CapÃ-tulo 2

Proyecto Fin de carrera
Diseo de una planta piloto para la produccin de bioetanol
2. FASE EXPERIMENTAL 2.1 Introduccin En este estudio sobre la produccin de bioetanol a travs de melaza y la actividad de las levaduras Saccharomyces, se han llevado a cabo una serie de experimentos. Estos experimentos se han realizado con la finalidad de obtener la cintica seguida por los reactivos y productos. Adems sirve como base para el desarrollo de un modelo matemtico. Sabiendo las tendencias de las variables de operacin en el proceso y fijando otras, se puede llegar a simplificar un sistema de ecuaciones complejos y resultar as un modelo sencillo y a la vez representativo. Esto es mediante el uso de una funcin objetivo. Tal funcin se puede optimizar y conseguir as el diseo ms eficiente. Mediante la fase experimental se obtienen las tendencias de las variables del proceso. Adems con ella se puede comprobar las hiptesis y las teoras que se han desarrollado en los captulos anteriores. Se ha de decir, que con el equipo utilizado de medida, no se ha podido hacer un seguimiento continuo de las variables necesarias para hallar la cintica de forma experimental. Pero s se ha podido estudiar la evolucin de importantes factores como el pH, la concentracin de un parmetro que relaciona a todos los experimentos, tal parmetro se refiere a la concentracin de sacarosa junto con la de alcohol, ya que su medida se realizaba a travs del refractmetro, y ste no era capaz de separar los dos componentes por separado. Tambin se ha podido estudiar la influencia de la aireacin en el proceso y de la agitacin. Con la instalacin de una columna de destilacin sencilla se hall la cantidad final de alcohol obtenida en cada experimento, esto indicar el rendimiento de cada uno de los susodichos experimentos. Sabiendo todo lo anterior, la cintica se obtendr de la bibliografa recogida y mediante el estudio de experimentos de mayor rigor. Los pasos seguidos en el periodo experimental, de forma esquemtica, han sido los que se describen a continuacin. Preparacin del sustrato. Siembra e incubacin de microorganismos. Operacin en el reactor de mezcla perfecta. Decantacin del producto obtenido. Separacin del etanol mediante una columna de destilacin. Filtracin de la fase densa, pesada de microorganismos producidos. Clculos Observaciones en base a los resultados grficos y analticos. Incidencias, errores, hiptesis aplicadas.
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2.2 Preparacin del sustrato Se parte de melaza, un subproducto de la remolacha. La melaza contiene una gran cantidad de azcares, en forma de sacarosa, en una proporcin cercana al 45%. A causa de esta excesiva cantidad de azcar es conveniente diluirla para poder usarla como sustrato de la levadura. Las diluciones se realizaran a diferentes concentraciones siendo el mximo de azcar permitido alrededor del 20% en volumen. En un recipiente de agua caliente se echar una cantidad precisa de melaza viscosa y se agitar para conseguir una buena disolucin. Una vez obtenida la mezcla sta se filtrar para quitar las impurezas de la propia melaza. Estas impurezas son de carcter slido y pueden ser negativas para el proceso de fermentacin. Cuando ya se tiene diluida la melaza, se le aade 5g/l de fosfato diamnico, esto hace ms nutritivo al sustrato, ya que se aade macroelementos como el fosfato y el nitrgeno ausentes en el sustrato original. La cantidad a aadir de esta sal depender de la cantidad en gramos de melaza que se ha usado para realizar la disolucin. La disolucin de melaza tiene un pH alto que se ve incrementado por la adicin del fosfato. Este pH se ha de disminuir hasta uno cido ya que uno demasiado bsico es perjudicial para la actividad de las levaduras. Entonces, la disolucin se acidificar llegando a un pH mnimo de 4. Este pH cido evita la contaminacin del sustrato con otros microorganismos sin inters industrial. Al acidificar el sustrato se consigue un medio hostil apto para un pequeo grupo de microorganismos. Este pequeo grupo corresponde a la Saccharomyces, que es el hongo que fermentar los azcares y los transformar en etanol. Adems, el sustrato ser calentado hasta unos 80 C, donde las bacterias y hongos existentes en l desaparecern, pero las esporas permanecern ya que se ha de llegar a una temperatura de unos 120C para romperlas. As que con este hecho ya se introduce un factor que restar eficiencia al proceso de produccin de etanol. Despus se enfriar rpidamente haciendo pasar agua por las paredes exteriores del recipiente que lo contenga. Hacia una temperatura cercana a los 30C estar listo para ser usado como caldo de cultivo y fermentativo. De forma esquemtica, los pasos a seguir para la preparacin del sustrato son los siguientes: Dilucin de la melaza Clarificacin Filtracin de la mezcla Adicin de macronutrientes y micronutrientes Acidificacin Esterilizacin
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1. Dilucin de la melaza De la dilucin depender la cantidad de sacarosa introducida el reactor. A travs del uso del refractmetro, previamente calibrado, se hallar la cantidad en %v/v de sacarosa. Esta variar desde un 12% a un 20% en los sucesivos experimentos. La cantidad de azcares fermentables no puede ser excesiva ya que creara una situacin perjudicial en el desarrollo de la actividad de las levaduras. stas se agobiaran y su actividad disminuira fuertemente. Tampoco puede ser deficiente, ya que la carencia de los elementos nutritivos evitara el desarrollo pleno de las funciones vitales de los microorganismos y como consecuencia se reducira la produccin de etanol. Los g/l de sacarosa aadidos variaran para as obtener diferentes experimentos en donde se puedan comparar los resultados y ver as la eficiencia de cada experimento.
Fig.1 Melaza sin diluir
Fig. 2 Dilucin de la melaza en agua caliente
Fig. 3 Homogenizacin de la mezcla Proyecto Fin de carrera Fase Experimental Pgina 3
2. Clarificacin La disolucin de la melaza en agua debe clarificarse antes de ser usada como sustrato. Esta clarificacin se puede hacer mediante el uso de un centrifugador o a travs de la sedimentacin por gravedad. En este caso se dej sedimentar en una columna durante 24 horas. As se recogi el clarificado y ste fue filtrado en la siguiente etapa. La clarificacin favorece la transferencia de oxgeno y adems reduce la formacin de espumas.
3. Filtracin de la melaza El clarificado se dej reposar sobre varios papeles de filtro y se recogi en varios Erlenmeyer. Las impurezas quedaron en el filtro y se obtuvo un sustrato ms puro.
4. Adicin de macronutrientes y micronutrientes La melaza proveniente de la remolacha contiene una gran variedad de macronutrientes y vitaminas tales como los que se presentan en la siguiente tabla:
Tabla 1. Composicin detallada de la melaza
Componentes Sacarosa Agua Cenizas No Azcar orgnica No Azcar inorgnica Nitrgeno total
% v/v 45 - 52 15 -20 8-12 20-22 9-10 2-3
La melaza tiene una densidad de 1,3 a 1,4 kg/m3. La composicin de la melaza es muy variable ya que depende del tipo de cultivo y el proceso seguido para la fabricacin del azcar. La sacarosa contenida en la melaza va acompaada de pequeas cantidades de rafinosa y de azcar invertido. El no azcar est compuesto por materias orgnicas nitrogenadas, no nitrogenadas y cenizas. La materia orgnica no nitrogenada comprenden los cidos orgnicos tartricos, mlico, ctricos y tambin pectina, pentosa y las gomas. La adicin de nitrgeno y fsforo a travs del fosfato diamnico aporta una mejora en la calidad del sustrato.
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La adicin de esta sal depender de la cantidad en masa absoluta de melaza utilizada, sta se pesar previamente a su dilucin.
