GUA DE TRABAJOS PRCTICOS

CURSO DE INMUNOLOGA BSICA

FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS
U.N.C.P.B.A.
2005













Objetivo y contenidos de losTrabajos Prcticos:
TP 1: Toma y conservacin de muestra. Frotis sanguneo
Objetivo: Que el alumno conozca que muestras se utilizan para la deteccin de anticuerpos y/o antgenos
en el diagnstico serolgico, su obtencin, remisin y conservacin.
Identificar los componentes sanguneos, humorales y celulares.
Contenidos: Venas de eleccin para la extraccin de sangre en las diferentes especies. Material necesario,
modo de obtencin. Frotis sanguneo. Toma de muestra con y sin anticoagulantes. Remisin al
laboratorio (tiempo y temperatura de remisin).
Identificacin de clulas sanguneas mediante coloracin de extendido de sangre. Frmula leucocitaria
relativa normal en las diferentes especies.
Separacin de plasma y suero. Caractersticas de una buena muestra. Conservacin de la muestra (tiempo
y temperaturas adecuadas). Observacin de protenas plasmticas en tiras de acetato de celulosa.
Toma de otros tipos de muestra: secreciones (leche, calostro, lgrima, mucus, secrecin vaginal y
prepucial, semen y plasma seminal, lquido articular, etc) y tejidos (biopsias)

TP2 :Tcnicas Inmunolgicas de aplicacin diagnstica I
Objetivo: Introducir al conocimiento de los fundamentos de las principales tcnicas serolgicas utilizadas
en diagnstico veterinario.
Contenidos: Sueros policlonales y Ac monoclonales: diferencias, obtencin, aplicaciones. Anti-
inmunoglobulinas como herramientas en tcnicas inmunolgicas. Tcnicas de interaccin primaria.
Fundamentos, conjugado, tipos de marcadores, ELISA, IFD, IFI, RIA, Western Blot, Citometra de flujo.
Aplicacin en la identificacin de clulas

TP3: Tcnicas Inmunolgicas de aplicacin diagnstica II
Objetivo: Introducir al conocimiento de los fundamentos de las principales tcnicas serolgicas utilizadas
en diagnstico veterinario.
Contenidos: Tcnicas de interaccin secundaria. Fundamentos, clasificacin (aglutinacin en placa,
aglutinacin en tubo, precipitacin etc), deteccin de diferentes isotipos de Ig. Tcnicas in vivo:
intradermorreaccin. Fundamento. Tcnicas para determinar Ig totales.

TP4: Aglutinacin y precipitacin
Objetivo: realizar pruebas de aglutinacin en placa (rpidas) cualitativas y semicuantitativas. Calcular el
ttulo de un suero. Observar resultados de pruebas de aglutinacin en tubo (lentas) y de inmunodifusin
radial y bidimensional. Identificar los factores que influyen sobre las pruebas de interaccin secundaria.
Contenidos: Tcnicas de interaccin secundaria. Fundamentos, clasificacin (aglutinacin en placa,
aglutinacin en tubo, inmunodifusin radial, inmunodifusin bidimensional), deteccin de diferentes
isotipos de Ig. Fenmeno de prozona. Ttulo de un suero.

TP5: Fagocitosis
Objetivos: Conocer las clulas que intervienen en la fagocitosis. Entender el mecanismo y los pasos de la
fagocitosis. Observar las clulas fagocticas en accin y relacionar el protocolo prctico con los
conocimientos tericos.
Contenidos:
Fagocitosis: definicin, clulas fagocticas: caractersticas. Pasos de la fagocitosis.


