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ESTUDO HISTOLGICO DA REGENERAO ESPLNICA DE RATOS SUBMETIDOS A ESPLENECTOMIA SUBTOTAL1

Orlando Jorge Martins Torres2 Eliane Lopes Macedo3 rica Regina Gomes Picciani3 Paulo Mrcio Sousa Nunes3 Jeannie Valria Gonalves Costa3 Anamada Barros Carvalho3 Pedro de Sousa Lobato Junior3 __________________________________________________________________________________________________________ Torres OJM, Macedo EL, Picciani ERG, Nunes PMS, Costa JVG, Carvalho AB, Lobato Jr PS. Estudo histolgico da regenerao esplnica de ratos submetidos a esplenectomia subtotal. Acta Cir Bras [serial online] 2000 Apr-Jun;15(2). Available from: URL: http://www.scielo.br/acb. RESUMO: Um aumento da susceptibilidade infeco severa uma complicao reconhecida da esplenectomia. Um grande nmero de alternativas tem sido propostas que poderiam impedir esta complicao do estado asplnico. O presente estudo analisa a regenerao histolgica do tecido esplnico em ratos submetidos a esplenectomia subtotal. Foram utilizados trinta ratos machos da linhagem Wistar, adultos, pesando entre 160 e 210g. Os animais foram submetidos a esplenectomia subtotal e divididos em trs grupos contendo dez ratos cada onde foram estudados aps 15, 30 e 45 dias. Aps este perodo de observao o tecido esplnico foi recuperado e submetido a exame histolgico. A estrutura tecidual esplnica no 15 dia se apresentava irregular, porm sem necrose. Aps 30 dias, a cpsula se apresentava histologicamente espessada e com maior desenvolvimento. Em 45 dias foi observado semelhana considervel entre o tecido esplnico remanescente e o bao normal. O presente estudo mostra que o bao submetido a esplenectomia subtotal se regenera completamente em um perodo de 45 dias. DESCRITORES: Histologia. Regenerao. Bao. __________________________________________________________________________________________________________

INTRODUO Como parte do sistema retculo-endotelial, o bao, apresenta papel importante nas defesas do organismo, atravs dos mecanismos de filtrao, fagocitose e sntese de fatores de complemento e imunoglobulinas, principalmente IgM.3,22,30 O papel do bao no sistema imunolgico tem sido objeto de muitos estudos clnicos e experimentais uma vez que

um dos mais importantes rgos envolvidos nas defesas contra microorganismos. Atravs de sua rede de folculos linfides circulam vrias clulas do sistema imunolgico.3,25,28 O bao tem sido um desafio para os pesquisadores, foi considerado por muito tempo um rgo misterioso e sem funo e, portanto, sua remoo cirrgica devido a trauma ou outras doenas, no provocaria dano maior ao paciente.8,23

___________________ 1. Trabalho realizado no Departamento de Cirurgia, Disciplina de Clnica Cirrgica III da Universidade Federal do Maranho (UFMA). 2.Professor Adjunto-Doutor, Coordenador da Disciplina de Clnica Cirrgica III (UFMA). Pesquisador 2C CNPq. 3. Estudantes de Medicina - UFMA; Bolsista do PIBIC-CNPq-UFMA.

