1 CROMATOGRAFA LQUIDA DE ALTA RESOLUCIN

Objetivos Proporcionar los fundamentos de la separacin por cromatografa lquida Realizar una descripcin de los instrumentos utilizados en la cromatografa lquida Bibliografa A. Braithwaite y F.J. Smith, Chromatographic Methods, Blackie Academic & Professional, 5a Ed., Glasgow, 1996 High Performace Liquid Chromatography, Analytical Chemistry by Open Learning, John Wiley & Sons, Chichester, 1998 Ll. R. Snyder, J.J. Kirkland y J.L. Glajch, Practical HPLC Method Development, John Wiley & Sons., New York, 1997

1.1.

Condiciones para el desarrollo de mtodos de HPLC

La HPLC1 es una tcnica de separacin de analitos basada en la transferencia de masa entre la fase estacionaria y la fase mvil. Tras disolver la muestra los analitos son arrastrados a lo largo de la columna por medio de la alta presin de la fase mvil. Dado que los analitos tienen distintas interacciones con la fase mvil y estacionaria la mezcla aparece separada en sus componentes a la salida de la columna. La cromatografa de lquidos abarca un grupo muy amplio entre los mtodos cromatogrcos puesto que el sistema ternario fase estacionaria/fase mvil/analito ofrece muchas y muy distintas
1 High

Performance Liquid Chromatography

1.1. CONDICIONES PARA EL DESARROLLO DE MTODOS DE HPLC

posibilidades para separar compuestos qumicos muy diferentes. La descripcin de la HPLC no se puede basar solo en la instrumentacin si no que tambin hay que ofrecer una aproximacin sistemtica para lograr separaciones adecuadas. Por tanto, la ruta fundamental para el desarrollo de mtodos de HPLC se puede resumir en los siguientes pasos: 1. Caractersticas de la muestra y objetivos de la separacin. 2. Tratamiento de la muestra y deteccin de analitos. 3. Condiciones iniciales de la separacin. 4. Validacin del mtodo HPLC. El desarrollo de cualquier mtodo se debe de basar forzosamente en el conocimiento de la cromatografa de separacin puesto que el grado de conocimiento que hoy en da se tiene acerca de los mtodos de separacin en funcin de la muestra y condiciones experimentales est bien cimentado.

1.1.1.

Caractersticas de la muestra y objetivos de la separacin.

Antes de hacer nada hay que tener en cuenta este anlisis que parece tan fundamental, puesto que tanto las caractersticas de la muestra como los objetivos de la separacin pueden proporcionar recursos que ayuden a llevar a cabo la separacin por HPLC. Las caractersticas referidas a la muestra aparecen recogidas en la Tabla 1.1 en la pgina siguiente. En un principio, esas caractersticas se pueden dar para cualquier muestra. Por ejemplo, en un medicamento antihistamnico se puede hacer un anlisis del componente activo teniendo en cuenta que tambin habr otros componentes que aparezcan disueltos. Otra cosa ser si se trata de sub-productos originados en la sntesis del componente activo o si este est contaminado. En cuanto a los objetivos de la separacin, hay que aclarar los siguientes puntos: El objetivo fundamental del mtodo HPLC es un anlisis cuantitativo, la deteccin de un compuesto, caracterizar algn componente desconocido o la puricacin del compuesto? Segn cual sea la respuesta el camino puede ser muy diferente. Hay que conseguir la resolucin de todos los componentes? Por ejemplo, en el ejemplo antes expuesto acerca del medicamento es preciso saber si hay que llevar a cabo tambin la separacin de los productos de degradacin o impurezas.

1.1. CONDICIONES PARA EL DESARROLLO DE MTODOS DE HPLC

Cuadro 1.1: Informacin fundamental acerca de la composicin y caractersticas de la muestra. Nmero de compuestos Estructura qumica de los compuestos (grupos funcionales) Peso molecular de los compuestos Ctes. de sus equilibrios cido/Base (pKa ) Espectros UV-V y MS Intervalo de concentracin de los analitos Solubilidad de la muestra En el caso de necesitarse un anlisis cuantitativo hay que saber con que grado de exactitud y precisin se quiere hacer. Si el anlisis de la muestra necesita un tratamiento largo entonces la obtencin de datos exactos y precisos necesita de un gran trabajo. De cuantas matrices hay que analizar el analito? No es lo mismo determinar un antihistamnico en distintos medicamentos que en la orina de un enfermo. Cuantas muestras se van a analizar a la vez? En funcin de ello puede ser ms razonable usar cromatogramas de 10 minutos que de 20 minutos. Cuales son los requisitos de la instrumentacin? En algunos hay que termostatizar la columna y en otros el sistema de deteccin puede no ser el mas habitual.

1.1.2.

Tratamiento y deteccin de la muestra

La muestra puede llegar de distintas formas al laboratorio:

Como para ser analizada enseguida por HPLC. Puede necesitar un proceso de dilucin o que se le aada una disolucin amortiguadora o un estndar interno. Puede ser necesario extraer compuestos de una matriz slida. Las muestras pueden necesitar pretratamientos largos para extraer los analitos y separarlos de otras especies interferentes antes de introducirlas en el HPLC.2
2 Ms

detalles sobre esto se pueden encontrar en el Captulo 10.

1.1. CONDICIONES PARA EL DESARROLLO DE MTODOS DE HPLC

Entre las condiciones para el desarrollo de mtodos hay que tener en cuenta el sistema de deteccin. El detector utilizado tiene que ver los analitos de la mejor forma posible (sensibilidad y selectividad). Puesto que como detector ms general se suele emplear el espectrofotmetro UV-V, los espectros de los compuestos de inters de la muestra pueden encontrarse en la bibliografa en la medida en la que los compuestos puros sean accesibles. Cuando este detector no es adecuado hay que considerar la utilizacin de otros. Si se trata de compuestos uorescentes o activos electroqumicamente existen detectores especcos y en ausencia de stos sera preciso utilizar el espectrmetro de masas.

1.1.3.