5. Acidificacin En esta etapa se pretende bajar el pH y crear un medio hostil donde no puedan vivir microorganismos diferentes a la Saccharomyces Cerevisiae. El pH se acidifica hasta uno que permita la vida de las levaduras, ste est en un rango de 4 a 4,5. A travs de la adicin de cido clorhdrico y de un agitador magntico que homogenice la mezcla se acidifica el medio de fermentacin. Un indicador de pH mide de forma continua la disolucin hasta que se obtiene una mezcla cida. El volumen de cido adicionado depende de la cantidad de disolucin a acidificar, si sta es de aproximadamente 1200 mililitros, la cantidad de cido oscila entre unos 50 ml y 70 ml.
6. Esterilizacin La esterilizacin es de vital importancia en la produccin de bioetanol a travs de la levadura, ya que si coexisten otras especies que no realizan la tarea de fermentacin va alcohlica, el rendimiento del proceso baja de forma considerable. Esto quiere decir, que la materia nutritiva es consumida por un mayor nmero de microorganismos y no es transformada en etanol sino en otros subproductos que no tienen inters industrial. Se crea una competencia entre diversos microorganismos en el medio de fermentacin, una lucha por el consumo de nutrientes. Se debe sealar, que en las actuales condiciones del laboratorio, donde se ha operado, es imposible llegar a la esterilizacin. Teniendo en cuenta lo dicho anteriormente, se intent el siguiente procedimiento, esterilizacin por va trmica. El sustrato es calentado a unos 80C mediante una placa. El tiempo de calentamiento es corto, alrededor de unos 15 minutos para un volumen de 1000 ml. Previamente se calienta el reactor a unos 70 C. Esto se realiza a travs del uso de un bao trmico, el cual hace circular agua hacia una camisa que envuelve al reactor. Se introduce el sustrato calentado y se mantiene la temperatura durante 30 minutos. Despus, se hace burbujear aire a travs del medio y mediante la camisa comienza a circular agua a temperatura ambiente. As comienza el periodo de enfriamiento rpido, donde se hace pasar al sustrato de 75C a 30C. Con todo esto se consigue la reduccin de bacterias y hongos, pero no se llega a romper las esporas, ya que para ello se debe alcanzar mayores temperaturas, alrededor de los 120C. De todas formas, un calentamiento excesivo de sustrato causa la descomposicin de la materia orgnica de dicho sustrato, y con ella la de los nutrientes.
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Por ello es preferible un periodo de calentamiento y enfriamiento rpido, y una fase de mantenimiento corta a una temperatura alta.
2.3 Siembra e incubacin de los microorganismos La Saccharomyces Cerevisiae pertenece al reino de los hongos. Es una levadura y es muy utilizada en la produccin de cervezas, vinos, La usada en concreto en este estudio pertenece a la cepa IFI 256 silvestre. Proviene del norte de Espaa. Por este motivo, aguantan bajas temperaturas, pero se desarrollan mejor a unos 30C. Este cultivo se mantiene en un medio slido, de agar. Se debe conservar en fro, y dependiendo de la temperatura de almacenamiento su duracin ser mayor o menor. Si se guarda en un frigorfico puede durar hasta un mes. Si se mantiene a -20C su duracin ser mayor. Y para almacenarlo como stock a -80C es necesario el uso de glicerol o leche. As se evita la cristalizacin de la levadura y su consecuente rotura. Este almacenamiento a tan baja temperatura precisa de nitrgeno lquido. Cuando se mantiene el cultivo a unos 5C es necesario repiques peridicos cada mes en medio de cultivo fresco. El cultivo fresco slido usado es el llamado YPD. En l se realiza la siembra de la levadura en forma de zigzag a travs de un palillo de dientes esterilizado. El motivo de esta forma de siembra es para conseguir diferentes colonias isogenticas, de iguales genes. Este cultivo se realiza sobre una caja de petri, una vez que se ha hecho la siembra se introduce en una estufa y se mantiene a 32C durante 48 horas. As se desarrollan mediante el consumo de nutrientes y el efecto de una clida temperatura que hace aumentar su crecimiento. Si se pretende una duracin mayor del cultivo, ste se ha de guardar en nitrgeno lquido, se tomarn 828 l de cultivo estacionario de 48 horas y se le adicionarn 172 l de glicerol 87. Su congelamiento se har en nitrgeno lquido a unos 80C bajo 0. As se asegura su almacenamiento en un largo periodo de tiempo, haciendo posible su uso en cualquier momento activndolo con calor. Otro mtodo usado, y quizs el ms eficiente es la liofilizacin, pero es muy complejo y se requiere de mayor tecnologa. La liofilizacin consiste en sacarle el agua a una sustancia congelada omitiendo el estado lquido. Se congela una solucin acuosa de la sustancia qumica que se desea liofilizar y, a esa baja temperatura que impide cambios qumicos de deterioro, se le somete a un alto vaco que hace pasar el agua del estado slido al estado gaseoso, sin pasar por el estado lquido. Es una forma de secar un producto qumico a temperaturas bajsimas, sin el deterioro que producira el recalentamiento. Tal vez el mtodo ms satisfactorio sea el descrito anteriormente, aunque pueden emplearse con xito cualquier otro mtodo que asegure la estabilidad, o sea que no se produzcan cambios en las propiedades bioqumicas del microorganismo.
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1. Procedimiento de siembra Se parte de una caja de petri que contiene la cepa IFI 256 de la levadura Saccharomyces Cerevisiae. Se ha de crear una atmsfera reductora donde se pueda operar sin riesgo de contaminacin. Con un mechero de laboratorio se obtiene un pequeo radio de ambiente reductor. Este mechero se coloca bajo una campana. Antes de comenzar el proceso de siembra se prepara el sustrato.
Fig.4 Cultivo de Saccharomyces Cerevisiae en YPD slido. El cultivo de la izquierda est sano. El de la derecha est contaminado.
Se ha de esterilizar los recipientes en donde se van ha realizar las inoculaciones del sustrato. Estos sern erlenmeyer de 250 ml. Se introducirn en la estufa y se calentarn hasta 120 C. Cuando se alcanza tal temperatura se mantiene la operacin de esterilizacin durante 10 minutos. Despus se transportarn hacia zona de operacin reductora y se metern en un bao de agua fra. As se conseguir enfriarlos rpidamente. El agua no debe introducirse en el interior de tales recipientes.
Fig. 5 Fase de esterilizacin y siembra en atmsfera reductora.
Las bocas de los erlenmeyer se harn pasar por la llama del mechero. Despus se introducir una cierta cantidad de sustrato debidamente elaborado y a una temperatura no superior a los 40C. Con la ayuda de un palillo de diente previamente esterilizado se coger una pequesima muestra de levadura de la caja de petri. Bastar con deslizar el palillo de diente de forma suave por unas de las colonias en zigzag existentes sobre el agar. Este palillo se introducir en el erlenmeyer y se realizar una pequea agitacin manual.
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Fig. 6 Fase de siembra y repiques peridicos.
