oxidasa (+)
L. seeligeri
L. monocytogenes
L. ivanovii
28
Escherichia coli O157:H7

Determinacin de Escherichia coli 0157:H7 (adaptado de USDA/FSIS Microbiology
Laboratory Guidebook 3rd Edition/1998. CHAPTER 5. DETECTION, ISOLATION AND
IDENTIFICATION OF ESCHERICHIA COLI O157:H7 AND O157:NM (NONMOTILE)
FROM MEAT PRODUCTS. (Revision # 2; 2-23-01). William C. Cray, Jr., Douglas O.
Abbott, Frankie J. Beacorn, and Steven T. Benson

Este mtodo se emplea para el anlisis de Escherichia coli O157:H7 y O157:NM en productos
crnicos crudos o listos para consumir. Est basado en un enriquecimiento en un caldo selectivo,
seguido por un ensayo rpido de screening, continuando con la separacin inmunomagntica
(IMS) en columnas paramagnticas y el aislamiento en medios altamente selectivos.
Escherichia coli O157:H7/NM es un patgeno con dosis infectivas muy bajas (la ingestin de
100 clulas puede causar la enfermedad). Trabajar con estas cepas demanda obligatoriamente el
uso de guantes y anteojos de proteccin. Asimismo, todas las superficies deben ser
perfectamente desinfectadas antes y despus del uso.

a) Enriquecimiento
Pesar 25 g de la muestra en una bolsa de Stomacher. Agregar 225 ml de caldo EC modificado
con novobiocina. Agitar por 2 minutos. Incubar sin agitacin a 352C por 20-24 h. Incluir
controles: uno positivo (cepa control de Escherichia coli O157:H7), uno negativo (cepa de
Escherichia coli no O157) y un medio sin inocular.
Se registrarn todas las reacciones observadas en los controles.

b) Test de screening. Ensayo de ELISA para Escherichia coli O157: H7/NM
Se emplean dispositivos comerciales de ensayos rpidos para demostrar la presencia de cepas
con antgeno O157 en el caldo de enriquecimiento (a).
Las muestras negativas se informan ausencia de Escherichia coli O157:H7/NM en 25
gramos y se descartan.
Las muestras positivas se consideran potenciales positivos. Se procede al aislamiento e
identificacin a partir del caldo de enriquecimiento en las bolsas de Stomacher.

c) Aislamiento
El aislamiento se realiza por IMS. Para tal fin se emplean pequeas esferitas magnticas
recubiertas con anticuerpo anti-E. coli O157. La metodologa recomienda Dynal Inc., Lake
Success, NY 11042 o equivalente. La muestra y los controles se ponen en contacto con estas
esferas inmunomagnticas y luego se hacen pasar por una columna de separacin que retiene las
esferas. Posteriormente se eluyen las esferas de cada columna y se siembran en el medio
selectivo. De esta forma se incrementa notablemente la sensibilidad del mtodo, comparado a la
forma tradicional de sembrado directo en medios de aislamiento.

Las placas de medio slido de aislamiento deben ser secadas en flujo laminar por 30 minutos
antes de ser sembradas. Se emplean tres placas por muestra positiva en screening y por cada
control.
Se procede al aislamiento en medio slido. Los medios se basan en dos caractersticas
diferenciales de la mayora de las cepas de E. coli O157: no fermentan sorbitol y no tienen
actividad -D-glucuronidasa.

29
Medios recomendados
a) Agar Mac Conkey-sorbitol (SMAC). El medio contiene sorbitol como azcar
fermentescible e inhibidores de flora no entrica. Las colonias son sorbitol negativas y
aparecen plidas, comparadas con las rosadas brillantes que son sorbitol positivas.
Cuando la muestra contiene una carga alta de coliformes se puede enmascarar la
presencia de E. coli O157:H7. Incluso, Escherichia hermanii y otras enterobacterias
pueden presentar fenotipos similares en SMAC y, por otra parte, Citrobacter freundii
puede aglutinar con suero O157, y, causar un falso positivo.
b) Agar HC (agar para cepas hemorrgicas). El medio contiene sorbitol y reactivo
fluorognico MUG (4 metil, umbeliferil, -D-glucurnido).
c) Agar Mac Conkey sorbitol-BCIG. El medio contiene sorbitol y un compuesto -D-
glucurnido cromognico.
d) Agar CT Mac Conkey sorbitol. El medio es similar al a), pero contiene agentes selectivos
(cefixime y telurito). Con el empleo de este medio se gana sensiblemente en selectividad,
inhibindose notablemente la flora acompaante. La colonia tpica es plida como en a).
e) Agar Rainbow O157: contiene sorbitol, novobiocina y telurito de potasio.
Se incuba a 24-26 h a 352C.
Se identifican las colonias caractersticas de E. coli O157:H7/NM y se les realiza el ensayo de
aglutinacin para O157 segn las indicaciones del proveedor del reactivo.
Se procede a la identificacin bioqumica para diferenciar E. coli O157 de organismos
competidores. Incluir TSI, celobiosa y medio de movilidad.

Reacciones caractersticas de Escherichia coli O157:H7

- TSI (amarillo/amarillo, H
2
S negativo)
- Fermentacin de sorbitol (negativo)
- Fermentacin de celobiosa (negativo)
- Caldo triptona (indol positivo)
- Medio RM-VP (RM: positivo; VP: negativo)
- Citrato de Simmons (negativo)
- Lisina decarboxilasa (positivo) *
- Ornitina decarboxilasa (positivo)*
- Medio decarboxilasa base (negativo)
- Medio movilidad (+/-)

Todos los medios se incuban a 35C. Los azcares deben leerse a las 24 horas.

*Los caldos decarboxilasa deben llevar un sello de vaselina. Los positivos son prpura (medio
bsico por decarboxilacin) y el negativo es amarillo (por acidificacin por fermentacin de la
glucosa del medio).

Confirmacin serolgica
Para confirmar la presencia de E. coli O157:H7/NM, analizar los cultivos con ensayos de
aglutinacin de ltex (RIM E. coli O157:H7 Ltex Test Kit, o equivalente), para probar los
antgenos O157 (somtico) y H7 (flagelar).

30
Confirmacin de toxinas Shiga/genes de toxina Shiga
Se confirma la presencia de toxinas Shiga en el cultivo aislado con un ensayo apropiado. Cuando
la presencia de toxinas no se confirma, se debe realizar la investigacin de genes para toxinas
Shiga (por PCR) para confirmar la presencia de E. coli O157:H7, o E. coli O157:NM.

Se considera confirmada la presencia de E. coli O157:H7, o E. coli O157:NM cuando hubo
confirmacin bioqumica, serolgica y de presencia de toxinas Shiga o de uno o ms genes de
toxina Shiga. Posteriormente, el aislado podr ser ensayado por PFGE (electroforesis de campos
pulsados) para evaluar la potencial asociacin epidemiolgica.
31
GUIAS DE ESTUDIO

GUIA DE ESTUDIO I

1. Cmo clasifica a los microorganismos de acuerdo a su temperatura ptima de crecimiento?
2. Cul es el pH ptimo de crecimiento para bacterias? y para mohos y levaduras?
3. Por qu no puede emplearse agua destilada para hacer una suspensin microbiana? qu
lquido empleara?
4. Qu es un medio qumicamente definido y en qu casos se lo emplea?
5. A qu se llama un medio de cultivo complejo? Cite tres ejemplos de medios complejos que
vaya a emplear para la deteccin de patgenos.
6. Qu caractersticas tienen los medios empleados para el cultivo de anaerobios? Qu es una
jarra de anaerobiosis y para qu se utiliza?
7. Defina medio de cultivo selectivo. Cite un ejemplo de medio selectivo que vaya a emplear en
la prctica de patgenos.
8. Defina medio de cultivo diferencial. Cite un ejemplo de medio diferencial que vaya a
emplear en la prctica de patgenos.
9. Defina medio de cultivo de enriquecimiento. Cite ejemplos de medios de enriquecimiento
que vaya a emplear en la prctica de patgenos.
10. Clasificacin e identificacin de microorganismos. Qu informacin brinda cada una de las
siguientes pruebas?
a) Observacin microscpica
b) Tincin de Gram
c) Pruebas bioqumicas
d) Serologa
11. Diagrame un esquema para el aislamiento e identificacin de microorganismos a partir de
una muestra de alimento, mencionando las etapas necesarias en la marcha.
12. Complete el siguiente cuadro comparativo de mtodos de recuento microbiano:

Ventajas Desventajas
Recuento en placa/
siembra por vertido en
placa

Recuento en placa/
siembra en superficie

Recuento por filtracin
por membrana

Recuento por tcnica del
nmero ms probable

Recuento microscpico
directo

32
GUIA DE ESTUDIO II

1. Complete la siguiente tabla:
Microorganismo Agar de
aislamiento
Agente
selectivo
Agente
diferencial
Colonia caracterstica
Baird Parker S. aureus
110
Bismuto sulfito
Verde Brillante
Salmonella
XLD
SPS Clostridium
perfringens TSN

2. Complete la siguiente tabla:
Microorganismo Pruebas de
identificacin
Reaccin caracterstica

S. aureus

Salmonella

Clostridium
perfringens

3. Complete el cuadro:
Microorganismo Caractersticas del
microorganismo
Enfermedad
(ETA) asociada
Reservorios y
transmisin
Alimentos
asociados a brotes
S. aureus

Salmonella

Clostridium
perfringens

Clostridium
botulinum

Bacillus cereus

33
Listeria
monocytogenes

Escherichia coli
O157:H7

4. Considerando la investigacin de los microorganismos del punto 3 en un alimento, seale
para cules considera apropiado hacer una prueba de ausencia/presencia y para cules un
recuento. Justifique.
5. Esquematice una marcha de ausencia/presencia y una de recuento. Seale las diferencias
entre ellas.
6. Cundo considerara adecuado determinar la ausencia de S. aureus enterotoxignico en
alimentos?
a) Explique cmo procedera indicando medios de cultivo y reacciones tpicas de
identificacin.
b) En qu circunstancias se justifica la investigacin de enterotoxina en la muestra de
alimento? Justifique brevemente.
7. Esquematice una marcha para determinar la ausencia de Clostridium perfringens en un
alimento. Cite los medios de cultivo y las reacciones caractersticas esperadas para cada uno
de ellos. Justifique sus respuestas.
8. En la marcha de determinacin de Salmonella de una muestra de leche en polvo, un analista
aisl cuatro colonias caractersticas a partir de los medios slidos. En el cuadro siguiente se
adjuntan los resultados de las pruebas de identificacin que ensay sobre cada una de las
cuatro cepas aisladas:

Colonia

Pruebas de
identificacin
I II III IV
Tincin de Gram
Coco bacilo
Gram -
Coco bacilo
Gram -
Coco bacilo
Gram -
Coco bacilo
Gram -
Oxidasa
Negativa Negativa Positiva Negativa
TSI (Sup./prof.)
Rojo/negro Amarillo/amarillo Rojo/amarillo Rojo/negro
LIA (Sup./prof.)
Violeta/violeta Amarillo/amarillo Violeta/violeta Violeta/violeta
Utilizacin de urea
negativo negativo negativo positivo

a) Cul o cules colonias pueden corresponder a Salmonella? Justifique. Qu otras
determinaciones tendra que realizar para asegurar este informe?
b) Considera que el analista realiz determinaciones innecesarias? En caso afirmativo, diga
cules y por qu.
c) Qu medios slidos de aislamiento pudo haber empleado el analista? Cmo hubieran
sido las colonias caractersticas en cada uno de ellos?
d) En los medios citados en c), cul sera el aspecto de una colonia de E. coli; y de
Proteus?

34
GUIA DE ESTUDIO III

1. Qu recomendaciones dara al administrador de un edificio si el anlisis de agua hubiera
dado un elevado recuento de coliformes?

2. Calcular el valor del recuento total de bacterias aerobias mesfilas para las muestras A, B y
C, si al realizar el recuento de aerobios mesfilos se obtienen los siguientes resultados.

Dilucin N de colonias por placa
A B C
1/100 890/921 0/0 208/160
1/1000 175/197 0/0 40/48
1/10000 43/50 0/0 3/12

3. En una muestra de helados se hace NMP (series de tres tubos) de coliformes totales a 30C,
coliformes a 45C y E. coli. Se observan los siguientes tubos positivos:

Determinacin 1/100 1/1000 1/10000
Coliformes totales 3 3 2
Coliformes fecales 3 2 0
E. coli 1 0 0

a) Informar los resultados de las 3 determinaciones
b) Indique los medios empleados en cada determinacin y la reaccin positiva tpica.
c) Nombre por lo menos dos gneros bacterianos que componen la flora acompaante en el
medio de aislamiento de E. coli y que pueden distinguirse por las reacciones de
identificacin de este microorganismo.

4. Una fbrica compra un polvo base para postres. Evala la aceptabilidad segn el siguiente
programa de muestreo (m y M se expresan por gramo de muestra):

Anlisis Categora n c m M
Aerobios totales 2 5 2 10
3
10
5
E. coli 5 5 2 <3 10
Clostridium perfringens 8 5 1 10
2
10
4

Salmonella 11 10 0 0

a) Indique qu mtodo emplea en cada determinacin (recuento en placa,
ausencia/presencia, NMP), cules son las unidades para la expresin del resultado y
comente sobre las situaciones en que se aplica cada uno.
b) En la tabla siguiente figuran los datos de recuentos de aerobios mesfilos para las cinco
muestras. Completar la tabla. Resulta aceptable el lote para recuento total de aerobios
mesfilos? Justifique.
35

Muestra Recuento en las placas
UFC/g de
muestra
Clase de muestra
A 1/10: MNPC ; 1/100: 458/342
B 1/10: 193/207 ; 1/100: 23/20
C 1/10: 235/165 ; 1/100: 22/16
D 1/10: 22/24 ; 1/100: 0/2
E 1/10: 0/0 ; 1/100: 0/0

c) Para determinar E. coli, se siembran diferentes combinaciones de diluciones para cada
muestra y se obtienen los siguientes resultados. Completar la tabla. Considera que el lote
es aceptable para esta determinacin? Por qu?

Muestra Tubos positivos para E. coli
Recuento de
E. coli
A 10 ml 1/10: 3/3; 1 ml 1/10: 1/3; 1 ml 1/100:0/3
B 1 ml 1/100: 0/3; 1 ml 1/1000: 0/3; 0,1 ml 1/1000: 0/3
C 1 ml 1/10: 2/3; 1 ml 1/100: 0/3; 1 ml 1/1000 :0/3
D 1 ml 1/10: 0/3; 1 ml 1/100: 0/3; 1 ml 1/1000 :0/3
E 1 ml 1/100: 1/3; 1 ml 1/1000: 0/3; 1 ml 1/10000:0/3

d) La empresa usa este polvo para fabricar postres. Mezcla el polvo con agua, lo cocina, lo
enfra, lo envasa y los vende refrigerados. Sabe que el valor promedio de aerobios totales
en este producto al final de su vida til es de 100/g. Qu puede comentar sobre un
producto que al final de la vida til presenta un recuento de 10
5
/g?

e) Identificar en el plan de muestreo para el polvo para postres cules son los
microorganismos indicadores, y comentar sobre su significado. Identificar los
microorganismos patgenos.

5. Se recibe un lote de leche en polvo y es necesario saber si resulta aceptable segn la siguiente
norma.

Determinacin Categora n c M (UFC/g) M (UFC/g)
Aerobios mesfilos 2 5 2 50000 500000
Coliformes totales 5 5 2 3 100
S. aureus 9 10 1 10 100
Salmonella 15 60 0 0 -

Responder Verdadero o Falso y justificar brevemente la respuesta en todos los casos:

a) Tanto para S. aureus como para Salmonella se hacen pruebas de ausencia/presencia.
b) La determinacin de coliformes totales se podra realizar sembrando 1 ml de la dilucin
1/10 y 1 ml de la dilucin 1/100 por duplicado (mtodo de recuento en placa), siguiendo
la metodologa correspondiente.
36
c) En la determinacin de Salmonella, las condiciones de incubacin del enriquecimiento
selectivo son crticas para la recuperacin ptima. Debe controlarse exactamente el
tiempo y la temperatura, que nunca debe exceder los 37C.

6. Completar teniendo en cuenta los fundamentos de la determinacin de Listeria
monocytogenes y de Escherichia coli O157:H7 en alimentos. Indicar, cuando corresponda,
agentes selectivos, diferenciales, colonias caractersticas, reacciones positivas.

Listeria monocytogenes

Medios de aislamiento:
- Agar Palcam
- Agar Oxford

- ....................................
- ....................................
- ....................................
- ....................................
- ....................................

Escherichia coli O157:H7

Medios de aislamiento
- Mc Conkey sorbitol
- Fluorocult E. coli O157:H7

- ..
- ..
- ..
- ..

37
FUNDAMENTOS TERICOS

MUESTREO PARA ANALISIS MICROBIOLOGICOS

Finalidad de los planes de muestreo

Para que el trabajo en el laboratorio resulte eficaz es de primordial importancia recibir una
muestra adecuada y en buenas condiciones.
Si las muestras no son correctamente tomadas y tratadas, o no son representativas, los resultados
del anlisis pueden carecer de sentido. Siempre que se vayan a hacer deducciones o a juzgar la
aptitud de una partida importante de alimentos, por el resultado obtenido del anlisis de una
muestra reducida de los mismos, es esencial seguir un procedimiento de muestreo adecuado. La
toma de muestra es especialmente importante cuando se trata de investigar en un alimento la
presencia de grmenes patgenos cuyo nmero puede ser escaso y su distribucin irregular, o
cuando el destino de una partida de alimentos, depende de que cumplan o no las normas
microbiolgicas legales.
Muchas veces no es posible ensayar el nmero de muestras necesario para demostrar la ausencia
de microorganismos peligrosos en un lote comercial, con el nivel de probabilidad que se
considerara deseable. La eleccin de un procedimiento particular de muestreo y del criterio de
decisin constituye el llamado plan de muestreo.
La severidad de los planes de muestreo est basada en los riesgos para el consumidor, que
dependen fundamentalmente de los tipos de microorganismos presentes en el alimento y de su
nmero. As por ejemplo, existen microorganismos que simplemente deterioran al producto,
otros que indican la posibilidad de contaminacin con patgenos y algunos que causan
enfermedades severas. El grado de peligro se ve modificado por las condiciones a las cuales ser
expuesto el lote y por las condiciones de uso del alimento, que pueden disminuir, mantener
inalterado o aumentar el nmero de clulas presentes originalmente en el mismo.
Existen 15 casos diferentes de acuerdo al riesgo y a como se modifica el mismo por las
condiciones de uso.

Cmo se modifica el grado de riesgo
por las condiciones de uso
Riesgo Disminuido No se modifica Incrementado
1) UTILIDAD
Ningn riesgo para la
salud
Caso 1 Caso 2 Caso 3
2) INDICADORES
Bajo riesgo indirecto
para la salud
38
3) RIESGO
MODERADO PARA
LA SALUD
Microorganismos que
no son rpidamente
diseminados
4) RIESGO
MODERADO PARA
LA SALUD
Microorganismos que
son rpidamente
diseminados
5) RIESGO SEVERO
PARA LA SALUD

Ensayos de utilidad: como la contaminacin general, vida til durante el almacenamiento o
deterioro, no estn relacionados al peligro para la salud pero s a la economa y a la apariencia
del alimento. Estos ensayos generalmente son el recuento estndar en placa de aerobios
mesfilos, microorganismos totales tolerantes al fro que predicen la vida en el almacenamiento
del alimento refrigerado.
El anlisis de los microorganismos indicadores, revela frecuentemente fallas relacionadas con el
procesado, condiciones de higiene, contaminacin posterior al procesado, temperatura
inadecuada durante el embarque. As esporulados mesfilos en alimentos no cidos estables al
almacenamiento indican la probabilidad de un procesado deficiente, coliformes y E. coli indican
inadecuada higiene general y contaminacin fecal, Staphylococcus a menudo son indicio de
contaminacin a partir de piel y nariz humana.
Los principales patgenos transmitidos por los alimentos son los que causan riesgos moderados y
severos para la salud. Entre los riesgos moderados es necesario distinguir entre aquellos de
rpida diseminacin y los de diseminacin limitada. Entre los primeros estn salmonelas,
shigellas, E. coli enteropatgena, que son primariamente diseminados por alimentos especficos
y secundariamente por otros alimentos como resultado de la contaminacin cruzada y de la
contaminacin ambiental y para los cuales la enfermedad resulta de un inculo relativamente
pequeo.
Entre los de diseminacin limitada encontramos Bacillus cereus, C. perfringens y
Staphylococcus aureus enterotoxignico, que causan enfermedad slo cuando el alimento
contiene un nmero bastante grande de clulas o cuando las condiciones de almacenamiento y
uso permiten la produccin de cantidades efectivas de toxinas (como para Staphylococcus).
Una vez evaluado: 1) el tipo de peligro asociado con la especie microbiana particular; 2) cmo se
modifica ste por las condiciones de uso; 3) ubicacin en el uso correspondiente, hay que elegir
el plan de muestreo apropiado.
Los planes de muestreo pueden ser de dos tipos:
1) planes de dos clases
2) planes de tres clases

39
1) Los planes de dos clases son aquellos que clasifican a las muestras analizadas como
aceptables o defectuosas. Estos planes estn definidos por tres nmeros: n, m, c.
Donde n es el nmero de muestras unidades que son analizadas, m es el valor que separa las
muestras aceptables de las defectuosas, y c da el nmero mximo de muestras subestndar
permitido (o sea las muestras que dan resultados insatisfactorios como ser la presencia de un
microorganismo o valores por encima de m).
m puede ser igual a cero o distinta de cero. Cuando m es igual a cero indica que el
microorganismo buscado estar ausente en la muestra analizada.
As por ejemplo un plan de dos clases definido por n=10, m=0, c=2 indicar que de cada diez
muestras del lote que se examinen, slo se permitir que 2 o menos den resultados positivos para
que el lote sea aceptado. Pero si tres o ms de las muestras dan resultado positivo (presentan el
microorganismo en cuestin), el lote ser rechazado.

2) Los planes de muestreo de tres clases, son aquellos que clasifican a las muestras analizadas
como: aceptables, marginalmente aceptables y defectuosas.
Estos planes quedan definidos por cuatro nmeros: n, m, M, c.
Donde n es el nmero de muestras analizadas, m es el valor que separa las muestras aceptables
de las marginalmente aceptables, M es el valor que separa las marginalmente aceptables de las
defectuosas y c es el nmero mximo de muestras para las cuales se acepta que den valores de
los recuentos entre m y M.
Un plan de tres clases con n=10, c=3, m=10
3
/g, M=10
7
/g, significa que de 10 muestras (tomadas
del lote) que son analizadas, slo tres o menos darn valores de los recuentos entre 10
3
/g y 10
7
/g
y ninguna dar recuentos mayores a 10
7
/g, para que el lote sea aceptado. Mientras que el lote
ser rechazado si 4 o ms de las muestras analizadas dan recuentos entre m y M y/o una muestra
da valores mayores a M.
Los planes de muestreo de dos clases son ms severos y se aplican a los casos de riesgos que
involucran a microorganismos patgenos (Salmonella typhi, Shigella dysenteriae) cuya presencia
en el alimento es inadmisible.
Los planes de tres clases, en cambio, son menos severos y se aplican a situaciones en las que hay
riesgo de prdida de la utilidad del alimento, al recuento de microorganismos indicadores, y a
algunos microorganismos moderadamente riesgosos.

Definiciones

Lote:
Nmero de muestras producidas en un batch o en un perodo de tiempo especfico producidas y
manipuladas bajo condiciones uniformes, de manera que presenten la misma calidad. Un lote
comprende unidades de producto de un nico tipo, grado, clase, tamao y composicin. Puede
incluir un gran nmero de pequeos envases, cajas, barriles, o tambin un producto a granel, una
o ms cargas de furgn o de vagn.

Partida:
Una partida puede contener cierto nmero de lotes.

Muestra representativa:
Es aquella que se considera tpica de una poblacin, es decir que sus caractersticas son tan
similares como sea posible a las del lote del que precede.
40
Una manera de obtener una muestra representativa consiste en utilizar un muestreo al azar
mediante el uso de nmeros aleatorios. No hay garantas que la muestra elegida de esta forma
tenga caractersticas idnticas a las del lote, pero s aseguramos que la muestra fue elegida con
objetividad.
Primero, se deben numerar todas las unidades de un lote. Supongamos un lote de 1000 paquetes;
si las 1000 unidades del lote estn distribuidas en 10 filas por cantidades iguales, se asignaran
nmeros del 1 al 100 a las unidades de la primera fila, del 101 al 200 a la segunda, y as
sucesivamente. Para seleccionar los nmeros de muestras a analizar se utilizan tablas de nmeros
aleatorios, las cuales contienen una sucesin de nmeros correlativos al azar que deben elegirse a
partir de un punto que debe ser seleccionado tambin de forma azarosa.