Condiciones iniciales de separacin

La separacin por medio de HPLC es una posibilidad ms entre muchos procedimientos. Es cierto que a travs de esta tcnica se puede llevar a cabo la separacin y determinacin de muchos compuestos pero hay que tener en cuenta tambin la viabilidad de otros mtodos. Como consecuencia de ello, es necesario considerar otras posibilidades como la cromatografa de gases, electroforesis, cromatografa de lquidos supercrticos o cromatografa de capa na. Si la tcnica elegida es la HPLC, entonces hay que especicar si la muestra a analizar es normal o especial. La denicin de muestra normal es bastante amplia, esto es, una mezcla de molculas pequeas (<2000 Da) que en un principio al menos pueden ser separadas por medios estndar. Las muestras que no entran en esta denicin se dir que son muestras especiales y su separacin necesitar de una columna especial y de medios o condiciones adecuadas. Una clasicacin de las muestras especiales aparece en la Tabla 1.2 en la pgina siguiente. Las muestras normales, igualmente, pueden ser clasicadas en dos grupos: neutras e iones. Entre los iones se encuentran los cidos, bases, sustancias anfteras, sales orgnicas, etc. Si la muestra tiene compuestos neutros la fase mvil no necesita de un amortiguador. Las condiciones iniciales utilizados en esos casos aparecen recogidas en la Tabla 1.3 en la pgina siguiente. Una vez puesto en marcha el mtodo inicial de anlisis por HPLC hay que llevar a cabo un ajuste del mismo para que las condiciones de separacin sean lo ms adecuadas posibles. Las caractersticas de ese ajuste vienen recogidas de forma general en la Tabla 1.4 en la pgina 6. La primera caracterstica en cuanto al anlisis cuantitativo es la resolucin. Si la mezcla tiene menos de cinco componentes se puede obtener una resolucin de lnea base (esto es Rs >1.5). Este tipo de resolucin ayuda al ajuste de los resultados. Si la muestra tiene mas de diez componentes, en cambio, la exigencias de la resolucin sern mas exibles (1.0 <Rs <1.5). Cuando el anlisis es cualitativo, esto es, cuando el objetivo es ms identicar componentes que cuan-

1.1. CONDICIONES PARA EL DESARROLLO DE MTODOS DE HPLC

Cuadro 1.2: Condiciones para la separacin de muestras especiales. Iones inorgnicos Ismeros Es problema ms importante es la deteccin. Utilizar cromatografa inica y detector de conductividad. Algunos ismeros se pueden separar con HPLC de fase reversa y clasicarse como muestras normales. Los resultados ms adecuados se obtienen con HPLC de fase normal o con columnas de fase reversa basadas en ciclodextrina slica. Se necesitan condiciones quirales para la separacin. Algunos factores convierten a este tipo de muestras en especiales: la conformacin molecular, la polaridad y un amplio intervalo de hidrofobicidad. Las molculas muy grandes necesitan materiales de empaquetamiento de poro grande ( > >10 nm). Las molculas biolgicas necesitan condiciones especiales.

Enantimeros Ctos. Biolgicos

Macromolculas

Cuadro 1.3: Condiciones iniciales de uso para HPLC de muestras normales. Mtodo/Columna
HPLC de fase reversa: Agua-fase orgnica C18 (ODS), C8 , fenil, trimetilsilil (TMS) o ciano HPLC de pares inicos: Agua-fase orgnica + buffer + cto. formador de pares inicos C18 , C8 , o ciano HPLC de fase normal : Mezcla de disolventes orgnicos Ciano, diol, amino, slica Es una buena segunda opcin cuando la fase reversa o la formacin de pares inicos no es efectiva. Es la primera opcin para molculas lipoflicas que no se disuelven bien en mezclas acuoso - orgnicas. Es la primera opcin para mezclas de ismeros y para HPLC a escala preparativa (mejor con slica). Es la eleccin ms aceptable para compuestos inicos o ionizables, especialmente bases y cationes

Condiciones de uso
Es la primera eleccin para la mayora de muestras, especialmente compuestos neutros o no ionizados solubles en agua o mezclas acuoso - orgnicas

1.1. CONDICIONES PARA EL DESARROLLO DE MTODOS DE HPLC

Cuadro 1.4: Objetivos de separacin del mtodo HPLC. Caracterstica Resolucin Tiempo de separacin Cuanticacin Presin Altura de picos Uso de disolvente Notas Para un anlisis cuantitativo preciso y adecuado se necesita que Rs >1.5 Para procedimientos de rutina <10 min < %2 para ensayos (1 sc ); < %5 para ensayos poco exigentes; < %15 para anlisis de trazas <150 bar deseable; a menudo se necesita <200 bar (para columnas nuevas) Picos estrechos son deseables para obtener relaciones seal / ruido elevadas El menor posible

ticarlos, entonces la resolucin no ha de ser de lnea base puesto que puede ser suciente el distinguir los picos. De saber que se cumplen el resto de caractersticas que aparecen recogidas en la Tabla 1.4 se espera un tiempo total de separacin lo ms bajo posible. Para tener referencia de ese tiempo, hay que tener en cuenta que para poner en marcha el procedimiento HPLC hace falta un tiempo de dos horas (preparacin de la fase mvil, ajuste y adecuacin de la columna, estabilizacin de la lnea base, inyeccin de estndares y obtencin de resultados repetidos....). Como consecuencia de ello, si se quieren analizar tres o cuatro muestras separaciones de 20 a 30 minutos pueden ser consideradas aceptables. Para el caso de que tengamos ms de diez muestras suele ser tpico pedir separaciones de 10 minutos. Adems de las caractersticas anteriores existen otras que no son tan importantes como la presin, altura de los picos y la utilizacin de disolvente. La presin no debe de llegar a valores superiores a 170 bar (2500 psi) en el caso de columnas nuevas puesto que disminuye el tiempo de duracin de la columna y puesto que a altas presiones es ms fcil que la columna quede obstruida por las partculas que llevan las disoluciones.

1.1.4.

Validacin del mtodo HPLC

En funcin de los objetivos expuestos al principio de esta pregunta se puede proceder a validar el mtodo. En general, para obtener un mtodo slido para una utilizacin rutinaria del mismo hay que conrmar el hecho de que puede ser aplicado en cualquier sitio y que cualquiera puede utilizarlo. Para ello hay que obtener resultados muy parecidos cuando se trabaja bastantes veces con muestras conocidas o estndares de referencia.

1.2. FUNDAMENTOS DE LA SEPARACIN

1.2.

Fundamentos de la separacin

Entre las caractersticas de la separacin la resolucin es la de mayor importancia. En consecuencia ser la ecuacin de la resolucin vista en el Captulo 7 la que se tomar como punto de partida: Rs = N 4 k ( 1) k +1

(1.1)

donde k es el factor de capacidad, N el numero de platos tericos de la columna y el factor de separacin. Como se dijo en su momento, la ecuacin 1.1 es la relacin fundamental de la cromatografa de lquidos puesto que resume las variables de la separacin en tres grupos: retencin (k ), ecacia de la columna (N) y selectividad (). Cambiando las condiciones de separacin, por ejemplo haciendo k ms pequeo la resolucin disminuir y aumentando el valor de k la resolucin mejorar. Cuando se aumenta , los tiempos de retencin de dos picos consecutivos pueden cambiar de forma distinta aumentando, en cualquier caso, la resolucin. Cuando se aumenta la ecacia de la columna, los picos sern ms estrechos y la resolucin entre ellos ser, por tanto, mayor. Por una parte, los valores de k y sern funcin de los siguientes factores que regulan el equilibrio de los analitos entre la fase estacionaria y la fase mvil: Componentes de la fase mvil Componente de la fase estacionaria Temperatura Por otra parte, los valores de N dependen de las condiciones de la columna: Velocidad de ujo Longitud de columna Tamao de partcula

1.2.1.

