EVOLUO E EXPRESSO DE HOMLOGOS DA DECREASE IN DNA

METHYLATION 1 EM ARROZ E SOJA APONTAM PARA IMPORTANCIA NO

DESENVOLVIMENTO VEGETAL
NAT MACHADO1; RAILSON SCHREINERT DOS SANTOS2; LUIS WILLIAN
PACHECO ARGE3; DANIEL DA ROSA FARIAS4; GLACY JAQUELINE DA
SILVA5; ANTONIO COSA DE OLIVEIRA6
1

Universidade Federal de Pelotas - CDTec natamachado@live.com;

Universidade Federal de Pelotas CDTec/FAEM rschsan@hotmail.com;
3
Universidade Federal de Pelotas - FAEM l.willianpacheco@yahoo.com.br;
4
Universidade Federal de Pelotas - FAEM fariasdr@gmail.com;
5
Universidade Federal de Pelotas - CDTec glacy.jaqueline@gmail.com;
6
Universidade Federal de Pelotas CDTec/FAEM acostol@cgfufpel.org.
2

1. INTRODUO
Metilao do DNA comumente discutida em eucariotos um processo
bioqumico que envolve a adio de um grupo metil no 5 carbono das citosinas
(Phillips, 2008). A metilao do DNA pode alterar a expresso gnica de forma
estvel ao longo de divises celulares.
A metilao do DNA de plantas diferente de mamferos, pois enquanto a
metilao do DNA em mamferos ocorre principalmente no nucleotdeo citosina
em stios CpG, em plantas a citosina pode ser metilada em stios CpG, CpHpG, e
CpHpH, onde H representa qualquer nucleotdeo, exceto guanina. As principais
metiltransferases de DNA de Arabidopsis, que promovem a ligao covalente de
os grupos metil no DNA, so DRM2, MET1 e CMT3 (SAZE et al., 2012).
O Methyl-CpG-binding domain (MBD) um domnio de ligao a DNA
metilado. Protenas com MBDs podem se ligar ao DNA e recrutar modificadores
da cromatina, sendo comumente relacionadas a represso da transcrio gnica.
A protena DECREASE IN DNA METHYLATION 1 (DDM1) de Arabdopsis
um dos reguladores epigenticos que so necessrios para manuteno da
metilao de citosinas no DNA genmico.
A expresso transiente de DDM1 fundido a GFP mostrou que stios DDM1
partilha de stios comuns com protenas AtMBD. ZEMACH et al. (2005). sugerem
que a localizao subnuclear de AtMBD no dependente apenas da metilao
CpG; DDM1 pode facilitar a localizao de AtMBDs em domnios nucleares
especficos. Juntamente com a small-RNA-directed DNA methylation (RdDM) a
DDM1 medeia quase toda a metilao de transposons e auxilia na regulao da
metilao e expresso gnica (ZEMACH et al., 2013).
Embora a metilao da citosina possa afetar vrios aspectos do
crescimento e desenvolvimento das plantas, incluindo aqueles com importncia
agrcola, ortlogos de DDM1 em outras plantas, alm de Arabidopsis, no foram
estudados em detalhe. Por isso Higo et al. (2012) identificaram dois genes DDMlike em arroz (LOC_Os09g27060 e LOC_Os03g51230), os quais possuem alta
similaridade com DDM1 Arabidopsis.
Ambos homlogos de DDM1 de arroz so transcritos durante o
desenvolvimento do vegetal e linhagens transgnicas de arroz silenciando o
OsDDM1a (LOC_Os09g27060) apresentaram hipometilao do DNA genmico.
Nessas linhas, sequncias repetidas foram mais severamente afetadas do que
sequncias de cpia nica, como ocorre nos mutantes ddm1 de Arabidopsis,
assim aumentando a atividade de transposons (HIGO et al., 2012).
Considerando-se a importncia dos genes DDM1 e homlogos, neste
trabalho procurou-se identificar genes codificadores de protenas DDM1-like em