Eleccin de un programa de muestreo
Fundamentalmente, segn el tipo de alimento, los microorganismos involucrados, su nmero y el
grado de peligro por la consumicin de los mismos en base a las condiciones de uso, quedan
determinadas las distintas pruebas a realizar y la rigurosidad de los planes de muestreo.

Pruebas a realizar:
a) Indice de utilidad: la alteracin debe ser considerada un riesgo para el alimento ms que
para el consumidor, por ello las pruebas de vida til, es decir, pruebas para organismos
indicadores de la vida comercial, tales como los recuentos de aerobios mesfilos, bacterias
psicrotrficas o grupos microbianos responsables de alteraciones relevantes como lipolticos o
proteolticos, tendrn los planes de muestreo ms indulgentes.
b) Anlisis de indicadores: las pruebas que determinan el nmero de microorganismos
indicadores revelan cmo ha sido el procesamiento, en qu forma se realiz el almacenamiento y
transporte de la partida. As, por ejemplo, los recuentos de Enterobacteriaceae o de coliformes
pueden proporcionar un indiio de la adecuacin de la higiene del proceso de elaboracin,
Escherichia coli es un microorganismo indicador de contaminacin fecal y de la posible
presencia de patgenos entricos, aunque no existe relacin directa por lo que la interpretacin
tampoco es definida. Debido a estas ambigedades, los anlisis de organismos indicadores slo
son de rigurosidad mediana. Sin embargo, puesto que ensayos positivos indican la posible
presencia de bacterias patgenas, se requieren programas de muestreo algo ms severos que los
utilizados para las pruebas de utilidad.
c) Peligrosidad moderada y grave: Cuando se buscan patgenos conocidos, son ms
apropiados planes de muestreo ms rigurosos, por lo que stos son ms exigentes a medida que
aumenta la gravedad del trastorno que causa el patgeno. En particular esta bsqueda se aplica
cuando se sabe que un determinado patgeno se encuentra con frecuencia en un alimento y es
capaz de producir enfermada, por ejemplo, C. perfringens en los platos preparados a base de
carne cocida, B. cereus en los alimentos desecados, Salmonella en las carnes de aves, etc.
Aquellos alimentos destinados a la bsqueda de patgenos caeran dentro de los casos de 7 a 15.
En la tabla 4 se describen con ms detalle estos microorganismos causantes de toxiinfecciones
alimentarias.

Es prcticamente imposible analizar todos los grupos microbianos en un determinado alimento,
se deben elegir los ms adecuados y para esta eleccin se deben tener en cuenta los siguientes
puntos fundamentales:
a) antecedentes de las enfermedades alimentarias transmitidas por el alimento.
b) condiciones probables de tratamiento y almacenamiento y posibilidad de alteracin posterior.
c) antigedad del lote.
41
Es tambin importante en la eleccin de un programa de muestreo tener en cuenta la influencia
de las condiciones de manipulacin a las que se someter el alimento sobre el grado de
peligrosidad para la salud (tabla 5).
La tabla 6 presenta numerosos ejemplos de las relaciones existentes entre los diferentes casos o
categoras, las condiciones de manipulacin y los microorganismos de inters para diversos
alimentos.

RECOLECCION Y MANIPULEO DE LAS MUESTRAS

El esquema de muestreo debe especificar, adems del procedimiento para la toma de muestra, el
tamao y el nmero de las muestras que se enviarn al laboratorio, el cual se determina en base a
consideraciones estadsticas. El nmero de muestras que se han de analizar en cada caso depende
de la variacin normal de la contaminacin microbiana en el alimento, de la homogeneidad del
mismo, y de la sensibilidad de los mtodos utilizados para el anlisis. El grado de homogeneidad
del alimento influye considerablemente en la eleccin del esquema de muestreo, siendo
necesarias ms muestras si el alimento no es homogneo.
Cuando es posible, las muestras deben enviarse al laboratorio en el envase original, no abierto.
Esto previene la posible contaminacin del producto y mostrar la verdadera condicin del
mismo tal como es preparado y ofrecido al consumidor. Si los productos se presentan a granel o
en envases de gran tamao, de modo que no es posible su traslado al laboratorio, debern
enviarse un nmero determinado de muestras que se tomarn al azar de diferentes partes del
envase. En estos casos las muestras se recogern en forma asptica, en recipientes de boca ancha
y tamao apropiado, que estarn perfectamente limpios y esterilizados, al igual que los utensilios
empleados (pinzas, esptulas, bisturs, etc.). Los recipientes pueden ser de plstico, de vidrio, o
metlicos, con cierres hermticos para impedir prdidas de material.
Todas las muestras deben ser perfectamente identificadas y registradas con los datos que se
consideren necesarios en cada caso. Debern ser enviadas al laboratorio lo ms rpidamente
posible y tratando de mantener las condiciones originales del almacenamiento. Una vez recibidas
en el laboratorio, las muestras deben ser examinadas lo ms pronto posible luego de su
recepcin. Cuando el anlisis deba posponerse, las muestras perecederas no congeladas debern
almacenarse en refrigeracin entre 0 y 4C por no ms de 36 h, y las muestras congeladas a -
20C hasta el momento del anlisis. La descongelacin debe ser cuidadosa para evitar la
destruccin de los microorganismos o su favorecer su multiplicacin durante el descongelado;
debern descongelarse en su recipiente original a temperaturas de refrigeracin ( 4,4C), por no
ms de 18 h. Las muestras de bajo contenido acuoso o de productos enlatados, que no son
perecederas y han sido recolectadas y enviadas a temperatura ambiente, pueden mantenerse a
temperatura ambiente o bien entre 0 y 4C. Todo otro tipo de muestra deber guardarse en
refrigerador (entre 0 y 4C) hasta el momento del anlisis.
Antes de iniciar el anlisis se debe observar la apariencia fsica de la muestra y del recipiente y
registrar toda anormalidad. Las muestras de productos deshidratados o lquidos deben ser
completamente mezcladas, empleando utensilios estriles para remover porciones de las
muestras (submuestras). El tamao de stas depende tambin de la homogeneidad del producto.
Un tamao corriente de muestra a analizar es 25 g, pero se puede tambin trabajar con cantidades
menores (nunca inferiores a 10 g) o mayores (hasta 100 g).
En el caso de los alimentos no lquidos, los mtodos de aislamiento y recuento de los
microorganismos presentes requieren por lo general, la preparacin previa de homogenatos, para
liberar en un medio fluido los microorganismos que pueden estar aprisionados en las estructuras
del alimento o en superficies secas o gelatinosas. Para este fin se recomienda el empleo del
42
Stomacher (dispositivo en base a paletas que agitan la muestra junto con el diluyente en bolsas
plsticas descartables). Es importante la normalizacin de este procedimiento inicial de
preparacin del homogenato, para obtener resultados comparables y reproducibles.
En el caso de los alimentos constituidos principalmente por grasas (p. ej. manteca, mayonesa,
cremas, etc.) el examen microbiolgico puede realizarse sobre el producto entero o empleando la
fase acuosa de los mismos (suero), que se obtiene fcilmente por fusin del alimento a 43C en
condiciones aspticas y posterior centrifugacin.
Normalmente se preparan diluciones decimales de la suspensin original de la muestra. La
naturaleza del diluyente utilizado tambin tiene importancia en la enumeracin o recuento de
microorganismos en el alimento. En algunos casos, p. ej. para ciertos microorganismos hay que
usar otros diluyentes especficos, tales como NaCl 3% para Vibrio parahaemolyticus (bacteria de
origen marino que requiere altas concentraciones salinas para su desarrollo). Si se analizan
alimentos grasos o con tendencia a formar grumos, se pueden emplear agentes tensioactivos tales
como Tergitol aninico 7 o Tween 80 (1%).
En sntesis las condiciones que debe presentar el diluyente son: impedir la aglutinacin de los
grmenes, no ser txicos, impedir la reproduccin de los microorganismos durante el tiempo de
exposicin y favorecer la reparacin de los microorganismos que pudieran encontrarse afectados
(estresados) por las condiciones del alimento o el tratamiento a que ste ha sido sometido
(desecacin, calor, etc.).

BACTERIAS AEROBIAS MESOFILAS TOTALES

El recuento de bacterias aerobias mesfilas (RAM) se utiliza como un indicador de la poblacin
microbiana de un alimento. Tambin se denomina recuento total en placa, recuento en placa de
aerobios, recuento en placa estndar (standard plate count, SPC) o recuento de mesfilos. Si bien
el mtodo presenta ciertas limitaciones, puede utilizarse para evaluar calidad sanitaria,
aceptabilidad organolptica, aplicacin de buenas prcticas de manufactura, etc. El recuento de
aerobios mesfilos aporta informacin acerca de las materias primas, condiciones del proceso,
condiciones de almacenamiento y manipulacin del alimento.
Para el recuento se utiliza como medio de cultivo el agar para recuento en placa (APC o SPC),
con una incubacin a 32C por 48 h, porque en estas condiciones crecen la mayora de las
bacterias aerobias contaminantes. La mayora de los alimentos se consideran no aptos para el
consumo cuando contienen un gran nmero de microorganismos, an cuando se sepa que stos
no son patgenos y que no han llegado a alterar marcadamente las caractersticas organolpticas
del alimento.
Existen varias razones que justifican este criterio:
1. Los recuentos altos de grmenes indican frecuentemente materias primas contaminadas,
limpieza y desinfeccin incorrectas, condiciones inadecuadas de tiempo-temperatura durante la
produccin o la conservacin de los alimentos.
2. Si existen recuentos altos de microorganismos mesfilos, las condiciones tambin fueron
favorables para el desarrollo de microorganismos patgenos, si es que existan y se encuentran,
por lo tanto, en gran nmero en el alimento.
3. Los recuentos altos indican de antemano que el producto va a alterarse muy pronto, ya que en
la mayora de los alimentos que contienen 10
6
a 10
8
mo/g la alteracin ya es evidente.
Es necesario advertir, sin embargo, que el recuento de la flora viable tiene en algunos casos un
valor limitado, por ejemplo:
a) En determinados alimentos, como los producidos por fermentacin o maduracin
(salchichas, quesos, etc.), es natural una gran multiplicacin de bacterias.
43
b) En los alimentos tratados por calor, los recuentos de grmenes viables pueden dar cifras muy
bajas, reflejando nicamente el grado de tratamiento trmico a que fueron sometidos. En estos
casos, el exmen microscpico directo nos dir si hubo o no una contaminacin intensa de la
materia prima.
c) Del mismo modo, entre los alimentos deshidratados y en los congelados, siempre se obtienen
recuentos de bacterias viables ms bajos. El recuento en placa no refleja la calidad bacteriolgica
de la materia prima, recurrindose tambin al exmen microscpico directo.
Es importante sealar que el mtodo de recuento en placa es el predilecto cuando las cifras de
grmenes no son demasiado elevadas (menor de 200.000) y pierde eficacia cuando se supera este
nmero.

Fuentes de error:
1. En el medio de cultivo no se distinguen las colonias formadas a partir de clulas individuales,
de las formadas a partir de cmulos de clulas.
2. Carencia de algunas bacterias de formar colonias, debido a la inadecuada composicin del
medio o desfavorable tensin de oxgeno o inadecuada temperatura de incubacin.
3. Errores en la medida de la toma de muestra y en el recuento de las colonias.
4. Incompleta esterilizacin o recontaminacin del material de vidrio, medio de cultivo o agua
de dilucin.
5. Presencia de sustancias inhibidoras en los diluyentes, en el material de vidrio, o en el mismo
alimento.

PROCEDIMIENTOS GENERALES PARA EL RECUENTO EN PLACA DE
BACTERIAS AEROBICAS TOTALES

Los mtodos de recuento de colonias proveen una estimacin del nmero de microorganismos
viables en los alimentos de acuerdo al medio empleado, al tiempo y temperatura de incubacin.
Las clulas microbianas a menudo se encuentran formando cmulos o agrupadas en los
alimentos. Si bien la agitacin de las muestras y las sucesivas diluciones permiten lograr una
distribucin uniforme de dichos cmulos, no logran disgregarlos en su totalidad.
Consecuentemente, cada colonia que desarrolla en las placas de agar puede provenir tanto de una
clula aislada como de un cmulo, por lo tanto los recuentos obtenidos por este mtodo no se
reportarn como clulas viables/g o ml, sino como unidades formadoras de colonias/g o ml.
Se debe tener en cuenta que no todos los tipos de microorganismos crecern sobre un medio
simple agarizado incubado bajo determinadas condiciones, debido a requerimiento de nutrientes,
tensin de O
2
desfavorable, temperaturas de incubacin inadecuadas, presencia de clulas
estresadas, entre otros factores. La presencia de sustancias inhibitorias presentes en el material de
vidrio o en los diluyentes, o producidas por microorganismos competitivos en el agar pueden
limitar el desarrollo de colonias.
Las condiciones y el medio ptimo para el mtodo de recuento en placa pueden variar de un
alimento a otro. Una vez que se seleccione el procedimiento ptimo, se pueden obtener
resultados precisos y reproducibles para el anlisis microbiolgico de rutina del alimento.

Reactivos y medios:
Para el recuento en placa de bacterias aerobias totales se deben usar medios no selectivos (agar
para recuento en placa, etc.).
44
Generalmente se utilizan diluciones decimales para simplificar el clculo de los resultados.
Existe una gran variedad de diluyentes disponibles. Entre los ms utilizados se encuentran el
buffer fosfato y el agua peptona 0,1%.

Consideraciones generales:
Todas las placas, tubos y recipientes a utilizar debern estar rotulados con el nmero de muestra,
dilucin, fecha y cualquier otra informacin relevante antes de preparar las diluciones.
Las muestras lquidas o semilquidas se mezclarn invirtiendo rpidamente el recipiente 25
veces, o bien recorriendo un arco de 25 cm en 7 seg. El tiempo entre el mezclado y la toma de
material a analizar no exceder los 3 minutos.
Las muestras slidas debern mezclarse aspticamente con una esptula o cuchara estril a fin de
obtener una muestra homognea. Para grandes muestras de alimentos slidos, las porciones de
muestra se tomarn de distintas partes y sern mezcladas aspticamente.
Antes de abrir, el envase se deber limpiar el rea exterior del recipiente con alcohol 70% para
destruir los microorganismos que podran contaminar la muestra.

a) Alimentos lquidos:
a.1) Lquidos no viscosos:
Las proporciones de muestra a analizar de alimentos lquidos no viscosos, se medirn
volumtricamente con pipeta estril. No introducir la pipeta ms de 2,5 cm por debajo de la
superficie de la muestra. La pipeta ser vaciada en el diluyente en un lapso de 2 a 4 seg tocando
con la punta de la pipeta el borde del tubo de dilucin. No soplar la ltima gota ni sumergir la
pipeta en el diluyente. Mezclar en Vortex.
a.2) Lquidos viscosos:
Para lquidos de viscosidad similar a la leche se debe soplar la ltima gota de la pipeta. Para
aquellos ms viscosos que la leche se pesan aspticamente 11,0 0,1 g en 99 ml de diluyente o
10,0 0,1 g en 90 ml o 50,00,1 g en 450 ml. Esto provee la dilucin 1/10.

b) Alimentos slidos o semislidos:
Se pesan aspticamente 50,00,1 g de muestra y se colocan en una jarra mezcladora. Se agregan
450 ml de diluyente y se agita 2 minutos a 3.000 rpm. El tiempo de mezclado puede variar
dependiendo del alimento. Dentro de los 15 minutos siguientes preparan las diluciones
necesarias. Durante el mezclado debe prevenirse el exceso de calentamiento.
La homogeneizacin de la muestra tambin puede realizarse mediante el uso de un Stomacher.

c) Plaqueo:
Fundir el medio evitando temperaturas elevadas y tiempos de calentamiento prolongados. Enfriar
el medio a 45C y mantenerlo en bao a 44-46C hasta su uso. Levantar la tapa de la placa de
Petri slo lo necesario para insertar la pipeta para introducir la muestra. Se colocan de 12 a 15 ml
de agar fundido por placa.
Mezclar rotando la placa primero en una direccin y luego en la direccin contraria. Dejar
solidificar el agar no ms de 10 minutos.Luego de solidificar el medio invertir la placa para
evitar difusin e incubar.
No deben pasar ms de 20 minutos entre la preparacin de las diluciones de la primera muestra y
el momento de volcar el agar en la ltima placa de la serie.

45
d) Recuento de colonias:
Para trabajos de rutina usar un cuentacolonias equipado con iluminacin, magnificador y una
placa gua graduada en cm. Contar todas las colonias en las placas seleccionadas que contengan
el nmero apropiado de colonias. Este nmero es una funcin que depede del tamao de la
colonia, el tamao de la placa, y tamao de las propiedades diferenciales producidas en el medio
(p.e. halos de precipitacin). Tpicamente se obtienen resultados confiables contando entre 25 y
250 colonias por placa. Se informa el resultado del recuento con slo dos cifras significativas.

e) Clculo del error:
Los lmites de confianza del 95% pueden ser calculados de modo aproximado como 2s = 2x
1/2
,
donde x es el valor promedio del recuento de colonias en las placas. As en una placa con slo 16
colonias, el lmite de confianza del 95% ser aproximadamente el 50% (esto es que tendramos
una confianza del 95% de que el recuento est comprendido entre 8 y 24 colonias por placa).

Reglas para computar el nmero total de microorganismos viables/g o ml de muestra

Se deben utilizar las siguientes reglas para seleccionar las placas adecuadas para realizar el
recuento y calcular el nmero de UFC/g o ml de alimento.

1. Una placa con 25 a 250 colonias:
Contar todas las colonias, incluyendo las muy pequeas, a menos que se excluya por difusin
(DIF) o accidente de laboratorio (AL). Teniendo en cuenta la dilucin, informar el nmero de
UFC/g o ml de alimento.

Colonias por placa
Dilucin Recuento
Muestra 1/100 1/1000 (UFC/g o ml)
1 234 23 23.000
2 DIF 31 31.000
3 305 42 42.000
4 243 AL 24.000

2. Dos placas de una misma dilucin con 25 a 250 colonias:
Si las dos placas de una misma dilucin presentan entre 25 y 250 colonias, contarlas y
promediarlas. Si slo una de las placas de un duplicado presenta entre 25 y 250 colonias, contar
ambas placas y promediarlas, a menos que una se excluya por difusin o accidente de
laboratorio.

Colonias por placa
Dilucin Recuento
5 175 16 19.000
208 17
6 239 16 28.000
328 19
46
7 275 24 30.000

280 35

3. Diluciones consecutivas con 25 a 250 colonias:
Si las placas de diluciones decimales consecutivas presentan 25 a 250 colonias cada una,
calcular el recuento por g o ml para cada dilucin e informar el promedio aritmtico como
UFC/g o ml de alimento a menos que el recuento ms elevado sea ms del doble que el menor
recuento. En este ltimo caso, informar el recuento ms bajo.

Colonias por placa
Dilucin Recuento
Muestra 1/100 1/1000 Relacin (UFC/g o ml)
8 243 34 1,4 29.000
9 140
32
2,3 14.000
10 228
28
1,2 25.000
240
26

11 142 28 2,1 14.000
134 30
12 224 28 1,4 24.000

180 DIF

4. Ninguna placa presenta 25 a 250 colonias:
Si ninguna placa tiene entre 25 y 250 colonias y una o ms placas presentan ms de 250 colonias,
seleccionar la dilucin con la/s placa/s que contengan el valor ms cercano a 250 colonias.
Informar el recuento como UFC/g o ml estimativo.

Colonias por placa
Dilucin Recuento
13 325 20 33.000 est.
14 287 23 28.000 est.
263 19

5. Todas las placas presentan menos de 25 colonias:
Si las placas de todas las diluciones presentan menos de 25 colonias contar las colonias de la
menor dilucin, a menos que sean excludas por difusin e informar el recuento como UFC/g o
ml estimativo.
47

Colonias por placa
Dilucin Recuento
15 18 2 1.800 est.
16 18 2 1.700 est.
16 0

6. Todas las placas sin crecimiento:
Si ninguna de las placas de todas las diluciones presenta colonias y no se han detectado
sustancias inhibidoras informar el recuento estimado como menor que (<) la inversa de la menor
dilucin.

Colonias por placa
Dilucin Recuento
17 0 0 <100 est.
18 0 0 <100 est.
0 0

7. Todas las placas presentan crecimiento excesivo (ms de 250 colonias):
Si el nmero de colonias por placa excede 250, para estimar el recuento, contar las colonias
presentes en porciones de la placa representativas de la distribucin de colonias para estimar el
recuento. Si hay menos de 10 colonias por cm
2
contar las colonias presentes en 12 cm
2

seleccionando 6 cuadrados consecutivos horizontalmente y 6 consecutivos perpendiculares sin
repetir. Cuando hay ms de 10 colonias por cm
2
contar las colonias en 4 cuadrados
representativos. En ambos casos, multiplicar el nmero promedio de colonias por cm
2
por el rea
de la placa para determinar el nmero de UFC/g o ml estimativo.
Cuando los recuentos bacterianos en placas con crecimiento excesivo superan las 100 colonias
por cm
2
, se informar como mayor que (>) el rea de la placa multiplicada por 100 para la mayor
dilucin plaqueada. Por ejemplo, para una placa de 56 cm
2
el recuento deber ser 5.600 veces la
inversa de la mayor dilucin plaqueada informado como UFC/g o ml estimativo.

Colonias por placa
Dilucin Recuento
1013 MNPC 840 840.000 est.
1006 MNPC 7150 >5.600.000 est.

8. Difusin:
Existen tres tipos diferentes de difusin. La primera consiste en una cadena de colonias, no lo
suficientemente separadas, aparentemente causada por la desintegracin de un cmulo bacteriano
cuando el inculo fue dispersado en la placa. Si una o ms cadenas parecieran provenir de
diferentes orgenes, contar cada una como una colonia. No deben contarse colonias
individuales en dichas cadenas.
48
El segundo tipo de difusin consiste en el desarrollo microbiano en una pelcula de agua entre el
agar y la placa. El tercer tipo consiste en el crecimiento de microorganismos en una pelcula de
agua situada en los bordes de la placa o sobre el agar. Si se presentan estos tipos de difusin,
contar las colonias en las zonas de la placa libres de difusin, siempre y cuando la distribucin
de las colonias en esas reas sea homognea y la difusin no exceda el 50% del rea total de la
placa. Calcular el recuento estimativo multiplicando el promedio de colonias por cm
2
por el rea
de la placa como en el punto 7. Cuando la difusin exceda el 50% de la placa, informar como
difusin (DIF) o accidente de laboratorio (AL).

NUMERO MAS PROBABLE

Principios bsicos
La tcnica de del nmero ms probable (NMP) se basa en la obtencin de resultados positivos o
negativos en una o ms diluciones decimales de la muestra para estimar el nmero de
organismos presentes en la misma. El resultado se expresa como el nmero ms probable de
microorganismos por gramo o por mililitro o por 100 mililitros segn los casos.
El mtodo deriva de la aplicacin de la teora de probabilidad para la determinacin de
microorganismos en una muestra. Los valores de la tabla de NMP son calculados presuponiendo
que los microorganismos buscados estn homogneamente distribuidos en la muestra y en el
homogenato. En las muestras de alimentos, las grasas y las partculas insolubles impiden la
formacin de un buen homogenato. Por esta razn los NMP derivados de muestras de alimentos
son algo menos precisos y reproducibles que aquellos derivados de muestras de agua, donde la
homogeneidad es ms fcil de conseguir.
A diferencia del recuento en placa, el NMP no constituye una medida directa del recuento
bacteriano y sus resultados suelen ser ms variables que los del recuento en placa. Es adecuado
para estimar la poblacin de microorganismos especialmente en situaciones donde se encuentran
densidades extremadamente bajas, ya que posee mayor sensibilidad que el recuento en placa.
El mtodo del NMP est basado en la subdivisin de la muestra y por lo tanto puede ser
descripto como el mtodo de dilucin hasta extincin en mltiples tubos. Cuando se realizan
sucesivas diluciones seriadas de una muestra, las diluciones ms altas contendrn una cantidad
tan pequea de muestra original que podran no contener microorganismos. La informacin ms
satisfactoria se obtiene cuando todos los tubos con la mayor porcin de muestra (menor dilucin)
muestran crecimiento y los tubos con la menor porcin de muestra (mayor dilucin) no muestran
crecimiento.
La precisin de esta tcnica aumenta con el incremento del nmero de tubos usados por dilucin
(la tcnica ms comn emplea entre 3 y 5 tubos de una misma dilucin).