TRABAJO PRCTICO N1
Toma y conservacin de muestra Frotis sanguneo

Extraccin Sangunea: obtencin de plasma y suero, remisin y conservacin de la muestra
La toma de muestra es una etapa esencial para asegurar un buen diagnstico. En la extraccin sangunea
es imprescindible que se utilice material limpio y seco (agujas de calibre adecuado, jeringas, tubos
rotulados, tapones) para evitar la contaminacin y hemlisis de la muestra. Es importante conocer para
qu se utilizar la muestra y qu volumen de muestra es necesario tomar. Si se desea obtener sangre para
recuento de clulas sanguneas, para analizar la presencia de microorganismos o para obtener plasma, la
extraccin debe realizarse en tubos con anticoagulante (EDTA o heparina). Para obtener suero, la sangre
se deja coagular en determinadas condiciones de tiempo y temperatura.

Sangre entera
Suero
Plasma
nticoagulante
nticoagulante Sangre sin a
Leucocitos
Glbulos rojos
Cogulo
Sangre con a

Las tcnicas de extraccin varan de una especie a otra, segn el vaso sanguneo de eleccin y el espesor,
dureza y capa de la piel.
En los rumiantes y equinos, la sangre se extrae de la vena yugular o bien de la vena caudal (bovinos). La
vena yugular se ingurgita por compresin manual del canal yugular y se introduce la aguja por encima de
este punto. La extraccin puede realizarse directamente de la aguja al tubo o con jeringa llevando el
mbolo hacia atrs lentamente. Tambin puede utilizarse el sistema de tubos al vaco (tipo vacutainer),
que presentan mayor facilidad de uso y garanta en cuanto a la asepsia y preservacin de las muestras;
este sistema manejado en forma adecuada presenta un menor riesgo de hemlisis de las muestras, con
respecto al sistema de extraccin con jeringa. Si la extraccin se practica sin jeringa, para que no se
genere turbulencia y se produzca la hemlisis, se saca la aguja y se deja que la sangre fluya lentamente
por las paredes del tubo. Cuando la extraccin se realiza a partir de la vena caudal, se levanta la cola y se
introduce la aguja a 15 cm de la base de la cola en la lnea media hasta que penetre en el vaso.
En cerdos la muestra se obtiene a partir de la puncin de la vena de la oreja. En perros y gatos la muestra
se extrae de la vena ceflica antebraquial o de la vena safena. En las aves se realiza por puncin de la
vena radial (alar).



Especie Vena de eleccin
Equino Vena yugular
Bovino, ovino, caprino Vena yugular o vena caudal (bovino)
Cerdo Vena de la oreja
Perro y gato Vena ceflica antebraquial o vena safena
Ave Vena radial

Cuando la muestra se toma con la adicin de anticoagulante, luego de verter la sangre entera en el tubo, se
realiza la homogeneizacin mediante una suave inversin. Cuando la sangre entera no se procesa
inmediatamente, debe conservarse refrigerada (4C-8C) de lo contrario se mantiene a temperatura
ambiente (20-22C). Para obtener el plasma, la sangre se centrifuga a 1500-2000 r.p.m. (revoluciones por
minuto) durante 10-15 min.y se separa la capa lquida (superior), la que se extrae mediante aspiracin con
una pipeta y se almacena en viales o tubos.
Para la obtencin del suero, se deja coagular la sangre en el tubo a temperatura ambiente durante un
tiempo mnimo de 1-2 h. y mximo de 12 h. (cuanto ms tiempo se deje para que la retraccin tenga
lugar, mayor cantidad de suero se obtendr aunque nunca ms del 40% del volumen total). La
coagulacin y retraccin se produce ms rpido si se incuba la sangre en estufa a 37C durante 1-2 hs y
luego se lleva a refrigeracin durante 30 min. mas. El suero obtenido a partir de la retraccin del cogulo
es separado con la ayuda de una pipeta. Si existieran glbulos rojos en suspensin deber centrifugarse a
1500-3000 r.p.m. y obtener el sobrenadante.
La coagulacin es un proceso que ocurre a temperatura corporal. Para obtener un buen suero la
muestra se debe incubar entre 20-37C (a menor temperatura mayor tiempo de incubacin).
Las muestras de suero y plasma (sin clulas) pueden conservarse refrigeradas (4C- 8C) si van a
utilizarse en corto plazo, de lo contrario si se pretende una conservacin por ms tiempo se congela a
(-20C) y se distribuye en alicuotas. El fraccionamiento evita las congelaciones y descongelaciones
sucesivas las cuales conllevan a la desnaturalizacin y agregacin de las protenas.
Las caractersticas deseables de un suero o plasma es que sea translcido e inodoro. Esto implica que no
deben utilizarse en las pruebas serolgicas sueros hemolisados o contaminados.