Variabilidad de la retencin (k )

La inuencia de la fuerza del disolvente es muy importante: mientras que los disolventes fuertes disminuyen la retencin, los disolventes dbiles ayudan a la retencin. Para formar la fase mvil

1.2. FUNDAMENTOS DE LA SEPARACIN

se utilizar como mnimo una mezcla de dos disolventes (A y B) siendo la fuerza de B mayor que la de A. Para predecir la inuencia del disolvente es muy til hacer una estimacin de k . Para ello se pueden utilizar los tiempos de elucin de los compuestos que no son retenidos y de esta forma transformar una escala de k sobre esos valores de elucin (t = to k = 1; tr = 2 to k = 2). A la hora de elegir el disolvente de la fase mvil hay que tener en cuenta que el objetivo a conseguir es el siguiente: que el intervalo de k existente entre el primer y ultimo analito est en el intervalo 0.5 <k <20. De esta forma las impurezas que salen rpido (k < 0,5) no se superpondrn a los analitos y se evitan tambin los picos anchos y retenciones largas de los que salen demasiado tarde (k > 20). En la cromatografa de fase reversa (RPC) la relacin entre k y la fase mvil ( %B) se ha dado de forma emprica mediante la siguiente expresin:

log k = log kw S

(1.2)

donde kw es el factor de capacidad del agua, S es una constante de cada analito y es la fraccin de volumen de B en la fase mvil (B %/100). En la mayora de analitos de masa molecular pequea (<500 Da) el valor de S 4. Segn la ecuacin 9.2, por lo tanto, aumentos en el %B del 10 % traen consigo un disminucin del doble o triple de k .

Figura 1.1: Diagrama de comparacin de disolventes en RFC. No solo hay que tener en cuenta la fuerza del disolvente con respecto a su inuencia sobre %B sino que tambin tiene su importancia el tipo de disolvente utilizado. Los disolventes ms utilizados son el acetonitrilo, el metanol y el tetrahidrofurano (THF). Entre ellos la sucesin en funcin de su fuerza es la siguiente: agua (el ms dbil) <metanol <acetonitrilo <etanol <tetrahidrofurano <propanol <cloruro de metileno (el ms fuerte) De todos ellos, el cloruro de metileno no es muy utilizado debido a que es inmiscible en agua. El ms utilizado es el AcN porque tiene la suciente fuerza y porque cuando se emplea como

1.2. FUNDAMENTOS DE LA SEPARACIN

sistema detector el espectrofotmetro UV-V es transparente a longitudes de onda bajas. Por otra parte, las mezclas de AcN son de baja viscosidad y eso, en cierta manera, aumenta la ecacia de la columna (N) y la presin a utilizar es menor. Algo menos que el AcN se utiliza el metanol y algo menos todava el THF. Cuadro 1.5: Caractersticas fsicas de disolventes ms usados en las fases mviles. Disolvente Acetona Acetonitrilo Cloroformo Dimetilsulfoxido 1,4-dioxano Acetato de Etilo ter etlico Hexano Iso-octano Metanol Metil-etilcetona Tetrahidrofurano Tolueno o-Xileno Agua Polaridad (P)3 5.1 5.8 4.1 7.2 4.8 4.4 2.8 0.1 0.1 5.1 4.7 4.0 2.4 2.5 10.2 Barrera UV (nm) 330 190 245 268 215 256 215 195 215 205 329 212 284 288 190 Viscosidad (cP) 0.36 0.38 0.57 2.24 1.37 0.45 0.24 0.31 0.50 0.55 0.43 0.55 0.59 0.81 1.0 Ta Ebullicin (0 C) 56.3 81.6 61.1 189.0 101.3 77.1 34.5 68.7 99.2 64.7 79.6 66.0 110.6 144.4 100

Aparte de la fase mvil, las retenciones presentan dependencia respecto a la fase estacionaria. Es as que las retenciones de los analitos dependen de tres caractersticas de la columna: tipo de fase enlazada, concentracin y supercie. Si se analiza el tipo de fase enlazada la retencin de analitos apolares y no inicos sigue el siguiente orden: Slica no unida < <ciano <C1 (TMS) <C3 <C4 <fenilo <C8 C18 Igualmente, los valores de k muestran una dependencia respecto a la supercie de la columna. Mientras que las columnas empaquetadas tpicas (poros de 8 nm) tienen supercies de 250 m2 /g, las empaquetadas de poro de 30 nm poseen supercies de 60 m2 /g.
1.2.2. Variabilidad de la selectividad

Una vez de que se hemos jado la elucin de los analitos en el intervalo k hay que adecuar la separacin entre los picos con el n de obtener una elucin lo ms selectiva posible. Eso conlleva la optimizacin de lo que, como antes se ha dicho, se puede llevar a cabo por medio

1.2. FUNDAMENTOS DE LA SEPARACIN

de cambios en la fase mvil, el empaquetamiento de la columna y/o la temperatura. De las opciones anteriormente citadas el cambio en la fase mvil es la que parece ms simple y esto se puede llevar a cabo de dos formas: cambiando la fuerza del disolvente y cambiando el tipo de disolvente. La primera de las opciones est en funcin del intervalo de retencin de los analitos, esto es, cuando la relacin de k entre el primer analito y el ultimo es del orden de 40 (ms concretamente, 0.5 <k <20) hay muy pocas posibilidades de adecuar la fuerza del disolvente. Por el contrario, cuando esa relacin es bastante menor que 40, entonces por medio de la fuerza del disolvente se puede mejorar mucho la resolucin de analitos que estn muy cercanos aumentando de esta forma la selectividad de la separacin. En cuanto a las caractersticas de la fase mvil, una de las que tienen ms importancia es la polaridad. Por medio de la polaridad se pueden predecir las interacciones que los analitos pueden tener con la fase mvil, el disolvente y/o la fase estacionaria. Es decir, cuando se aumenta la polaridad las interacciones son ms fuertes. La medida de la polaridad, sin embargo, no se lleva a cabo de una sola forma. Para ello se utilizan principalmente dos desarrollos empricos: Numero de polaridad de Snyder (P):

P = log Kd (etanol ) + log Kd (dioxano) + log Kd (nitrometano)

(1.3)

donde a travs de cada una de las constantes de reparto se mide la tendencia a recibir protones (basicidad), a darlos (acidez) y a generar momentos dipolares. e = di = nt =
log Kd (et ) P log Kd (di) P log Kd (nt ) P

Basicidad Acidez Momento dipolar

Parmetro de solubilidad de Hildebrand (t ): Eb B

1/2

t =

(1.4)

donde E es la energa interna de vaporizacin del compuesto y B es el volumen molar de ese compuesto. Como se ha hecho antes, se puede considerar que el parmetro de solubilidad tiene tres aportes:

10

1.2. FUNDAMENTOS DE LA SEPARACIN

2 2 t2 = 2 h + p + d

(1.5)

h p d

Poder de formacin de enlaces de hidrgeno Polaridad Coeciente de dispersin

Los anteriores desarrollos empricos llevan a la segunda opcin que es la del cambio de disolvente. Basndose en la denicin de polaridad de Snyder se han clasicado muchos disolventes y la consecuencia ms practica de ello es la de la Figura 1.2. La utilidad de esa clasicacin se basa en el hecho de que no se utilizan ms de tres disolventes en la HPLC.