Deteccin de tubos positivos
a) Turbidez:
Cuando se analizan muestras que no opacan el medio de cultivo la aparicin de turbidez luego de
la incubacin indica crecimiento (tubo positivo). Cuando las muestras causan turbidez, deben
emplearse otros mtodos para determinar los tubos positivos.
b) Productos metablicos finales:
1. Deteccin de la produccin de gas: Los gases producidos por el desarrollo de
microorganismos pueden atraparse en viales invertidos (campanita de Durham) colocados en el
medio de crecimiento. Se evidencia una reaccin positiva cuando el gas que se acumula en la
punta de la campanita desplaza al menos 1/5 del lquido contenido en ella.
49
2. Deteccin de cidos o bases: La produccin de cidos o bases se puede determinar luego de
la incubacin midiendo el pH en cada tubo o empleando un medio que contenga un indicador de
pH.
3. Deteccin con mtodos de reduccin: Compuestos aceptores de electrones (p.e. rezarsurina,
azul de metileno, TTC, etc.) que cambian de color luego de ser reducidos pueden ser
incorporados al medio. El cambio de color indicar reaccin positiva.
4. Otros: Existen medios especficos que permiten evaluar ciertas actividades metablicas, por
ejemplo, reduccin de NO
3
, produccin de indol, hidrlisis de almidn, produccin de H
2
S, etc.

Interpretacin de datos
Como el NMP provee una estimacin del recuento de microorganismos presentes en una
muestra, en las tablas utilizadas para calcularlo se presenta la concentracin ms probable de
microorganismos en la muestra, para una dada combinacin de tubos positivos teniendo en
cuenta las diluciones empleadas.
Cuando se emplean ms de 3 diluciones de una muestra en la determinacin del NMP, se utilizan
los resultados de slo 3 diluciones consecutivas. Para seleccionar las 3 diluciones ms
adecuadas, se aplican las siguientes reglas:

1. Seleccione la dilucin ms alta (menor cantidad de muestra) en la que resulten todos los
tubos positivos (5/5 o 3/3) y las dos diluciones subsiguientes (casos a y b). Si esto no es posible,
ya sea porque ninguna de las diluciones presenta todos los tubos positivos, o porque no se
hicieron dos diluciones subsiguientes a sta, emplear las 3 ltimas (casos c y d).
2. Si slo una dilucin presenta tubos positivos, elegir 3 diluciones sucesivas de modo que el
resultado positivo corresponda a la dilucin del medio (caso e).
3. Si aparecen resultados positivos en la dilucin siguiente a las 3 seleccionadas, sumar el
nmero de tubos positivos presentes en esta dilucin al resultado de la dilucin anterior (casos f
y g).

Casos 1/10 1/100 1/1000 1/10000
Combinacin
de tubos +
a 5/5 5/5 2/5 0/5 5-2-0
b 3/3 3/3 2/3 0/0 3-2-0
c 4/5 3/5 1/5 0/5 3-1-0
d 5/5 5/5 5/5 3/5 5-5-3
e 0/5 1/5 0/5 0/5 0-1-0
f 5/5 3/5 1/5 1/5 5-3-2
g 3/3 2/3 1/3 1/3 3-2-2

50
BACTERIAS COLIFORMES, COLIFORMES A 45C Y E. COLI

Se define como coliformes a las bacterias aerobias y anaerobias facultativas, Gram negativas,
bacilos cortos no formadores de esporas, capaces de fermentar lactosa produciendo cido y gas a
35C en 48 h. En los productos lcteos se utiliza una temperatura de incubacin de 32C. El
grupo de los coliformes se deine en base a reacciones bioqumicas y no a relaciones genticas,
por lo que el trmino coliforme" no tiene validez taxonmica.
Este grupo incluye la mayora de las cepas de E. coli y otros microorganismos que no son
predominantemente de origen fecal, como Klebsiella, Citrobacter y Enterobacter.
Escherichia coli es un germen cuyo hbitat natural es el tracto intestinal del hombre y de otros
animales de sangre caliente. Su presencia en los alimentos se interpreta generalmente como
contaminacin directa o indirecta de origen fecal. Por ello E. coli es el indicador clsico de la
presencia simultnea de bacterias patgenas entricas tales como Salmonella typhi, otras
salmonellas, shigelas, vibrios, y virus entricos. Muchos de estos microorganismos patgenos
son difciles y costosos de determinar y por eso se hace preciso confiar en los organismos
indicadores. Sin embargo, la presencia de E. coli en un alimento no indica que existan
necesariamente grmenes patgenos, sino simplemente advierte el riesgo de que pudieran estar
presentes.
Con excepcin de E. coli, los coliformes persisten en el suelo o sobre la superficie (por ejemplo
frutas, granos y otros productos de campo) mucho ms tiempo que el propio E. coli. Por lo tanto,
los coliformes no indican necesariamente contaminacin fecal en el sentido de implicar un
contacto inmediato con heces o con una superficie contaminada con heces. La principal
aplicacin del recuento de coliformes es para la evaluacin de la calidad microbiolgica de un
alimento y las condiciones higinicas durante el procesado. Cuando el alimento ha sido
conservado o almacenado a temperaturas no adecuadas o durante un tiempo excesivo el nmero
de coliformes suele ser elevado. Usualmente es imposible determinar si un dado nmero de
coliformes es debido a una gran contaminacin inicial o al crecimiento posterior a una leve
contaminacin inicial. No sucede lo mismo con las determinaciones cuantitativas en el agua,
debido a que este medio no es adecuado para la multiplicacin, por lo tanto el nmero de
coliformes determinado estara directamente relacionado con el grado de contaminacin inicial.
Los coliformes fecales o coliformes a 45C se definen como aquellos coliformes capaces de
fermentar la lactosa con produccin de cido y gas a 44,5-45,5C en 48 h. El trmino coliformes
fecales, al igual que coliformes, carece de validez taxonmica. En este grupo se incluyen E.
coli, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter spp., Citrobacter freundii, entre otros
microorganismos. La determinacin de este grupo fue desarrollada como un mtodo rpido y
reproducible para detectar la presencia de E. coli sin la necesidad de tener que utilizar las
pruebas confirmadoras para esta especie cuya realizacin requiere tiempo. Esto se debe a que los
coliformes fecales incluyen un porcentaje elevado de cepas de E. coli.
En los alimentos, E. coli es por lo general, el indicador preferido para significar una
contaminacin de origen fecal relativamente reciente y en consecuencia de la proliferacin de
grmenes patgenos con l asociados, si estaban presentes. Con el fin de poner de manifiesto en
los alimentos la presencia de E. coli cuali o cuantitativamente, se desarrollaron varios mtodos
que se basan en lo siguiente:
1. Determinacin de grmenes coliformes, incluyendo E. coli, en un caldo de enriquecimiento
de coliformes.
2. Si el ensayo anterior da lugar a la posibilidad de contaminacin fecal, los coliformes se
someten a otros ensayos para determinar si entre ellos est presente E. coli. Es por esto que ha
surgido el concepto de coliformes fecales o coliformes a 45C. Para realizar este ensayo el
51
inculo se extrae de un caldo de enriquecimiento de coliformes. Tales cultivos microbianos
tienen por lo general un alto porcentaje de E. coli tipos I y II y por lo tanto son indicativos en el
alimento de una contaminacin de origen fecal.
Sin embargo, se debe tener en cuenta que en ciertos alimentos procesados, en los cuales un gran
nmero de E. coli ha sido eliminado durante el procesamiento, pueden persistir salmonelas, por
ej. Salmonella typhi puede permanecer viable en quesos durante meses; Salmonella paratyphi ha
sido aislada de huevos congelados despus de varios aos de conservacin. Otras salmonelas han
sido encontradas en alimentos disecados en los que se han eliminado gran nmero de E. coli en
el proceso de desecacin. Es importante tener en cuenta que en estos alimentos citados, E. coli
estara prcticamente ausente y sera errneo, por lo tanto, utilizarlo como indicador de la
presencia o ausencia de bacterias entricas patgenas.
Es por esto, que cada vez se utiliza ms la determinacin en alimentos procesados de la familia
Enterobacteriaceae, es decir, que se incluye los microorganismos lactosa (+) y lactosa (-). Estos
recuentos se utilizan generalmente como un indicador de la calidad higinica ms que de la
contaminacin fecal.

Conclusiones Generales
En alimentos procesados, la presencia de un nmero considerable de Enterobacteriaceae o
bacterias coliformes indica:
- Inadecuado procesamiento y/o recontaminacin post procesamiento, frecuentemente a partir de
alimentos muy contaminados, equipos sucios o manipuleo no higinico.
- Que las condiciones fueron tambin favorables para la multiplicacin de un amplio rango de
organismos patgenos y toxicognicos.

BACTERIAS PSICROTROFICAS

El trmino psicrotrficos se aplica a aquellos microorganismos que son capaces de crecer
relativamente rpido a temperaturas de refrigeracin, pero poseen una temperatura ptima de
crecimiento mayor, en el rango de la temperatura ptima para mesfilos.
Especies de Pseudomonas, Achromobacter, Flavobacterium, Alcaligenes, y otras bacterias Gram
negativas, como tambin Geotrichum, Botrytis, Mucor, Fusarium, Rhodotorula, entre los hongos
y levaduras, desarrollan en alimentos refrigerados.
La presencia de bacterias psicrotrficas es importante tambin en productos congelados tales
como pollos y pavos que son descongelados para ser comercializados como alimentos
refrigerados. Algunas especies microbianas pueden crecer lentamente a temperaturas tan bajas
como -5 a -12C, causando deterioro en alimentos almacenados por largos periodos a esas
temperaturas.
Cuando las bacterias psicrotrficas estn presentes en gran nmero en alimentos, pueden causar
la aparicin de sabores y aromas atpicos como tambin defectos fsicos debido a la accin de
enzimas lipolticas y proteolticas.

Mtodos generales
- Las bacterias psicrotrficas son usualmente enumeradas en medios no selectivos como el agar
para recuento (SPC) con una incubacin de las placas a temperaturas de refrigeracin, tal como
7C por 10 das cuando el recuento se realiza por el mtodo de vertido en placa. Otras
combinaciones de tiempo y temperatura utilizadas son: 7-8 das a 7C para recuento en placa en
superficie, y una combinacin de 16 h a 17C seguida de 3 das a 7C.
52
- Otras condiciones de incubacin para esta determinacin utilizan tiempos ms cortos y
temperaturas ms elevadas, como 25 h a 21C para leche y crema, 45 h a 18C para leche, y 24 h
a 25C para carnes.
- La prueba de Moseley es un ensayo que se realiza tambin con el fin de reconocer la presencia
y cantidad de psicrotrficos. Previamente se determina la presencia de bacterias que desarrollan
a 32C durante 48 h en el medio SPC, luego se sigue incubando a 7C durante 5-7 das ms
realizndose un nuevo recuento. Un incremento grande entre ambos recuentos es indicativo de
posibles problemas cuando el alimento es almacenado durante perodos prolongados a bajas
temperaturas.
- Dado que por lo general las bacterias psicrotrficas son Gram negativas un recuento
orientativo en forma rpida se realiza en agar con cristal violeta y cloruro de trifeniltetrazolio
(TTC), incubando 48 h a 30C. El cristal violeta inhibe las bacterias Gram positivas. Se cuentan
como bacterias psicrotrficas aquellas que reducen el cloruro de trifeniltetrazolium a formazn.
Sin embargo, esta tcnica no proporciona un recuento muy preciso debido a que muchos
mesfilos no psicrotrficos pueden crecer en estas condiciones.
53

DIRECCIONES UTILES

http://www.fda.gov/Food/ScienceResearch/LaboratoryMethods/BacteriologicalAnalyticalManua
lBAM/default.htm: Bacteriological Analytical Manual (BAM) on line

http://www.fsis.usda.gov/Science/Microbiological_Lab_Guidebook/index.asp: Food Safety and
Inspection Service, USDA (United States Department of Agriculture)

USDA/FSIS Microbiology Laboratory Guidebook, USDA, 3rd edition, 1998

http://www.minagri.gob.ar/site/index.php: Ministerio de Agricultura, Ganadera y Pesca

http://www.alimentosargentinos.gov.ar/: Alimentos Argentinos, Ministerio de Agricultura,
Ganadera y Pesca

http://www.senasa.gov.ar/indexhtml.php: SENASA, Servicio Nacional de Sanidad y Calidad
Agroalimentaria.
54
ANEXO: NDICE

TABLAS
Caractersticas bioqumicas de Enterobacteriaceae 57
Gneros de Enterobacteriaceae con respecto a su origen fecal, reaccin en las pruebas de
coliformes y a su patogenicidad... 58
Clasificacin y caractersticas bioqumicas del gnero Clostridium... 59
Tablas referidas en Mtodos de muestreo para anlisis microbiolgicos 60
Tablas de NMP 64

MTODOS DE TINCIN
Tincin de Gram-Nicole. 67
Tincin negativa.. 68
Demostracin de cpsulas bacterianas 68
Tincin de esporas bacterianas 69
Tincin de bacterias en leche.. 69
Observacin de movilidad de bacterias.. 69

SOLUCIONES Y REACTIVOS
Solucin de cloruro de trifeniltetrazolio (TTC) al 1%............................................................ 70
Solucin de tetraciclina... 70
Solucin de telurito de potasio (3,5 %)... 70
Reactivo de Kovacs. 70
Reactivo de Voges-Proskauer. 70
Reactivo para la prueba de reduccin de nitrato 70
Reactivo para determinar diacetilo en jugo de fruta 71
Reactivo para oxidasa.. 71
Vaspar. 71

MEDIOS DE CULTIVO
Instrucciones generales para su preparacin... 72
Acetamida Agar................................... 73
Almidn Agar...................................... 73
Azul de toluidina DNA Agar.............. 73
Baird Parker Agar................................ 74
Base sangre Agar................................. 75
Bilis Rojo Neutro Cristal Violeta (ABRV) Agar ................... 75
Bilis Rojo Neutro Cristal Violeta Glucosa Agar segn Mossel.. 76
Bismuto Sulfito Agar (Wilson y Blair)................... 76
Buenos Aires Medio (BAM) .................................. 77
Casena Agar... 78
Casoy Caldo........................................................ 79
Carne Cocida Medio Comercial.............................. 79
Carne Cocida Medio................................................ 79
Cerebro Corazn Agar................................................ 80
Cerebro Corazn Caldo........................................... 80
Cetrimida Agar.................................... 80
Citrato de Koser Caldo........................................ 80
55
Citrato de Simmons Agar.................... 81
Clark y Lubs (RMVP) Medio.............. 81
Cristal Violeta Tetrazolium Agar........ 81
Desoxicolato Citrato Agar segn Leifson............... 82
Diclorn Glicerol 18 % (DG18) Agar..................... 82
Dicloran Rosa De Bengala Cloranfenicol (DRBC) Agar 83
Duncan Strong Caldo.......................... 83
Endo Agar........................................... 84
Eosina Azul de Metileno (EMB) Agar segn Levine. 84
Escherichia coli Caldo........................ 84
Esculina Hierro Agar........................... 85
Extracto de Carne Agar....................... 85
Extracto de Carne Caldo. 86
Extracto de Malta Agar... 86
Fermentacin de Azcares Caldo (Aerobios)......... 86
Fermentacin de Azcares Caldo (Anaerobios)..... 86
Fluorocult Agar para Escherichia coli O157:H7.... 87
Fraser Caldo........................................ 87
Gelatina Medio (Aerobios).................. 88
Glucosa Caldo..................................... 88
Grasa de Manteca Agar....................... 89
Hgado + Hgado Caldo.......................................... 89
Hgado de Ternera Agar.................................. 89
Infusin de Cerebro Corazn Caldo 90
Infusin de Corazn Agar................... 90
Infusin de Hgado Caldo................... 91
Investigacin de H
2
S Caldo................ 91
KF Streptococcus Agar....................... 91
KG Agar.............................................. 92
Lactosa Caldo...................................... 93
Lauril Sulfato Caldo............................ 93
Levadura Caldo (Membrana filtrante) 93
Lisina Hierro Agar.............................. 94
Leche Agar.................................................................................. 95
Leche Tornasolada.................................................. 95
Mac Conkey Agar................................................... 96
Mac Conkey Caldo.................................................. 96
Mac Conkey Sorbitol Agar..................................... 97
Manitol Lisina Cristal Violeta (MLCB) Agar......... 97
Manitol Yema de Huevo Polimixina (MYP) Agar. 98
Medio 110 para Estafilococos (Agar Chapman) 98
Modified McBride (MMA) Agar........ 99
Movilidad Agar para........................... 100
Nitrato Caldo....................................... 100
Nitrato Movilidad Buffereado Agar.... 100
Oxford Modificado (MOX) Agar....... 101
Palcam Agar........................................ 101
Papa Dextrosa Agar. 102
56
PE-2 Medio......................................... 102
Pseudomonas: F Agar y P Agar.......... 103
Rappaport Caldo de Enriquecimiento segn Wauters 103
Rappaport Vassiliades Caldo.............. 104
Recuento en placa Agar... 104
Salmonella-Shigella Agar... 104
Selenito Caldo. 105
Selenito Cistina Caldo..... 105
SIM Agar............................................ 106
Suero de Naranja (OSA) Agar........................ 106
Suero de Naranja (OSB) Caldo........... 107
Sulfito Hierro Agar...................................................... 107
Sulfito Hierro Neomicina Agar............................... 107
Sulfito Polimixina Sulfadiazina (SPS) Agar... 107
Termoacidurans (TAA) Agar.............. 108
Tetrationato Caldo segn Mueller-Kauffmann... 108
Tioglicolato Caldo............................... 109
Triple Azcar Hierro (TSI) Agar............ 109
Tributirina Agar.................................. 111
Triptona Glucosa (GTA) Agar............ 111
Triptona Glucosa (GTB) Caldo........... 111
Triptona Sulfito Clicloserina (TSC) Agar... 112
Triptona Sulfito Neomicina (TSN) Agar 112
Urea Caldo.......................................... 112
UVM Caldo........................................ 113
Verde Brillante 2% Sales Biliares (BRILA) Caldo 113
Verde Brillante Rojo Fenol Lactosa Sacarosa (BPLS) Agar...... 113
Verde Brillante Rojo Fenol Lactosa Sacarosa (BPLS) Agar modificado... 114
Xilosa Lisina Desoxicolato (XLD) Agar 115
YGC Agar.............................................. 115

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TABLAS

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Tabla 2. Gneros de Enterobacteriaceae con especial referencia a su origen fecal o no fecal, a su
patogenicidad por va digestiva y a su puesta en evidencia por varias pruebas

Gnero Predominantemente
de origen fecal (F), de
origen no fecal (-), o
de ambos orgenes (a)
Detectada por las pruebas de
coliformes:
+ =la mayora de las cepas
v = variable
(-) = casi ninguna cepa
Patogenicidad:
P = la mayora de las cepas patgenas
por va digestiva para el hombre
p = pocas especies entero-patgenas
(-) = casi ninguna especie
enteropatgena
Arizona F V P
Citrobacter (-) + (-)
Edwardsiella F (-) P (p)
Enterobacter (-) + (-)
Erwinia (-) (-) (-)
Escherichia F + p
Hafnia a (-) (-)
Klebsiella a + p
Proteus a (-) p
Providencia (-) (-) p
Salmonella F (-) P
Serratia (-) (-) (-)
Shigella F (-) P
Yersinia F (-) P (p)

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60
Tabla 4
Principales bacterias patgenas (o toxinas) causantes de toxiinfecciones alimentarias
a
Microorganismo Frecuencia Distribucin Vehculos
b

Factores secundarios que
influyen en la severidad del
programa del muestreo
I MUY PELIGROSOS

Clostridium botulinum
(Botulismo)
Poco frecuente cuando
existe un control eficaz de
los alimentos
Muy extendido Alimentos (enlatados o
curados) elaborados
defectuosamente; productos
crnicos; pescado crudo y
ahumado
Alta mortalidad; el reconoci-
miento rpido y tratamientos
especficos pueden ser
esenciales para la
supervivencia del enfermo
Salmonella typhi
Salmonella paratyphi y
S. choleraesuis
(Fiebres tficas y
paratficas)
Endmica en muchas
partes del mundo;
ocasionalmente
epidmica
Mundial Agua; leche y productos
lcteos crudos; productos
crnicos y verduras
Dosis infectivas bajas;
requiere cuidados mdicos
prolongados; puede
transmitirse por portadores
(especialmente S. typhi)
Shigella dysenteriae I
c

(Shigae)
(Shigelosis, disentera de
Shiga)
Espordica o epidmica Amrica Central;
Mjico, Africa del Norte
y Central, Japn y
Sureste asitico
Agua, verduras y ensaladas Alta mortalidad; se
diagnostica con frecuencia
errneamente
Vibrio comma
(Clera)
Espordica, endmica y
epidmica
ocasionalmente
Asia, Oriente Medio,
Africa del Norte y
Central
Agua, alimentos diversos
Brucella melitensis
(Brucelosis)
Moderadamente rara pero
endmica ocasionalmente
Pases del Mediterrneo Leche y queso de cabra Convalecencia con frecuencia
prolongada
Clostridium perfringens
tipo C
(Enteritis necrtica)
Rara Espordica en Europa,
Nueva Guinea
Carnes cocidas
Virus de la hepatitis
infecciosa
d

Frecuente Mundial Agua, leche y productos
lcteos, ensaladas, verduras y
mariscos
Muy grave para enfermos
hepticos; larga duracin

Tabla 4 (continuacin)
a
b

programa del muestreo
II MODERADAMENTE PELIGROSOS: DIFUSION POTENCIALMENTE EXTENSA
e

Salmonella typhimurium y
otras especies de
salmonelas
(Salmonelosis)
Frecuente Mundial Carne de aves y huevos; otro
tipo de carnes; otros muchos
alimentos
Grave en individuos jvenes
y viejos
Shigella (ver Seccin I)
(Shigelosis, Disentera de
Flexner y Sonne)
Frecuente, endmica en
ciertas reas
Mundial Agua, ensaladas, frutas Grave en individuos jvenes
y viejos; es difcil aislar el
microorganismo del alimento
Vibrio parahaemolyticus Frecuente en Japn; en
todo el mundo est
aumentando la incidencia
Lejano Oriente.
Probablemente muy
extendido
Pescado procedente del mar;
crustceos
El peligro es ms grave
cuando procede de pescado
crudo o inadecuadamente
cocido
Escherichia coli
(Enteropatgeno)
Est aumentando en
diversas reas
Extendido probable-
mente por todo el
mundo
Carnes; leche y productos
lcteos crudos
Grave en individuos jvenes
Estreptococos
-hemolticos
Enfermedad alimentaria
poco frecuente
Muy extendido Leche y productos lcteos
crudos; ensaladas de huevo
Ciertos grupos del tipo A
pueden causar faringitis agua,
nefritis, artritis y complica-
ciones cardiovasculares
61
Tabla 4 (continuacin)
a
b

muestreo
III MODERADAMENTE PELIGROSOS: DIFUSION LIMITADA
e

Bacillus cereus Est aumentando en
diversas reas
Extendido
probablemente por todo
el mundo
Productos reconstituidos
derivados de los cereales;
leche; pudn y natilla; arroz

Brucella abortus Espordica en varias
partes del mundo
Muy extendido Leche y crema crudas; queso
fresco

Clostridium perfringens Frecuente Extendido
probablemente por todo
el mundo
Carnes cocidas
Staphylococcus
(enterotoxignico)
(intoxicacin
estafiloccica)
Frecuente Mundial Jamn y otros productos
crnicos; pasteles de crema y
alimentos cocidos; postres y
salsas; platos preparados con
leche, queso y huevos;
crustceos

a Consltese la obra de Bryan (1971) para mayor informacin sobre las enfermedades alimentarias
b Vanse las Conclusiones de la Comisin Mixta FAO/WHO (1970) para mayor informacin sobre las enfermedades transmitidas por la leche
c Shigella dysenteriae causa, a veces, una enfermedad leve
d El virus an no se ha aislado a partir de alimentos
e Vanse las Conclusiones de la pg. 40 para la explicacin de difusin limitada y extensa

Tabla 5
Programas de muestreo recomendados para combinaciones de diferentes grados de peligrosidad para la salud y diversas
condiciones de manipulacin (es decir, las 15 categoras)

Condiciones en que se espera el alimento sea manipulado y consumido despus del muestreo
a

Grado de importancia en
relacin con la alteracin y
el peligro para la salud

Condiciones que reducen el
grado de peligrosidad
Condiciones que no modifican el
grado de peligrosidad
Condiciones que pueden aumentar la
peligrosidad
Sin peligro directo para la
salud
Vida til y alteracin

Aumento de la vida til
Categora 1
3-clases n = 5, c = 3
Sin modificacin
Categora 2
3-clases n = 5, c = 2
Reduccin de la vida til
Categora 3
3-clases n = 5, c = 1
Peligro para la salud bajo,
indirecto (indicadores)

Peligrosidad reducida
Categora 4
3-clases n = 5, c = 3
Sin modificacin
Categora 5
3-clases n = 5, c = 2
Peligrosidad aumentada
Categora 6
3-clases n = 5, c = 1
Moderado, directo, difusin
limitada
b