Otras muestras de utilidad para el inmunodiagnstico o diagnstico serolgico
Para obtener muestras de secreciones vaginales o de tracto prepucial se realiza la perfusin de solucin
salina, luego se colecta el lquido del lavado y se centrifuga para eliminar todo tipo de partculas.
Cuando se desea obtener plasma seminal debe usarse un electroeyaculador o vagina artificial. Una vez
obtenida la muestra debe centrifugarse para obtener el sobrenadante que se retira con pipeta.
Las muestras de descargas nasales, lgrimas, secreciones vaginales o prepuciales se realizan mediante
hisopado. Luego el hisopo se coloca en solucin salina con el agregado de un agente bacteriosttico
durante 24 h. a 4C para permitir la difusin de las molculas. La eliminacin de partculas extraas se
logra mediante centrifugacin. La muestra se conserva a (-20C).
Las muestras de leche o calostro se toman directamente en el tubo y se agrega algn agente
bacteriosttico. La conservacin y remisin de la muestra se realiza a 4C .
Muestras de tejidos:
Las muestras tomadas se procesan hasta obtener el preparado histolgico en el portaobjetos. ste puede
utilizarse para la deteccin de Ag o Ac en pruebas de inmunofluorescencia o inmunohistoqumica. Estas
pruebas tambin pueden desarrollarse sobre frotis o improntas.

Frotis sanguneo y frmula leucocitaria relativa.

Objetivo:
Visualizar e identificar clulas sanguneas
Principio:
Se obtiene una delgada capa de sangre sobre un portaobjetos y se tie con colorantes para identificar,
evaluar la proporcin de cada leucocito (frmula leucocitaria relativa) y la morfologa de las clulas
blancas de la sangre, eritrocitos y plaquetas.
Los extendidos de sangre perifrica deben ser hechos inmediatamente cuando se utiliza sangre fresca, o
dentro de las 2-3 horas de la extraccin si se adiciona un anticoagulante (preferiblemente heparina, ya que
no produce deformacin de las clulas)
Materiales
Muestra: Sangre fresca o con anticoagulante
Microscopio con objetivos de 40x y 100x (de inmersin) y aceite de inmersin
Portaobjetos limpios y desengrasados
Soporte de preparaciones
Colorante de Wright o Giemsa
Metanol
Agua destilada

Procedimiento:
1. Limpiar la zona de extraccin de sangre con alcohol. Para la coleccin de sangre debe tenerse en
cuenta el sitio de puncin y el calibre de la aguja a utilizar para cada especie (ver seccin de
recoleccin de muestras).

Consideraciones generales para la toma de muestras de sangre para frotis
Evitar colocar el bisel de la aguja hacia abajo pues imposibilita el paso de sangre.
No usar agujas hmedas ya que se hemolisan los glbulos rojos.
Evitar usar el anticoagulante en solucin pues se diluye la sangre.
El no retirar la aguja de la jeringa antes de llenar el tubo donde se depositar la sangre, provoca la
ruptura de los glbulos rojos (hemlisis).
El no mezclar en forma homognea la sangre con el anticoagulante, ocasiona la formacin de
cogulos.