Figura 1.2: Tringulo de selectividad del disolvente. Las caractersticas de los disolventes utilizados en la cromatografa de fase reversa (AcN, MeOH y THF) son de otro tipo y por eso se puede poner a punto mtodos con estos disolventes sin mayores problemas. Si bien en algunos casos es posible obtener con esos disolventes una elucin inversa, un cambio pequeo en la selectividad ( 2-5 %) puede ser suciente para obtener una resolucin adecuada. Si el ajuste de las variables anteriores resulta intil, se puede pensar en un cambio en el empaquetamiento de la columna. Igualmente, el cambio de la columna trae consigo un ajuste total de la fase mvil. En el caso de la RPC las posibilidades iniciales son columnas C18 o C8 y luego ciano o fenilo.

11

1.2. FUNDAMENTOS DE LA SEPARACIN

1.2.3.

Ecacia de la columna

Caractersticas del empaquetamiento

En la cromatografa de lquidos se usan columnas empaquetadas. En este tipo de cromatografas no es posible utilizar columnas capilares puesto que siendo la difusin de los lquidos 100 veces menor que la de los gases, la fase liquida disolvente es demasiado ancha como para que pueda ser atravesada en un tiempo corto por los analitos y llegar as a la fase estacionaria de las paredes de la columna. En las columnas empaquetadas, en cambio, como la fase estacionaria est a lo largo de la columna, los analitos no tienen problema para entrar en contacto con la fase estacionaria. Las columnas para HPLC son tubos de acero inoxidable o plstico que poseen una longitud de 5-30 cm y un dimetro interno de 1-5 mm. La tendencia de hoy en da es utilizar columnas cada vez ms pequeas (3-5 cm) y de dimetro interno tambin cada vez ms pequeo (1-2 mm) para de esta forma hacer los tiempos de anlisis ms cortos. Las columnas capilares (dimetros internos de 180-30 m) estn obteniendo cada vez ms fama puesto que reducen el tiempo de anlisis y ahorran disolvente. La columnas son caras y con el material particulado (suciedad) del disolvente o la muestra se pueden degradar fcilmente. En consecuencia, por delante de la columna se coloca una precolumna o una columna pequea de proteccin. La precolumna es una columna corta del mismo material que la columna analtica. Puesto que los solutos y partculas nas quedan totalmente pegados, esa precolumna habr que cambiarla frecuentemente. Los soportes de las fases estacionarias de la HPLC son partculas de slice. En el mercado se pueden encontrar slices de distinto tamao de partcula, distinta supercie externa y distinto tamao de poro. Las partculas pueden esfricas o irregulares. Las columnas llenas de partculas irregulares tienen una menor ecacia pero son ms baratas y se utilizan en cromatografas de pretratamiento. Puesto que por encima de valores de pH = 8 la slice es soluble en agua, no se puede trabajar por encima de ese pH. Ya hay algunos tipos de slice aptos para ser utilizados en el intervalo de pH 9-10 y para cromatograar compuestos bsicos en el intervalo de pH 8-12 utilizando soportes polimricos del tipo del poliestireno. En funcin de la fase estacionaria, la cromatografa de lquidos se puede clasicar, entre otras, en cromatografa de adsorcin, de intercambio de iones, de exclusin por tamao de partcula y cromatografa de anidad. En la Figura 1.3 en la pgina siguiente se recoge la utilizacin relativa de las fases estacionarias4 . La slice pura y la almina tambin se pueden usar como fase estacionaria en la cromatografa de adsorcin siendo la primera la ms utilizada. Debido a los grupos silanol, la slice tiene una
4 LCGC,

1998

12

1.2. FUNDAMENTOS DE LA SEPARACIN

Figura 1.3: Naturaleza de las fases estacionarias usadas en HPLC y su utilizacin relativa. alta actividad supercial y estos grupos pueden interaccionar con los grupos polares (alcoholes, aminas, cetonas y cidos carboxlicos) que tienen las molculas de soluto. Ms normal es la cromatografa de reparto liquido-liquido. Para la cromatografa de reparto se une al soporte de la slice una fase estacionaria liquida como se puede ver en las siguientes reacciones: El enlace siloxano (Si-O-Si-R) se puede hidrolizar por debajo de pH = 2 y en consecuencia la utilizacin de fases enlazadas lquidas que tienen un soporte slido est limitada al intervalo de pH 2-8.

Cuadro 1.6: Algunas fases estacionarias utilizadas en la cromatografa de separacin liquidoliquido. Fases enlazadas polares (CH2 )3 NH2 amino (CH2 )3 CN ciano (CH2 )2 OCH2 CH(OH)CH2 OH diol Fases enlazadas no polares (CH2 )17 CH3 octadecilo (CH2 )7 CH3 octilo (CH2 )3 C6 H5 fenilo

Las columnas de fase reversa (apolares) son muy utilizadas, puesto que los tipos de muestra que pueden ser analizados en estos casos son muchos. Adems, las columnas de fase reversa que hoy en da se producen son de buena calidad y muy estables para las condiciones de trabajo. Basndose en la hidrofobia, predecir el orden de elucin de los analitos es fcil. Las fases mviles que se utilizan con este tipo de fases estacionarias son mezclas de disolventes miscibles en agua. Adems, el agua como componente principal de la fase mvil es un disolvente barato y sin peligro.

13

1.2. FUNDAMENTOS DE LA SEPARACIN

Para una fase reversa hay distintos tipos de columna (C22 , C18 , C8 , C6 , C4 , C1/2 ) y se diferencian en el grupo funcional que se une al soporte silcico. La ms utilizada es la fase octadecilo (C18 u ODS) y tiene muchas aplicaciones en el anlisis de compuestos apolares desconocidos. En cuanto a la permeacin de geles o cromatografa en funcin del tamao hay que decir que es una tcnica muy usada en el caso de molculas de alto peso molecular. Tiene aplicaciones en el campo de la bioqumica para separar protenas y carbohidratos y tambin tiene aplicaciones en el campo de los polmeros. En esta cromatografa la fase estacionaria es una matriz porosa. Las molculas de dimetro mas pequeo que los poros de la matriz entran en los poros y pueden ser retenidas durante un tiempo en la columna. Las molculas de mayor tamao que los poros no se retienen y se eluyen en la columna. Las fases estacionarias ms usadas son geles de dextrano y poliacrilamida. La cromatografa de anidad se utiliza para la separacin de un solo componente en mezclas complejas. Es muy utilizada en bioqumica y est basada en las interacciones especicas que se dan entre encimas y substratos, anticuerpos y antgenos y receptores y hormonas.