Categora 7
3-clases n = 5, c = 2
Categora 8
3-clases n = 5, c = 1
Categora 9
3-clases n = 10, c = 1
Moderado, directo, difusin
potencialmente extensa
b

Categora 10
2-clases n = 5, c = 0
Categora 11
2-clases n = 10, c = 0
Categora 12
2-clases n = 20, c = 0
Grave, directo
Categora 13
2-clases n = 15, c = 0
Categora 14
2-clases n = 30, c = 0
Categora 15
2-clases n = 60, c = 0

a Deben emplearse programas de muestreo ms rigurosos para alimentos delicados destinados a poblaciones especialmente sensibles.
b Vase Conclusiones, pg. 40 para la explicacin de difusin extensa y limitada
62
Tabla 6
Interrelacin entre las categoras (grado de importancia)
a
y el tipo de alimento, pruebas microbiolgicas y condiciones de
tratamiento del alimento (se ofrecen ejemplos de diversos tipos de alimentos)

Tipo de problema
Influencia de las
condiciones
Cate-
gora
Producto alimenticio
Pruebas
microbiolgicas
Tipo de tratamiento a que se someter el
alimento
Alteracin y vida til Peligrosidad
reducida
1 Pescado fresco congelado
Huevos congelados
SPC Se someter a coccin antes de su consumo
Se utilizarn como ingrediente en productos
que se tratarn por el calor (p. ej., tartas)
Alimentos preparados
congelados
SPC Se consumirn inmediatamente despus de la
descongelacin y debidamente cocinados
Alim. desecados en polvo
(leche, alim. para emergenc.)
SPC Se consumirn inmediatamente despus de la
reconstitucin y tratados por el calor
Sin modificacin
en la peligrosidad
2 Pescado ahumado refrig.
Frutas secas
SPC
Mohos, levaduras
Se consumirn sin coccin
Embalaje correcto; almacenam. bajo condi-
ciones que garantizan la impermeabilidad del
agua
Clara de huevo congel. SPC Almacenam. bajo congelacin; se sometern
a tratamiento trmico o se consumirn
inmediatamente despus de la descongelacin
Colas de langosta y gambas
cocidas y congeladas
SPC Almacenamiento bajo congelacin; su
consumo se realizar tras la descongelacin
Peligrosidad
aumentada
3 Alim. desecados en polvo SPC Embalaje defectuoso o a granel; almacena-
miento bajo condiciones hmedas
Nueces, granos, frutas secas
Carnes frescas
Mohos
SPC
Almacenamiento bajo condiciones hmedas
Almacenamiento excesivo; refrigeracin dis-
continua o inadecuada
Conservas de carnes curadas Abombamientos Almacenamiento a temperatura ambiente
normal
Verduras y mezcla de las
mismas enlatadas
Termfilos Almacenamiento a temperaturas elevadas
Alimentos congelados SPC Sospecha de almacenamiento inadecuado
bajo congelacin; perodo de descongelacin
largo
Peligro para la salud
indirecto y escaso
(microorg.
indicadores)
Peligrosidad
reducida
4 Egletin ahumado y Refrig. Coliformes fecales
Estafilococos
b

Se sometern a coccin
Verduras escaldadas y
congeladas
SPC
Coliformes
Queso Colif. fecales Destinado a la fabricacin de queso fundido
Alimentos desecados Coliformes Destinados a la preparacin de productos que
se sometern a tratamiento trmico
Gambas crudas congeladas Coliformes
Estafilococos
b
Se sometern a coccin u otro tipo de
tratamiento trmico antes del consumo
Sin modificacin
en la peligrosidad
5 Verduras frescas o
refrigeradas
Coliformes Se consumirn crudas
Pescado ahumado Refrig. Colif. fecales Almacenamiento a temperatura ambiente
Carne de cangrejo de mar
preparada a mano y
sometida a coccin
Coliformes
Estafilococos
b

No se someter a coccin antes del consumo
Leche en polvo
c
SPC
Coliformes
Se consumir inmediatamente despus de su
reconstitucin
Verduras congeladas SPC
Coliformes
Se consumirn cocidas insuficientemente
Gambas cocidas
congeladas
Coliformes
Estafilococos
b

Ser consumirn inmediatamente despus de
la descongelacin
Platos precocinados
congelados
SPC
Coliformes
Se consumirn cocidos insuficientemente
Peligrosidad
aumentada
6 Marisco fresco o
congelado
Coliformes En el caso en que las aguas estn
contaminadas o no se hayan analizado
(pueden contener salmonelas, etc.)
Leche en polvo, alimentos
para emergencias
SPC
Coliformes
Estafilococos
b

El control, tras la reconstitucin, ser escaso
Alimentos congelados en
general
SPC
Coliformes
En los pases que tienen una cantidad
insuficiente de congeladores

63
Tabla 6 (Continuacin)

Tipo de problema
Influencia de las
condiciones
Cate-
gora
Producto alimenticio
Pruebas
microbiolgicas
Tipo de tratamiento a que se someter el
alimento
Peligro directo para la
salud pero moderado
(difusin limitada)
Peligrosidad
reducida
7 Carne o productos crnicos
desecados
Estafilococos
b
Se sometern a tratamiento trmico tras la
reconstitucin
Platos cocinados y
congelados
Estafilococos
b
Se volvern a calentar de una forma eficaz
Sin modificacin
en la peligrosidad
8 Ensaladas de verduras
refrigeradas o congeladas
Salmonella Se consumirn crudas
Pescado ahumado
refrigerado
Estafilococos
b
Almacenamiento, con frecuencia a tempe-
ratura ambiente
Alimentos desecados,
leche en polvo
Estafilococos
b
Se consumirn inmediatamente despus de la
reconstitucin
Helados Estafilococos
b
Se consumirn congelados
Queso fabricado con leche
pasteurizada
Estafilococos
b
Almacenamiento habitual
Postres congelados Salmonella Se consumirn sin descongelar
Peligrosidad
aumentada
9 Carne cocida C. perfringens No se refrigerar inmediatamente
Alimentos amilceos
cocidos, mayonesa
B. cereus Su consumo no se efectuar inmediatamente
Queso Estafilococos
b
Se aadir a otros alimentos
Leche en polvo, alimentos
para emergencias
Estafilococos
b
El control, tras la reconstitucin, ser
inadecuado
Peligrosidad
reducida
10 Carne cruda Salmonella Se someter a coccin Peligro directo para la
salud pero moderado
(difusin potencial-
mente extensa)
Verduras frescas Salmonella
Shigella
Productos derivados del
huevo
Salmonella Se sometern a coccin
Sin modificacin
en la peligrosidad
11 Pescado fresco y
congelado
V. parahaemolyticus En los pases en que se consumen crudos
Pescado de agua dulce
procedente de zonas
clidas
Salmonella Se sometern a refrigeracin
Marisco cocido y
congelado
V. parahaemolitycus Se consumirn directamente tras la
descongelacin
Peligrosidad
aumentada
12 Carne cruda Salmonella Refrigeracin inadecuada y contaminaciones
cruzadas
Pescado fresco y
congelado
V. parahaemolitycus Se destinarn a la preparacin de productos
fermentados y se consumirn sin coccin
Peligro directo y
grave para la salud
Peligrosidad
reducida
13 Carnes perecederas C. botulinum Refrigeracin
Carne de ave; huevos en
polvo
Salmonella Cuando estn destinados a individuos
sensibles (por ej., hospitales); se sometern a
coccin antes del consumo
Verduras crudas

V. comma
Sh. dysenteriae I
En el caso de que las reas sean endmicas o
epidmicas excepto si se someten a coccin
antes del consumo
Sin modificacin
en la peligrosidad
14 Marisco S. typhi En el caso de que se trate de reas endmicas
o epidmicas o de aguas contaminadas y
siempre que su consumo se efecte sin
coccin (en crudo)
Queso elaborado con leche
pasteurizada
Enterotoxina
estafiloccica
Cuando su destino sea comunidades sensibles
Peligrosidad
aumentada
15 Pescado ahumado C. botulinum E Las condiciones habituales de refrigeracin
pueden permitir la formacin de toxina
Semiconservas de carne tal
como jamn enlatado
C. botulinum B Almacenamiento a temperaturas templadas;
insuficiente cantidad de sal o nitritos;
almacenamiento habitual
Alimentos poco cidos
enlatados
C. botulinum A y B Alimentos procedentes de fbricas en las que
el control del tratamiento sea inadecuado
64
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Ferramola, Examen bacteriolgico de aguas,1947
66
MPN index and 95% confidence limits for various combinations of positive results when various
numbers of tubes are used. (Inocula of 0.1, 0.01, and 0.001g)

3 Tubes per dilution 5 Tubes per dilution
95% Confidence
limits
95% Confidence
limits
Combination
of positives
MPN index
per g
Lower Upper MPN index
per g
Lower Upper

0-0-0 <3 <0.5 <9 <2 <0.5 <7
0-0-1 3 <0.5 9 2 <0.5 7
0-1-0 3 <0.5 13 2 <0.5 7
0-2-0 - - - 4 <0.5 11
1-0-0 4 <0.5 20 2 <0.5 7
1-0-1 7 1 21 4 <0.5 11
1-1-0 7 1 23 4 <0.5 11
1-1-1 11 3 36 6 <0.5 15
1-2-0 11 3 36 6 <0.5 15
2-0-0 9 1 36 5 <0.5 13
2-0-1 14 3 37 7 1 17
2-1-0 15 3 44 7 1 17
2-1-1 20 7 89 9 2 21
2-2-0 21 4 47 9 2 21
2-2-1 28 10 150 - - -
2-3-0 - - - 12 3 28
3-0-0 23 4 120 8 1 19
3-0-1 39 7 130 11 2 25
3-0-2 64 15 380 - - -
3-1-0 43 7 210 11 2 25
3-1-1 75 14 230 14 4 34
3-1-2 120 30 380 - - -
3-2-0 93 15 380 14 4 34
3-2-1 150 30 440 17 5 46
3-2-2 210 35 470 - - -
3-3-0 240 36 1,300 - - -
3-3-1 460 71 2,400 - - -
3-3-2 1,100 150 4,800 - - -
3-3-3 >1,100 >150 >4,800 - - -

FAO, Manual of Food Control Quality. Microbiological Analysis, 1992.

67

METODOS DE TINCION

TINCION DE GRAM-NICOLE

-Primer colorante: Violeta de Genciana

Solucin A:
Violeta de Genciana ........................................1,0 g
Alcohol etlico...............................................10,0 ml

Solucin B:
Fenol................................................................1,0 g
Agua destilada.............................................100,0 ml

Se mezclan las soluciones A y B

-Mordiente: Solucin de Lugol

Yodo................................................................1,0 g
Yoduro de Potasio...........................................2,0 g
Se disuelve primero el yoduro en poca agua, se agrega luego el yodo y una vez disuelto se agrega
el resto del agua.

-Segundo colorante (de contraste): Fucsina Bsica

Fucsina Bsica.................................................0,1 g

Mtodo:

1- Extender y fijar el material sobre un portaobjetos limpio, desengrasado y seco.
2- Cubrir el preparado durante un minuto con el primer colorante, volcar el colorante y lavar
con agua corriente.
3- Cubrir el preparado con el mordiente, dejarlo actuar por un minuto y volcar el exceso.
4- Decolorar con alcohol durante 10 segundos y lavar con agua.
5- Colorear durante 30 segundos con el segundo colorante, lavar con agua y secar.
6- Examinar al microscopio usando objetivo de inmersin.

68
TINCION NEGATIVA

Es un mtodo muy sencillo y eficaz para poner de manifiesto la forma externa de las bacterias en
una extensin. Las bacterias quedan rodeadas de una fina capa de colorante negro y aparecen
como objetos blancos sobre fondo gris.

Mtodo:

1- Se prepara una extensin muy fina de la forma habitual utilizando un portaobjetos limpio,
desengrasado y seco.
2- Se coloca en un extremo del portaobjetos una gota de solucin de nigrosina al 10%.
3- Se toma otro portaobjetos y se apoya sobre el primero formando un ngulo de 30 y tocando
la gota de nigrosina. Luego se pasa resbalando, arrastrando la gota de nigrosina, de forma que se
extienda por toda la superficie del portaobjetos. De esta manera, la extensin queda cubierta de
una fina pelcula de colorante.
4- Se deja secar el colorante y se examina la preparacin con objetivo de inmersin.

DEMOSTRACION DE CAPSULAS BACTERIANAS

Mtodo de la Nigrosina

La tcnica de tincin negativa puede usarse en conjuncin con una tcnica de tincin simple con
el fin de poner de manifiesto la presencia de cpsulas. En este caso, la extensin debe cubrirse
con fucsina fenicada diluida, lavarse y secarse, antes de hacer el tratamiento con nigrosina.

Mtodo con Tinta China

1- Se coloca un ansa de tinta china sobre un portaobjetos muy limpio.
2- Se mezcla con la tinta china una pequea porcin del cultivo bacteriano o de la suspensin.
3- Se coloca un cubreobjetos sobre la mezcla, cuidando que no se formen burbujas de aire, y se
presiona firmemente con un papel de filtro hasta que la pelcula de lquido sea muy fina.
4- Se examina con objetivo seco de gran aumento o con objetivo de inmersin.
La cpsula se ver como una zona clara en torno a la bacteria.

Nota: Siempre debe prepararse y examinarse una pelcula de tinta china como testigo.

69
TINCION DE ESPORAS BACTERIANAS

Tcnica de Wirtz, modificada por Shaeffer y Fulton

-Solucin acuosa de Verde de Malaquita al 5%.
-Solucin acuosa de Safranina al 0,5%.

Mtodo:

1- Extender y fijar el material sobre un portaobjetos limpio, desengrasado y seco.
2- Verter la solucin de Verde de Malaquita sobre la preparacin, calentar hasta emisin de
vapores durante 5 minutos (no hervir). Lavar con agua.
3- Colorear por 30 segundos con la solucin de Safranina. Lavar con agua y secar.
4- Observar al microscopio con objetivo de inmersin. Las esporas aparecen coloreadas en verde
y los cuerpos de las bacterias en rojo.

TINCION DE BACTERIAS EN LECHE

Reactivos:
- Solucin colorante: se prepara una solucin al 2% de azul de metileno en alcohol absoluto a
96. Se toman 30 ml de esta solucin madre y se diluyen con 100 ml de agua destilada.
- Desengrasante: xileno.
- Fijador: alcohol absoluto.

Mtodo:
A partir de los extendidos bacterianos de Breed-Newman se procede a la tincin de la siguiente
forma:

1- Luego de la fijacin a 45C se desengrasa el portaobjetos sumergindolo durante 5 minutos en
xileno. Secar al aire.
2- Para fijar, se coloca el portaobjetos en alcohol absoluto durante 2-3 minutos.
3- Sin dejar secar el alcohol, se introduce el portaobjetos en la solucin colorante y se deja all
durante 30 segundos. Luego se lava sucesivas veces con agua, contenida en un vaso de
precipitados, hasta que la misma permanezca lmpida.

OBSERVACION DE MOVILIDAD DE BACTERIAS

Se observa en preparados frescos sin colorear.

Observacin en gota pendiente:

A partir de un cultivo reciente (de 18 a 24 horas) se toma un ansa de material que se coloca sobre
un cubreobjetos; se invierte ste sobre la excavacin de un portaobjetos excavado y se lo adhiere
con vaselina. Se observa de inmediato en seco con objetivo de gran aumento.

70
SOLUCIONES Y REACTIVOS

SOLUCION DE CLORURO DE TRIFENILTETRAZOLIO (TTC) AL 1%

Esterilizar 3 ml de agua destilada. Una vez fra, agregarle 30 mg de TTC. Disolver y guardar en
heladera.

SOLUCION DE TETRACICLINA (400 ppm)

Pesar 40 mg de tetraciclina y llevar a 100 ml con agua estril en un matraz aforado. Disolver y
guardar en heladera.
Usar al 10 %. Concentracin final: 40 ppm.

SOLUCION DE TELURITO DE POTASIO (3,5 %)

Se disuelven 350 mg de telurito de potasio en 10 ml de agua estril. Guardar en heladera.

REACTIVO DE KOVACS

Se disuelven, en bao mara, 5 g de p-dimetilaminobenzaldehdo en 75 ml de alcohol amlico.
Luego aadir lentamente y bajo campana 25 ml de HCl concentrado. Guardar en frasco oscuro y
en heladera.

REACTIVO DE VOGES-PROSKAUER

a) Solucin de KOH al 40 %
Se disuelven 40 g de KOH en 100 ml de agua destilada.
b) Solucin de -naftol al 5 %
Se disuelven 5 g de -naftol en 100 ml de alcohol etlico.

Ambos reactivos deben guardarse en frasco oscuro y en la heladera.

REACTIVO PARA LA PRUEBA DE REDUCCION DE NITRATO

Solucin A:
Se disuelven 8 g de cido sulfanlico en 1000 ml de cido actico 5 N.
Solucin B:
Se disuelven 5 g de -naftol en 1000 ml de cido actico 5 N.

Se agregan 0,5 ml de la solucin A y 4 gotas de la solucin B por 9 ml de medio sembrado e
incubado.
71
REACTIVO PARA DETERMINAR DIACETILO EN JUGO DE FRUTA

a) Solucin de KOH 40 % con creatinina
Disolver 40 g de KOH en 100 ml de agua destilada. Agregar 0,3 g de creatinina en el
momento de usar, y agitar hasta disolucin.
b) Solucin de -naftol 5 %
Disolver 5 g de -naftol en 100 ml de isopropanol de 99 % de pureza.

Guardar ambos reactivos en la heladera.

REACTIVO PARA OXIDASA

Reactivo de Carpenter, Suhrland y Morrison:

Oxalato de p-aminodimetilanilina .........................1,0 g
H
2
O destilada ....................................................100,0 ml

Disolver 1 g del reactivo en menos de 100 ml de agua destilada. Calentar suavemente hasta su
disolucin. Pasar a un frasco volumtrico y agregar agua destilada c.s.p. 100 ml.
Dejar descansar 15 minutos antes de su empleo. Si se guarda en frasco de vidrio de color
caramelo, tapado, la solucin acuosa se mantiene estable por lo menos 6 meses.

VASPAR

Mezclar en partes iguales vaselina y parafina.
72
MEDIOS DE CULTIVO

Instrucciones generales para su preparacin

1. Agregar los ingredientes pesados en la cantidad de agua destilada que se indique.

2. Ayudar a la disolucin de los ingredientes, dejando que se hidraten por 15 minutos.

3. Disolver los ingredientes completamente por ebullicin con frecuente agitacin.

4. Enfriar el medio de cultivo a temperatura ambiente si es un caldo, o a 50C si es un agar; si
es necesario, reponer el agua que se hubiera evaporado.

5. Clarificar la solucin por sedimentacin o por filtracin, si es necesario.

6. Ajustar el pH del medio, de forma de obtener el pH deseado, despus de autoclavar.
En los medios no amortiguados, el descenso de pH es generalmente 0,1-0,2 unidades por
autoclavado. Efectuar el ajuste de pH empleando soluciones de NaOH 1N y HCl 1N para la
mayor parte de los medios.

7. Distribuir el medio de cultivo en el recipiente a autoclavar, sean tubos, botellas o
erlenmeyers.

8. Esterilizar en autoclave a 121C durante 15 minutos. Estas condiciones pueden variar para
algunos medios de cultivo. Cuando as suceda, se aclarar inmediatamente debajo de la
composicin.
73
ACETAMIDA AGAR

Acetamida...... .................................................2,0 g
Sulfato magnsico ....................................... 0,158 g
Cloruro sdico ................................................0,2 g
Sulfato ferroso ..........................................0,0005 g
Fosfato dipotsico ..........................................0,2 g
Molibdato sdico ........................................0,005 g
Agar-agar .....................................................15,0 g
Agua destilada ................................................1,0 l

Disolver los ingredientes en el agua destilada a temperatura ambiente. Comprobar el pH y en
caso de ser necesario ajustarlo. Esterilizar en autoclave.

Este medio contiene adems de algunas sales inorgnicas, acetamida como nica fuente de
carbono y nitrgeno. En l solo pueden crecer microorganismos que puedan aprovechar la
acetamida. Muchos de ellos, lo hacen formando amoniaco, lo que puede utilizarse como
caracterstica taxonmica, por ejemplo, para la diferenciacin de las especies de Pseudomonas.

ALMIDON AGAR

Extracto de carne.............................................3,0 g
Peptona............................................................5,0 g
Almidn soluble ..............................................2,0 g
Agar-agar.......................................................15,0 g
Agua destilada.................................................1,0 l

Disolver los ingredientes en el agua destilada, llevar a ebullicin agitando regularmente, calentar
3-4 minutos hasta disolucin. Enfriar a 50-60C. Esterilizar en autoclave.

Este medio se utiliza para identificar microorganismos que degradan el almidn.
La hidrlisis del almidn se evidencia cubriendo la placa con una solucin de Lugol (I
2
-KI). Se
forma un complejo color azul con el almidn, ausente en las zonas donde hubo hidrlisis. Si las
colonias son almidn positivas, aparece un halo transparente alrededor de las mismas.

AZUL DE TOLUIDINA DNA AGAR

Buffer TRIS 0,005M.......................................1,0 l
DNA................................................................0,8 g
Agar-agar...............................................10,0 g
Solucin de CaCl
2
0,01M................................1,0 ml
NaCl ..............................................................10,0 g
Solucin de azul de toluidina 0,1M...............30,0 ml

Disolver completamente el DNA y el agar en el buffer a ebullicin. Agregar la solucin de azul
74
de toluidina. Dividir la mezcla en volmenes ms pequeos y conservar a temperatura ambiente.
La mezcla es muy estable, se conserva durante cuatro meses a temperatura ambiente.

Este medio se utiliza para evidenciar DNAsa microbiana. Sirve para la identificacin de
microorganismos DNAsa positivos, sobre todo de estafilococos coagulasa positivos.

El cido desoxirribonucleico forma un complejo color azul con el azul de toluidina, ausente en
las zonas donde hubo hidrlisis. Las colonias DNAsa positivas hidrolizan a su alrededor al cido
desoxirribonucleico contenido en el medio de cultivo. Dichas colonias aparecen rodeadas por
halos rosados luminosos en contraste con el resto del medio de cultivo, que permanece azul. Los
microorganismos DNAsa negativos no forman halo. Se incuba 18 a 24 horas a 37C.

BAIRD PARKER AGAR

Triptona .........................................................10,0 g
Extracto de levadura........................................1,0 g
Piruvato de sodio...........................................10,0 g
Glicina .............................................................5,0 g
LiCl..................................................................5,0 g
Agar-agar.......................................................15,0 g
Agua destilada.................................................1,0 l

Esterilizar en autoclave. Enfriar a 50C y agregar 50 ml de suspensin de yema de huevo y 3 ml
de telurito de potasio al 3,5 %.
pH = 7,00,2
El medio completo debe usarse dentro de las 48 h de preparado. Largos perodos de
almacenamiento reducen su selectividad. Este efecto puede ser revertido por el agregado al
medio preparado de una solucin de piruvato de sodio al 20 %, para obtener una concentracin
final del 1 %. El medio base libre de piruvato es estable durante un mes. En el momento de ser
usada, se cubre la placa con 0,5 ml de solucin de piruvato de sodio al 20 % y se seca a 50C.

Emulsin yema de huevo
Sumergir el huevo en solucin alcohlica al 70 % durante media hora. Romperlo aspticamente
y separar la yema en una probeta estril. Se agrega a la misma un volumen igual de NaCl 0,85
%. Este medio se emplea para el aislamiento e identificacin de estafilococos coagulasa
positivos. El medio contiene telurito de potasio y cloruro de litio como inhibidores de la flora
acompaante. El piruvato de sodio y la glicina favorecen el crecimiento de los estafilococos. El
medio de cultivo es opaco debido a su contenido en yema de huevo. Las colonias de
estafilococos coagulasa positivos muestran las siguientes caractersticas diagnsticas: estn
rodeadas por una zona opaca de precipitacin formada por sales de calcio y magnesio de los
cidos grasos liberados por liplisis. Est seguida de un halo claro debido a la actividad
proteoltica. Ambas caractersticas constituyen la reaccin yema de huevo. Las colonias
presentan generalmente centro negro debido a la reduccin de telurito a teluro. La reaccin
yema de huevo y la reduccin de telurito se correlacionan bien con la presencia de coagulasa
y, por lo tanto, pueden utilizarse como ndices de la misma.

75
BASE SANGRE AGAR

Infusin de corazn.....................................500,0 g
Triptosa..........................................................10,0 g
NaCl ...............................................................l5,0 g
Agar-agar.......................................................15,0 g
Agua destilada.................................................1,0 l
pH = 6,8

Esterilizar en autoclave, dejar enfriar a 45C, incorporar 6 % de sangre desfibrinada y verter en
placas.