2. Depositar la gota de sangre, en un lado y en el centro de un portaobjetos, bien limpio y
desengrasado, que se ha rotulado con los datos del animal. Seguidamente, con el empleo de un
segundo porta de borde esmerilado se hace un frotis o extensin de sangre (Fig.1).
3. El segundo portaobjetos se ubica en ngulo de aproximadamente 30 con respecto al porta
horizontal y se permite que ste tome contacto con la gota de sangre. La sangre se distribuir por
capilaridad a lo largo del borde del portaobjetos extensor.
El porta con el que se hace la extensin debe deslizarse bien colocado sin hacer presin y lo ms
perfectamente aplicado en su borde contra el porta horizontal, sobre el que se hace la extensin. Slo
debe pasarse una vez, de forma continua e ininterrumpida.


Fig. 1. Extendido de sangre

Es conveniente realizar dos o tres extensiones, con el fin de seleccionar para la tincin la mejor lograda.
4. Secar el extendido sanguneo al aire lo ms rpidamente posible. La desecacin se facilita con
movimiento en forma de abanico, nunca soplando o por calor. La rpida desecacin evita la
deformacin de las clulas sanguneas.


Rtulo
Zona de
recuento
celular
Origen del frotis
(Extendido grueso)
Final del frotis
(extensin fina)
Fig. 2. frotis sanguneo terminado

5. Depositar el portaobjetos con la extensin de sangre encima del soporte de tinciones y ste sobre
una bandeja o sobre la pileta del laboratorio. Dejar caer sobre la extensin unas gotas de metanol y
esperar que el alcohol se evapore. Este procedimiento fija las clulas sobre el porta y las
permeabiliza, permitiendo la entrada del colorante.
6. Depositar, con un gotero, unas gotas de reactivo de Wright o Giemsa, cubriendo toda la extensin.
Evitar la desecacin y dejar actuar el colorante unos 5-20 minutos, dependiendo del colorante
utilizado. El reactivo de Wright contiene una mezcla de colorantes rojos y azules que son
acidfilos (reaccionan con sustancias cidas) y basofilicos (reaccionan con sustancias bsicas),
respectivamente.
Evitar el contacto del colorante con la piel, ya que la mayora de los colorantes son txicos.
7. Lavar la preparacin con cuidado, sosteniendo por un extremo el portaobjetos a 45 bajo un chorro
suave de agua destilada y dejando que sta pase sobre el extendido hasta que arrastre todo el
colorante.
8. Tomando el porta por los cantos secar aireando el porta, o bien al calor muy lento de la llama de
un mechero.
9. Una vez seco, se observa con un microscopio de luz

Observacin microscpica y recuento
1. Primeramente se observa con bajo aumento (40x), explorando la preparacin para localizar la
zona en la que el frotis es ms perfecto. Un frotis correcto ser mas grueso cerca de la gota de
sangre y la capa de sangre se ir afinando hacia el final del portaobjetos. Los lugares ms aptos
son aquellos en los que la extensin de los glbulos se ha conseguido en una sola capa, estn bien
teidos y no se han producido precipitados de los colorantes. Cuando se observe una zona apta,
pasar a aumento de 100x, utilizando una pequea gota de aceite de inmersin directamente sobre
el frotis en la zona a observar (Atencin, no colocar aceite sobre todo el preparado!).
2. En el campo del microscopio, se vern principalmente los glbulos rojos, hemates o eritrocitos,
teidos en color rojo. Los eritrocitos de mamferos son esfricos, excepto los de camlidos que
presentan forma oval, y ms delgados por el centro que por los bordes, no presentando ncleo. Los
eritrocitos de las aves, los reptiles, los anfibios y los peces son ovales y con ncleo central. Los
glbulos blancos o leucocitos de identifican por la presencia de ncleo, a veces irregular, y
grnulos segn el tipo.
3. Hay varias clases de glbulos blancos y su proporcin vara de acuerdo a la especie (Tabla 1