Caractersticas de la fase estacionaria

El empaquetamiento de la columna tiene su efecto directo en la separacin entre los picos. De todas formas, no es muy conveniente mezclar empaquetamientos diferentes en la misma columna aunque se puedan unir unos con otros. En consecuencia, el cambio de la columna trae un cambio simultaneo de la selectividad a diferencia del cambio de la fase mvil. Ese acontecimiento es el que limita la habilidad de la columna para ajustar la separacin de muchos componentes. En consecuencia, el cambiar la columna acarrea un readecuamiento de la fase mvil para poder llevar a cabo la separacin. La mayora de las columnas de la HPLC tienen una fase estacionaria enlazada, es decir, supercies de partculas de slica con capas orgnicas de revestimiento unidas por enlaces covalentes. Independientemente del tipo de empaquetamiento, las siguientes caractersticas fsicas de la fase estacionaria resultan muy inuyentes en la separacin cromatogrca: Caractersticas qumicas o grupo funcional de la fase enlazada (por ejemplo, C18 o C8 ). Densidad supercial de la fase enlazada (2 o 4 mol/m2 ) Tipo de enlace de la fase enlazada y de la slica (de nica funcin o varias funciones). Caractersticas de las supercies de slica.

14

1.2. FUNDAMENTOS DE LA SEPARACIN

Cuadro 1.7: Caractersticas deseables de las partculas usadas en columnas analticas de HPLC. Caracterstica Partculas de 5 m totalmente porosas Partculas de 3 m totalmente porosas Partculas peliculares de 1.5 m Distribucin de tamao de partcula 50 % (de la media) Poros de 7-12 nm, 150-400 m2 /g (poros estrechos) Poros de 15-100 nm, 10-150 m2 /g (poros anchos) Utilidad La mayora de separaciones Separaciones rpidas Separaciones muy rpidas (especialmente macromolculas) Columnas estables, reproducibles y ms ecientes con menores cadas de presin Separacin de molculas pequeas Separacin de macromolculas

La mayora de las columnas de fase reversa tienen grupos funcionales organosilanol unidos mediante enlace covalente a soportes de slica. Esos enlaces se pueden llevar a cabo de distintas formas con muestra la Figura 1.4 en la pgina siguiente. La polimerizacin puede ser a travs de grupos monofuncionales silanol o grupos polifuncionales. En funcin de ello se obtendrn estabilidades qumicas diferentes. Igualmente, la fase estacionaria presentar una reactividad mayor o menor en funcin del numero de grupos silanol libres que quedan sin saturarse en la reaccin de silanizacin. Para que este tipo de cosas no ocurran, los fabricantes de las columnas suelen desactivar los grupos silanol que quedan libres con trimetilsilano (C1 o TMS) y los grupos funcionales utilizados tienen dos sustituyentes muy voluminosos para proteger los TMS-s o los grupos OH.

Inuencia de la ecacia de la columna

Una vez de que se han ajustado las variables analizadas en los apartados anteriores cabe esperar que se obtenga una separacin adecuada. De todas formas, como ha quedado demostrado en la ecuacin 9.1 si se aumenta N, manteniendo y k constantes aumenta la resolucin de los compuestos. En consecuencia, una vez ajustados y k se puede pensar en ajustar el valor de N bien para aumenta la resolucin o si sta fuera muy grande (Rs > >2) para acortar los tiempo de elucin de la separacin. Igualmente, se producir un aumento del numero de platos tericos en las siguientes condiciones:

Con un empaquetamiento adecuado de la columna Con columnas ms largas

15

1.2. FUNDAMENTOS DE LA SEPARACIN

Figura 1.4: Distintas fases enlazadas con estructura C18 .

16

1.2. FUNDAMENTOS DE LA SEPARACIN

Con ujos bajos (no demasiado bajos) Con empaquetamientos de partculas mas pequeas Con viscosidades ms pequeas de la fase mvil y temperaturas ms altas Con molculas de analito de la muestra ms pequeas Minimizando cualquier efecto exterior sobre la columna Adems de las expresiones conocidas para estimar el valor de N en la HPLC, tambin es muy utilizada la siguiente expresin: tR h A
2

N = 2

(1.6)

donde h y A son, respectivamente, la altura y el rea del pico. Para expresar la calidad de la columna a travs de N es mejor utilizar un sistema de prueba en condiciones ideales. Estas seran las siguientes: 1. Usar como muestra de prueba un compuesto neutro y pequeo (por ejemplo tolueno, naftaleno). 2. Utilizar un ujo de 1 ml/min con columnas de dimetro interno entre 0.4 y 0.5 cm. 3. Utilizar viscosidades () de la fase mvil menores de 1 cP (por ejemplo 0-100 % AcN agua para T >20 o C). 4. Usar temperaturas <40 o C. 5. Emplear instrumentos puestos a punto adecuadamente. La ecacia de columnas empaquetadas aumenta al disminuir el tamao de partcula de la fase estacionaria. El tamao de partcula normal para la HPLC es de 3-20 m. Al disminuir el tamao de partcula los picos son ms estrechos y la resolucin aumenta. Al disminuir el tamao de partcula, disminuye la altura de los platos aunque se aumente el ujo (ver Figura 1.5 en la pgina siguiente). En condiciones ptimas, alrededor del mnimo de la Figura 1.5 en la pgina siguiente, el numero de platos tericos para una columna de longitud L se puede expresar de la siguiente forma:

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1.2. FUNDAMENTOS DE LA SEPARACIN

N=

3500L dp

(1.7)

donde d p es el dimetro de la partcula. Como se puede entender a travs de la expresin cuanto ms pequeo es el tamao de partcula el numero de platos tericos ser mayor y por lo tanto tambin la resolucin.

Figura 1.5: Platos tericos en funcin del tamao de poro de la partcula y del ujo. Las razones por las cuales al disminuir el tamao de partcula se produce un aumento de la resolucin son dos. Por un lado, al disminuir el tamao de partcula el ujo de la fase mvil es ms uniforme y esto origina una disminucin de A en la ecuacin de Van Deemter. Por otro lado, al disminuir el tamao de partcula la trayectoria que han de recorrer los solutos a lo largo de la fase mvil es menor y esto provoca una disminucin del trmino C de la ecuacin de Van Deemter relacionado con la difusin molecular. Una de las desventajas de disminuir el tamao de partcula es que disminuye la resistencia que ofrecen al ujo de la fase mvil. En la HPLC se necesitan presiones muy altas (7-40 Mpa o 70-400 atm) para conseguir ujos de 0.5-5 ml min1 . El tamao de los poros de las partculas condiciona el rea de la supercie externa. De esta forma, las partculas de poros grandes tendrn una supercie externa menor y viceversa. Para la mayora de las usos, las partculas de poro pequeo (<10 nm) son adecuadas, puesto que aumenta la supercie externa y se mejora la capacidad de la columna. De todas formas, al analizar molculas de alto peso molecular (por ejemplo, las protenas), son necesarias columnas de poro grande (> >10 nm)

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1.2. FUNDAMENTOS DE LA SEPARACIN

Masa molecular < 2000

Soluble en disolventes orgnicos

Soluble en agua

Soluble en disolventes no polares o dbilmente polares (de hexano a CHCl3)

Soluble en disolventes polares o dbilmente polares (de CHCl3 a CH3OH)

No inico o par inico

Inico

Cromatografa de fase normal enlazada

Cromatografa de intercambio inico

Cromatografa de fase enlazada reversa

Soluble en CHCl3

Soluble en alcohol, acetonitrilo o acetato de etilo

Ciano, amino

Grupos C18, C8,C4, C1, ciano o fenil

Cromatografia de adsorcin

Cromatografa de fase normal enlazada

Slice Ciano, amino o diol

Figura 1.6: Gua de separacin de muestras/analitos comunes.