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Os estudos de MORRIS e BULLOCK, em 1919, mostraram que a ausncia do bao estaria associada com o aumento da susceptibilidade a infeco.14 Ainda assim, a esplenectomia total continuou sendo amplamente utilizada como tratamento de escolha para trauma e distrbios hematolgicos. Em 1952, KING e SHUMACKER, demonstraram cinco casos de crianas com diagnstico estabelecido de anemia hemoltica congnita que foram submetidas a esplenectomia total. Estes pacientes evoluram com meningite infecciosa grave, ocorrendo dois bitos.12 Isto tambm tem sido observado em esplenectomizados por trauma.3,22,23 Desde ento, o risco de infeco fulminante ps-esplenectomia tem sido reconhecido, ocorrendo tanto em crianas quanto em adultos, principalmente nos dois primeiros anos aps a cirurgia.13,21 A incidncia de infeco grave aps a esplenectomia por trauma (0,5 a 1,0%) 58 vezes maior que na populao normal e apresenta um ndice de mortalidade de 50 a 80%.12,14,25,29 O comprometimento da funo fagocitria, depresso dos nveis de imunoglobulinas sricas (classe IgM), properdina e linfcitos T, alteraes na atividade do complemento e deficincia de tuftsina tm sido observados nestes pacientes.3,5 A infeco grave ps-esplenectomia se caracteriza por incio sbito, crescimento bacteriano incomum e exuberante, alta incidncia de coagulao intravascular disseminada e morte, ocorrendo dentro de horas do incio dos sintomas e uma mortalidade que atinge 80%. O Streptococcus pneumoniae o microorganismo mais frequentemente isolado nestes processos infecciosos, entretanto, outros germes encapsulados como o Haemophilus influenzae, Neisseria meningitidis e Escherichia coli tm sido observados.3,12,22 Um grande nmero de alternativas, principalmente em pacientes politraumatizados, foram propostas para prevenir as complicaes relacionadas ausncia total do bao. Em crianas, o tratamento no operatrio com controle atravs de exames seriados e tomografia computadorizada, realizando a cirurgia apenas em casos selecionados, tem mostrado resultados animadores.7,13,29 Os mtodos operatrios de preservao esplnica so os preferidos em traumatismos esplnicos tais como a esplenorrafia, aplicao de agentes hemostticos, ligadura da artria esplnica, esplenectomia total associado ao autotransplante esplnico e esplenectomias parciais.2,5,11,13,18,20,24,26,28 Em 1962, CAMPOS CHRISTO introduziu o procedimento da esplenectomia parcial na prtica cirrgica de rotina em nosso meio.6 O propsito da esplenectomia parcial preservar tecido esplnico suficiente para manter a funo de defesa do organismo.

Diversos estudos clnicos e experimentais demonstraram que o ndice de infeco ps-operatria diminui quando pelo menos 25% do rgo est preservado. Um ponto tcnico importante da esplenectomia parcial a qualquer nvel a manuteno do seu pedculo vascular. Isto pode ser realizado inclusive pela simples preservao dos vasos esplenogstricos, que pode apresentar melhor funo fagoctica que o tecido esplnico autotransplantado.1,4,9,10 Existe uma relao entre tecido esplnico e peso corporal, o que faz com que o segmento esplnico remanescente possa crescer e desempenhar a funo imunolgica. Por definio, a massa crtica aquela abaixo da qual no se observa resposta a antgenos.9,10 Apesar do reconhecimento do desenvolvimento do tecido esplnico remanescente, torna-se necessrio avaliar aquela rea regenerada em diferentes fases at atingir o padro histolgico do tecido esplnico normal.28 O presente estudo tem por objetivo verificar o desenvolvimento histolgico do bao de ratos submetidos a esplenectomia subtotal e as fases de regenerao, quando comparados com o tecido esplnico normal. MTODOS Foram utilizados 30 ratos da linhagem Wistar adultos, machos, com peso variando de 160 a 210g, provenientes do Biotrio da Universidade Federal do Maranho (UFMA) e transferidos para o Laboratrio de Pesquisas do Departamento de Fisiologia e Farmacologia do Centro de Cincias da Sade da UFMA. Estes animais foram mantidos em condies ambientais constantes e aclimatizados por um perodo de 15 dias antes de iniciar o experimento, recebendo rao padro para ratos (Purina) e gua ad libitum. Aps jejum de 12 h que antecedeu o experimento, os animais foram submetidos ao procedimento cirrgico, realizado sob condies de limpeza. Foram anestesiados por via inalatria com ter sulfrico comercial, com ventilao espontnea, pesados e imobilizados em decbito dorsal horizontal com ligas elsticas; realizada a tricotomia na regio ventral do abdmen e a anti-sepsia feita com soluo tintura de polivinilpirrolidona-iodo (Povidine tintura). Durante o procedimento cirrgico, inicialmente foi realizada uma inciso mediana de aproximadamente trs cm de extenso, inventrio da cavidade abdominal para verificar a presena de baos acessrios, exposio do hipocndrio esquerdo com rebatimento do estmago e bao, luxao parcial deste da cavidade abdominal e proteo com gazes umedecidas com soluo de cloreto de sdio a 0,9%.

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Realizou-se ento a esplenectomia subtotal com retirada de 2/3 superiores do bao , aps isolamento, pinamento e ligadura de parte do pedculo esplnico com fio de algodo 4.0 (figura 1). O seguimento retirado foi em seguida pesado, depositado em frascos individuais contendo soluo de formalina tamponada a 10% e enviado para estudo histolgico a fim de se definir as caractersticas do tecido esplnico normal. Houve posteriormente hemostasia e reposio do bao remanescente e estmago na cavidade abdominal, sntese da parede abdominal em 2 planos de sutura com fio mononylon 4.0 .