Caninos Felinos Equinos Bovinos Porcinos Ovinos
Neutrfilos
60-70% 35-75% 30-75% 15-45% 20-70% 10-50%
Eosinfilos 2-10% 2-12% 1-10% 2-20% 0-15% 0-10%
Basfilos 0.1-0.5% 0.1-0.5% 0-3% 0-2% 0-3% 0-3%
Linfocitos 12-30% 20-55% 25-60% 45-75% 35-75% 40-75%
Monocitos 3-10% 1-4% 1-8% 2-7% 0-10% 0-6
Leucocitos
totales
(miles/l)
6-17 5.5-19.5 6-12 4-12 11-22 4-12
Tabla 1: Frmula leucocitaria relativa y conteo total de leucocitos en diferentes especies.
Extrado de: The Merck Veterinary Manual 7ma Ed. 1991. Merck&Co.,Inc; Rahway, N.J., U.S.A.

Los linfocitos son algo mayores que los glbulos rojos, con un ncleo muy voluminoso que ocupa
casi toda la clula y que aparece fuertemente teido en color violeta oscuro.
Los monocitos son los leucocitos mayores. Tienen un ncleo muy grande y redondeado que aparece
teido en color violeta.
Los neutrfilos presentan el ncleo como fragmentado o en forma de rosario. Sus grnulos no se
tien con los colorantes basoflicos o acidofilicos, por lo tanto su citoplasma permanece rosado. Las
aves no tienen neutrfilos. En su lugar se encuentran heterfilos, que cumplen la misma funcin que
los neutrfilos pero que son difciles de diferenciar de los eosinfilos aviares ya que sus grnulos se
tien tambin de color rojo.
Los eosinfilos, con granulaciones abundantes de color rojizo y el ncleo teido de color azul marino.
Estos glbulos aumentan su nmero en caso de parasitosis o procesos alrgicos. En las aves, el
citoplasma de los eosinfilos se tie de azul claro con grnulos rojos y el ncleo mas oscuro que el de
los heterfilos.
Los basfilos presentan un ncleo teido de azul y las granulaciones del citoplasma de color muy
oscuro. Los basfilos de las aves tienen ncleo no-lobulado y difcil de observar detrs de grnulos
basoflicos, que normalmente son ms plidos que los de los mamferos.

NEUTRFILOS
Fig. 3-.Frotis sanguneo de mamfero

En las especies mamferas, las plaquetas aparecen como pequeos fragmentos sin ncleo teidos de
color violeta. Las plaquetas intervienen en el proceso de coagulacin sangunea. En las aves se encuentran
los trombocitos, que cumplen la misma funcin, y que son clulas verdaderas con ncleo.

Ejercicios:
Realice un esquema de cada una de las clulas que observa en su preparado clasificndolas segn el tipo.
Puede identificar de cul especie proviene la muestra? Por qu?










4. Una vez familiarizados con la morfologa de las clulas sanguneas, recorra la zona de conteo (ver
Fig. 2) en forma de guarda griega y cuente por lo menos 100 leucocitos discriminando el nmero
de cada tipo identificado. Complete la siguiente tabla:

Leucocito Nmero Porcentaje
Linfocitos
Monocitos
Eosinfilos
Basfilos
Neutrfilos
Total de clulas contadas