Masa molecular > 2000

Soluble en disolventes orgnicos

Soluble en agua

Tamao < 30 nm

Tamao 30-400 nm

No inico o par inico

Inico

Cromatografa de fase enlazada reversa

Cromatografa de separacin por tamao

Tamao < 30 nm

Tamao 30-400 nm

C18,C8,C4

Cromatografa de fase enlazada reversa o interaccin hidrofbica Grupos C18, C8,C4 polieter o fenil

Cromatografa de separacin por tamao

Cromatografa de intercambio inico

Figura 1.7: Gua de separacin de muestras/analitos especiales.

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1.3. INSTRUMENTACIN

1.2.4.

Efecto de la temperatura

Calentando las columnas cromatogrcas, en general, disminuye la viscosidad del disolvente y las presiones necesarias para conseguir ujos ms rpidos son menores. Al aumentar la temperatura, disminuyen los tiempos de retencin y se mejora la resolucin puesto que aumenta la velocidad de difusin del soluto. Por contra, el aumento de la temperatura puede disminuir la vida de la columna. Si no se controla, la temperatura puede cambiar con las condiciones del medio. Manteniendo el horno a una temperatura un grado superior a la del ambiente se puede mejorar la repetitividad de los tiempos de retencin as como la exactitud del anlisis cuantitativo. Es conocido que si se aumenta 1 o C la temperatura la retencin (k ) disminuye en 1 o 2 %. Los cambios en el factor de capacidad pueden tener tambin su efecto en la selectividad, por lo que la temperatura es un factor a tener en cuenta para ajustar la resolucin y la separacin. Tomar la temperatura como variable inuyente tiene una consecuencia directa: es muy fcil de controlar y no implica cambiar la columna y la fase mvil. De todas formas, hasta hace poco no se han tenido en cuenta los cambios de temperatura por las siguientes razones: La instrumentacin de un sistema tpico HPLC no tena la capacidad de termostatizar la columna. Muchas de las columnas utilizadas en HPLC no son estables a temperaturas altas sobre todo cuando el pH de la fase mvil es inferior a 3 o superior a 6. Las viscosidades y las presiones de vapor del disolvente dependen mucho de la temperatura y como consecuencia de ello los mrgenes de temperatura que se pueden utilizar son muy cortos. Hoy en da estos argumentos estn en duda y cada vez ms mtodos utilizan un control de la temperatura, sobre todo si se trata de compuestos inicos.

1.3.

Instrumentacin

La instrumentacin de la HPLC se puede decir que es exible. Como se puede ver en la Figura 1.8 en la pgina siguiente, cada elemento puede tener un origen distinto y despus de ensamblarlos todos se puede llegar a una situacin adecuada para la separacin. Como elementos fsicos obligatorios, entre otros, estn: bomba, portal de inyeccin, columna y detector. Adems de stos, impregnando la muestra y los analitos, est la fase mvil.

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1.3. INSTRUMENTACIN

Figura 1.8: Esquema de un cromatgrafo de lquidos de alta resolucin.

1.3.1. Fase mvil

Puesto que la fase mvil es una variable que inuye en el reparto de los compuestos, su eleccin es un factor importante. De todas formas, la eleccin est limitada a la columna. La distincin mas importante se da entre las cromatografas de fase normal e reversa. Mientras que en la cromatografa de fase normal los disolventes utilizados son los apolares hexano o iso-octano, en la de fase reversa es tpica la utilizacin de disolventes polares como el agua, el acetonitrilo y el etanol. Las caractersticas fsicas del disolvente van a limitar tambin la eleccin de la columna. Los factores a tener en cuenta sern la polaridad, capacidad de mezcla con otros disolventes, viscosidad, longitud de onda limite en el ultravioleta y toxicidad del disolvente. En la Tabla 1.5 en la pgina 9 se recogen las caractersticas de varios disolventes utilizados como fase mvil. En los sistemas de HPLC se puede trabajar de manera isocrtica o en gradiente. En la forma isocrtica, la composicin de la fase mvil permanece constante a lo largo de todo el anlisis. Cuando se trabaja en gradiente, la composicin de la fase mvil es variada poco a poco a lo largo del anlisis. La razn por la que se trabaja en gradiente es porque se mejora la resolucin y se reduce el tiempo de anlisis. A la hora de trabajar con la fase mvil, hay que tener en cuenta las siguientes normas:

Para la HPLC hay que utilizar reactivos de alto grado de pureza. Las impurezas pueden provocar un aumento de la lnea base.

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1.3. INSTRUMENTACIN

La fase mvil no ha de tener partculas. Para ello se suele colocar un ltro de acero inoxidable en el extremo del tubo que va de los recipientes de fase mvil a la bomba. Hay que eliminar el aire disuelto en la fase mvil, puesto que debido a bombeos irregulares pueden producirse distorsiones de las seales. Para ello la fase mvil se puede desgasicar con helio, someter a vaco o introducir en un bao de ultrasonidos. Los compuestos voltiles de la fase mvil originados al mezclar disolventes pueden evaporarse y en consecuencia cambiar la composicin de la fase mvil. Para evitar esto, a lo largo de la desgasicacin hay que mantener fra la disolucin y las botellas de fase mvil han de estar cerradas en todo momento. La muestra a analizar ha de poder disolverse en la fase mvil. Cuando se usan los detectores UV, hay que tener en cuenta que la fase mvil pueda absorber en el esta zona del espectro. Esta absorcin viene dada por la longitud de onda del limite UV y los analitos que absorben por debajo de este valor lmite caracterstico de cada fase mvil no podrn ser analizados ( < UVlimite ). La fase mvil no ha de reaccionar qumicamente con la fase estacionaria. Las disoluciones amortiguadoras pueden tener amoniaco y este ltimo puede sustituir a un grupo N-R de las amidas de la fases estacionarias de tipo aminopropil. Hay que controlar el nivel (volumen remanente) de la fase mvil y no hay que dejarlas secar nunca.

1.3.2.

Bombas

Como consecuencia del pequeo tamao de las partculas de la fase estacionaria, para conseguir un ujo adecuado de la fase mvil hay que trabajar a altas presiones y para obtener dichas presiones es necesario usar bombas. Las bombas para la HPLC han de tener las siguientes caractersticas: A lo igual que la fase mvil debern de ser inertes respecto a los disolventes utilizados. Han de poder obtenerse ujos sin pulsos del orden de 0.1-10 ml/min con una exactitud del valor del ujo del orden del 0.5 %. Han de poder crear presiones por encima de 6000 psi.