Para esterilizar el palillo, se introduce en un bao de agua hirviendo y despus, hmedo, se pasa por la llama del mechero. Normalmente, para la esterilizacin del material a usar en la siembra y en el proceso de fermentacin, se requiere de un autoclave. ste es un recipiente donde se pueden introducir todos los elementos que requieran esterilizacin y se someten a presin con vapor. Adems todos los conductos y sistemas deben ser sometidos a un chorro de vapor. En este caso se careca de un autoclave y se hizo de una forma sencilla que no aseguraba el 100% de esterilizacin. Sin embargo, se ha de tener en cuenta, que en el proceso de fermentacin se genera alcohol. Y ste acta como desinfectante de microorganismos extraos al proceso. Por ello, el riesgo de contaminacin disminuye. Adems la acidificacin del sustrato tambin previene de la existencia de microorganismos competentes por los nutrientes. Tambin se poda haber usado una olla a presin. Despus de inocular con los hongos el sustrato, el erlenmeyer es tapado con algodn llevado a una estufa donde se dejar incubando durante 72 horas y a una temperatura de unos 32C. Durante este periodo la colonia de levadura sumergida en el medio se alimentar de los nutrientes existentes y crecer hasta llegar al estado estacionario. Depositndose en la parte inferior del recipiente, ya que tales microorganismos sedimentan bien. En esta incubacin es aconsejable introducir agitacin en la mezcla. Al cabo de los tres das, se puede encontrar una fina capa blancuzca con tintes marrones en el fondo del erlenmeyer. Esta capa es la levadura generada. Se procuran unas condiciones donde se fomente el crecimiento de la levadura, que es el objetivo marcado para la posterior siembra del reactor de fermentacin.
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Cuando se obtiene esta capa, cuidadosamente se extrae el lquido clarificado, es decir, el alcohol producido mezclado con los dems elementos. Una vez separadas ambas fases se puede proceder de dos formas para obtener la levadura. Una sera filtrar la levadura y posteriormente usarla, de forma hmeda o seca para inocular el reactor u otras siembras. La otra sera usar directamente este pequeo volumen de sustrato inoculado para sembrar el reactor. Las dos opciones son aceptables y la usada en este caso es la segunda, porque as se evita usar otros recipientes e instrumentos que no llegaran a ser totalmente esterilizado, a causa de la falta de medios. El proceso de siembra se suele realizar en serie, es decir, que a partir de un medio inoculado donde se ha llegado al crecimiento estacionario de los microorganismos, se repica otros medios de sustratos frescos en diferentes recipientes. Y a travs de la siembra de estos nuevos medios se sigue inoculando otros. As se consigue aumentar la cantidad inicial de levadura contenida en la caja de petri que fue sacada del congelamiento. Y adems se renueva haciendo que su calidad mejore. En el proceso de siembra se ha utilizado cantidades de sustratos diferentes contenidos en erlenmeyer de iguales tamaos. As se puede estudiar la velocidad de dilucin. Y como afecta el aire en el crecimiento de los microorganismos. Tambin se vari el pH en las distintas siembras para estudiar su influencia en la situacin planteada, adems de aadir diversas cantidades de sales.
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2.4 Operacin en el reactor Para la realizacin del estudio, se utiliza un reactor de mezcla perfecta de capacidad 2 litros. Con un agitador y una camisa envolvente para su calefaccin con la ayuda de un bao trmico. Adems se tiene una entrada inferior de aire que procura la cantidad de oxgeno disuelto necesario para la fermentacin en el reactor.
Fig. 7 Reactor y bao trmico.
En principio se opera en discontinuo para estudiar la cintica del proceso con la intencin de operar en un futuro en continuo. Sin embargo las expectativas variarn al no encontrar unas buenas condiciones para realizar el proyecto. Como el reactor es de pequeo volumen se prefiere operar en discontinuo y semicontinuo para todo el estudio de la fermentacin. A travs de un refractmetro se mide la variacin de un parmetro conforme avanza el proceso. Este parmetro corresponde a la concentracin de sacarosa en el medio. Aunque no se puede decir con plena certeza que no intervengan otros compuestos en la seal que resulta de su medicin, ya que el propio etanol tambin es analizado por dicho instrumento. Para calibrar el refractmetro a este estudio, se toma una cantidad conocida de melaza, la cual se diluye a una concentracin determinada. De esta mezcla se toma una alcuota que se lleva al refractmetro y se puede comprobar que mide la misma concentracin en %v/v. Antes de tal procedimiento se toma una mezcla conocida de azcar disuelta en agua y se demuestra el calibrado del refractmetro para la medicin de azcares. Para realizar este proyecto se requiere el uso de un cromatgrafo de lquidos para hallar las diferentes concentraciones de etanol, sacarosa y biomasa en los diversos tiempos que ocupa el proceso. As se puede trazar una curva para cada compuesto y mediante una regresin obtener la cintica de cada componente. Sin embargo, al ser esto una tarea imposible ya que se carece de medios suficientes, se hace el estudio a travs del parmetro de concentracin de sacarosa medido por el refractmetro.
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Fig. 8 Formacin de espumas causada por la aireacin.
Este parmetro no representa la evolucin de los azcares conforme avanza el tiempo ya que en l tambin influye la cantidad de alcohol producido. Por eso, como se ver ms adelante, este factor de concentracin ir disminuyendo hasta llegar a un valor en cual se compensa la cantidad de alcohol producida con la de azcares consumidos. Se podra pensar que tal parmetro no es representativo, pero si se ve desde el punto de vista comparativo entre los diversos experimentos, puede dar muchos datos y explicar las situaciones dadas en tal periodo experimental. En este estudio se llamar a tal concentracin, concentracin de sacarosa, aunque se tendr en cuenta todo lo dicho anteriormente. Por tal motivo, la cintica del sustrato no se obtendr mediante los resultados obtenidos sino que se har mediante la bibliografa y otros experimentos ya realizados. Se puede hacer la siguiente aclaracin, en el instante inicial, la medicin de tal parmetro, corresponde a la concentracin de sacarosa inicial existente en el sustrato. Esto no deja de ser una aproximacin. Se han hecho siete experimentos, los cuales han transcurrido a diferentes condiciones de operacin. En tales experimentos se ha estudiado la evolucin del pH, que a su vez es controlado y fijado en un valor constante. Tambin se ha estudiado la evolucin de la concentracin de nutrientes conforme avanzaba el proceso. La temperatura, la aireacin, la adicin de sustrato fresco y el reciclaje o no de las clulas han sido los parmetros variables de un experimento a otro. El tiempo tambin es un factor muy importante porque llegado a un instante determinado la fermentacin se ve estancada, a causa de las altas concentraciones de alcohol en el medio, de la escasez de nutrientes y del crecimiento estacionario de las levaduras.
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Fig. 9 Reactor de mezcla perfecta con aireacin
Fig. 10 Reactor de mezcla perfecta sin aireacin.
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EXPERIMENTOS A continuacin se describen los experimentos desarrollados con sus condiciones y sus mediciones. Experimento 1 Fecha: Comienzo: 28/12/05, Final: 30/12/05. Duracin: 72 horas. Temperatura de operacin: 35C (controlado). Presin atmosfrica Concentracin inicial de sacarosa: 131%v/v. pHinicial: 4,7 (controlado). Volumen de sustrato: 1250 ml. Volumen de levadura en solucin: 200 ml (correspondientes a 1,2 g levadura filtrada). Tiempo de aireacin: 2 h de aire intenso. Agitacin inicial = 88 rpm. Masa de nutrientes aadidos ((NH3)2HPO4), en este caso no se aadi ningn nutriente adicional.
EXPERIMENTO 1 Temperatura: 35 C Tiempo (h) C (%) 10,1 10,1 10,1 10,1 10,1 8,5 8,5 8,5 8,5 8,5 8,5 8,1 8,1 8,1 8,1 8,1 8,0 8,0 8,0 pH 4,79 4,79 4,79 4,80 4,79 4,53 4,47 4,47 4,47 4,47 4,47 4,60 4,60 4,60 4,60 4,30 4,30 4,30 4,30 Caudal de aire (cc/min) 125 125 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Mediciones
1 2 3 4 5 24 25 26 27 28 29 48 49 50 51 52 70 71 72
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Grficos Evolucin del parmetro Cs frente al tiempo