Avaliamos o grau de desenvolvimento da rea de regenerao esplnica de todos os elementos do estudo histolgico com os seguintes valores: 0 (ausente), 1 (discreto), 2 (moderado) e 3 (importante). Este ltimo semelhante ao tecido esplnico normal.

Aps o procedimento comum, os ratos foram divididos em 3 grupos, contendo 10 animais cada, denominados de grupos I, II e III e avaliados respectivamente no 15, 30 e 45 dia aps a esplenectomia. O procedimento de avaliao constou de laparotomia mediana xifopbica e inventrio da cavidade abdominal ; posteriormente os ratos foram sacrificados por intoxicao anestsica com ter sulfrico comercial para recuperao do tecido esplnico remanescente e colocao deste em frascos individuais contendo soluo de formalina tamponada a 10 % para ser submetido a estudo histolgico (figura 2). O preparo histolgico consistiu em desidratao com lcool etlico em concentraes progressivas de 70 a 100%, diafanizao em xilol, impregnao por parafina a 58C e incluso nesta para formao do bloco. Aps este procedimento, realizou-se cortes do bloco de parafina de 4 a 6m de espessura, os quais foram colocados sobre lminas de vidro e corados com hematoxilina - eosina. O exame histolgico foi realizado utilizando - se microscpio ptico e os parmetros avaliados foram: cpsula esplnica, polpa branca (folculos linfides e seus componentes), polpa vermelha, estrutura tecidual esplnica, vascularizao, linfcitos, plasmcitos e macrfagos.

RESULTADOS Durante o perodo de observao no ocorreram bitos ou complicaes entre os animais submetidos a esplenectomia parcial. No inventrio da cavidade abdominal, aps o sacrifcio dos animais, observamos poucas aderncias intraperitoneais e ausncias de hematomas ou abscessos. O remanescente esplnico de cada grupo foi facilmente identificado e recuperado em todos os animais. O tecido esplnico controle era do tipo reticular, com clulas reticulares, linfcitos e macrfagos, com uma cpsula fibroelstica com trabculas que se dirigiam para a regio central. Entre a cpsula e as trabculas observou-se tecido pouco consistente e com pouca quantidade de vasos sangneos, identificados como polpa branca e vermelha. A polpa branca estava constituda por sinusides, que formavam um extenso plexo de espaos sangneos irregulares e com dilataes. Entre os sinusides estavam os cordes da polpa (Cordes de Billroth). Na polpa branca, notou - se a presena de folculos linfides e arterolas centrolobulares, ramos das artrias trabeculares que se apresentam no s excntricas em relao ao folculo ao qual atravessava, mas tambm envolvidos por um manto linftico constitudo por uma rede de clulas reticulares e por um arcabouo de fibras reticulares com numerosos linfcitos. Foram observados linfcitos em fases distintas de diferenciao, macrfagos e plasmcitos dando origem ao centro germinativo. A zona marginal era constituda predominantemente por linfcitos pequenos e clulas reticulares.

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GRUPO I Macroscopicamente foram encontradas aderncias entre o fgado, estmago, omento, parede abdominal e bao, observando se tambm tecido de granulao. O peso mdio do tecido esplnico recuperado foi de 0,454g. Histologicamente observamos rarefao do tecido linfide, com predomnio de macrfagos e grande quantidade de pigmentos de hemossiderina. A estrutura tecidual apresentou-se irregular. A polpa vermelha apresentava-se hiperplsica, sem proliferao fibroblstica na cpsula e sem presena de necrose (figura 3).

GRUPO III Observamos ao inventrio da cavidade abdominal poucas aderncias entre o bao e outras estruturas da cavidade abdominal, particularmente o estmago. O remanescente esplnico recuperado apresentou peso mdio de 0,505g. Neste grupo, do ponto de vista histolgico, observamos que a superfcie tecidual estava coberta por clulas mesoteliais e com fina cpsula de tecido fibroelstico. A polpa branca consistiu de pequenos folculos linfides, centro germinativo em atividade, bainhas linfides periarteriais e zona marginal bem diferenciada. Na cpsula esplnica foi observada pequena proliferao fibroblstica. A polpa vermelha tambm se apresentava bem diferenciada. Neste grupo, observamos, na rea de regenerao grande semelhana ao tecido esplnico normal (figura 5).

GRUPO II Foram encontrados aderncias na parede abdominal, entre o bao e o estmago e tecido de granulao na ferida operatria. O peso mdio do tecido esplnico recuperado foi de 0,492g. No estudo microscpico do tecido esplnico recuperado 30 dias aps o procedimento cirrgico, observou-se leve espessamento da cpsula esplnica com focos de proliferao fibroblstica e pouca quantidade de macrfagos. A polpa branca estava mais desenvolvida, com aumento do tecido linfide. A polpa vermelha mostrou-se menos congesta, porm no apresentava padro de desenvolvimento normal (figura 4).