Este medio se utiliza para el cultivo y aislamiento de microorganismos, sobre todo patgenos, y
para la determinacin de sus formas hemolticas. Su abundante base nutritiva ofrece condiciones
ptimas de crecimiento de todos los microorganismos presentes. El valor de pH es especialmente
favorable para la formacin de halos de hemlisis.
Incubacin: 24 a 48 h a 37C.

BILIS ROJO NEUTRO CRISTAL VIOLETA (ABRV) AGAR

Peptona............................................................7,0 g
Sales biliares....................................................1,5 g
Lactosa ..........................................................10,0 g
NaCl ................................................................5,0 g
Agar-agar.......................................................15,0 g
Rojo neutro................................................... 0,03 g
Cristal Violeta ............................................ 0,002 g
Agua destilada.................................................1,0 l
pH = 7,4

Este medio se utiliza para el aislamiento y enumeracin del grupo coliformes, inclusive E. coli, a
partir de alimentos, agua y otros. El cristal violeta junto con las sales biliares inhiben el
crecimiento de la flora acompaante Gram positiva. La degradacin de lactosa a cido se pone
de manifiesto por el viraje al rojo del indicador de pH rojo neutro, y por un halo de precipitacin
de sales biliares alrededor de las colonias. Las colonias de coliformes en este medio son rojas
oscuras, no menores de 0,5 mm de dimetro, con un halo de precipitacin rojizo. Aparecen entre
las 242 horas de incubacin a 32C. Para la expresin de resultados es conveniente contar las
placas conteniendo entre 15 y 150 colonias. En placas con excesivo crecimiento, las colonias de
coliformes pueden presentar caractersticas atpicas o medir menos de 0,5 mm de dimetro.
Adems, en estas placas, algunas colonias de levaduras y bacterias no coliformes son
comparables en color y tamao a las de los coliformes. En tales casos, es necesario realizar una
prueba confirmatoria. Esta consiste en inocular la colonia en un tubo de fermentacin que
contiene caldo Verde Brillante 2 % sales biliares. La formacin de gas entre las 482 horas de
incubacin a 32C confirma la presencia de coliformes.

76
BILIS ROJO NEUTRO CRISTAL VIOLETA GLUCOSA AGAR segn Mossel

Peptona de carne..............................................7,0 g
NaCl ................................................................5,0 g
Glucosa..........................................................10,0 g
Sales biliares....................................................1,5 g
Rojo neutro....................................................30,0 mg
Cristal Violeta .................................................2,0 mg
Agar-agar.......................................................13,0 g
Agua destilada.................................................1,0 l
pH 7,30,2

Este medio se utiliza para la enumeracin de grmenes totales tipo enterobactericeas en
alimentos. El Cristal Violeta y las sales biliares inhiben considerablemente la flora acompaante.
La degradacin de la glucosa con formacin de cido se pone de manifiesto por el viraje del
indicador de pH al rojo y eventual precipitacin de cidos biliares alrededor de las colonias
correspondientes. Todas las enterobactericeas degradan glucosa, por lo tanto son fcilmente
reconocibles en este medio. Sin embargo algunos grmenes que crecen al mismo tiempo, como
Aeromonas, pueden dar la misma reaccin. Las colonias sospechosas de ser enterobactericeas
deben ser reinvestigadas para su confirmacin.
La incubacin es de 18 a 24 h a 37C.

BISMUTO SULFITO AGAR (WILSON Y BLAIR)

Peptona............................................................ 10 g
Extracto de carne............................................... 5 g
Dextrosa ............................................................ 5 g
Na
2
HPO
4
(anh.) ................................................. 4 g
FeSO
4
(anh.) ................................................... 0,3 g
Bismuto sulfito.................................................. 8 g
Verde Brillante ........................................... 0,025 g
Agar................................................................. 20 g
Agua destilada.................................................... 1 l

Este medio se utiliza para el aislamiento y diferenciacin de Salmonella tiphy y otras salmonelas.
El verde brillante y el bismuto sulfito inhiben a los grmenes acompaantes. Las colonias de
salmonelas sulfhdrico positivas presentan ennegrecimiento debido al sulfuro de hierro. La
reduccin de los iones bismuto a bismuto metlico produce brillo metlico alrededor de las
correspondientes colonias, que suele aparecer a las 48 h de incubacin. Las colonias tpicas de
salmonelas (excepcin de Salmonella paratiphy A y S. pollarum) son con centro negro, borde
claro, precipitado negro con brillo metlico alrededor de las colonias (ojo de conejo u ojo de
pez).

77
BUENOS AIRES MEDIO (BAM)

(A)
Peptona............................................................2,0 g
Agar-agar.........................................................0,3 g
Agua destilada...............................................93,2 g

(B)
Solucin acuosa de urea 50 %.........................2,0 ml
Indicador de Andrade......................................1,5 ml
Solucin de Azul de Timol..............................0,3 ml
Solucin acuosa de urea 10 %.........................3,0 ml

Se calienta (A) hasta disolucin, se enfra a 20C y se ajusta el pH a 6,8. Esterilizar en autoclave.
Al volumen (A) fundido a 70C, agregar (B) y pasarlo a tubos estriles. Se lleva a bao de agua
hirviente durante diez minutos y se lo enfra rpidamente.

Indicador de Andrade

Fucsina cida..0,25 ml
NaOH 0,1N....................................................16,0 ml

Indicador Azul de Timol

Azul de timol ...................................................1,6 ml
NaOH 0,1N....................................................34,4 ml

Este medio se utiliza para diferenciar entre otras bacterias, E. coli, Enterobacter, Proteus,
Salmonella, Shigella, Klebsiella y Citrobacter.
El medio de cultivo se coloca en tubos pequeos de 3 a 4 ml por tubo. Es semislido y de color
pajizo.
La siembra se realiza por puncin con ansa recta, a partir de cultivos puros.

Este medio permite revelar:

a) La hidrlisis de urea con produccin de lcali, que se evidencia por el viraje al azul del
indicador bsico Azul de Timol.

b) La fermentacin de lactosa con formacin de cido, con o sin formacin de gas. El cido
producido se evidencia por el viraje al rojo del indicador cido de Andrade.

c) La produccin de indol a partir de triptofano. Se evidencia a travs de la reaccin de Kovacs.
El procedimiento consiste en introducir una tirilla de papel de filtro estril en el interior del
tubo ya sembrado, sujetndola con el tapn de algodn.
Luego de la incubacin, se retira el papel y se agrega una gota del reactivo de Kovacs; un
78
color rojizo indica un cultivo positivo, un color amarillo, negativo.

d) La produccin de sulfhdrico a partir de peptonas.
Se evidencia por la formacin de PbS negro en una tirilla de papel de filtro embebida
en acetato de plomo.
Luego de la incubacin, un ennegrecimiento indica un cultivo productor de sulfhdrico.

e) Apreciacin directa de la movilidad.
Se evidencia por un crecimiento difuso a partir de la zona de siembra.
Los resultados son observados a las 24, 48 y 72 horas de incubacin.

Identificacion bacteriana en Medio Buenos Aires

Microorganismo movilidad indol H
2
S gas
Sin cambio de color del
medio de cultivo
Salmonella
Shigella
+ (-)
-
-
- (+)
+ (-)
-
-
-
Cambio de color del
medio de cultivo al azul
Proteus rettgeri
Proteus mirabilis
Proteus morganii
Proteus vulgaris
+
+
+
+
+
-
+
+
-
+
+
+
-
-
-
-
Cambio de color del
medio de cultivo al rojo
Enterobacter
Escherichia
Klebsiella (x)
+
+ (-)
-
-
+
-
-
-
-
+
+
+
Cambio de color al azul
verdoso

Klebsiella pneumoniae - - - -
(x) Despus de 24 horas, puede virar al azul a 36C.
( ) No frecuente.

CASEINA AGAR

NaCl ................................................................5,0 g
Casena ............................................................2,5 g
CaCl
2
............................................................ 0,05 g
Agar-agar.......................................................13,5 g
Agua destilada.................................................1,0 l

Suspender los ingredientes, calentar a bao mara hasta disolucin y mantener 10 minutos.
Esterilizar en autoclave, fraccionar en placas.
pH = 7,2
Se pueden agregar 5-10 g de leche descremada para reforzar turbidez.

Este medio se utiliza para la investigacin de microorganismos proteolticos. Estos son capaces
de degradar la casena, y aparecen con un halo transparente alrededor de las colonias. Si el halo
79
no es muy visible, agregar cido actico 1N, que refuerza la opacidad del medio por
desnaturalizacin de la casena, y se destaca el halo de degradacin.

CASOY CALDO

Peptona de casena ........................................17,0 g
Peptona de harina de soja................................3,0 g
D(+) glucosa....................................................2,5 g
NaCl ................................................................5,0 g
K
2
HPO
4..........................................................................................
2,5 g
Agua destilada.................................................1,0 l
pH 7,3 0,1

Este es un medio de cultivo universal, exento de sustancias inhibidoras, concebido para un
amplio espectro de aplicaciones. Por su rica y abundante base nutritiva, este medio se utiliza para
el cultivo de microorganismos exigentes.

CARNE COCIDA MEDIO COMERCIAL

Peptona..........................................................10,0 g
Extracto de carne...........................................10,0 g
Protena de soja tiernizada.............................30,0 g
NaCl ................................................................5,0 g
Agua destilada.................................................1,0 l

CARNE COCIDA MEDIO

Corazn bovino ...........................................500,0 g
Proteosa peptona ...........................................20,0 g
NaCl ................................................................5,0 g
Glucosa............................................................2,0 g
Agua destilada.................................................1,0 l

Picar la carne, agregar el agua y hervir durante 45 minutos. Incorporar los otros ingredientes y
hervir 10 minutos ms. Filtrar por gasa y llevar a volumen inicial. Dejar en la heladera 24 horas
y separar la grasa solidificada.
Filtrar por papel de filtro, fraccionar en tubos con tapa de rosca (2/3 de carne y 1/3 de caldo).
Esterilizar en autoclave.

Este medio se utiliza para el aislamiento de microorganismos, especialmente anaerobios, a partir
de alimentos. Es un medio rico en nutrientes. Se puede observar ennegrecimiento del medio.

80
CEREBRO CORAZON AGAR

Infusin de cerebro........................................12,5 g
Infusin de corazn.........................................5,0 g
D-(+)-Glucosa .................................................2,0 g
NaCl ................................................................5,0 g
Na
2
HPO
4
........................................................2,5 g
Agar-agar.......................................................15,0 g
Agua destilada.................................................1,0 l

Este medio de cultivo es adecuado para el crecimiento de bacterias exigentes, como
estreptococos. Tambin puede utilizarse para el cultivo de hongos patgenos por adicin de
antibiticos.

CEREBRO CORAZON CALDO

Idem anterior, excepto el Agar-agar.

El caldo es especialmente adecuado para el cultivo de estafilococos destinados al ensayo de
coagulasa y para la realizacin de hemocultivos.

CETRIMIDA AGAR

MgCl
2
..............................................................1,4 g
K
2
SO
4
............................................................10,0 g
Bromuro de N-cetil-N,N,N-trimetilamonio ....0,3 g
Agar-agar.......................................................13,6 g
Glicerol..........................................................10,0 ml
Agua destilada.................................................1,0 l
pH = 7,2

Este medio se utiliza para aislamiento e identificacin de Pseudomonas aeruginosa, a partir de
diversos materiales. La cetrimida es un potente inhibidor de la flora acompaante. Las colonias
de P. aeruginosa forman en este medio un pigmento verde azulado (piocianina), y son
fluorescentes a la luz U.V.

CITRATO DE KOSER CALDO

Fosfato de sodio y amonio ..............................1,5 g
K
2
HPO
4
...........................................................1,0 g
MgSO
4
.............................................................0,2 g
Citrato de sodio ...............................................3,0 g
81
Agua destilada.................................................1,0 l
pH = 6,7

CITRATO DE SIMMONS AGAR

NH
4
H
2
PO
4
.......................................................1,0 g
K
2
HPO
4
...........................................................1,0 g
NaCl ................................................................5,0 g
Citrato de sodio ...............................................2,0 g
MgSO
4
.............................................................0,2 g
Azul de bromotimol ..................................... 0,08 g
Agar-agar.......................................................12,0 g
Agua destilada.................................................1,0 l
pH = 6,6

Este medio se utiliza para la identificacin de microorganismos, especialmente
enterobactericeas, y ciertos hongos, basado en el empleo de citrato como nica fuente de
carbono.
El empleo de citrato por ciertos microorganismos da lugar a una alcalinizacin del medio de
cultivo, lo que se manifiesta por un viraje al azul oscuro del indicador de pH Azul del
bromotimol.
Se incuba 24-48 h a 37C.

CLARK Y LUBS (RMVP) MEDIO

Polipeptona........................................................7,0 g
Glucosa..............................................................5,0 g
K
2
HPO
4
.............................................................5,0 g
Agua destilada...................................................1,0 l
pH = 6,9

Distribuir en tubos. Esterilizar en autoclave.

CRISTAL VIOLETA TETRAZOLIUM AGAR

Agregar al agar para recuento en placa.

Cristal Violeta 0,1%........................................1 ml/l
Cloruro de
2,3,5 trifeniltetrazolium (TTC) 1%.................5 ml/l

Disolver el agar para recuento en placa, agregar el Cristal Violeta y esterilizar en autoclave.
Agregar el TTC estril en forma asptica al agar fundido y enfriado a 45C.

82
Solucin de Cristal Violeta

Cristal Violeta .................................................0,1 g
Etanol ..........................................................100,0 ml

Este medio se utiliza para un ensayo orientativo rpido de bacterias psicrotrficas. Por lo general
las bacterias psicrotrficas son Gram(-), por esa razn se agrega al medio de cultivo el colorante
que inhibe el crecimiento de la flora Gram(+).
Se cuentan como bacterias psicrotrficas aquellas que reducen el TTC a formazano, lo que se
manifiesta por la formacin de colonias rojas.
Incubacin 48 h a 32C.

DESOXICOLATO CITRATO AGAR segn Leifson

Lactosa ..........................................................10,0 g
Na
2
S
2
O
3..........................................................................................
5,4 g
Citrato de Amonio y de Hierro (III) ................1,0 g
Citrato de Sodio...............................................6,0 g
Desoxicolato de Sodio.....................................3,0 g
Rojo Neutro...................................................20,0 mg
Agar-agar.......................................................12,0 g
Agua destilada.................................................1,0 l

Este medio se utiliza para el aislamiento de Salmonellas y Shigellas. Las altas concentraciones
de desoxicolato inhiben la flora Gram (+) y los coliformes resultan inhibidos ms o menos
intensamente. Las Salmonellas crecen sin obstculos, algunas Shigellas son algo inhibidas. La
degradacin de lactosa con formacin de cido se evidencia por el viraje del indicador de pH
rojo neutro al rojo. La reduccin de tiosulfato a sulfuro se observa por la formacin de sulfuro
ferroso negro.
Los microorganismos lactosa positivo forman colonias rojo-rosadas que debido a la acidificacin
aparecen rodeadas por un halo turbio de precipitacin de desoxicolato. Las colonias de
microorganismos lactosa negativo son incoloras.
La incubacin es de 18 a 24 h a 37C.

DICLORN GLICEROL 18 % (DG18) AGAR

Glucosa..........................................................10,0 g
Peptona............................................................5,0 g
KH
2
PO
4
...........................................................1,0 g
MgSO
4
.7H
2
O...................................................0,5 g
Glycerol .......................................................220,0 g
Agar...............................................................15,0 g
Diclorn (0,2% w/v en etanol, 1 ml) ...............2,0 mg
Cloranfenicol ...............................................100,0 mg
83
Agua destilada.................................................1,0 l
pH = 5,5-5,8

Agregar los componentes minoritarios y el agar hasta ca. 800 ml de agua destilada. Calentar a
bao mara hasta disolucin del agar y completar hasta 1,0 l de agua destilada. Agregar el
glicerol (notar que la concentracin final es 18% w/w, no w/v). Esterilizar en autoclave a 121C
durante 15 minutos. La actividad acuosa final del medio es 0,955. Este medio se utiliza
especialmente para el aislamiento de hongos xerfilos.

DICLORAN ROSA DE BENGALA CLORANFENICOL (DRBC) AGAR

Glucosa..........................................................10,0 g
Peptona bacteriolgica ....................................5,0 g
KH
2
PO
4
...........................................................1,0 g
MgSO
4
.7H
2
O...................................................0,5 g
Agar...............................................................15,0 g
Rosa de Bengala (5% w/v en agua, 0,5 ml) ..25,0 mg
Diclorn (0,2% w/v en etanol, 1 ml) ...............2,0 mg
Cloranfenicol ...............................................100,0 mg
Agua destilada.................................................1,0 l
pH = 5,5-5,8

Esterilizar en autoclave a 121C durante 15 minutos. Almacenar en oscuridad, ya que los
productos de fotodescomposicin del Rosa de Bengala son altamente inhibitorios para algunos
hongos. En oscuridad el medio es estable por al menos 1 mes a 1-4C. Las soluciones stock de
Rosa de Bengala y Diclorn no requieren esterilizacin y son estables por perodos prolongados.
El cloranfenicol es un antibitico muy efectivo que no se afecta por la esterilizacin en
autoclave.
Este medio se utiliza para el aislamiento y enumeracin de mohos y levaduras en alimentos.

DUNCAN STRONG CALDO

Almidn soluble ..............................................4,0 g
Tioglicolato de sodio.......................................1,0 g
Na
2
HPO
4
........................................................10,0 g
Agua destilada.................................................1,0 l
pH = 7,0

Fraccionar en tubos con tapa de rosca, dejando poco espacio libre. Esterilizar en autoclave.

Este caldo se utiliza para inducir la esporulacin de Clostridium perfringens. La esporulacin se
produce debido a la ausencia de azcares fermentables, ya que el medio slo contiene almidn
(poco fermentable). El tioglicolato genera el ambiente reductor necesario para el crecimiento de
microorganismos anaerobios.
84
Si el medio ha sido preparado en el momento, utilizar inmediatamente; si no, eliminar el O
2

disuelto por ebullicin en bao de agua hirviente durante 15 minutos. Enfriar rpidamente.
Sembrar 0,1 - 0,2 ml del cultivo o dilucin en el fondo del tubo con pipeta sin burbujear.

ENDO AGAR

Peptona......................................................... 10,0 g
Hidrogenofosfato dipotsico .......................... 2,5 g
Sulfito sdico (anh.) ....................................... 3,3 g
Pararrosanilina (Fucsina)................................ 0,3 g
Agar.............................................................. 12,5 g
Agua destilada.................................................... 1 l
pH = 7,4

Este es un medio selectivo que se utiliza para el aislamiento de E. coli fecal y coliformes en
diversos materiales. El sulfito sdico y la fucsina inhiben las bacterias Gram positivas. E. coli y
coliformes consumen lactosa formando aldehdo y cido. Por otra parte, el aldehdo libera
fucsina a partir de la combinacin fucsina-sulfito, lo cual da lugar a la coloracin roja de las
colonias. En el caso de E. coli, esta reaccin es tan intensa que la fucsina llega a cristalizar dando
a las colonias un brillo metlico estable, de reflejo verde tpico.

EOSINA AZUL DE METILENO (EMB) AGAR segn Levine

Peptona......................................................... 10,0 g
Lactosa ..........................................................10,0 g
K
2
HPO
4
...........................................................2,0 g
Eosina .............................................................0,4 g
Azul de metileno ........................................ 0,065 g
Agar-agar...................................................... 15,0 g
Agua destilada.................................................1,0 l
pH = 7,1

Este medio se utiliza para aislamiento y diferenciacin de enterobacterias y Escherichia coli.
Los colorantes contenidos en su frmula inhiben a muchos grmenes Gram positivos de
acompaamiento.
Incubacin: 24-48 h a 37C.
Las colonias de coliformes presentan centro oscuro y periferia incolora.

ESCHERICHIA COLI CALDO

Sales biliares....................................................1,5 g
Lactosa ............................................................5,0 g
K
2
HPO
4
...........................................................4,0 g
85
KH
2
PO
4
...........................................................1,5 g
NaCl ................................................................5,0 g
Agua destilada.................................................1,0 l

Distribuir en tubos provistos de sendas campanitas de Durham. Esterilizar en autoclave.

Este medio se utiliza para la demostracin selectiva de coliformes y Escherichia coli en aguas,
alimentos y otros materiales. La lactosa favorece el crecimiento de bacterias lactosa positivas,
especialmente coliformes y E. coli. Las sales biliares inhiben el crecimiento de bacterias Gram
positivas. Los grmenes lactosa positivos consumen lactosa con produccin de gas.
Incubacin: 48 horas a 37C y/o 45,5C.

ESCULINA HIERRO AGAR

Bilis de buey..................................................40,0 g
Esculina ...........................................................1,0 g
Citrato frrico..................................................0,5 g
Agar-agar.......................................................15,0 g
Agua destilada.................................................1,0 l
pH = 6,6

Esterilizar en autoclave. Enfriar a 45C y agregar 5% de suero (optativo).
Este medio se utiliza para la investigacin preliminar de enterococos (grupo serolgico D).
La hidrlisis de la esculina y la tolerancia a la bilis se consideran caractersticas constantes y
fidedignas de los enterococos.
Numerosas bacterias acompaantes resultan notablemente inhibidas en su crecimiento por las
sales biliares. Los enterococos hidrolizan al glucsido esculina convirtindolo en esculetina y
glucosa.
La esculetina, con los iones hierro (III) forman un complejo color verde oliva hasta negro.
Aadiendo suero de caballo al medio puede optimizarse el crecimiento de los enterococos.
Incubacin: hasta tres das a 37C.
En presencia de enterococos, se produce, por lo regular ya al cabo de 24 horas, una coloracin
oscura del medio de cultivo alrededor de las colonias. Cuando las colonias son numerosas y llegan
a confluir, puede llegar a oscurecerse todo el medio.
Si al cabo de tres das no se ha producido oscurecimiento, se acepta que el material sembrado no
contena enterococos.

EXTRACTO DE CARNE AGAR

Peptona............................................................5,0 g
Agar-agar.......................................................15,0 g
Agua destilada.................................................1,0 l
pH = 6,4 - 7,0
86
EXTRACTO DE CARNE CALDO

Se prepara de igual manera que el anterior, pero sin agregar el agar.

EXTRACTO DE MALTA AGAR

Extracto de Malta en polvo .......................... 20,0 g
Peptona........................................................... 1,0 g
Glucosa......................................................... 20,0 g
Agar.............................................................. 20,0 g
Agua destilada................................................. 1,0 l
pH = 5,6

Esterilizar en autoclave a 121C durante 15 min. No esterilizar por perodos ms prolongados, ni
sobrecalentar ya que el medio puede ablandarse. Este medio se utiliza principalmente para el
aislamiento de mohos y levaduras.

FERMENTACION DE AZUCARES CALDO (AEROBIOS)

Tripticasa (o proteosa peptona n 3)..............10,0 g
NaCl ................................................................5,0 g
Rojo fenol ................................................... 0,018 g
Hidrato de carbono..........................................1,0 g
Agua destilada.................................................1,0 l

a) Preparar el medio basal y esterilizar en autoclave.
Preparar las soluciones de carbohidratos y esterilizarlas por filtracin. Agregar al medio basal
para obtener una concentracin final de 1 g por litro.
b) Preparar el medio basal y agregar el carbohidrato (todos al 1% excepto salicina, 0,5%).
Fraccionar en tubos de hemlisis. Colocar campanitas de Durham slo a los tubos con glucosa.
Esterilizar en autoclave a 118C durante 10 minutos.
pH = 7,40,2.

La degradacin de distintos azcares por distintas vas metablicas produce cido o gas. El cido
se detecta por el viraje al amarillo del indicador rojo fenol, y el gas por la formacin de burbujas
que quedan atrapadas en la campanita.
Prueba positiva: color amarillo con o sin gas.
Prueba negativa: color rojo con ausencia de gas.

FERMENTACION DE AZUCARES CALDO (ANAEROBIOS)

Peptona..........................................................10,0 g
NaCl ................................................................5,0 g
87
Clorhidrato de cistena ....................................0,3 g
Agar-agar.........................................................0,5 g
Hidrato de carbono..........................................1,0 g
Agua destilada.................................................1,0 l

Preparar el medio base. Fraccionar en tantas porciones como azcares se prueben. Pesar los
azcares y agregarlos a cada una de ellas. Fraccionar en tubos con tapa de rosca. Esterilizar en
autoclave 10 minutos a 118C.

La degradacin de los azcares produce cido y/o gas. El cido produce un descenso del pH del
medio, que se detecta agregando unas gotas del indicador prpura de bromocresol al 0,04%.
Prueba positiva: color amarillo-cido.
Prueba negativa: color prpura-alcalino.