Variacin Concentracin Sacarosa Experimento 1 12 10 8 6 4 2 0 0 20 40 Tiempo (h) 60 80 Variacin Concentracin Sacarosa
Concentracin S (%v/v)
Evolucin del pH frente al tiempo

Variacin pH Experimento 1 4,9 4,8 4,7 pH 4,6 4,5 4,4 4,3 4,2 0 20 40 Tiempo (h) 60 80 Variacin pH Experimento 1
Hay que indicar, que el pH se fue midiendo cada hora pero tambin se controlaba estableciendo su valor en un rango de valores tales como 4,6 4,7. Esto se consigui adicionando cido clorhdrico o hidrxido sdico.
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Experimento 2 Condiciones de operacin Fecha: Comienzo: 03/01/06, Final: 06/01/06. Duracin: 72 horas. Temperatura de operacin: 35C (controlado). Presin atmosfrica. Concentracin inicial de sacarosa: 13%v/v. pHinicial: 4,6 (controlado). Volumen de sustrato: 1250 ml. Volumen de levadura en solucin: 1,5 g de levadura obtenida del primer experimento ms 0,05 ml de levadura nueva disuelta en agua destilada. Tiempo de aireacin: 10 h totales de aireacin, intensa e intermedia. Agitacin inicial = 88 rpm. Masa de nutrientes aadidos ((NH3)2HPO4), no se adicin ninguna sal.
Mediciones
1 2 3 4 5 24 25 26 27 28 29 48 49 50 51 52 70 71 72
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Evolucin del parmetro Cs frente al tiempo

Variacin concentracin Sacarosa Experimento 2 14 12 10 8 6 4 2 0 0 20 40 Tiempo (h) 60 80 Variacin de la concentracin

Variacin pH Experimento 2
4,9 4,8 4,7 4,6 4,5 4,4 4,3 4,2 4,1 0 20 40 Tiempo (h) 60 80
pH
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Experimento 3 Condiciones de operacin Fecha: Comienzo: 09/01/06, Final: 13/01/06. Duracin: 96 horas. Temperatura de operacin: 33C (controlado). Presin atmosfrica. Concentracin inicial de sacarosa: 18,1%v/v. pHinicial: 4,06 (controlado). Volumen de sustrato: 1100 ml. Volumen de levadura en solucin: 250 ml levadura disuelta en sustrato. equivalente a 1,5 g de levadura seca. Tiempo de aireacin: 2 h totales de aireacin, intensa e intermedia. Agitacin inicial = 88 rpm. Masa de nutrientes aadidos ((NH3)2HPO4) = 4,2 g.
Mediciones
EXPERIMENTO 3 Temperatura: 33C C Caudal de aire pH (%) (cc/min) 16,00 4,02 125 16,00 16,00 16,00 16,00 13,50 13,50 13,25 13,25 13,00 13,00 11,00 11,00 11,00 11,00 11,00 10,00 10,00 10,00 10,00 10,00 4,07 4,07 4,09 4,07 4,04 4,05 4,05 4,05 4,05 4,05 4,12 4,12 4,12 4,12 4,12 4,03 4,03 4,04 4,00 4,00 50 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Tiempo (h)
1 2 3 4 5 24 25 26 27 28 29 48 49 50 51 52 70 71 72
95 96
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Variacin Sacarosa Experimento 3 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 0 50 100 150 Tiempo (h) Concentracin Sacarosa (%v/v)
Variacin Sacarosa Experimento 3

Variacin pH Experimento 3 4,14 4,12 4,1 4,08 4,06 4,04 4,02 4 3,98 0 50 Tiempo (h) 100 150
pH
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Experimento 4 Condiciones de operacin Fecha: Comienzo: 17/01/06, Final: 22/01/06. Duracin: 72 horas. Temperatura de operacin: 25C (controlado). Presin atmosfrica. Concentracin inicial de sacarosa: 18 %v/v. pHinicial: 4,04 (controlado). Volumen de sustrato: 1100 ml. Volumen de levadura en solucin: 250 ml levadura disuelta en sustrato, equivalente a 1,5 g de levadura seca. Tiempo de aireacin: 2 h totales de aireacin, intensa e intermedia. Agitacin inicial = 88 rpm. Masa de nutrientes aadidos ((NH3)2HPO4) = 4,2 g.
Mediciones
EXPERIMENTO 4 Temperatura: 25 C C Caudal de aire pH (%) (cc/min) 16,90 4,05 125 16,90 16,50 16,50 16,50 14,80 14,20 14,20 14,20 14,20 14,20 11,75 11,75 11,75 11,50 11,50 10,80 10,80 10,80 4,05 4,05 4,20 4,20 4,01 4,00 3,99 4,00 4,00 4,00 3,99 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 125 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Tiempo (h)
1 2 3 4 5 24 25 26 27 28 29 48 49 50 51 52 70 71 72
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Variacin Concentracin Sacarosa Experimento 4 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 0 20 40 Tiempo (h) 60 80
Variacin Concentracin Sacarosa Experimento 4

Variacin pH Experimento 4 4,25 4,2 4,15 4,1 4,05 4 3,95 0 20 40 Tiempo (h) 60 80 Variacin pH Experimento 4 pH
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Experimento 5 Condiciones de operacin Fecha: Comienzo: 23/01/06, Final: 27/01/06. Duracin: 96 horas. Temperatura de operacin: 35C (controlado). Presin atmosfrica. Concentracin inicial de sacarosa: 20,5 %v/v. pHinicial: 4,01 (controlado). Volumen de sustrato: 1000 ml. Volumen de levadura en solucin: 250 ml levadura disuelta en sustrato, equivalente a 1,5 g de levadura seca. Sin aireacin. Se lleva a cabo sin aire para comprobar dos hechos importantes, el primero es que las levaduras son microanaerbicas, es decir que pueden desarrollar su actividad en un medio con escaso oxgeno disuelto. Esto es beneficioso para la produccin de bioetanol aunque tambin es perjudicial para el crecimiento de tales hongos. Y al ser menor la cantidad desarrollada de microorganismos sern menor la actividad total ejercida por estos dando lugar a menos alcohol. Adems, tambin se quiere comprobar el efecto del aire en relacin a la contaminacin del sustrato. Agitacin inicial = 88 rpm. Masa de nutrientes aadidos ((NH3)2HPO4) = 4,2 g.
A este experimento le seguir otro, que es su continuacin. ste se llamar 5 y se basar en la operacin en semicontinuo del reactor. Al cabo de las 72 horas, la concentracin de nutrientes del sustrato es baja. Ha disminuido desde un 21% aproximadamente hasta alrededor de un 13%. Transcurrido este tiempo se le aade al reactor 300 ml de sustrato fresco de concentracin alta en azcares. Previamente se le extrajo 250 ml de producto obtenido a los tres das de fermentacin. Las mediciones que se muestran en la siguiente tabla corresponden a la primera etapa donde se opera en continuo y se establece un tiempo de 72 horas para poder as comparar los resultados con los dems experimentos. Los 250 ml extrados servirn para en futuro realizar las operaciones de decantacin, filtracin y destilacin. As se podr saber la cantidad de alcohol obtenida de forma absoluta. Despus se continuar midiendo hasta llegar al cuarto da donde se parar el proceso y se har el mismo procedimiento tomado para los dems casos. El tiempo total de los experimentos 5 y 5 es de 96 horas.
Fase Experimental
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Mediciones
1 2 3 4 5 24 25 26 27 28 29 48 49 50 51 52 70 71 72
Fase Experimental
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Variacin Concentracin Sacarosa Experimento 5 Concentracin S (%v/v) 25 20 15 10 5 0 0 50 Tiempo (h) 100 150 Variacin Concentracin Sacarosa Experimento 5