Proteinograma electrofortico
Objetivo:
Reconocer las distintas fracciones proteicas del suero sanguneo obtenidas mediante un proteinograma
electrofortico.
El proteinograma electrofortico (o electroforesis de protenas del suero) es una tcnica simple de
laboratorio que permite separar las protenas sricas en distintas fracciones por medio de la aplicacin de
un campo elctrico.
Esta prueba es muy usada para evaluar y monitorear distintos cuadros clnicos as como tambin de gran
ayuda en el diagnstico de distintas enfermedades asociadas a desrdenes proteicos.
Fundamento:
El plasma contiene muchas protenas (protenas transportadoras, enzimas, anticuerpos, etc.). Tanto la
carga elctrica que poseen las protenas, dada por los aminocidos que la componen, como su peso
molecular afectan su movimiento sobre un soporte cuando se aplica un campo elctrico. Es decir,
pequeas protenas altamente cargadas migran ms rpido que grandes protenas, lo que permite que se
separen durante la corrida electrofortica.
La distinta velocidad de migracin permite la formacin de varias bandas o fracciones en el gel de
electroforesis, formadas por grupos de protenas de tamao y carga similar.
Procedimiento:
Se coloca una pequea muestra de suero en un soporte, que puede ser de distintos tipos:
- Soportes tipo 1: acetato de celulosa gelificado o agarosa , donde se observan 5-6 bandas de protenas
plasmticas (la migracin es segn relacin carga-masa de cada protena)
- Soportes tipo 2: almidn o poliacrilamida, donde se observan 25 o ms bandas (la migracin es segn la
relacin carga-masa y tamao).
En los laboratorios se usa habitualmente los soportes tipo 1 ya que son ms fciles de interpretar.
Se coloca el soporte en la cuba de electroforesis con un buffer de corrida de pH y fuerza inica
determinados tal que las protenas posean carga elctrica negativa y migren hacia el nodo (polo +)
cuando se aplica voltaje.
Luego de terminada la corrida se retira el soporte y se deja evaporar el solvente. Se fijan las bandas y se
colorean con algn colorante para protenas (segn el soporte usado):
- Rojo Ponceau (acetato).
- Negro Amido (agarosa), etc.
Las bandas pueden mirarse a simple vista o leerse con un densitmetro (aparato que permite cuantificar la
intensidad y anchura de cada banda para conocer el porcentaje de cada fraccin proteica). Si por otro
mtodo se determina la concentracin de las protenas totales del suero, es posible calcular el contenido
de cada fraccin.








Albmina



Fig.1 Gel de un proteinograma de suero normal, y su lectura en densitmetro.

Como se observa en la Fig.1, las protenas se separan normalmente en 5 fracciones:
albmina, y
1
,
2
, y globulinas
Albmina es una protena que se sintetiza en el hgado, y es la de mayor concentracin en el suero.
Adems de su funcin de transportadora de algunas sustancias endgenas y exgenas, es de gran
importancia en el mantenimiento de la presin coloidosmtica y reservorio mvil de aminocidos.

globulinas incluye varias protenas, algunas se mencionan a continuacin:

1
globulina.: incluye principalmente a la
1
-antitripsina, una protena de fase aguda.
2
globulina: en
esta fraccin se encuentra la haptoglobina, una protena que une hemoglobina intravascular evitando su
excrecin por el hgado. Tambin se encuentran
2
macroglobulina y ceruloplasmina.
En general, los niveles de las protenas de las fracciones
1
y

2
globulina se incrementan en inflamacin.
globulinas:. incluye protenas de baja densidad involucradas en el transporte lipdico (lipoprotenas), de
hierro (transferrina) y factores del complemento (C3 y C4).
globulinas : en esta fraccin estn includos los Ac del isotipo IgG.
Es importante aclarar que no todos los anticuerpos migran electroforticamente con las -globulinas, sino
que algunos de ellos lo hacen con las y globulinas. (ver fig.2)

















Fig. extrada de http://inmunologia-online.tripod.comT
Fig.

Los niveles de gammaglobulinas pueden estar disminuidos en hipogammaglobulinemias como en
agammaglobulinemias, mientras que pueden estar aumentados en enfermedades inflamatorias crnicas
(artritis reumatoidea, lupus eritematoso sistmico) e infecciones.
A dems de las gammapatas policlonales, el proteinograma tambin permite identificar gammapatas
monoclonales mediante la deteccin de bandas estrechas en las fracciones gamma y beta (y,
excepcionalmente, en la fraccin alfa).