FLUOROCULT AGAR PARA Escherichia coli O157:H7

NaCl ................................................................5,0 g
Sorbita ...........................................................10,0 g
Citrato de amonio y hierro (III).......................0,5 g
4 metil umbeliferil beta D glucurnido...........0,1 g (MUG)
Tiosulfato de sodio..........................................2,0 g
Azul de bromotimol ................................... 0,025 g
Desoxicolato de sodio .................................. 1,12 g
Agar-agar...................................................... 13,0 g
Agua destilada.................................................1,0 l
pH: 7,40,1

El desoxicolato sdico inhibe en gran medida la flora Gram positiva. La sorbita, junto con el
indicador sirven para demostrar la fermentacin del azcar. Las colonias sorbita positivas son
amarillas, y las negativas resultan de color verdoso, sin cambio en el color del medio de
cultivo. El tiosulfato y el hierro III evidencian las colonias de grmenes productores de sulfuro
de hidrgeno, las colonias tienen precipitado negro-parduzco de sulfuro de hierro. Esta
caracterstica es muy importante para diferenciar Proteus mirabilis de Escherichia coli
O157:H7. El MUG sirve para evidenciar las cepas beta glucuronidasa positivas ya que son
fluorescentes a la radiacin con luz UV de larga longitud de onda. La mayora de las cepas de
Escherichia coli dan positivo, mientras que Escherichia coli O157:H7 da negativa.

FRASER CALDO

Peptona Proteosa .............................................5,0 g
Peptona de caseina ..........................................5,0 g
88
NaCl ..............................................................20,0 g
KH
2
PO
4
...................................................... 1,35 g
Na
2
HPO
4 ......................................................
12,0 g
Esculina ..........................................................1,0 g
LiCl .................................................................3,0 g
Agua destilada.................................................1,0 l
Suplementos:
Citrato de amonio y hierro (III)..................... 500 mg
Acido Nalidxico ............................................. 10 mg
Acriflavina.................................................... 12,5 mg

Autoclavar a 121C, 15 minutos. Disolver el de citrato de amonio frrico y el suplemento de
cido nalidxico y acriflavina en 1 ml, en cada caso, de agua destilada estril y aadir al caldo
base enfriado por debajo de 50C.
Este medio se utiliza para la investigacin de Listeria. El crecimiento de flora acompaante es
inhibido por el cloruro de litio, el cido nalidxico y la acriflavina. La esculina y el citrato de
amonio y hierro permiten evidenciar la accin de la -D-glucosidasa, que escinde la esculina en
esculetina y glucosa. La esculetina forma un complejo verde oliva a negro con los iones hierro
(III). En caso de crecimiento de Listeria en el caldo, se observa un ennegrecimiento en el
mismo.

GELATINA MEDIO (AEROBIOS)

Peptona............................................................5,0 g
Gelatina .......................................................120,0 g
Agua destilada.................................................1,0 l

Mezclar la gelatina con el agua y dejar reposar durante 15 minutos. Calentar a ebullicin,
agregar los otros ingredientes y seguir calentando hasta que se disuelvan, sin sobrecalentar.
Ajustar el pH a 6,8-7,0.
Distribuir en tubos, esterilizar en autoclave. Enfriar en posicin vertical.

Los microorganismos productores de gelatinasa causan licuefaccin. Esta propiedad vara con
la cepa y con la temperatura de incubacin. Es importante referirse a un tubo patrn sin
inocular. Se debe tener en cuenta que a la temperatura de incubacin, 37C, la gelatina est
lquida, por lo tanto, es necesario enfriar para interpretar los resultados. Algunos
microorganismos se deben incubar por ms de 48 horas.

GLUCOSA CALDO

NaCl ................................................................5,0 g
89
Glucosa..........................................................10,0 g
Agua destilada.................................................1,0 l
pH = 7,3 0,1

Este medio de cultivo se utiliza para el crecimiento y multiplicacin de diversos
microorganismos. Como no contiene ms hidratos de carbono que la glucosa, el medio es
adecuado para la demostracin de fermentacin de glucosa cuando se agrega previamente un
indicador de pH.

GRASA DE MANTECA AGAR

Peptona............................................................5,0 g
Agar-agar.......................................................15,0 g
Agua destilada.................................................1,0 l
Emulsin grasa de manteca
Grasa de manteca ..........................................20,0 g
Goma arbiga ..................................................2,5 g
Agua destilada.................................................1,0 l
Fundir manteca no salada en bao de agua a 50C, separar la grasa pipeteando cuidadosamente.
En el momento de preparar las placas, la solucin de goma arbiga y la grasa se mezclan y
emulsionan en un homogenizador estril.
Emulsin de goma arbiga
Suspender la goma en agua fra, calentar hasta disolucin. Esterilizar en autoclave.
Preparacin de las placas: Fundir el medio y llevarlo a 50-55C. Agregar entonces 5 ml de la
emulsin de grasa de manteca a 100 ml del mismo. Mezclar y verter en placas de Petri.

HIGADO + HIGADO CALDO

Hgado bovino.............................................750,0 g
Agua destilada.................................................2,0 l

Cortar el hgado en trozos pequeos agregar el agua y dejar en la heladera 24 h. Hervir una hora,
enfriar y llevar a volumen. Filtrar y ajustar el pH a 7,6.
Distribuir en tubos de ensayo y colocar un trocito de hgado en cada uno. Esterilizar en
autoclave. Este medio rico en nutrientes es especial para la recuperacin de microorganismos
anaerobios. El crecimiento de los mismos se evidencia por el enturbiamiento con o sin
produccin de gas. Las cepas proteolticas degradan los pedacitos de hgado.

HGADO DE TERNERA AGAR

Infusin de hgado.........................................50,0 g
Infusin de ternera.......................................500,0 g
90
Neopeptona......................................................1,3 g
Triptona ...........................................................1,3 g
Dextrosa ..........................................................5,0 g
Almidn soluble ............................................10,0 g
Casena isoelctrica.........................................2,0 g
NaCl ................................................................5,0 g
NaNO
3
.............................................................2,0 g
Gelatina .........................................................20,0 g
Agar-agar.......................................................15,0 g
Agua destilada.................................................1,0 l
pH = 7,3

Prehidratar y disolver los ingredientes, distribuir en tubos y esterilizar en autoclave.
Este medio se utiliza para el aislamiento y cultivo de organismos anaerobios, favoreciendo su
esporulacin.

INFUSIN DE CEREBRO CORAZN CALDO

Corazn de vaca ..........................................500,0 g
Triptona .........................................................10,0 g
NaCl ................................................................5,0 g
Agua destilada.................................................1,0 l

Mezclar los ingredientes, excepto el NaCl, hervir una hora y llevar a pH 7,4-7,6. Agregar el
NaCl y hervir durante 10 minutos, filtrar. El pH final debe ser 7,0-7,4. Si se requiere agregar un
trozo de corazn en cada tubo. Tambin se comercializa el medio deshidratado.

Este medio se utiliza para el mantenimiento e identificacin de clostridios y otros anaerobios a
partir de carne y otros alimentos. Las sustancias reductoras contenidas en el tejido producen a su
alrededor un medio suficientemente anaerobio, incluso para grmenes anaerobios exigentes.
El tejido rico en nutrientes es utilizado por enzimas proteolticas como sustrato. Si el
microorganismo es proteoltico se produce degradacin, si es sacaroltico se produce
enrojecimiento, y si es productor de sulfhdrico se produce ennegrecimiento. Tambin se observa
produccin de gas. Si el medio no es utilizado inmediatamente, calentar a ebullicin durante 15
min. para eliminar el O
2
disuelto.
Sembrar en el fondo del tubo sin burbujear, con pipeta. Sellar con tapn de VASPAR o agar 2 %
a 55C, hacindolo gotear en el fondo del tubo.

INFUSION DE CORAZON AGAR

Se agrega al caldo Infusin de corazn 15 g de agar por litro. Esterilizar en autoclave.

91
INFUSIN DE HIGADO CALDO

Hgado de buey............................................750,0 g
HCl (cc) ...........................................................2,0 ml
Agua destilada.................................................2,0 l

Se corta el hgado en trozos pequeos se agrega el agua y el cido y se deja en la heladera
durante 24 hs.
Luego se hierve durante una hora, se filtra, se ajusta el pH a 7,6; se lo distribuye en tubitos de
ensayo en los que se ha colocado un trocito de hgado fresco y se esteriliza el medio en la forma
habitual. Se comercializa el medio deshidratado.
El medio se utiliza para el cultivo de clostridios y otros anaerobios. Su fundamento y uso es
similar al del caldo corazn.

INVESTIGACION DE H
2
S CALDO

Peptona trptica..............................................10,0 g
NaCl ................................................................5,0 g
FeSO
4
.............................................................0,2 g
Na
2
S
2
O
3
...........................................................0,3 g
Agar-agar.........................................................0,5 g
Agua destilada.................................................1,0 l

Ajustar el pH a 7,2. Repartir en tubos de 160 x 16. Colocar 12 ml por tubo.
Este medio se utiliza para el crecimiento y la identificacin de microorganismos productores de
H
2
S. El H
2
S producido a partir del Na
2
S
2
O
3
reacciona con el FeSO
4
dando FeS negro que
precipita.

Si el medio no es utilizado en el momento, hervir durante 15 minutos a ebullicin para eliminar
el O
2
disuelto justo antes de usar.
Sembrar con pipeta en profundidad antes de usar.

KF STREPTOCOCCUS AGAR

Extracto de levadura......................................10,0 g
NaCl ................................................................5,0 g
Glicerolfosfato de sodio ................................10,0 g
Maltosa..........................................................20,0 g
Lactosa ............................................................1,0 g
Azida sdica ....................................................0,4 g
Prpura de bromocresol .............................. 0,015 g
92
Agar-agar.......................................................20,0 g
Agua destilada.................................................1,0 l
pH = 7,2

Luego de esterilizado el medio y enfriado a 60C, agregar 10 ml de una solucin al 1 % de
cloruro de trifeniltetrazolio.

Solucin de cloruro de trifeniltetrazolio (TTC) al 1 %

Esterilizar 3 ml de agua destilada. Una vez fra, agregarle 30 mg de TTC. Disolver y guardar en
la heladera.

Este medio se utiliza para el crecimiento y la enumeracin de enterococos en agua y otros
alimentos.

La maltosa y la lactosa son utilizadas por los enterococos con produccin de cido.
Los grmenes acompaantes son reprimidos por la azida de sodio.
El agregado de TTC tiene como finalidad diferenciar S. faecalis del resto de los enterococos,
aprovechando la habilidad del primero de reducir el tetrazolio a formazano. Estos derivados del
tetrazolio son sustancias incoloras que al reaccionar con un azcar se transforman en compuestos
poco solubles de color rojo (formazanos).
Como indicador se utiliza el prpura de bromocresol. Azul: indica pH neutro o bsico. Amarillo:
indica pH cido.
Las colonias se presentan pequeas de color rojo, de 0,3-2 mm; el medio alrededor de las
mismas vira al amarillo.
Incubacin: 48 horas a 37C.

KG AGAR

Peptona............................................................1,0 g
Rojo fenol .................................................... 0,025 g
Agar-agar.......................................................18,0 g
Agua destilada.................................................1,0 l

Disolver los ingredientes en agua, ajustar el pH a 6,8. Esterilizar en autoclave. Enfriar a 50C y
agregar 100 ml de suspensin yema de huevo y 1 ml de solucin de sulfato de polimixina B (10
mg/ml) estril. Distribuir en placas. Este medio se utiliza para el aislamiento y la identificacin
de B. cereus en alimentos. El Rojo fenol y la Polimixina B inhiben buena parte de la flora
acompaante. El medio promueve la esporulacin de Bacillus, lo que permite la confirmacin
directa de las colonias lecitinasa positivas, como las del grupo I de Bacillus, y B. cereus en
particular. Ciertas colonias de Bacillus del grupo II lecitinasa positivas, que sern B. cereus
presuntivas en MYP, no dan la reaccin en este medio relativamente pobre en nutrientes.

93
LACTOSA CALDO

Peptona de gelatina..........................................5,0 g
Lactosa ............................................................5,0 g
Agua destilada.................................................1,0 l

El medio se utiliza para ensayos orientativos de bacterias coliformes, especialmente E. coli; no
contiene sustancias inhibidoras.
La utilizacin de la lactosa se demuestra por produccin de gas, que se recoge en campanitas de
Durham. El medio se utiliza tambin como caldo de enriquecimiento no selectivo para
Salmonellas. En presencia de una flora mixta, la fermentacin de lactosa provoca una
disminucin del pH, con lo que se inhibe la flora competitiva, especialmente coliformes. El
crecimiento de Salmonellas no se ve afectado por el descenso de pH; esto permite su
recuperacin sin prdidas al cabo de hasta una semana.

LAURIL SULFATO CALDO

Triptosa..........................................................20,0 g
Lactosa ............................................................5,0 g
Cloruro de sodio..............................................5,0 g
Lauril sulfato de sodio.................................... 0,1 g
Hidrgeno fosfatodipotsico ........................ 2,75 g
Dihidrgeno fosfato potsico ....................... 2,75 g
Agua destilada.................................................1,0 l

El medio es selectivo para coliformes en la investigacin en aguas, productos lcteos y otros
alimentos. El gas formado se visualiza por la incorporacin de campanitas de Durham al tubo
con medio.
Debido a su elevada calidad nutritiva y al tampn de fosfatos que contiene este medio de cultivo,
se garantiza el rpido crecimiento y la intensa formacin de gas, incluso en el caso de coliformes
que fermenten lentamente la lactosa. El contenido en laurilsulfato inhibe notablemente el
crecimiento de la flora acompaante indeseable.

LEVADURA CALDO (MEMBRANA FILTRANTE)

Extracto de malta...........................................20,0 g
Triptona ...........................................................1,5 g
Proteosa peptona .............................................1,5 g
Dextrina...........................................................5,0 g
KH
2
PO
4
...........................................................1,0 g
NH
4
Cl ..............................................................1,0 g
Agua destilada.................................................1,0 l
pH = 4,8
94
Este medio se utiliza para el crecimiento selectivo de levaduras a partir de alimentos. El pH bajo
favorece el crecimiento de levaduras inhibiendo el crecimiento bacteriano.

LISINA HIERRO AGAR

Peptona............................................................5,0 g
Glucosa............................................................1,0 g
L - lisina ........................................................10,0 g
Citrato frrico amnico ...................................0,5 g
Na
2
S
2
O
3
........................................................ 0,04 g
Prpura de bromocresol ............................... 0,02 g
Agar-agar.......................................................15,0 g
Agua destilada.................................................1,0 l
pH = 6,7

Este medio se utiliza para la demostracin simultnea de lisina descarboxilasa y la produccin de
cido sulfhdrico. Permite la identificacin de enterobacterias, sobre todo de Salmonella y
Arizona.
La lisina puede ser descarboxilada por microorganismos LD-positivos, que la transforman en la
amina cadaverina. Esto produce un viraje al violeta del indicador de pH prpura de bromocresol.
Puesto que la descarboxilacin slo tiene lugar a pH inferior a 6,0, es necesario que se produzca
acidificacin del medio por fermentacin de la glucosa. Por este motivo, el medio de cultivo slo
debe ser utilizado para organismos fermentadores de glucosa. Los microorganismos LD-
negativos pero fermentadores de glucosa, producen un viraje al amarillo de la totalidad del
medio de cultivo. La incubacin prolongada puede ocasionar una alcalinizacin del medio. La
produccin de sulfhdrico se pone de manifiesto por la formacin de sulfuro de hierro negro. Las
cepas del grupo Proteus providencia, con excepcin de algunas cepas de Proteus morganii,
desaminan la lisina a cido ceto-carbnico; este ltimo, con la sal de hierro y en presencia de O
2
,
forma sustancias pardo-rojizas en la regin superficial del medio de cultivo.
Se siembra en profundidad y en superficie; se incuba durante 24 horas.

Microorganismos Color del medio de cultivo
Produccin de H
2
S

Columna vertical Superficie inclinada
Arizona Violeta Violeta +
Salmonella
*

Violeta Violeta
+
Proteus mirabilis Amarillo Pardo-rojizo +
Proteus vulgaris Amarillo Pardo-rojizo +
Morganella morganii Amarillo Pardo-rojizo -
Providencia Amarillo Pardo-rojizo -
Citrobacter Amarillo Violeta +
Escherichia coli Amarillo Violeta -
Shigella Amarillo Violeta -
Klebsiella Violeta Violeta -
Yersinia Amarillo Violeta -
* Excepcin de S. paratyphi: Columna vertical amarilla; Superficie inclinada violeta.
95
LECHE AGAR

Peptona............................................................5,0 g
Leche en polvo descremada ............................1,0 g
Agar-agar.......................................................12,0 g
Agua destilada.................................................1,0 l
pH = 7,20,2

Esterilizar por tindalizacin 30 minutos. Este medio se utiliza para la demostracin de la
hidrlisis de la casena por microorganismos aerobios. El medio es blanquecino opaco. La
protelisis se evidencia por halos claros transparentes alrededor de las colonias (debidos a la
degradacin de la casena).

LECHE TORNASOLADA

Leche descremada en polvo ........................100,0 g
Agar-agar.........................................................0,5 g
Tornasol (Litmus)......................................... 0,75 g
Agua destilada................................................ 1,0 l

Disolver la leche en el agua tibia, agregar los otros ingredientes y calentar a bao mara.
Fraccionar en tubos con tapa de rosca. Esterilizar por tindalizacin (30 minutos a 100C, tres
das consecutivos).
pH = 6,8

Este medio se utiliza para determinar varias funciones metablicas:

Fermentacin de lactosa. La leche tornasolada presenta un color purpreo a pH = 6,8. Si el
microorganismo fermenta la lactosa con produccin de cido lctico, el descenso de pH hace
virar el indicador a color rojo rosado. Si la bacteria no fermenta la lactosa, y por su metabolismo
se alcaliniza el medio, el indicador vira de prpura a prpura azulado.
Formacin y digestin del cogulo (peptonizacin). La coagulacin puede deberse a la
precipitacin de la casena por la formacin de cidos, o por la conversin de la casena en para-
casena por la enzima renina. En el primer caso, el cogulo es firme y gelatinoso, no se separa de
las paredes del tubo y se disuelve en medio alcalino. En el segundo caso, el cogulo es blando, se
separa de las paredes del tubo dando un lquido grisceo (suero). La peptonizacin o digestin
del cogulo se produce si la bacteria posee la enzima caseasa.
Formacin de gases. Se generan como producto final de la degradacin de la lactosa. Se
produce una fermentacin turbulenta que puede llegar a descomponer el cogulo cido
(Clostridium perfringens).

96
MAC CONKEY AGAR

Proteosa peptona o Peptona de carne ..............3,0 g
Lactosa ..........................................................10,0 g
Sales biliares....................................................1,5 g
NaCl ................................................................5,0 g
Agar-agar.......................................................13,5 g
Rojo neutro................................................... 0,03 g
Agua destilada.................................................1,0 l
pH = 7,1

Disolver los ingredientes en agua destilada calentando y agitando. Autoclavar a 121C durante
15 minutos.
Este medio de cultivo se utiliza para el aislamiento de Salmonellas, Shigellas y bacterias
coliformes, a partir de alimentos, heces, orina y aguas contaminadas.
Las sales biliares y el Cristal Violeta inhiben la flora Gram positiva. La lactosa, junto con el
indicador de pH Rojo neutro, sirven para comprobar la degradacin de dicho azcar.
Incubacin: 18-24 horas a 37C.

Las colonias lac (-) son incoloras.
Las colonias lac (+) son rojas, con un halo de precipitacin debido al descenso de pH provocado
por los cidos biliares.

MAC CONKEY CALDO

Peptona......................................................... 20,0 g
Lactosa ......................................................... 10,0 g
Prpura de bromocresol ............................... 0,01 g
Bilis de buey................................................... 5,0 g
Agua destilada.................................................1,0 l
pH = 7,3

Este es un medio selectivo, orientativo para coliformes o Escherichia coli en leche y agua. El
caldo contiene lactosa, cuya degradacin a cido con formacin de gases sealan, por definicin,
la presencia de coliformes.
El gas producido es recogido en campanitas de Durham y la formacin de cido se comprueba
mediante el viraje a amarillo del indicador Prpura de bromocresol.
La bilis de buey favorece el crecimiento de bacterias intestinales y es inhibitoria para
microorganismos extraentricos.

Produccin de cido y gas: sospecha de presencia de E. coli y coliformes.
Produccin de cido sin gas: sospecha de presencia de coliformes, sin E. coli.

97
MAC CONKEY SORBITOL AGAR

Digerido pancretico de gelatina.................. 17,0 g
Digerido pancretico de casena..................... 1,5 g
Digerido pptico de tejido animal .................. 1,5 g
Sales biliares................................................... 1,5 g
Sorbitol ......................................................... 10,0 g
NaCl ............................................................... 5,0 g
Agar-agar...................................................... 13,5 g
Rojo neutro................................................... 0,03 g
Agua destilada................................................. 1,0 l
pH = 7,1

Este medio de cultivo se utiliza para el aislamiento de Escherichia coli O157:H7, a partir de
alimentos y de heces. Se emplea la caracterstica de dicho organismo de no fermentar este
azcar, a diferencia de la mayora de las cepas de Escherichia coli que son sorbitol +.
Las sales biliares y el Cristal Violeta inhiben la flora Gram positiva. El sorbitol, junto con el
indicador de pH Rojo neutro, sirven para comprobar la degradacin de dicho azcar.

Las colonias sorbitol (-) son incoloras.
Las colonias sorbitol (+) son rojas, con un halo de precipitacin debido al descenso de pH
provocado por los cidos biliares.

Otras versiones de este medio incluyen el agregado de telurito y cefixime para aumentar la
selectividad.

MANITOL LISINA CRISTAL VIOLETA (MLCB) AGAR

Extracto de levadura....................................... 5,0 g
Peptona......................................................... 10,0 g
NaCl ............................................................... 4,0 g
Manitol ........................................................... 3,0 g
Cloruro de L-lisina ......................................... 5,0 g
Citrato frrico amnico .................................. 1,0 g
Na
2
S
2
O
3
.......................................................... 4,0 g
Verde Brillante ........................................... 0,005 g
Cristal Violeta .............................................. 0,01 g
Lab-Lemco polvo........................................ 2,0 g
Agar-agar...................................................... 16,0 g
Agua destilada.................................................1,0 l
pH = 6,8

Calentar a ebullicin durante 15 minutos. No esterilizar en autoclave.
Verde Brillante: Se agrega 1 ml de solucin al 0,5 %.
Cristal Violeta: Se agregan 10 ml de solucin 0,1 %.
98
El medio se utiliza para el crecimiento selectivo de Salmonella.
Los colorantes presentes en el medio inhiben la flora de acompaamiento. El tiosulfato es
reducido por Salmonella a H
2
S que junto con la sal de hierro forma FeS negro.
El agregado de LAb-Lemco polvo reemplaza al extracto de carne.

Las colonias de Salmonella en este medio son grandes con centro negro.

MANITOL YEMA DE HUEVO POLIMIXINA (MYP) AGAR

Peptona de carne............................................10,0 g
D (-) manitol..................................................10,0 g
NaCl ..............................................................10,0 g
Rojo fenol .................................................... 0,025 g
Agar-agar.......................................................12,0 g
Emulsin yema de huevo ............................100,0 ml
Polimixina B (0,01 a 0,1 g)
pH = 7,10,1

Al medio esterilizado y enfriado a 50C, agregar la suspensin yema de huevo a la misma
temperatura, mezclando bien, y la solucin de Polimixina B.

Este medio se utiliza para el aislamiento y la identificacin de Bacillus cereus a partir de
alimentos. La Polimixina B inhibe la flora usual de acompaamiento, en tanto que el B. cereus
puede desarrollarse sin dificultad.
El medio contiene manitol y el indicador de pH rojo fenol. La flora acompaante es
normalmente manitol (+), lo que hace virar al indicador a amarillo, por acidificacin del medio,
como consecuencia de la fermentacin del manitol. El Bacillus cereus es manitol (-), por lo tanto
el medio aparece de color rosado, por alcalinizacin debida al metabolismo nitrogenado.
Finalmente, B. cereus posee la enzima lecitinasa, una fosfolipasa que hidroliza la lecitina de la
yema del huevo, cuyos productos precipitan dando un halo blanco opaco alrededor de las
colonias.
El B. cereus en este medio aparece en forma de colonias rugosas con sustrato rosado o prpura,
rodeadas de un espeso precipitado blanco, opaco. Las colonias de la flora acompaante aparecen
con sustrato amarillo.
El recuento en este medio es presuntivo, se deben confirmar las colonias sospechosas (gelatina,
reduccin de nitratos, fermentacin anaerbica de glucosa).