Variacin pH Experimento 5 4,2 4,1 4 3,9 3,8 3,7 3,6 0 50 Tiempo (h) 100 150 Variacin pH Experimento 5 pH
Fase Experimental
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Experimento 5 (Continuacin del anterior) Fecha: Comienzo: 27/01/06, Final: 28/01/06 Mediciones
EXPERIMENTO 5' Temperatura: 35 C Tiempo (h) C (%) 21,5 19,6 19,35 19,35 19,35 18,5 18 17,75 17,75 17 17 15,5 15,5 15,25 15,25 15,25 13,75 13,75 13 pH 4,04 3,98 3,64 3,79 3,88 3,83 4,03 4,13 4,13 4,13 4,13 4,07 4,07 4,13 4,13 4,13 4,05 4,05 4,05 Caudal de aire (cc/min) 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
1 2 3 4 5 24 25 26 27 28 29 48 49 50 51 52 70 71 72 73 74 94 95 96
16,5 16,5 12,65 12,65 12,65
4,23 4,02 3,85 4,02 4,02
0 0 0 0 0
Fase Experimental
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Grficos Evolucin del parmetro Cs frente al tiempo

Variacin Sacarosa Experimento 5' 25 20 15 10 5 0 0 50 100 Tiempo (h) 150 Variacin Sacarosa Experimento 5'

Variacin pH Experimento 5' 4,3 4,2 4,1 pH 4 3,9 3,8 3,7 3,6 0 50 Tiempo (h) 100 150 Variacin pH Experimento 5'
Fase Experimental
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EXPERIMENTO 6 Temperatura: 30 C Caudal de aire C (%) pH (cc/min) 19,10 4,50 0 19,10 19,00 18,50 18,00 18,00 18,00 18,00 16,25 16,00 16,00 15,00 15,00 15,00 15,00 15,00 14,25 14,25 14,50 4,50 4,44 4,44 4,35 4,35 4,35 4,10 4,10 4,10 4,10 4,08 4,08 4,02 4,02 4,02 4,00 4,00 4,00 0 75 125 125 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Mediciones
Tiempo (h)
1 2 3 4 5 24 25 26 27 28 29 48 49 50 51 52 70 71 72
Fase Experimental
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Variacin Concetracin Sacarosa Experimento 6 25 20 15 10 5 0 0 20 40 Tiempo (h) 60 80 Variacin Concetracin Sacarosa Experimento 6

Variacin pH Experimento 6 4,6 4,5 4,4 pH 4,3 4,2 4,1 4 3,9 0 20 40 Tiempo (h) 60 80 Variacin pH Experimento 6
Fase Experimental
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Mediciones
1 2 3 4 5 24 25 26 27 28 29 48 49 50 51 52 70 71 72
Fase Experimental
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Variacin Concentracin Sacarosa Experimento 7 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 0 20 40 Tiempo (h) 60 80
Variacin Concentracin Sacarosa Experimento 7

Variacin pH Experimento 7 4,1 4,05 4 pH 3,95 3,9 3,85 3,8 3,75 0 20 40 Tiempo (h) 60 80 Variacin pH Experimento 7
Fase Experimental
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2.5 Decantacin del producto obtenido Despus del proceso de fermentacin, para cada experimento, se toma el total contenido del reactor y se introduce en una columna de una altura considerable donde se deja en reposo varios das. En estos das precipitan por gravedad los microorganismos y las dems sustancias de mayor densidad. Despus se separa la parte ms densa del clarificado. Este ltimo se deja de nuevo reposar durante varios das y se vuelve a repetir la operacin. El clarificado quedar exento de materiales slidos, y ser la alimentacin del proceso de destilacin. Las medidas del parmetro Cs en el clarificado, despus de la separacin de las dos fases, la densa y la ligera, son las que se presentan a continuacin.
CLARIFICADOS Exp 1 2 3 4 5 5 6 7 Cs inicial (%v/v) 13,10 13,00 18,10 18,00 20,50 16,50 18,00 17,00 Cs final (%v/v) 10,00 8,00 11,25 11,50 12,25 12,75 14,50 10,25
Fig. 11 Recogida del producto del reactor despus del proceso
Fase Experimental
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La fase densa se filtrar para as poder pesar la cantidad de materia slida obtenida. Entre esta masa viscosa habr microorganismos tales como la levadura, pero tambin otros extraos, adems de la formacin de un subproducto oscuro espeso. Pero todo esto se ver con mayor claridad en el apartado de filtracin.
2.6 Separacin del producto mediante una columna de destilacin La otra parte del proceso es la destilacin del producto obtenido. Previamente, se deja decantar y as se retira la fase ms densa, introduciendo el clarificado en la columna de destilacin. La columna de destilacin consta de un hervidor, de una columna de rectificacin, otra con una camisa para la refrigeracin y condensacin del etanol, de un serpentn a la salida de la misma tambin para refrigerar y un recipiente donde se recoge el destilado. Tambin se tiene un termmetro a la salida de los gases de la columna de rectificacin.
Fig. 12 Columna de destilacin.
Mediante el control de la potencia del hervidor se puede conseguir mayor cantidad de destilado y a mayor concentracin. Se ha de evitar llegar a los 100C, ya que a esta temperatura se est destilando agua, y lo que se obtiene es un destilado con muy pequea concentracin de etanol. Por ello se ha de aplicar inicialmente una potencia alta pero cuando la temperatura se va aproximando a los 100C sta se ha de poner al mnimo y as evitar llegar a tal temperatura, que es la de ebullicin del agua. A travs de este proceso se completa as la fase experimental, se obtiene el producto obtenido y se puede calcular el rendimiento global de cada experimento.
Fase Experimental
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Aunque hay que tener en cuenta que la altura de la columna es baja y que su mecanismo es sencillo, es decir, que se obtendrn bajas concentraciones de alcohol. A travs de la medicin del ndice de refraccin del destilado y utilizando las correlaciones precisas se obtiene la concentracin de alcohol en %v/v y con sta se puede hallar la cantidad de alcohol producida total para cada caso, sabiendo el volumen del cual se parte. Para cada experimento se obtienen los datos expuestos en la tabla que se presenta a continuacin, adems tambin de contener los rendimientos de cada proceso. La ecuacin tomada para el clculo del rendimiento del proceso global es la siguiente:
E=
Cet VD 100 CS 0 VS
[1]
Siendo E la eficiencia del proceso global, VD el volumen total de destilado resultante, VS el volumen total inicial de sustrato utilizado, Cet la concentracin de etanol en el destilado obtenido y CS0 es la concentracin de sacarosa inicial contenida en el sustrato. Mediante el uso de la ecuacin [1] se calculan los rendimientos para cada experimento, estos quedan representados en la siguiente tabla.
DESTILACIN Exp 1 2 3 4 5 5 6 7 0 IR 1,3450 1,3490 1,3500 1,3412 1,3605 1,3450 1,3545 1,3543 1,3360 VS ml 1250 1250 1100 1100 200 1000 1100 1200 500 CS0 %v 13,1 13,0 18,1 18,0 20,5 16,5 18,0 17,0 11,5 VSacarosaInicial ml 163,8 162,5 199,1 198,0 41,0 165,0 198,0 204,0 57,5 Etanol %v 25,75 33,75 35,75 18,25 56,80 25,75 44,75 44,25 7,75 VD ml 135 100 125 320 20 275 180 125 40 Vet ml 34,76 33,75 44,69 58,40 11,36 70,81 80,55 55,31 3,10 Rendimiento % 21,23 20,77 22,45 29,49 27,71 42,92 40,68 27,11 5,39
COLA Sinicial %v 13,100 13,000 18,100 18,000 20,500 16,500 18,000 17,000 11,500 Scola %v 9,25 7,75 11,50 14,00 7,50 7,50 12,75 10,75 9,50 Vcola ml 660 780 745 580 180 650 765 980 460
Fase Experimental
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2.7 Filtracin de la fase densa. Pesada de los microorganismos producidos Se toman varios Erlenmeyer, y sobre cada boca de stos se coloca un embudo donde reside un papel filtrante. Se introduce la fase densa, separada previamente del clarificado, y se deja en reposo durante 24 h.
Fig. 13 Filtrado de la fase densa del producto de reactor.
Cuando ha transcurrido este tiempo se puede ver que sobre el papel filtrante se ha depositado los posos del reactor. En esta masa viscosa que se obtiene, estn presente las levaduras producidas, con un color claro que va adquiriendo tonos oscuros dados por otros subproductos del proceso, como puede ser el provocado por la reaccin que dan el metabolismo de otros microorganismos sin inters industrial.
Fig. 14 Depsito de la masa slida sobre el papel de filtro.
Fase Experimental
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Contando con la posible contaminacin, se pes la materia slida recogida para cada caso, y se obtuvieron los resultados de la tabla siguiente. Se ha tenido en cuenta que el papel de filtro pesaba un gramo antes de usar.
LEVADURA Masa g 3,7 8,5 5 5,3 0,9 2 8,3 7,1 1,4
Exp 1 2 3 4 5 5 6 7 0
Masa Ini g 1,2 1,5 1,5 1,5 1,5 0 1,5 1,2 0
En esta tabla se puede ver un experimento que atiende al nombre de 0, este se refiere a la filtracin de sustrato fresco, sin fermentar. Con l se quiere demostrar la generacin de productos slidos del proceso de fermentacin ya que la masa depositada en el caso de tratarse de melaza meramente diluida, es muy pequea. Figuras 15, 16, 17 y18
De las siguientes imgenes se puede ver en el centro de los filtrados correspondientes a los procesos de fermentacin una capa ms clara, sta es la correspondiente a las levaduras. En la foto inferior derecha se ve la clara diferencia de depsitos producidos en los procesos de fermentacin comparado con la mera filtracin del sustrato sin ser sometido a la reaccin.
Fig. 15 Filtrado del sustrato fresco.
Fig. 16 Levadura producida en el proceso en la parte central del papel.
Fig. 17 Levadura producida por fermentacin mezclada con otros microorganismos extraos.
Fig. 18 Comparacin de la masa filtrada entre los sustratos sometidos a la fermentacin y el sustrato fresco.
Fase Experimental
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Captulo 5
2.8 Clculos Rendimiento Para el clculo del rendimiento del proceso global, como se vio anteriormente, se puede usar la siguiente ecuacin:
YP =
S
P P P0 = S S 0 S
[2]
La ecuacin [2] es el rendimiento respecto del producto segn el sustrato total consumido. Si se supone que inicialmente la disolucin de melaza no contena alcohol y adems el sustrato se agota por completo, se llega a la ecuacin [1] usada en el apartado 2.6. Esta ecuacin se ha aplicado para cada experimento. En la tabla siguiente se indican los diferentes rendimientos de operacin. El rendimiento mximo obtenido est entorno al 42%. Segn estas hiptesis realizadas la ltima concentracin medida en el refractmetro, al cabo de 72 96 h, corresponde al alcohol formado. Por otro lado, se podra pensar que no todo el sustrato es agotado, ya que al realizar la destilacin y separar el alcohol del producto total sigue midiendo azcares en el refractmetro. Segn esto se podran hallar otros valores de los rendimientos de cada experimento. Se ha de tener en cuenta que el refractmetro no es el instrumento ms idneo para medir azcares en una disolucin que tambin contiene alcohol. Adems la columna de destilacin no opera con un rendimiento del 100%. En la siguiente tabla se tienen los resultados obtenidos.
RENDIMIENTO FORMACIN DE PRODUCTO Exp 1 2 3 4 5 5 6 7 0 V0 ml 1250 1250 1100 1100 200 1000 1100 1200 500 S0 %v 13,1 13,0 18,1 18,0 20,5 16,5 18,0 17,0 11,5 VSacarosaInicial ml 163,75 162,50 199,10 198,00 41,00 165,00 198,00 204,00 57,50 VD ml 135 100 125 320 20 275 180 125 40 VTotalEtanol ml 34,76 33,75 44,69 58,40 11,36 70,81 80,55 55,31 3,10 YP/S 21,23 20,77 22,45 29,50 27,71 42,92 40,68 27,11 5,39
El rendimiento del proceso tambin se puede calcular a travs de la biomasa formada. Se puede observar la tabla del apartado 2.7. En ella aparece la masa filtrada en una disolucin de melaza fresca, sin ser sometida a fermentacin. Este peso medido puede ser restado a cada masa obtenida en los dems experimentos adems de la levadura inicial introducida en alimentacin, as se podr calcular el rendimiento correspondiente a la generacin de microorganismos respecto del sustrato consumido.
Futuras lneas de investigacin
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Captulo 5
A travs de la siguiente ecuacin se obtienen tal rendimiento:

YX =
S
X X X 0 = S S0 S
Sin embargo, el hecho de suponer que gran parte de la masa filtrada sea levadura es un error grande ya que en el proceso las condiciones de esterilizacin son mnimas. Aunque por otra parte, la concentracin de alcohol y la alta acidez del caldo eliminan las bacterias que puedan estar presentes. Experimentalmente se encuentra la densidad de la melaza. Se toma una cierta cantidad, medida en gramos, de melaza. sta se disuelve en un litro de agua. Y se mide la concentracin de sacarosa a travs del refractmetro. Este ltimo dar la concentracin de azcares en volumen. Como se sabe que la concentracin de sacarosa en la melaza sin diluir es aproximadamente del 45% en peso, y se tiene la concentracin de la melaza, se puede obtener la concentracin de sacarosa. As se puede obtener la relacin existente entre g/l de sacarosa y %v/v de sacarosa. Esta sucesin de clculos quedaran de la siguiente forma: Experimento para hallar la relacin entre concentraciones en peso y volumen de sacarosa gMelaza gSacarosa % p / pSacarosa = 1lAgua lagua gMelaza = % p / pMelaza gTotales Se pesan 4235 gramos melaza en un recipiente de 2 litro de capacidad. Se adiciona un litro de agua. Se pesa el total, corresponde a 1414,6 gramos totales. Se supone que la concentracin de sacarosa en la melaza sin diluir es del 45% en peso. Con esto se tiene 190,575 gramos de sacarosa/litro de agua. Mediante el refractmetro se obtiene la concentracin de sacarosa en % en volumen. sta corresponde al 235%. A travs de este experimento se pueden pasar a masa las concentraciones en volmenes de la sacarosa de los diferentes experimentos y aplicar la ecuacin para el rendimiento en funcin del crecimiento celular generado respecto del sustrato consumido en masa.
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Captulo 5
A continuacin se obtiene la tabla con los valores obtenidos.