soja (Glycine max L. Merrill.), arroz (Oryza sativa L.) e em Physcomitrella patens
(Hedw.) Bruch & Schimp. (brifita). Dados de expresso transcricional e a
similaridade entre promotores tambm foram analisados, buscando fornecer
informaes iniciais para estudo destes genes.
2. METODOLOGIA
Utilizou-se a ferramenta BLASTp + (Altschul et al., 1990) do National Center
for Biotechnology Information (NCBI), em sistema Linux, para encontrar
sequncias similares (> 50% de identidade) a DDM1 de Arabidopsis (Query:
AT5G66750) nos bancos de protenas preditas de soja, arroz e P. patens. As
sequencias obtidas para soja e arroz foram buscadas no banco de dados do
Genevestigator (HRUZ et al., 2008) para encontrar dados de expresso
transcricional destes genes ao longo do desenvolvimento e em diferentes rgos
da planta. As sequencias de aminocidos e as regies promotoras dos genes (1000pbs) foram alinhadas pelo ClustalW2 (LARKIN et al., 2007), utilizando a
matriz PAM (Dayhoff) para protenas e IUB para nucleotdeos. As topologias das
rvores filogenticas foram definidas com o uso do programa Mr.Bayes v.3.2.2
(HUELSENBECK; RONQUIST, 2001), utilizando a sequncia de P. patens
(brifita) como outgroup, e as figuras foram geradas com o programa FigTree
v.1.3.1 (http://tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree/). A busca por motivos
conservados nas regies promotoras foi feita atravs do MEME sute (TIMOTHY
et al., 2009), utilizando as condies padro. Buscou-se ainda encontrar ilhas
CpG nos promotores destes genes atravs do PlantPAN (CHANG et al., 2008).
3. RESULTADOS E DISCUSSO
Os genes identificados nas bases de protenas preditas de soja, arroz e P.
patens so mostrados na Tabela 1, juntamente com o nome genrico utilizado
neste estudo.
Tabela 1 Genes identificados nos bancos de protenas preditas de P. patens, soja e arroz, a partir
do BLAST utilizando a DDM1 de Arabdopsis como query.
Nome Genrico
Nmero de Acesso
% de identidade com DDM 1
Gm_DDM1
Glyma01g38150.1
69
Gm_DDM2
Glyma11g07220.1
68
Os_DDM1
LOC_Os09g27060.1
65
Os_DDM2
LOC_Os03g51230.1
54
Os_DDM3
LOC_Os04g59624.1
53
Pp_DDM1
XP_001763998.1
56

Dois destes homlogos (LOC_Os09g27060 e LOC_Os03g51230) j

haviam sido identificados tambm em trabalho anterior (HIGO et al., 2012). A
rvore filogentica obtida a partir do alinhamento das protenas preditas, e
possivelmente homlogas a DDM1 apresentada na Figura 1.

Figura 1 rvore filogentica obtida a partir do alinhamento de aminocidos dos genes em estudo.

A figura demonstra maior similaridade entre as Os_DDM1 e Os_DDM2 com

as Gm_DDM1 e GmDDM2. Com base na utilizao de P. patens como ancestral
(Victoria et al., 2012), tais genes devem ter possudo um ancestral comum antes
da divergncia entre mono e dicotiledneas, tendo sofrido duplicao posterior.
O perfil de expresso transcricional dos genes de soja e do Os_DDM1 de
arroz ao longo do desenvolvimento da cultura so exibidos na Figura 2.

Figura 2 Expresso transcricional dos genes em estudos em diferentes estdios de

desenvolvimento da soja e do arroz.

Todos os genes demonstram aumento de expresso nas fases iniciais e na

transio para a florao, denotando uma provvel importncia destes genes
nestas fases de desenvolvimento.
Para estudar a relao de similaridade entre os perfis de expresso desses
genes as suas sequncias promotoras tambm foram alinhadas, formando outra
rvore filogentica (dados no exibidos), tambm demonstram maior similaridade
entre os genes Os_DDM1, Os_DDM2, Gm_DDM1 e GmDDM2; separando o
Os_DDM3 dos demais.
A similaridade de expresso entre os genes mais parecidos entre si pode ser
um indicativo de que estes ainda esto em processo de neofuncionalizao,
possivelmente ainda tendo funes redundantes ou sendo pseudogenes.
Entretanto maiores estudos ainda so necessrios.
Anlises da presena de motivos conservados nas regies promotoras
destes genes tambm foram feitas (dados no exibidos), demonstrando regies
bem conservadas principalmente na regio proximal dos dois genes de soja, os
quais tm expresso bem similar.
A procura por ilhas CpG/CpNpG em genes DDM1-like aqui estudados
demonstram (dados no exibidos) resultou na deteco de somente uma ilha na
Pp_DDM1, demonstrando uma possvel perda de regulao por metilao nestes
genes ao longo da evoluo.
4. CONCLUSES
Putativos homlogos de DDM1 foram encontrados em nmero semelhante
nos bancos de dados de protenas preditas de arroz e soja.
Anlise em bancos de dados pblicos de microarranjo demonstram aumento
da expresso transcricional de trs dos genes em estudo nas fases iniciais de
desenvolvimento, bem como na transio para a florao.
Os genes Os_DDM1/Os_DDM2 e Gm_DDM1/GmDDM2 se agrupam,
indicando que provavelmente um nico ancestral existia antes da divergncia
entre mono e dicotiledneas, mas ambos devem ter sofrido duplicao posterior.
A similaridade encontrada nas sequncias de aminocidos dos genes em
estudo foi parecida quando se analisando a regio promotora dos genes.
A anlise de ilhas CpG/CpNpG nas regies promotoras dos genes em
estudo demonstra a perda destas ao longo da evoluo evoluo vegetal para
genes DDM1-like.

5. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
Altschul, S.F., Gish, W., Miller, W., Myers, E.W. & Lipman, D.J. (1990)
"Basic local alignment search tool." J. Mol. Biol. 215:403-410
Higo H, Tahir M, Takashima K, Miura A, Watanabe K, Tagiri A, Ugaki M,
Ishikawa R, Eiguchi M, Kurata N, Sasaki T, Richards E, Takano M, Kishimoto N,
Kakutani T, Habu Y.DDM1 (decrease in DNA methylation) genes in rice (Oryza
sativa). Mol Genet Genomics. 2012 Oct;287(10):785-92. Epub 2012 Aug 24
Hruz T, Laule O, Szabo G, Wessendorp F, Bleuler S, Oertle L, Widmayer P,
Gruissem W, Zimmermann P. Genevestigator v3: a reference expression
database for the meta-analysis of transcriptomes. Adv Bioinformatics.
2008;2008:420747. doi: 10.1155/2008/420747. Epub 2008 Jul 8.
Zemach A, Li Y, Wayburn B, Ben-Meir H, Kiss V, Avivi Y, Kalchenko V,
Jacobsen SE, Grafi G. DDM1 binds Arabidopsis methyl-CpG binding domain
proteins and affects their subnuclear localization. Plant Cell. 2005 May;17(5):154958. Epub 2005 Apr 1.
Zemach A, Kim MY, Hsieh PH, Coleman-Derr D, Eshed-Williams L, Thao K,
Harmer SL, Zilberman D. The Arabidopsis nucleosome remodeler DDM1 allows
DNA methyltransferases to access H1-containing heterochromatin. Cell. 2013 Mar
28;153(1):193-205. doi: 10.1016/j.cell.2013.02.033.
W.C. Chang, T.Y. Lee, H.D. Huang*, H.Y. Huang and R.L. Pan*. (2008)
"PlantPAN: Plant Promoter Analysis Navigator, for identifying combinatorial cisregulatory elements with distance constraint in plant gene group", BMC Genomics,
9:561.
Timothy L. Bailey, Mikael Bodn, Fabian A. Buske, Martin Frith, Charles E.
Grant, Luca Clementi, Jingyuan Ren, Wilfred W. Li, William S. Noble, "MEME
SUITE: tools for motif discovery and searching", Nucleic Acids Research,
37:W202-W208, 2009.
Huelsenbeck, J. P. and F. Ronquist. 2001. MRBAYES: Bayesian inference
of phylogeny. Bioinformatics 17:754-755.
Bioinformatics. 2007 Nov 1;23(21):2947-8. Epub 2007 Sep 10. Clustal W
and Clustal X version 2.0. Larkin MA, Blackshields G, Brown NP, Chenna R,
McGettigan PA, McWilliam H, Valentin F, Wallace IM, Wilm A, Lopez R,
Thompson JD, Gibson TJ, Higgins DG.
Saze H, Tsugane K, Kanno T, Nishimura T. DNA methylation in plants:
relationship to small RNAs and histone modifications, and functions in transposon
inactivation. Plant Cell Physiol. 2012 May;53(5):766-84. doi: 10.1093/pcp/pcs008.
Epub 2012 Feb 1.
The Role of Methylation in Gene Expression By: Theresa Phillips, Ph.D.
(Write Science Right) 2008 Nature Education Citation: Phillips, T. (2008) The
role of methylation in gene expression. Nature Education 1(1)
Genome. 2012 Dec;55(12):883-900. doi: 10.1139/gen-2012-0064. Epub
2012 Nov 1. Phylogenetic relationships and selective pressure on gene families
related to iron homeostasis in land plants. Victoria Fde C, Bervald CM, da Maia
LC, de Sousa RO, Panaud O, de Oliveira AC.