MEDIO 110 PARA ESTAFILOCOCOS (AGAR CHAPMAN)

K
2
HPO
4
...........................................................5,0 g
Gelatina .........................................................30,0 g
99
Lactosa ............................................................2,0 g
D (-) manitol..................................................10,0 g
NaCl ..............................................................75,0 g
Agar-agar.......................................................12,0 g
Agua destilada.................................................1,0 l
pH = 7,00,2

Este medio se utiliza para el aislamiento y la identificacin de estafilococos a partir de alimentos
y otros materiales. Sobre este medio crecen slo microorganismos que poseen una elevada
tolerancia a la sal comn.
Las colonias de estafilococos son diferenciables utilizando como criterios, entre otros, la
fermentacin de manitol, la licuefaccin de la gelatina y la formacin de pigmento.
Las colonias que producen pigmento aparecen de color amarillo dorado. De ellas se aslan
colonias para la prueba de coagulasa. La produccin de cido a partir de manitol se pone de
manifiesto por el viraje al amarillo del indicador de pH prpura de bromocresol.
La licuefaccin de la gelatina se pone de manifiesto por la reaccin de Stone. Esta consiste en
inundar la placa con solucin saturada de sulfato de amonio o una solucin al 20 % de cido
saliclico. Despus de 10 minutos aparecen zonas claras alrededor de las colonias que licuaron la
gelatina.

MODIFIED MCBRIDE (MMA) AGAR

Triptosa..........................................................10,0 g
Extracto de carne ............................................3,0 g
NaCl ...............................................................5,0 g
LiCl .................................................................0,5 g
Feniletanol ...................................................... 2,5 g
Glicina ..........................................................10,0 g
Cicloheximida ................................................0,2 g
Agar-agar ......................................................15,0 g
Agua destilada ................................................1,0 l
pH = 7,3 0,2.

Autoclavar a 121C, 15 minutos. Opcional adicin de sangre.
Este medio se utiiza para el aislamiento de Listeria monocytogenes con o sin la adicin de
sangre. Se recomienda para el aislamiento de Listeria a partir de muestras clnicas, leche cruda y
alimentos en general. Cuando se adiciona sangre se observa una zona delgada de hemlisis
alrededor de las colonias de Listeria.
La triptosa y el extracto de carne son fuentes de nitrgeno, vitaminas y minerales. El NaCl
mantiene el balance osmtico del medio. El LiCl, la glicina y el feniletanol actan como agente
selectivos, inhibiendo a los gram-negativos y a algunos gram-positivos, con excepcin de
Listeria. La cicloheximida aumenta la selectividad del medio.

100
MOVILIDAD, AGAR PARA

Peptona..........................................................10,0 g
NaCl ................................................................5,0 g
Agar-agar.........................................................4,0 g
Agua destilada.................................................1,0 l
pH = 7,3

Distribuir en tubos, esterilizar en autoclave. Enfriar en posicin vertical.

Los microorganismos mviles migran desde la zona de siembra y difunden en el medio de
cultivo, provocando turbiedad.
Los microorganismos no mviles crecen slo en la zona de siembra.
Es importante la temperatura de incubacin, pues algunos microorganismos son mviles a 37C
y otros a 22-25C.

NITRATO CALDO

Peptona............................................................5,0 g
KNO
3
...............................................................1,0 g
Agua destilada.................................................1,0 l

Disolver a bao mara y fraccionar en tubos (2 ml por tubo). Esterilizar en autoclave.
pH = 7,0

La reduccin de NO
3
-
a NO
2
-
y N
2
se da en condiciones anaerbicas en las que el NO
3
-
acta
como aceptor final de electrones de la cadena respiratoria. Muchas bacterias anaerobias
facultativas pueden crecer en anaerobiosis reduciendo nitrato.
El fundamento de la prueba consiste en la deteccin del nitrito formado, que al reaccionar con
los reactivos para la prueba de reduccin de nitrato forman un compuesto diazoico rojo.
Si la reaccin es dbil, y no aparece color dentro de los 30 segundos, se agrega polvo de zinc,
que acta como agente reductor, en medio cido actico y reduce al compuesto formado, con
aparicin de color rojo dentro de los treinta segundos. Si no aparece color, la prueba se considera
negativa.

NITRATO MOVILIDAD BUFFEREADO AGAR

Peptona............................................................5,0 g
KNO
3
...............................................................5,0 g
Na
2
HPO
4
..........................................................2,5 g
Galactosa .........................................................5,0 g
Glicerol............................................................5,0 g
101
Agar-agar.........................................................3,0 g
Agua destilada.................................................1,0 l
pH = 7,4

Colocar en tubos con tapa en porciones de 10 ml. Esterilizar en autoclave.

Reactivo para la prueba de reduccin de nitrato

Solucin A:
Se disuelven 8 g de cido sulfanlico en 1000 ml de cido actico 5 N.
Solucin B:
Se disuelven 5 g de -naftol en 1000 ml de cido actico 5 N.

Este medio se utiliza para la demostracin de bacterias que reducen nitrato a nitrito.
El nitrito formado durante la incubacin se detecta agregando 0,5 ml de la solucin A y 4 gotas
de la solucin B en el tubo de fermentacin.
El fundamento y la interpretacin corresponden a los de los medios para nitrato y movilidad
respectivamente. Este medio se utiliza para la investigacin de la movilidad y de la reduccin
de nitrato por Clostridium perfringens.

OXFORD MODIFICADO (MOX) AGAR

Agar Columbia (o agar triptena-soya, TSY) 42,0 g
Agar-agar ........................................................2,0 g
Esculina ...........................................................1,0 g
Citrato de amonio frrico ................................0,5 g
LiCl ...............................................................15,0 g
Colistina (sol. 1%) ..........................................1,0 ml
Agua destilada.................................................1,0 l

Agar base Columbia
Sustrato especial nutritivo.............................23,0 g
Almidn...........................................................1,0 g
NaCl ...............................................................5,0 g
Agar-agar ......................................................13,0 g
pH = 7,2.

Autoclavar a 121C, 10 minutos. Enfriar a 46C y aadir 2,0 ml de solucin 1% de
moxalactam, en buffer fosfato de potasio de pH: 6,0, esterilizada por filtracin.

PALCAM AGAR

Peptona......................................................... 23,0 g
Almidn.......................................................... 1,0 g
NaCl ............................................................... 5,0 g
Agar-agar...................................................... 13,0 g
102
Manitol ......................................................... 10,0 g
Citrato de hierro y amonio ............................. 0,5 g
Esculina .......................................................... 0,8 g
Dextrosa ........................................................ 0,5 g
LiCl .............................................................. 15,0 g
Rojo fenol .................................................... 0,08 g
pH: 7,2 + 0,1.

Autoclavar 121C, 15 minutos. Enfriar a 51C y agregar el suplemento.

Suplemento (para 500 ml de medio)

Polimixina .......................................................5,0 mg
Ceftazidin ......................................................10,0 mg
Acriflavina.......................................................2,5 mg

Disolver el suplemento previamente en agua estril.

PAPA DEXTROSA AGAR

Papas peladas...............................................200,0 g
Glucosa..........................................................20,0 g
Agar-agar.......................................................15,0 g
Agua destilada.................................................1,0 l

Hervir las papas en el agua durante una hora, filtrar por algodn o gasa. Agregar el agar y la
glucosa y calentar hasta disolucin. Esterilizar en autoclave.
En el momento de uso, se ajusta el pH a 4,5 con cido tartrico al 10 % estril. Una vez ajustado
el pH, no volver a calentar, pues se hidrolizara el agar. Tambin se comercializa el medio
deshidratado.

Este medio se utiliza para el aislamiento y recuento de hongos y levaduras a partir de alimentos.
El pH bajo inhibe el crecimiento de bacterias.

PE-2 MEDIO

Peptona..........................................................20,0 g
Agua destilada.................................................1,0 l
Prpura de bromocresol 1 %...........................4,0 ml
Arvejas ......................................................... 6 por tubo

Disolver los ingredientes, fraccionar en tubos con tapa de rosca, agregar 6 arvejas por tubo.
Este medio se utiliza para la recuperacin primaria de microorganismos anaerobios en el anlisis
de conservas alteradas.

103
PSEUDOMONAS: F AGAR Y P AGAR

F AGAR

MgSO
4
.............................................................1,5 g
KH
2
PO
4
...........................................................1,5 g
Agar-agar.......................................................12,0 g
Agua destilada.................................................1,0 l
Aditivo: Glicerina 10,0 ml

P AGAR

Peptona de gelatina........................................20,0 g
MgCl
2
..............................................................1,4 g
K
2
SO
4
............................................................10,0 g
Agar-agar.......................................................12,6 g
Agua destilada.................................................1,0 l
Aditivo: Glicerina 10,0 ml

Estos medios de cultivo se utilizan para el estudio de Pseudomonas, fundamentado en la
formacin de los pigmentos: piocianina y/o piorrubina y fluorescena.
El agar F estimula la produccin de fluorescena y disminuye la produccin de piocianina. El
agar P acta de manera opuesta. El uso de ambos medios de cultivo simultneamente permite
una identificacin simple y rpida de Pseudomonas, porque algunas cepas slo pueden formar
piocianina, otras slo fluorescena y slo algunas, ambos pigmentos.
Incubacin: hasta una semana a 37C.
Solamente Pseudomonas aeruginosa forma colonias sobre agar P con una zona de pigmentacin
de azul hasta verde (piocianina) o rojiza (piorrubina). Esto pigmentos son extrables con
cloroformo. Sobre el agar F las colonias de Pseudomonas aeruginosa aparecen con zona amarilla
o amarillo-verdosa (fluorescena). La formacin simultnea de piocianina da lugar a un color
verde luminoso, que presenta fluorescencia a la luz ultravioleta.

RAPPAPORT CALDO DE ENRIQUECIMIENTO segn Wauters

Peptona de casena ......................................... 5,0 g
NaCl ............................................................... 8,0 g
K
2
HPO
4
.......................................................... 0,8 g
MgCl
2
........................................................... 80,0 g
Verde de Malaquita ...................................... 0,12 g
Agua destilada................................................. 1,0 l
pH = 6,0

Agregar 1 ml de solucin de Carbencilina (2,4 mg/l) en forma estril.
104
Este medio se utiliza para el aislamiento de Yersinia a partir de alimentos.
El Verde de Malaquita y el MgCl
2
inhiben notablemente el crecimiento de la flora intestinal
normal, en tanto que Yersinia se multiplica sin obstculos.
Se incuba 16-18 h a 28C.

RAPPAPORT VASSILIADIS CALDO

A) Peptona....... 5,0 g B) MgCl
2
........ 400,0 g C) Oxalato de Verde
NaCl............ 8,0 g Agua dest. ...... 1,0 l de Malaquita ...... 4,0 g
KH
2
PO
4
....... 1,4 g Agua dest. .......... 1,0 l
K
2
HPO
4
....... 0,2 g
Agua dest. ... 1,0 l

Se prepara mezclando 1 litro de la solucin A, 100 ml de la solucin B y 10 ml de la solucin C.
Esterilizar 15 minutos a 115C.
pH = 5,2 - 5,3

Este medio se utiliza para el enriquecimiento selectivo de Salmonellas a partir de material de
origen fecal.
El Verde de Malaquita y el MgCl
2
inhiben el crecimiento de la flora intestinal normal, en tanto
que la Salmonella se desarrolla sin obstculos.

RECUENTO EN PLACA AGAR

Peptona de casena ..........................................5,0 g
Glucosa............................................................1,0 g
Agar-agar.......................................................15,0 g
Agua destilada.................................................1,0 l

Medio de cultivo exento de sustancias inhibidoras y de indicadores, concebido esencialmente
para la determinacin del nmero total de microorganismos en alimentos. Se siembra
generalmente por el procedimiento de vertido en placa.

Para la determinacin de microorganismos caseolticos agregar, antes de la esterilizacin, 10 ml/l
de leche descremada o 1,0 g/l de leche descremada en polvo.
Las colonias de caseolticos producen un halo claro que contrasta con el resto del medio, opaco.

SALMONELLA-SHIGELLA AGAR

Extracto de carne............................................ 5,0 g
Proteosa peptona ............................................ 5,0 g
Lactosa ......................................................... 10,0 g
Sales biliares................................................... 8,5 g
105
Citrato de sodio .............................................. 8,5 g
Tiosulfato de sodio......................................... 8,5 g
Citrato frrico................................................. 1,0 g
Verde Brillante ....................................... 0,00033 g
Rojo neutro................................................. 0,025 g
Agar-agar...................................................... 15,0 g
Agua destilada.................................................1,0 l
pH = 7,0

Disolver los ingredientes en agua a ebullicin. No esterilizar en autoclave.

Se utiliza para el aislamiento y la identificacin de Salmonellas y Shigellas a partir de alimentos
contaminados. El Verde Brillante, la bilis de buey y la elevada concentracin de citrato inhiben
considerablemente la flora acompaante. Con el hierro y el tiosulfato se pone de manifiesto la
formacin de FeS negro y el ennegrecimiento de las correspondientes colonias.
Las colonias de coliformes quedan sealadas por la degradacin de la lactosa a cido, que se
manifiesta por el viraje al rojo del indicador de pH Rojo neutro.

Colonias Microorganismos
Incoloras transparentes translcidas Shigellas y la mayora de las Salmonellas
Transparentes con centro negro Algunas Salmonellas y Proteus
Rosadas rojas, medio rojo Escherichia coli y dems coliformes

SELENITO CALDO

Triptona ...........................................................5,0 g
Lactosa ............................................................4,0 g
Na
2
HPO
4
........................................................10,0 g
Selenito de sodio .............................................4,0 g
Agua destilada.................................................1,0 l
pH = 7,0

Esterilizar en vapor fluente durante 30 minutos. No autoclavar.

Este medio se utiliza para el enriquecimiento selectivo de Salmonella y, eventualmente, Shigella
sonnei a partir de alimentos, agua, heces y orina. El medio inhibe el crecimiento de bacterias
intestinales coliformes y enterococos. Salmonella y Proteus son inhibidos en menor grado por el
selenito de sodio.
Incubacin: 24 horas a 37C o 6-12 horas a 43C.

SELENITO CISTINA CALDO

Peptona de casena ......................................... 5,0 g
L (-) cistina................................................... 0,01 g
106
Lactosa ........................................................... 4,0 g
Na
2
HPO
4
......................................................... 2,0 g
Selenito de sodio .............................................1,0 l
pH = 7,0

Esterilizar por filtracin. No autoclavar. Si aparece, precipitado rojo, el medio no es utilizable.

Se utiliza para el crecimiento de Salmonella a partir de agua, heces y alimentos. Posee ms de un
agente selectivo (selenito, cistina), lo cual aumenta la recuperacin de Salmonella, Shigella y
Proteus.
Incubacin: Idem caldo selenito.

SIM AGAR

Peptona de casena ....................................... 20,0 g
Peptona de carne............................................. 6,6 g
Citrato de amonio e hierro (III) ...................... 0,2 g
Tiosulfato sdico ........................................... 0,2 g
Agar-agar........................................................ 3,0 g
Agua destilada.................................................1,0 l
pH = 7,3 0,1

Disolver los ingredientes, distribuir en tubos (aproximadamente 4 cm de altura) y esterilizar en
autoclave 15 minutos a 121C. Dejar solidificar en posicin vertical.
Medio de cultivo de ensayo para comprobar la formacin de sulfuro, de indol y la motilidad de
Enterobactericeas.

SUERO DE NARANJA (OSA) AGAR

Triptona .........................................................10,0 g
Glucosa............................................................4,0 g
K
2
HPO
4
...........................................................3,0 g
Suero de naranja..........................................200,0 ml
Agar-agar.......................................................17,0 g
pH = 5,5

Esterilizar 15 minutos a 115C; no sobrecalentar.

Este medio se utiliza para el aislamiento y demostracin del nmero de bacterias de putrefaccin,
cido tolerantes, en zumos de frutas, sencillos o concentrados, especialmente ctricos.
Por su contenido en suero de naranja, este medio est ajustado a los requisitos de la flora
existente en los jugos ctricos; entre los microorganismos mencionados estn: Bacillus,
Lactobacillus, Leuconostoc, hongos.
107
SUERO DE NARANJA (OSB) CALDO

Se prepara como el anterior, omitiendo el agar.

SULFITO HIERRO AGAR

Triptona .........................................................10,0 g
Na
2
SO
3
............................................................0,5 g
Citrato de hierro (II) ........................................0,5 g
Agar-agar.......................................................25,0 g
Agua destilada.................................................1,0 l
pH = 7,1

Este medio se utiliza para el aislamiento y la enumeracin de clostridios en medios crnicos.
El medio contiene sulfito, que es una sustancia inhibitoria para otros microorganismos pero no lo
es para los clostridios. El C. perfringens y otros clostridios reducen el sulfito a sulfuro, el cual
reacciona con la sal de hierro para dar FeS negro. La incubacin debe realizarse en condiciones
de anaerobiosis, 48 horas a 37C.
Las colonias de clostridios presentan en este medio color pardo oscuro o negro.

SULFITO HIERRO NEOMICINA AGAR

Al agar sulfito hierro fundido y enfriado a 50C, se le agrega solucin de sulfato de neomicina
estril, de manera de obtener en el medio una concentracin final de 50 ppm.

La neomicina acta como agente selectivo, inhibiendo la flora de acompaamiento y permitiendo
el crecimiento de C. perfringens y otros clostridios.

SULFITO POLIMIXINA SULFADIAZINA (SPS) AGAR

Peptona de casena ....................................... 15,0 g
Extracto de levadura..................................... 10,0 g
Citrato frrico................................................. 0,5 g
Na
2
SO
3
........................................................... 0,5 g
Sulfato de Polimixina B............................... 0,01 g
Sulfadiazina sdica....................................... 0,12 g
Agar-agar.......................................................14,0 g
Agua destilada.................................................1,0 l
pH = 7,0

El medio de cultivo posee antibiticos que inhiben el crecimiento de la flora acompaante de
Clostridium perfringens, incluso otros reductores de sulfito. El sulfito es reducido a sulfuro, que
reacciona con el hierro para dar sulfuro de hierro negro en las colonias. Para la identificacin de
C. perfringens se deben hacer pruebas complementarias.
108
TERMOACIDURANS (TAA) AGAR

Proteosa peptona .............................................5,0 g
Glucosa............................................................5,0 g
K
2
HPO
4
...........................................................4,0 g
Agar-agar.......................................................20,0 g
Agua destilada.................................................1,0 l
pH = 5,0

Este medio se utiliza para el aislamiento y enumeracin de bacterias acidricas de alteracin,
principalmente del flat sour, que causan alteracin en conservas cidas.
Puede incubarse a 37C, para recuento total de mesfilas, y a 55C, para la deteccin de
termfilas, (por ejemplo, el Bacillus coagulans). Para la deteccin de anaerobios se siembra en
profundidad en tubos largos.

TETRATIONATO CALDO segn Mueller-Kauffmann

NaCl ................................................................4,5 g
CaCO
3
............................................................25,0 g
Na
2
S
2
O
3
.........................................................40,7 g
Bilis de buey desecada...4,75 g
Aditivos: KI, I
2
, Verde Brillante

Disolver y calentar brevemente (enfriar rpidamente). No esterilizar en autoclave. Antes de
usar, aadir 20 ml/litro de solucin de I
2
-KI (5,0 g de I
2
y 6,0 g de KI en un litro de agua
destilada); y 10 ml/litro de solucin al 0,1 % de Verde Brillante.
pH = 7,00,1

Este medio de cultivo se utiliza para el enriquecimiento selectivo de Salmonella a partir de
diversos alimentos.
El tetrationato inhibe el crecimiento de coliformes y otras bacterias de acompaamiento. En
cambio, las bacterias reductoras de tetrationato, como, por ejemplo, Salmonella y Proteus,
pueden desarrollarse sin obstculos. El cido procedente de la reduccin del tetrationato es
neutralizado por el carbonato.
Las sales biliares inhiben el crecimiento de microorganismos de presencia no obligatoria en el
intestino. El Verde Brillante sirve para reprimir la flora Gram (+). Dado que el Verde Brillante
posee un efecto inhibidor muy intenso, se recomienda no agregarlo para obtener un mayor
rendimiento.
109
TIOGLICOLATO CALDO

Peptona..........................................................15,0 g
Glucosa............................................................5,5 g
Cistina..............................................................0,5 g
NaCl ................................................................2,5 g
Na
2
S
2
O
3
...........................................................0,5 g
Agua destilada.................................................1,0 l
pH = 7,10,2

Fraccionar en tubos con tapa de rosca, dejando poco espacio libre. Esterilizar en autoclave.
Si el medio no es utilizado inmediatamente, calentar a ebullicin 15 minutos y enfriar
rpidamente en el momento de usar.
Se utiliza para el crecimiento de microorganismos anaerobios estrictos. La cistina y el
tioglicolato proporcionan una anaerobiosis suficiente, incluso para anaerobios exigentes.
Sembrar con pipeta en el fondo del tubo, sin burbujear.

TRIPLE AZUCAR HIERRO (TSI) AGAR

Extracto de carne............................................ 3,0 g
Peptona......................................................... 20,0 g
NaCl ............................................................... 5,0 g
Lactosa ......................................................... 10,0 g
Sacarosa........................................................ 10,0 g
Glucosa........................................................... 1,0 g
Citrato frrico................................................. 0,3 g
Na
2
S
2
O
3
.......................................................... 0,3 g
Rojo fenol ................................................... 0,025 g
Agar-agar...................................................... 12,0 g
Agua destilada.................................................1,0 l
pH = 7,4

El medio se coloca en tubos y se solidifica en posicin inclinada.

Este medio se utiliza para la identificacin de enterobacterias. En este medio se observa la
capacidad de los microorganismos para fermentar glucosa, lactosa y sacarosa. La acidificacin
del medio se pone de manifiesto por el viraje al amarillo del indicador de pH Rojo fenol. El
rango de viraje del mismo es pH: 6,8-8,4. A pH alcalino, el medio vira al rojo, a pH cido, el
medio vira al amarillo.
La deteccin de las reacciones de fermentacin depende de los siguientes factores:
1) El balance de las concentraciones de azcares y compuestos nitrogenados. La glucosa est
presente en concentracin diez veces menor que la lactosa y la sacarosa.
2) La difusin lenta de los productos de fermentacin cidos y de los productos
alcalinos del metabolismo nitrogenado a travs del medio.
110
3) La mayor produccin de cido en la profundidad del tubo (fermentacin) comparado con
la superficie aerobia (respiracin).
Las bacterias que fermentan azcares ms concentrados, lactosa o sacarosa, determinarn la
formacin de suficiente cantidad de cido para difundir a travs del medio y acidificar incluso la
superficie. La degradacin de azcar con formacin de cido se pone de manifiesto por el viraje
al amarillo del indicador de pH Rojo fenol. La alcalinizacin del medio se pone de manifiesto
por un viraje al rojo del indicador.
El tiosulfato es reducido por algunos grmenes a cido sulfhdrico, que forma sulfuro de hierro
negro con la sal frrica presente en el medio. No se recomienda el uso de este medio para la
identificacin de especies tales como Citrobacter o Proteus, debido a que la fermentacin de
sacarosa enmascara la formacin de sulfuro de hierro.

Interpretacin

Microorganismos Color del medio de cultivo Formacin de H
2
S
Columna
vertical
Superficie
inclinada

Salmonella typhi S OA
+ solamente en la parte superior de
la columna vertical, frecuentemente
formacin de anillo, eventualmente
slo a las 48 horas.
Salmonella paratyphi A SG OA -
Salmonella cholerae suis SG OA -
Salmonella paratyphi B SG OA + columna vertical
Salmonella typhimurium SG OA + columna vertical
Shigella flexneri S OA -
Enterobacter aerogenes SG S -
Enterobacter cloacae SG S -
Escherichia coli SG S -
Citrobacter SG S +
Klebsiella SG S -
Proteus vulgaris SG** S + verde negruzco
Proteus mirabilis SG** A/S + verde negruzco
Morganella morganii SG** OA -
Proteus rettgeri S (A) OA -
Klebsiella pneumoniae S/SG OA -
Pseudomonas aeruginosa OA OA* -
Al. faecalis OA OA -

* - Eventualmente por formacin de pigmento.
* - muchas cepas A, eventualmente sin produccin de gas.
A: viraje al rojo por formacin de lcali.
OA: sin alteracin del color original del medio de cultivo, o rojo por formacin de lcali.
S: viraje al amarillo, por formacin de cido.
SG: viraje al amarillo y produccin de gas.
+: ennegrecimiento por formacin de H
2
S.
-: ausencia de ennegrecimiento.
111
TRIBUTIRINA AGAR

Peptona............................................................5,0 g
Tributirina......................................................10,0 g
Agar-agar.......................................................15,0 g
Agua destilada.................................................1,0 l
pH = 7,5

El medio se utiliza para la identificacin de microorganismos lipolticos. La degradacin de
tributirina produce halos de aclaramiento alrededor de las colonias, en contraste con el resto del
medio que permanece turbio. La incubacin es de hasta 72 h en condiciones ptimas.