RENDIMIENTO SEGN GENERACIN DE LEVADURA Exp 1 2 3 4 5 5 6 7 0 Xfinal g 3,7 8,5 5,0 5,3 2,0 2,0 8,3 7,1 1,4 Xinicial g 1,2 1,5 1,5 1,5 1,5 0,0 1,5 1,2 0,0 Sinicial %v 13,1 13,0 18,1 18,0 20,5 16,5 18,0 17,0 11,5 S g/l 106,24 105,43 146,79 145,98 166,26 133,82 145,98 137,87 93,27 V l 1,25 1,25 1,10 1,10 0,20 1,00 1,10 1,20 0,50 Yx/s 1,88 5,31 2,17 2,37 1,50 1,49 4,23 3,57 3,00
Es claro que en el experimento de mayor rendimiento en formacin de producto, tendr un valor mnimo en el rendimiento de produccin de levadura, ya que el sustrato consumido se ha utilizado para la obtencin de etanol y no para la fabricacin de microorganismos. El experimento 2 de un bajo rendimiento en la produccin de etanol, alcanza el mximo rendimiento de elaboracin de levadura. El experimento 5 de mayor rendimiento en la produccin de etanol, alcanza un rendimiento mnimo en la fabricacin de levadura. Todo esto indica que los clculos efectuados son lgicos.
Cintica Si se considera que la concentracin de azcares corresponde a la concentracin de sacarosa en la disolucin de melaza, se puede escribir la siguiente estequiometra de reaccin: C12 H 22O11 + H 2O + SaccharomycesCerevisiae 4CH 3CH 2OH + 4CO2 A travs de esta reaccin se puede obtener la cantidad de alcohol formado en funcin del sustrato consumido, ya que se sabe la relacin molar existente entre ambas sustancias. Por cada mol que reacciona de sacarosa se forman 4 moles de etanol. Se sabe la cantidad inicial y final de azcares en la disolucin de melaza. Tambin se pueden hallar las masas moleculares de cada molcula, se tiene la siguiente ecuacin:
P=
S0 S 4molesCH3CH 2OH PM (CH 3CH 2OH ) PM (C12 H 22O11 ) 1molC12 H 22O11
Mediante esta relacin se podra obtener la cantidad de alcohol terica que se forma con el tiempo para cada experimento. Y se podra realizar una tabla donde por cada valor de concentracin de azcares medidos se tenga una concentracin terica de alcohol en la mezcla. Esta claro que esto no es del todo cierto pero al carecer de datos experimentales sobre
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Captulo 5
la evolucin del etanol en el proceso, es preciso recurrir a tales valores para llegar a una cintica aproximada del producto de reaccin.
Consumo de sustrato Para la cintica del consumo de sustrato se puede utilizar la ecuacin de Michaelis y Menten. La inversa de tal ecuacin se representa y as se pueden hallar la constante de Michaelis y la velocidad mxima de consumo, o tambin llamada velocidad especfica mxima. Adems servir para demostrar que tal ecuacin se ajusta bien a la evolucin del consumo de sustrato. Por otro lado, la velocidad de desaparicin de sustrato se deber obtener de diferenciar los valores medidos de azcares respecto del tiempo. Con todo esto se obtiene la ecuacin cintica de consumo de sustrato en funcin de la concentracin del sustrato.
rS =
dS (rS ) mx S = dt km + S
km 1 1 1 = + rS ( rS ) mx S ( rS ) mx
Formacin de biomasa Para modelar el crecimiento de la biomasa se utilizan las ecuaciones de Monod y su inversa. Estas ecuaciones slo son aplicables al crecimiento exponencial. Mediante su representacin se pueden obtener los datos de la velocidad de crecimiento mxima especfica y de la constante de Monod. Finalmente, se halla la ecuacin cintica de crecimiento celular funcin de la concentracin del sustrato. La velocidad de aparicin de biomasa se halla a travs de la diferenciacin de la biomasa respecto del tiempo. En este caso, se carecen de datos para obtenerla.
=
1
mx S
kS + S
kS 1 1 + mx S mx
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Captulo 5
Formacin de producto La velocidad de aparicin de producto puede relacionarse con la velocidad de consumo de sustrato a travs del rendimiento, que actuara como una constante de proporcionalidad. De igual forma se puede relacionar con la velocidad de formacin de biomasa, teniendo en cuenta que este caso el valor del rendimiento variara ya que est referido a otras variables.
dP dS = Y p dt dt s dP dX = Y p dt dt x
Balance de materia Se puede realizar un balance de materia para cada experimento. Se sabe la reaccin cintica y la estequiometra del proceso. A travs de tal ecuacin se puede obtener las relaciones molares entre los reactivos y los productos. Adems se conocen las cantidades iniciales de los reactivos. Por otro lado se carece de datos sobre el dixido de carbono producido. Slo es claro que se puede hacer un balance de materia terico pero no se puede comparar con el real, ya que no se tienen datos suficientes. C12 H 22O11 + H 2O + SaccharomycesCerevisiae 4CH 3CH 2OH + 4CO2
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Captulo 5
2.9 Observaciones experimentales 1. Evolucin de la concentracin S Como ya se dijo anteriormente, el parmetro Cs no representa slo la concentracin de sacarosa, aunque en su gran mayora s, ya que en un principio es esta concentracin la que lee el refractmetro. A medida que avanza la reaccin de fermentacin aumenta la concentracin de alcohol y entonces la seal que indica el refractmetro al medir las muestras son una mezcla entre lo que lee por azcares y por alcohol. Como se puede observar de los grficos, de la curva que representa la evolucin de la concentracin de sacarosa conforme avanza el tiempo se puede obtener los siguientes resultados. La concentracin de azcares disminuye conforme avanza la reaccin. Hecho lgico, si se tiene en cuenta que los microorganismos se alimentan de los nutrientes para desarrollar sus funciones vitales y actividad catalizadora. Esta disminucin es ms rpida los primeros das. En el momento inicial, las levaduras se encuentran en su fase de crecimiento exponencial, pasado 48 h, stas llegan a un crecimiento estacionario. Y a partir de las 72 horas, comienzan a degenerar. A partir del tercer da esta concentracin se estabiliza llegando a su mnimo. Debido a errores de medida, como el uso del refractmetro, la concentracin de alcohol aumenta la concentracin total medida. Si se tuviese un cromatgrafo de lquidos calibrado para este caso a estudio, se podra ver cmo disminuye la concentracin de azcares respecto del tiempo, y tambin se podra comprobar la influencia del alcohol en el medio para el desarrollo de los microorganismos. A partir de una determinada concentracin de alcohol, para un tiempo aproximado de 72 horas y una cierta cantidad de nutrientes, el proceso de reaccin se estanca y se paraliza, haciendo que las levaduras lleguen a un estado estacionario y partiendo de ste, entren en la fase degenerativa. Cuando el medio se hace hostil, los seres microscpicos dejan de realizar correctamente sus funciones vitales, y la actividad de tales seres se ve en decremento. El alcohol y la escasez de nutrientes hacen disminuir la actividad de las levaduras. Esto se da cuando el proceso es avanzado, a partir de las 72 h. Existen factores que hacen disminuir el rendimiento del proceso, como por ejemplo la existencia de microorganismos ajenos, que luchan por el sustrato compitiendo con nuestros microorganismos de inters. Tambin las impurezas causan el mismo efecto. Al coexistir diversas especies de microorganismos, compiten de forma feroz por el alimento, as que esto repercute directamente sobre el rendimiento del consumo de nutrientes.
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Captulo 5
Es decir, cuando los nutrientes que se consumen no se utilizan para sintetizar etanol o para el desarrollo de las Saccharomyces, entonces se est perdiendo eficacia, y por ello se reduce el rendimiento. Se demuestra la contaminacin a travs del filtrado de la fase densa.