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1.3. INSTRUMENTACIN

La mayora de sistemas para HPLC utilizan un esquema basado en bombas recprocas del estilo al que se ve en la Figura 1.9. Con el n de disminuir el volumen muerto (35-400 l), estas bombas poseen dentro de la despensa un pistn de zaro. El pistn absorbe la fase mvil de recipientes que se encuentran a baja presin y la enva a la columna a alta presin a travs de un sistema de vlvulas tal y como se ve en la Figura 1.9. Con este mtodo, adems de obtener altas presiones y ujos constantes, es fcil obtener una elucin en gradiente puesto que el volumen interno de la bomba es pequeo. Sin embargo, se obtiene un ujo a pulsos y para evitar esto se utilizan sistemas que poseen dos pistones.

Figura 1.9: Esquema de bombas recprocas y de desplazamiento. Unas bombas menos utilizadas que las anteriores son las bombas de desplazamiento que consisten en un reservorio o despensa grande que poseen un mecanismo de tornillos. Se obtiene un ujo sin pulsos pero tienen una capacidad limitada (250 ml). Las bombas neumticas se valen de la presin de un gas aplicado en el recipiente de la fase mvil. Son bombas muy simples, obtenindose ujos sin pulso pero estn limitadas a presiones muy bajas.

1.3.3.

Sistemas de inyeccin

El mecanismo usado para introducir las muestras en la columna suele ser el paso que limita el carcter repetitivo de las medidas. Con el n de que la columna no se sature, los volmenes que a inyectar han de ser pequeos y al introducirlos en la columna el sistema no ha de perder presin. De todas formas, este sistema esta limitado a presiones mximas de 1500 psi. En sistema ms utilizado en HPLC son las vlvulas de inyeccin que poseen bucles de volumen conocido (ver la Figura 1.10 en la pgina siguiente). En la posicin de llenado (Figura 1.10 en la pgina siguiente(a)) la fase mvil pasa directamente a la columna y la muestra se introduce en el bucle de inyeccin con la ayuda de una microjeringa. Una vez de que el bucle est lleno la vlvula gira a la posicin de inyeccin (Figura 1.10(b)) y

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1.3. INSTRUMENTACIN

Figura 1.10: Vlvula de inyeccin: (a) Llenado; (b) inyeccin. la fase mvil impulsa la muestra hacia la columna. La desventaja que presenta este sistema se basa en el hecho de que la exactitud de esta inyeccin se puede alterar con el tamao del bucle. Los equipos que contienen sistemas de inyeccin automticos miden el volumen a travs de microjeringas y no a travs de bucles. De este modo, en distintas inyecciones pueden entrar masas de analito distintas sin tener que cambiar la concentracin del estndar.

1.3.4.

Detectores

Detector ultravioleta

El detector ultravioleta (UV) es muy corriente y se puede usar para el anlisis de muchos compuestos orgnicos. Los analitos que absorben en la zona UV cuando salen de la columna e intereren en la trayectoria de la luz, absorben la radiacin UV y el detector mide la reduccin de la seal (Figura 1.11 en la pgina siguiente). La capacidad que tienen los analitos de absorber tanto en el visible como en el ultravioleta depende de sus grupos cromforos. De esta forma, el detector UV se utiliza bastante si los compuestos poseen en su estructura grupos tiol, carbonilo, amina, etilen, acetilen, nitrilo, sulfona, yodo as como heterociclos cromforos. Hay distintos tipos de detectores UV. Algunos de ellos solo miden en una nica y determinada longitud de onda (en muchos casos 254 nm). Otros miden tambin a una longitud de onda determinada pero esta longitud de onda se puede elegir en un rango amplio (190-800 nm). Puesto que en estos detectores se puede llevar a cabo la eleccin de la longitud de onda, se puede mejorar la sensibilidad respecto a cada compuesto, ya que se puede elegir la longitud de onda ms adecuada.

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1.3. INSTRUMENTACIN

Figura 1.11: Clula de ujo de forma de U.

El detector de la (matriz) de diodos puede medir en todo el espectro de longitud de ondas al mismo tiempo y el usuario puede determinar absorciones concretas a longitudes de ondas diferentes. A la hora de elegir las longitudes de onda para llevar a cabo medidas con el detector UV, se pude encontrar en bibliografa la longitud de onda correspondiente a la mxima absorcin de cada cromforo. Otra posibilidad es obtener de forma preliminar el espectro de absorcin de los distintos analitos.

Detector de uorescencia

Muchos compuestos tienen la habilidad de absorber la radiacin de luz a una determinada longitud de onda para luego emitir uorescencia a una longitud de onda ms larga. Los compuestos uorescentes ms habituales son sistemas cclicos de alta conjugacin, entre otros, compuestos aromticos policclicos, quinoleinas, esteroides, alcaloides etc. Los detectores de uorescencia para HPLC son parecidos a los uormetros y espectrouormetros. Lmparas de deuterio de xenon originan radiaciones de excitacin, por medio de monocromadores se elige la longitud de onda de la radiacin incidente y el detector se coloca perpendicular a sta (Figura 1.12 en la pgina siguiente).

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1.3. INSTRUMENTACIN

Figura 1.12: Esquema del detector de uorescencia.

Detector de ndice de refraccin

En el detector de ndices de refraccin la fase mvil uye por una clula y la seal que mide el detector es funcin del ndice de refraccin de la sustancia que pasa por la clula. De esta forma, cuando la fase mvil pase sola la seal ser menor que cuando pase con el analito (Figura 1.13).

Figura 1.13: Esquema del detector de ndice de refraccin.

Detector de dispersin de luz

El detector de dispersin de luz es sensible a compuestos bastante ms voltiles que el disolvente. El eluato se introduce por la parte superior del detector. En el nebulizador, el eluato se mezcla con nitrgeno y se hace pasa por el capilar. En el extremo del capilar se originan gotas. Estas gotas se hacen pasar por un tubo caliente, vaporizndose el disolvente y quedando una serie de partculas slidas nas. Estas partculas slidas pequeas entran al lugar de deteccin y su

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1.3. INSTRUMENTACIN

deteccin se realiza por medio de una luz procedente de un diodo lser que va al fotodiodo de dispersin (Figura 1.14).

Figura 1.14: Esquema del detector de dispersin de luz. Las seal del detector de dispersin es proporcional a la masa del analito y no es funcin ni de la estructura del analito ni de su masa molecular. La seal tampoco es lineal respecto a la concentracin y normalmente hay que valerse de polinomios para construir las curvas de calibracin. Este detector puede usarse con una elucin en gradiente. Adems, no hay pico relacionado con la elucin del disolvente y de esta forma la fase mvil no interere con los compuestos que eluyen al principio del cromatograma. De aadir a la fase mvil una disolucin amortiguadora esta ltima ha de ser voltil. Las disoluciones amortiguadoras que no son voltiles pueden generar partculas slidas como consecuencia de la evaporacin. Estas partculas slidas dispersaran la luz y no se podra diferenciar la seal de los analitos. Utilizando cido actico, cido frmico, cido triuoroactico, acetato de amonio, fosfato de diamonio, amoniaco o trietilamina se pueden preparar disoluciones amortiguadoras de baja concentracin.