TRIPTONA GLUCOSA (GTA) AGAR

Glucosa............................................................5,0 g
Prpura de bromocresol ................................40,0 mg
Agar-agar.......................................................12,0 g
Agua destilada.................................................1,0 l

Se utiliza para la enumeracin y deteccin de agentes del flat sour en alimentos de acidez baja
y media, tanto mesfilos como termfilos.
Si se desea hacer un recuento total de aerobios, se cuentan todas las colonias. El recuento de
bacterias del flat sour se realiza considerando slo las colonias rodeadas de un halo amarillo
por viraje del indicador, debido a la acidez.
Las bacterias termfilas del flat sour (ej. B. stearothermophilus) presentan colonias
tpicamente circulares, de 2 a 5 mm de dimetro, con centro opaco rodeadas de una zona amarilla
debido a la produccin de cido.

TRIPTONA GLUCOSA (GTB) CALDO

Glucosa............................................................5,0 g
Prpura de bromocresol ................................40,0 mg
Agua destilada.................................................1,0 l

Este medio se utiliza para la deteccin de bacterias que causan alteracin en conservas de acidez
baja y media, tanto mesfilas como termfilas del flat sour. Se observa turbidez y viraje al
amarillo debido a la acidificacin del medio y la presencia del indicador de pH Prpura de
bromocresol.

112
TRIPTONA SULFITO CICLOSERINA (TSC) AGAR

Triptona .........................................................15,0 g
Peptona de soja................................................5,0 g
NaHSO
3
...........................................................1,0 g
Citrato de amonio y hierro III .........................1,0 g
Agar-agar.......................................................15,0 g
Agua destilada.................................................1,0 l

Luego de esterilizar se agrega 10 ml de cicloserina al 5% esterilizada por filtracin.
La cicloserina inhibe la flora acompaante de C. perfringens cuyas colonias aparecen negras
debido a la reduccin del sulfito y formacin de sulfuro ferroso negro. El medio se utiliza para el
aislamiento de C. perfringens en alimentos. Deben realizarse pruebas confirmatorias para su
identificacin.

TRIPTONA SULFITO NEOMICINA (TSN) AGAR

Triptona ........................................................ 15,0 g
Extracto de levadura .................................... 10,0 g
Sulfito sdico.................................................. 1,0 g
Neomicina sulfato ........................................ 0,05 g
Polimixina B................................................. 0,02 g
Citrato frrico................................................. 0,5 g
Agar-agar...................................................... 13,5 g
pH = 7,20,2

Autoclavar durante 10 minutos a 121C. No volver a calentar. El medio de cultivo preparado
debe utilizarse en lo posible en el da.

Con este medio altamente selectivo, es posible realizar una investigacin cuantitativa,
relativamente rpida de Clostidium perfringens.

UREA CALDO

Dihidrogenofosfato potsico .......................... 9,1 g
Hidrogenofosfato disdico ............................. 9,5 g
Urea .............................................................. 20,0 g
Rojo fenol ..................................................... 0,01 g

En este medio de cultivo slo crecen aquellos microorganismos que pueden utilizar urea como
nica fuente de carbono. Los grmenes que utilizan urea producen un viraje del indicador hacia
el rojo y turbidez del medio de cultivo.

113
UVM CALDO

Peptona Proteosa .............................................5,0 g
Triptona ...........................................................5,0 g
Lab Lemco Polvo.........................................5,0 g
NaCl ..............................................................20,0 g
KH
2
PO
4
..1,35 g
Na
2
HPO
4
.......................................................12,0 g
Esculina ...........................................................1,0 g
Acido Nalidxico (2% en 0,1 M NaOH) .........1,0 ml
Clorhidrato de acriflavina..............................12,0 mg
Agua destilada.................................................1,0 l
pH = 7,2

Autoclavar a 121C, 15 minutos Este medio se utiliza para el enriquecimiento selectivo de
Listeria.
La combinacin de diferentes peptonas, extractos, sales y sustancias tampn permite un buen
crecimiento de Listeria. La selectividad del medio viene dada por el cido nalidxico y el
clorhidrato de acriflavina, que son sustancias inhibidoras del crecimiento.

VERDE BRILLANTE 2% SALES BILIARES (BRILA) CALDO

Peptona..........................................................10,0 g
Lactosa ..........................................................10,0 g
Sales biliares..................................................20,0 g
Verde Brillante ..............................................13,3 mg
Agua destilada.................................................1,0 l
pH = 7,2

Este medio se utiliza para el aislamiento de bacterias coliformes. La bilis y el Verde Brillante se
utilizan para inhibir el crecimiento de la flora acompaante, inclusive C. perfringens (degradador
de lactosa). La fermentacin de la lactosa con produccin de gas indica la presencia de
coliformes. La investigacin se realiza en tubos de fermentacin.
Se incuba 48 h a 37C para coliformes totales y 48 h a 44,5C para coliformes fecales.

VERDE BRILLANTE ROJO FENOL LACTOSA SACAROSA (BPLS) AGAR

NaCl ................................................................5,0 g
Lactosa ..........................................................10,0 g
Sacarosa.........................................................10,0 g
Rojo fenol ......................................................80,0 mg
Verde Brillante ..............................................12,5 mg
114
Agar-agar.......................................................15,0 g
Agua destilada.................................................1,0 l
pH = 6,9

Este medio se utiliza para el aislamiento de Salmonellas. Contiene Verde Brillante como agente
selectivo, que inhibe el crecimiento de bacterias Gram(+), permitiendo el desarrollo sin
restricciones de coliformes. El rojo fenol vira al rojo en medio alcalino y al amarillo en medio
cido, lo que lleva a distinguir las colonias fermentadoras de las no fermentadoras de lactosa. Las
colonias de Salmonellas son pequeas translcidas o incoloras y el medio a su alrededor vira al
rojo debido a que no fermentan lactosa. Las colonias de coliformes aparecen grandes, cremosas y
de color amarillo; el medio vira al amarillo verdoso.

VERDE BRILLANTE ROJO FENOL LACTOSA SACAROSA (BPLS) AGAR modificado

NaK
2
PO
4
..........................................................0,6 g
Na
2
H PO
4
.........................................................1,0 g
Lactosa ..........................................................10,0 g
Sacarosa.........................................................10,0 g
Rojo fenol ......................................................90,0 mg
Verde Brillante ................................................4,7 mg
Agar-agar.......................................................12,0 g
Agua destilada.................................................1,0 l
pH = 6,9 0,1

Este medio se utiliza para la demostracin de Salmonellas, excepto S. typhi y Shigellas, en
carnes, derivados crnicos y otros alimentos.
La flora acompaante Gram positiva, as como S. typhi y Shigella resultan muy reprimidos por el
Verde Brillante. Para la inhibicin del grupo Proteus se recomienda la adicin de 0,2% de
desoxicolato de sodio. Puesto que las Salmonellas no degradan lactosa ni sacarosa, se diferencian
de la flora acompaante lactosa y/o sacarosa positiva. La degradacin de los azcares con
formacin de cido se pone de manifiesto por el viraje del indicador Rojo fenol al amarillo.
Se obtiene un rendimiento ptimo en Salmonellas realizando un enriquecimiento previo en
Caldo Tetrationato segn Mueller-Kauffmann durante 18 h a 43C. A continuacin se siembra
en superficie sobre agar BPLS y se incuba 18-24 h a 37C.

Colonias Microorganismos
Salmonella, Proteus (sin dispersin)
Rojas, con halo luminoso
Pseudomonas (colonias pequeas y dentadas)
Amarillas, con halo opaco Escherichia coli, Enterobacter, Citrobacter,
Klebsiella y otros

115
XILOSA LISINA DESOXICOLATO (XLD) AGAR

L-lisina ........................................................... 5,0 g
Xilosa ........................................................... 3,75 g
Lactosa ........................................................... 7,5 g
Sacarosa.......................................................... 7,5 g
Desoxicolato de sodio .................................... 2,5 g
Citrato de amonio y hierro ............................. 0,8 g
Tiosulfato de sodio......................................... 6,8 g
NaCl ............................................................... 5,0 g
Agar-agar...................................................... 15,0 g
Rojo fenol ..................................................... 80,0 mg
Agua destilada.................................................1,0 l
pH = 7,4

Este medio se utiliza para el aislamiento de enterobactericeas patgenas, especialmente
Salmonella y Shigella.
La degradacin de los azcares se pone de manifiesto por el viraje al amarillo del indicador Rojo
fenol. Las bacterias que descarboxilan la lisina con formacin de cadaverina se reconocen por un
color rojo purpreo alrededor de las colonias.

YGC AGAR

D(+)-glucosa................................................. 20,0 g
Cloramfenicol................................................. 0,1 g
Agar-agar...................................................... 14,9 g
pH = 6,60,2

Esterilizar en autoclave, 15 minutos a 121C.

Agar selectivo para la enumeracin y aislamiento de mohos y levaduras en leche, productos
lcteos y otros alimentos.

116
REGLAS BSICAS DE HIGIENE Y SEGURIDAD PARA ALUMNOS DE LABORATORIOS DE
QUMICA Y BIOLOGA - PAUTAS DE ACTUACION EN CASOS DE EMERGENCIAS
FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS Y NATURALES - SERVICIO DE HIGIENE Y SEGURIDAD
_____________________________

Las prcticas que se realizan en los laboratorios presentan riesgos propios de cada
actividad. Las reglas bsicas aqu indicadas son un conjunto de normas destinadas a
proteger la salud de los alumnos y a evitar accidentes y contaminaciones tanto dentro
del mbito de trabajo, como hacia el exterior.

Es un elemento clave en la seguridad la informacin que permita reconocer y minimizar
o evitar los riesgos presentes en el laboratorio. Ser fundamental respetar la
metodologa de cada tcnica, y trabajar con cuidado y en forma ordenada.

MEDIDAS GENERALES

1. Se deber conocer la ubicacin de los elementos de seguridad en el lugar de
trabajo, tales como: matafuegos, salidas de emergencia, mantas ignfugas, lavaojos,
gabinete para contener derrames, accionamiento de alarmas, etc.
2. No se debe comer, beber, fumar o maquillarse en el laboratorio.
3. No se debe guardar alimentos en heladeras que contengan drogas o preparados.
4. Se debe utilizar vestimenta apropiada para realizar trabajos de laboratorio,
guardapolvo abrochado (preferentemente de algodn y de mangas largas) y
zapatos cerrados. Evitar el uso de accesorios colgantes (aros, pulseras, collares,
etc.). Llevar el cabello recogido.
5. Las mesadas de trabajo, deben estar despejadas, sin libros, ni abrigos ni objetos
personales. Es imprescindible mantener el orden y la limpieza. Cada persona es
responsable directa de la zona que le ha sido asignada y de todos los lugares
comunes.
6. Las manos deben lavarse cuidadosamente despus de cualquier manipulacin de
laboratorio y antes de retirarse del mismo.
117
7. Se deben utilizar guantes apropiados para evitar el contacto con sustancias qumica
o material biolgico. Toda persona cuyos guantes se encuentren contaminados no
deber tocar objetos, ni superficies, tales como: telfono, lapiceras, manijas de
cajones o puertas, cuadernos, etc.
8. No se permite correr en los laboratorios.
9. No se deben bloquear las rutas de escape o pasillos con bancos, sillas, equipos,
mquinas u otros elementos que entorpezcan la correcta circulacin.
10. De aviso inmediato al docente responsable si encuentra instalaciones elctricas y
de gas precarias o provisorias.
11. No utilice equipos (Ej. Rotavap, columnas de destilacin, sonicadores, hornos etc.)
sin haber recibido entrenamiento previo y sin supervisin durante su uso.
12. Toda herida o abrasin, an los pequeos cortes que puedan producirse durante el
trabajo prctico deben ser informados al Docente. Los laboratorios cuentan con un
botiqun de primeros auxilios con los elementos indispensables para atender casos
de emergencia.
13. Respete las seales de advertencia. (ej.: riesgo elctrico, alta
temperatura, radiaciones, etc.)

14. Todo residuo generado debe colocarse en los
recipientes destinados para tal fin segn las indicaciones
del docente (ver Pautas para Gestin de Residuos)

118
LABORATORIOS DE QUMICA

1. No se permite pipetear con la boca.
2. Siempre que sea necesario proteger los ojos y la cara de salpicaduras o impactos
se utilizarn anteojos de seguridad, viseras o pantallas faciales u otros dispositivos
de proteccin. Cuando se manipulen productos qumicos que emitan vapores o
puedan provocar proyecciones, se evitar el uso de lentes de contacto.
3. No utilice el contenido de un recipiente que no este identificado. Los envases que
contengan agentes qumicos deben adecuadamente etiquetados con la
denominacin del compuesto y el tipo de riesgo (Ej.: corrosivo, txico, inflamable,
oxidante, radiactivo, explosivo o nocivo).

4. Cuando sea necesario manipular grandes cantidades de materiales inflamables
(ms de 5 litros) deber tenerse a mano un extintor apropiado para ese material en
cuestin.
5. Al almacenar sustancias qumicas se debe considerar las incompatibilidades que
dan lugar a reacciones peligrosas. Consultar con el Docente.
119
6. No almacenar en estantes sobre mesadas sustancias corrosivas y en caso de
cidos o lcalis concentrados (mayor de 2N) deben ser mantenidos en bandejas de
material adecuado.
7. Las prcticas que produzcan gases, vapores, humos o partculas, y que puedan ser
riesgosas por inhalacin deben llevarse a cabo bajo campana.
8. Se debe verificar la ausencia de vapores inflamables antes de encender una fuente
de ignicin.
9. No se debe trabajar con materiales inflamables o solventes sobre llamas directas o
cerca de las mismas. Para calentamiento, slo se utilizarn resistencias elctricas o
planchas calefactoras blindadas. Se prestar especial atencin al punto de
inflamacin y de autoignicin del producto.
10. Est prohibido descartar lquidos inflamables o txicos o corrosivos por los
desages de las piletas, sanitarios o recipientes comunes para residuos. Se deben
seguir las pautas para la gestin de residuos.
11. Los cilindros de gases comprimidos y licuados deben estar en posicin vertical
sujetos con correas o cadenas a la pared en sitios de poca circulacin, de ser
posible fuera del lugar de trabajo, protegidos de la humedad y fuentes de calor.
12. El material de vidrio roto no se depositar con los residuos comunes. Ser
conveniente envolverlo en papel y ubicarlo en cajas resistentes,
13. Todo recipiente que hubiera contenido agentes qumicos puede ser descartado
junto a los residuos comunes vaciado totalmente, enjuagado apropiadamente y sin
etiquetas.
14. Est terminantemente prohibido hacer experimentos no autorizados por el Docente.
No substituya nunca un producto qumico por otro en una prctica.

LABORATORIOS DE BIOLOGIA

1. Leer Reglas Bsicas para Laboratorios de Qumica.
2. Se deben utilizar mascarillas descartables cuando exista riesgo de produccin de
aerosoles (mezcla de partculas en medio lquido) o polvos durante operaciones de
120
pesada de sustancias txicas o biopatgenas, apertura de recipientes con cultivos
despus de agitacin, etc.
3. Est prohibido descartar material biolgico por los desages de las piletas,
sanitarios o recientes comunes para residuos. En cada caso se debern seguir los
procedimientos establecidos para la gestin de residuos.
4. La superficie de trabajo se deber descontaminar una vez terminadas las tarea o
luego de cada derrame de material viable, utilizando productos probadamente
efectivos contra los agentes con que se trabaja.
5. El derrame o cada de muestras contaminadas, diluciones y medios sembrados o
inoculados ser informada al docente de inmediato. Se proceder a tratar el rea
afectada con la solucin desinfectante que corresponda, la cual se dejar actuar y
se recoger con papel absorbente que ser luego descartado con los residuos
patognicos.
6. En caso de rotura del recipiente de vidrio que contiene microorganismos, proceder
de igual forma pero no tocar los residuos antes que el desinfectante haya actuado.
7. Cuando proceda a la limpieza de una superficie con alcohol, verifique que no haya
mecheros encendidos.
8. Consulte con el Docente si el material biolgico debe ser descontaminado previo a
su descarte en recipiente de residuos patognicos (bolsa roja).

121
PAUTAS PARA LA GESTIN DE RESIDUOS PELIGROSOS Y PATOGNICOS

Peligrosos (cidos, lcalis, oxidantes, corrosivos, guantes, trapos, etc.):
Los residuos lquidos se debern acumular en bidones provistos por el Servicio de
Higiene y Seguridad. Mantenerlos tapados. No mezclar sin consultar al Docente.
Los residuos slidos se debern acumular en bolsas negras dentro de cajas provistas
por el Servicio de Higiene y Seguridad. No tirar residuos domsticos.

Patognicos (tips, guantes, cajas de petri, etc.):
Los residuos biolgicos (sangre, tejidos animales o humanos y todo el material que
haya estado en contacto con ellos) se debern acumular en bolsas rojas dentro de
cestos con tapa provistos por el Servicio de Higiene y Seguridad. Quedan exceptuados
los elementos corto-punzantes (agujas, hojas de bistures), que se recogern en
contenedores especiales.

ANTE CUALQUIER DUDA CONSULTE CON EL DOCENTE

La seguridad la disfrutamos todos. Actuemos responsablemente

PAUTAS DE ACTUACIN EN CASO DE EMERGENCIAS

En caso de accidente, avisar inmediatamente al Docente.

EMERGENCIAS MDICAS

Si ocurre una emergencia tal como cortes o abrasiones, quemaduras o ingestin accidental de algn
producto qumico, txico o peligroso, se deber proceder en la siguiente forma:
1. A los accidentados se les proveer los primeros auxilios
2. Se da aviso al Departamento de Seguridad y Control (Int. 311 Emergencias)
122
3. El Docente responsable del turno o una autoridad del Departamento, deber completar el
Formulario de Incidentes y enviarlo al Servicio de Higiene y Seguridad para su conocimiento y
evaluacin.

CENTROS PARA REQUERIR AYUDA MEDICA
S.A.M.E. Telfono 107
Hospital Pirovano
Av. Monroe 3555 Tel. 4542-5552 / 9279

INTOXICACIONES:
Hospital de Nios. Dr. R. Gutirrez
Snchez de Bustamante 1399. Capital Federal. Tel: 4962-6666.
Hospital de Nios. Dr. P. de Elizalde
Av. Montes de Oca 40 Tel. 4307-7491 Toxicologa 4300-2115

QUEMADURAS:
Hospital de Quemados
P.Goyena 369 Tel. 4923-4082 / 3022

OFTALMOLOGA
Hospital Santa Luca
San Juan 2021 Tel. 4941-7077
Hospital Dr. P. Lagleyze
Av. Juan B. Justo 4151 Tel. 4581-0645 / 2792

1. Quemaduras.
Las pequeas quemaduras producidas por material caliente, baos, placas o mantas
calefactoras, etc., se trataran lavando la zona afectada con agua fra durante 10-15
minutos. Las quemaduras ms graves requieren atencin mdica inmediata. No utilices
cremas y pomadas grasas en las quemaduras graves.
123

2. Cortes.
Los cortes se tienen que lavar bien, con abundante agua corriente, durante 10 minutos
como mnimo. Si son pequeos y dejan de sangrar en poco tiempo, lvalos con agua y
jabn y tpalos con una venda o apsito adecuados. Si son grandes y no paran de
sangrar, requiere asistencia mdica inmediata.

3. Derrame de productos qumicos sobre la piel.
Los productos qumicos que se hayan vertido sobre la piel han de ser lavados
inmediatamente con agua corriente abundante, como mnimo durante 15 minutos. Es
necesario sacarle toda la ropa contaminada a la persona afectada lo antes posible. El
lavado es muy importante para reducir la gravedad y la extensin de la herida.
Requiere asistencia mdica.

4. Actuacin en caso de producirse corrosiones en la piel.
Por cidos. Sacar o cortar lo ms rpidamente posible la ropa. Lavar con agua
corriente abundante la zona afectada. Neutralizar la acidez con bicarbonato sdico
durante 15-20 minutos. Esperar la asistencia mdica.
Por lcalis. Lavar la zona afectada con agua corriente abundante y luego con una
solucin saturada de cido brico. Secar y esperar la asistencia mdica.

5. Fuego en el cuerpo.
Si se te incendia la ropa, pide ayuda. El afectado no correr, tiene que tirarse en el
suelo y rodar sobre si mismo para apagar las llamas. Es tu responsabilidad ayudar a
alguien que se est quemando. Cubrirlo con una manta antifuego, conducirlo hasta la
ducha de seguridad, si est cerca. No utilices nunca un extintor sobre una persona.
Una vez apagado el fuego, mantener a la persona tendida, hasta que llegue la
asistencia mdica.

6. Actuacin en caso de producirse corrosiones en los ojos.
En este caso el tiempo es esencial (menos de 10 segundos). Cuanto antes se lave el
ojo, menos grave ser el dao producido. Lavar los dos ojos con agua corriente
124
abundante durante 15 minutos como mnimo en una ducha de ojos, o con solucin
fisiolgica. Es necesario mantener los ojos abiertos con la ayuda de los dedos para
facilitar el lavado debajo de los prpados. Es necesario recibir asistencia mdica, por
pequea que parezca la lesin.

7. Actuacin en caso de ingestin de productos qumicos.
Antes de cualquier actuacin concreta pide asistencia mdica. Si el paciente est
inconsciente, ponerlo en posicin inclinada, con la cabeza de lado. Si est consciente,
mantenerlo apoyado. No dejarlo slo. No provocar el vmito si el producto ingerido es
corrosivo.

8. Actuacin en caso de inhalacin de productos qumicos.
Identificar el vapor txico. Si se trata de un gas, utilizar el tipo adecuado de mscara
para gases durante el tiempo que dure el rescate del accidentado. No arriesgarse.
Conducir inmediatamente la persona afectada a un sitio con aire fresco. Requiere
asistencia mdica lo antes posible. Ante el primer sntoma de dificultad respiratoria,
iniciar la respiracin artificial boca a boca.

INCENDIOS

1. Fuego en el laboratorio.
Mantenga la calma.
Informe al docente responsable.
Se dar aviso inmediatamente al Dpto. de Seguridad y Control (Interno 311)
informando el lugar y las caractersticas del siniestro

2. Fuegos pequeos
Si el fuego es pequeo y localizado, y sabe utilizar un extintor, trate de apagarlo
utilizando un extintor adecuado, arena, o cubriendo el fuego con un recipiente de
tamao adecuado que lo ahogue.
Retirar los productos qumicos inflamables que estn cerca del fuego.
125
No utilices nunca agua para extinguir un fuego provocado por la inflamacin de un
solvente.

3. Fuegos grandes
Si el fuego es de consideracin, no se arriesgue y manteniendo la calma ponga en
marcha el plan de evacuacin. Apague los equipos elctricos y cierre las llaves de gas
y ventanas.
Acate las indicaciones de los brigadistas.
Evacue la zona por la ruta asignada.
No corra, camine rpido, cerrando a su paso la mayor cantidad de puertas. No utilice
ascensores. Descienda siempre que sea posible.
No lleve consigo objetos, pueden entorpecer su salida.
Si pudo salir por ninguna causa vuelva a entrar. Deje que los equipos especializados se
encarguen.

DERRAME MAYORES DE PRODUCTOS QUMICOS

Avise al Departamento de Seguridad y Control (int. 311 Emergencias)
Atender a cualquier persona que pueda haber sido afectada.
Notificar a las personas que se encuentren en las reas cercanas acerca del
derrame. Buscar los elementos en el Gabinete para contener derrames.
Coloque la cinta de demarcacin para advertir el peligro.
Evacuar a toda persona no esencial del rea del derrame.
Si el derrame es de material inflamable, apagar las fuentes de ignicin, y las fuentes
de calor.
Evite respirar los vapores del material derramado, si es necesario utilizar una
mscara respiratoria con filtros apropiados al tipo de derrame.
Ventilar la zona.
Utilizar los elementos de proteccin personal tales como equipos de ropa resistente a
cidos, bases y solventes orgnicos y guantes.
126
Confinar o contener el derrame, evitando que se extienda. Para ello extender los
cordones en el contorno del derrame.
Luego absorber con los paos sobre el derrame.
Deje actuar y luego recoger con pala y colocar el residuo en la bolsa roja
(patognicos) o negra (peligrosos) y cirrela.
Si el derrame es de algn elemento muy voltil deje dentro de la campana hasta que
lo retire para su disposicin.
Disponer la bolsa con los residuos (consultar al Servicio de Higiene y Seguridad, int.
275)
Lave el rea del derrame con agua y jabn. Seque bien.
Cuidadosamente retire y limpie todos los elementos que puedan haber sido
salpicados por el derrame.
Lave los guantes, la mscara y ropa.

127

Fecha: ..................................................................

Declaro haber ledo las REGLAS BSICAS DE HIGIENE Y SEGURIDAD EN
LABORATORIOS DE QUMICA Y BIOLOGA PROCEDIMIENTOS ANTE
EMERGENCIAS que aparecen en la gua de Trabajos Prcticos de la Materia
................................................................................................
Turno de Laboratorio: ........................................

Firma:...................................................................

Aclaracin:............................................................
L.U. N: ...............................................................

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