2. Evolucin del pH conforme avanza el proceso El pH es un factor que se ha ido controlando a lo largo del desarrollo de la reaccin. ste tiende a bajar con el paso del tiempo pero al ir controlndolo mediante la adicin de cido clorhdrico o hidrxido sdico, llega a estabilizarse ms o menos bien. Con esto se quiere decir, que la evolucin de pH representada est condicionada por la cantidad de cidos y bases aadidas. El pH es un parmetro crucial ya que con l se crea un medio hostil para un gran abanico de microorganismos que haran disminuir de forma considerable el proceso. Y sin embargo permitira vivir a los hongos que estn habituados a medios cidos. La introduccin de aire hace aumentar el pH a la vez que lo estabiliza, ya que en experimentos donde no se ha introducido aire, el pH vara de forma ms evidente y tiende a valores ms cidos. El hecho de que el aire basifique el medio puede explicarse por el dixido de carbono producido por el paso del aire a travs del sustrato. La aireacin provoca la formacin de espumas, en el caso a estudio, esta proliferacin de espumas no es considerable, por ello no se ha adicionado antiespumantes. En la fase experimental se hicieron varias pruebas que ponan de manifiesto el efecto producido por el aire. Con el objetivo de observar la influencia del aire en el proceso, se han hecho diferentes experimentos donde se ha introducido en fases diferentes y se ha obtenido resultados distintos. En otros casos se ha evitado la introduccin de aire. En los experimentos 1, 3 y 4 se ha introducido un caudal de aire en la primera fase del proceso de fermentacin. Este hecho tiene consecuencias beneficiosas y tambin perjudiciales. Al introducir aire en las primeras horas, promueve el desarrollo del crecimiento de las levaduras, as se proliferan antes y aprovechan las ptimas condiciones del sustrato. Ya que es en los primeros instantes cuando los nutrientes se encuentran en exceso. Pero el aire tambin hace aumentar el pH, adems de introducir microorganismos que vengan arrastrados por l. Si consideramos que se ha utilizado una corriente de aire de alta calidad, como es el caso, slo habra que tener en cuenta, que como consecuencia de hacer tender al sustrato a su neutralizacin esto puede originar una contaminacin del medio ya que ste ha pasado de ser hostil a ser ideal para microorganismos extraos al proceso. Como conclusin se podra decir que el efecto de la proliferacin de levaduras causada por la aireacin prematura es contrarrestado por el aumento del crecimiento de microorganismos contaminantes, que compiten por los nutrientes existentes con las levaduras encargadas de la fermentacin, generndose as subproductos sin inters industrial. Como se puede observar, la cantidad de microorganismos obtenidos de la filtracin del producto ms denso resultante del proceso, es bastante mayor que la obtenida para los experimentos en los cuales no se ha introducido aire, o se ha hecho pero en una fase ms avanzada.
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En el experimento 5 y 5 no se ha dado la aireacin del sustrato, y se demuestra que la cantidad de depsitos recogidos de tal caso es mucho menor que para los dems experimentos. La masa filtrada es del orden de 4 veces menos que la media general de todos los casos. Adems, el aspecto de este filtrado es de un color ms claro. Esto indica que la cantidad de levaduras es mayor, ya que stas dan este color marrn claro, mientras que impurezas, subproductos slidos de reaccin y otros microorganismos extraos oscurecen la produccin de levadura convirtiendo el depsito slido en marrn oscuro con tintes rojizos. En este proceso se evit la introduccin de aire para prevenir la contaminacin e infeccin. Adems tambin se quera probar que las condiciones microanaerbicas son beneficiosas para la produccin de etanol. Y esto se comprueba en el rendimiento global del proceso para el experimento 5. Es el mayor de todos. Esto se puede deber a varios acontecimientos. Condiciones microanaerbicas. La Saccharomyces Cerevisiae se desarrolla muy bien en tales medios y emplea mayor energa en la produccin de alcohol que en su desarrollo propio. Una temperatura ptima. Los 35C han hecho desarrollarse adecuadamente a las levaduras. Mnima contaminacin. Al no introducir aire, las condiciones de esterilizacin marcadas al inicio se han mantenido durante todo el proceso y as se ha reducido el riesgo de contaminacin por parte de microorganismos extraos a la fermentacin. Operacin en semicontinuo. El experimento 5 deriva del 5. Es decir, durante 72 horas se trabaj en discontinuo, con una concentracin inicial de azcares del 20,5%. Al cabo de este tiempo, cuando la concentracin de sacarosa haba bajado enormemente, se introdujo sustrato fresco en el reactor, y as se mejor las condiciones nutritivas del medio, propiciando el aumento del rendimiento. Concentracin inicial de sacarosa ptima, del 20,5%.
En este caso, se puede observar que la evolucin del pH es ms inestable, y as se demuestra, que el aire lo estabiliza. Adems tambin se ve en la curva de pH frente al tiempo, que el pH baja ms que en los dems experimentos, ya que como se dijo, el aire tiende a neutralizar el medio. En el experimento 2 la aireacin se ha realizado en dos fases del proceso, en la inicial y en la avanzada. Esto se dio as porque en este caso se us microorganismos reciclados, es decir, que ya haban sido usados en un experimento anterior. Por ello su actividad se vea reducida, el aumento en horas de la aireacin respecto de los dems casos se debe a que as se ayudaba a acelerar el crecimiento de las levaduras, y con l, la actividad de tales microorganismos.
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3. Rendimiento En este estudio, se trata de obtener la mxima cantidad de etanol posible. Al realizarse diferentes experimentos con diversas condiciones de operacin, se pueden observar cuales benefician la proliferacin de clulas y las que propician la fabricacin de alcohol. Atendiendo a las tablas del punto 2.8 se puede ver que cuando las condiciones de proceso benefician el desarrollo del crecimiento de los microorganismos, estas mismas condiciones no son buenas para la produccin de etanol, y viceversa. Por eso, existen diferentes definiciones de rendimiento, las que se refieren al producto formado segn el sustrato consumido, las que se refieren al crecimiento celular respecto al sustrato consumido y otras ms.
2.10 Incidencias, errores, hiptesis aplicadas Los errores ms significativos cometidos en el desarrollo experimental estn relacionados con las condiciones precarias de esterilizacin en las que se ha dado el proceso. Adems del material de medida utilizado. Con esto se quiere decir que se ha producido una contaminacin inevitable, ya que se careca de medios para realizar las tareas de de laboratorio exentas de microorganismos extraos al proceso. Se ha de tener en cuenta que la acidificacin del sustrato y la propia produccin de alcohol a medida que avanzaba el proceso ha reducido la contaminacin. De todas formas el rendimiento global disminuye por estas razones y tambin por la operacin de separacin. La altura de la columna y su sencillez hacen reducir el rendimiento de tal operacin. El clculo de la cintica de la reaccin para el sustrato, el producto y la biomasa se hace imposible a causa de no tener el material necesario para realizar un seguimiento continuo de las variables tales como la concentracin de cada sustancia. Respecto a las hiptesis se considera que la concentracin inicial medida en el refractmetro del sustrato se refiere absolutamente a la cantidad de sacarosa, es decir, que inicialmente en el sustrato no hay alcohol. Y esto se puede demostrar viendo la tabla correspondiente a la operacin de destilado. El experimento nmero 0 se refiere a la destilacin de sustrato fresco. Y se puede comprobar que el volumen inicial de alcohol es muy bajo. Tambin se supondr que la masa obtenida de la filtracin corresponde a la levadura formada, considerando que la contaminacin producida es contrarrestada por el efecto del alcohol y un pH bajo. Esto se usar para los balances de materia. En el esquema 1 est representado el diseo de la operacin en la laboratorio.
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Fig.1 Melaza sin diluir

Fig. 2 Dilucin de la melaza en agua caliente

Fig. 3 Homogenizacin de la mezcla Proyecto Fin de carrera Fase Experimental Pgina 3

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% v/v 45 - 52 15 -20 8-12 20-22 9-10 2-3

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Fig. 5 Fase de esterilizacin y siembra en atmsfera reductora.

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Fig. 6 Fase de siembra y repiques peridicos.

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Fig. 7 Reactor y bao trmico.

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Fig. 8 Formacin de espumas causada por la aireacin.

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Fig. 9 Reactor de mezcla perfecta con aireacin

Fig. 10 Reactor de mezcla perfecta sin aireacin.

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Grficos Evolucin del parmetro Cs frente al tiempo

Evolucin del pH frente al tiempo

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