Detector electroqumico

El detector electroqumico es sensible analitos que se puedan tanto oxidar como reducir, entre otros, fenoles, aminas aromticas, perxidos, mercaptanos, cetonas, aldehidos, nitrilos conjugados, compuestos halogenados y nitroaromticos. Las tcnicas electroqumicas ms utilizadas son la amperometra, voltamperometra y la culombimetra.

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1.3. INSTRUMENTACIN

Los detectores electroqumicos corrientes utilizan tres electrodos: electrodo de trabajo, electrodo de referencia y electrodo auxiliar. Como electrodo de referencia se usa el Ag/AgCl y el de Calomelanos (Hg/HgCl). En cambio, como electrodo auxiliar se usan tanto electrodos de carbono vitricado como de platino. Para analitos oxidables se utilizan electrodos de trabajo tanto de cobre como de carbono (de pasta de carbono, carbono vitricado, grato, bra de carbono, etc.). Para especies reducibles es tpico usar el electrodo de gotas de mercurio. Tanto en un caso como en el otro la corriente medida es proporcional a la concentracin. En la amperometra se mide la intensidad de corriente que pasa entre el electrodo auxiliar y el electrodo de trabajo manteniendo el potencial jo con respecto al electrodo de Ag/AgCl. Puesto que el rea del electrodo es muy pequea (<0.5 cm2 ), la reaccin es una microelectrlisis. Cuando se usan electrodos de mayor rea, sobre la supercie del electrodo puede tener lugar una reaccin cuantitativa, de forma que en ese caso se hablara de una culombimetra. Por ltimo, en la voltamperometra al electrodo de trabajo se le aplica un potencial variable y se basa en la determinacin del potencial de la reaccin del electrodo. Entre estos tres detectores el ampermetrico es el ms utilizado. La polarografa se utiliza muy poco porque la construccin clulas de pequeo volumen para el electrodo de gotas de mercurio tiene muchas dicultades. Para usar estos detectores es preciso trabajar con disolventes polares que tengan disolucin acuosa y electrolitos y para evitar el oxgeno hay que desgasicar las disoluciones. El detector es muy sensible a los cambios de temperatura y ujo.
Detector de conductividad

El detector de conductividad es muy utilizado para la deteccin de compuestos inicos as como de aquellos que pueden ser separados por cromatografa de intercambio inico; entre otros para la deteccin de cidos, bases, aniones y cationes inorgnicos. La conductividad se mide por medio de la diferencia de potencial entre los dos electrodos que originan el movimiento de los cationes y aniones de la disolucin. La resistencia de la disolucin entre los dos electrodos es funcin de la naturaleza de la disolucin y de las concentraciones de los analitos. Se trabaja con corriente alterna y la clula de conductividad se coloca en un extremo del puente Wheaston.
Espectrmetro de masas

La espectrometra de masas es una tcnica muy utilizada como deteccin cromatogrca. Es un detector universal que ofrece tanto informacin cualitativa como cuantitativa. El problema para acoplar los espectrmetros de masas a los cromatgrafos lquidos es la alta cantidad de disolvente que va junto con los analitos. Los espectrmetros de masas hacen su

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1.3. INSTRUMENTACIN

trabajo en condiciones de alto vaco y no aceptan ujos de disolvente de 1ml/min. De esta forma, en el caso de los espectrmetros de masas se utilizan columnas de 2.1 mm de dimetro y hay que utilizar ujos de 0.2 ml/min. Adems no se pueden aadir a la fase mvil sustancias no voltiles (como disoluciones amortiguadora de fosfatos). Durante tiempo, el problema para acoplar el espectrmetro de masas a la cromatografa de lquidos ha sido el de generar interfases a travs de iones que se encuentran en estado gaseoso. Hoy en da, las interfases ms utilizadas son la ionizacin qumica a la presin atmosfrica y la electronebulizacin por medio de gases. En la ionizacin qumica a la presin atmosfrica, por medio de un calefactor y de un ujo coaxial de nitrgeno el disolvente se evapora y el eluato liquido se convierte en un aerosol. Esta tcnica es la ms utilizada como interfase entre la cromatografa de lquidos y la espectrometra de masas, puesto que se puede aplicar a distintos tipos de analitos y puesto que admite los ujos que se utilizan en cromatografa (ujos de hasta 2 ml/min). Sin embargo, los analitos inestables pueden descomponerse a la temperatura de 125 o C del aerosol.

Figura 1.15: Esquema de la interfase de ionizacin qumica a presin atmosfrica. Una vez que se ha obtenido el aerosol, viene la etapa de la ionizacin. En la ionizacin qumica a la presin atmosfrica, la corona de descarga de alto voltaje aplicada a una aguja manda electrones al aerosol antes obtenido. Estos electrones van a impulsar la generacin de reacciones en las que se obtengan aniones y cationes. En estas reacciones la molcula M va a generar el catin MH+ . En la ionizacin qumica a la presin atmosfrica el fraccionamiento del catin MH+ es pequeo. De esta forma los espectros obtenidos son fcilmente interpretables pero se obtiene poca informacin acerca de la estructura de las molculas. En la ionizacin por electronebulizacin, en la salida del cromatgrafo se coloca un campo elctrico intenso y se aplica tambin un ujo coaxial de nitrgeno. En consecuencia, se obtiene un aerosol de partculas cargadas. El aerosol se carga positivamente si el capilar de salida de la columna con respecto a la entrada al espectrmetro de masas esta cargado positivamente y viceversa. Como ocurre en la ionizacin qumica a presin atmosfrica aqu tambin el fraccionamiento es pequeo y se obtienen espectros de masas sencillos.

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1.3. INSTRUMENTACIN

Figura 1.16: (a) Interfase de ionizacin por electronebulizacin. (b) Detalles para la creacin de iones en fase gas. El espectrmetro de masas puede medir todos los iones originados por cada analito o iones particulares que pueden ser elegidos. En el caso de que solo se midan estos iones particulares elegidos (el llamado mtodo SIM), el cromatograma se simplica, porque solo darn seal aquellos compuestos que tengan esos iones particulares. El tndem selectividad y sensibilidad tambin se puede obtener por medio de la espectrometra de masas. Este tndem se conoce como espectometra MS/MS. En este tipo de sistemas existen cuatro cuadropolos. El primer cuadropolo ltra los iones originados de la ionizacin en funcin de la relacin m/z. De esta forma, al segundo cuadropolo llegarn iones con una relacin m/z determinada. Estos iones de m/z concreta (iones madre) al llegar al segundo cuadropolo van a chocar con gases como el nitrgeno y el argn y se dividirn en iones-producto. Al tercer cuadropolo llegarn estos iones-productos de m/z concreto que van a atravesarlo llegando al detector. De esta forma, los detectores MS/MS son muy especcos porque es muy difcil que dos molculas distintas se rompan en los mismos iones madre e iones producto.

Figura 1.17: Fundamento de la espectrometra MS/MS.

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