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Ao analisarmos o grau de desenvolvimento da rea de regenerao esplnica observamos no grupo I, grau 0 (zero) de desenvolvimento; grupo II, graus 1 e 2 e no grupo III, grau 3, semelhante ao tecido esplnico normal. DISCUSSO O aumento da susceptibilidade infeco, bem reconhecida em pacientes esplenectomizados tem levado cirurgies pesquisadores a alternativas visando a preservao do rgo. Este ocupa uma posio central na distribuio sangunea circulante, recebendo um volume por minutos prximo a 5%. Alm disto, representa um importante ponto de encontro entre as informaes antignicas transportadas pelo sangue e o sistema imune. Duas grandes funes podem ser reconhecidas que so a capacidade de funcionar como grande filtro fagoctico e a qualidade de rgo produtor de anticorpos. As alteraes de funo esplnica so sugeridas por nveis de imunoglobulinas, principalmente IgM e pela presena de corpsculos sanguneos anormais que expressam hipofuno esplnica.3,12,14,23,27 Entre as alternativas utilizadas para a preservao da funo esplnica est a esplenectomia subtotal, onde 25 a 30% de tecido esplnico deve permanecer no local.18,19 Apesar da esplenectomia segmentar ter sido discutida desde o sculo passado, somente aps os relatos de CAMPOS CHRISTO (1962), este procedimento foi introduzido na prtica cirrgica em nosso meio. A manuteno do bao permite que este mantenha sua capacidade de preservar a funo imunolgica e de filtro fagocitrio.6,15,16,17,19 O rato, utilizado no presente estudo de fcil manipulao, favorece a tcnica cirrgica de esplenectomia subtotal por sua disposio anatmica e pode ser realizado seguimento ps-operatrio com baixo custo. A escolha foi baseada em outros estudos prvios de investigao em mamferos. Aqueles estudos apontam o rato como sendo adequado para a investigao da vascularizao esplnica e apresentam o bao proporcionalmente maior que outras espcies. Os vasos esplnicos e suas reas correspondentes de desvascularizao so facilmente identificadas nessa espcie.4,10,28 Apesar da morfologia particular de cada espcie, os aspectos microscpicos do tecido e o padro vascular no so diferentes de humanos. Estes dados so teis para ser utilizado em condutas conservadoras do bao. A seco e ligaduras vasculares correspondem ao segmento esplnico que deve ser retirado. Por outro lado a retirada da rea desvascularizada prudente a fim de evitar o desenvolvimento de necrose e / ou abscessos. A tcnica operatria da esplenectomia subtotal em ratos, retirando-se os 2/3 superiores do bao mantendo a vascularizao apenas pelo pedculo inferior demonstra uma segmentao vascular esplnica bem

definida.17,18,20 O fato de no ter sido observado infeco, abscessos ou necrose do remanescente esplnico no presente estudo estimula a aplicao prtica deste procedimento. Os tecidos imunolgicos e hematopoticos apresentam caractersticas estruturais e funcionais em comum, por serem, filtros vasculares com rede vascular que armazena clulas sangneas. Outra caracterstica comum destes tecidos a sua capacidade de regenerao completa para atingir a sua relao de funcionalidade, denominada hipertrofia compensatria. As clulas reticulares associadas rede reticular so responsveis por este potencial regenerativo. O clareamento sangneo esplnico devido arquitetura vascular esplnica. O bao capta partculas estranhas atravs de seu mecanismo de rede e os macrfagos podem eventualmente ser fagocitados. A preservao do tecido esplnico importante para evitar a imunodeficincia criada pela esplenectomia, principalmente em crianas.2,23,30 O crescimento tecidual da rea de resseco do segmento esplnico, no estudo, apresenta uma fase de resposta inflamatria cicatricial, seguida de uma fase de regenerao. Esses tecidos sofrem em decorrncia da ausncia da cpsula naquela rea e com a deficincia da resposta fagoctica inicial, entretanto apresenta um retorno precoce a partir do seu remanescente. Este segmento o estmulo inicial e apresenta baixa quantidade de clulas e elementos linfides. Assume uma disposio de crescimento que mantido pela vascularizao segmentar.3,19 O desenvolvimento do tecido esplnico ocorre em ratos, em curto espao de tempo. Em nosso estudo, em 45 dias, foi possvel observar histologicamente uma arquitetura semelhante ao tecido esplnico normal. Este desenvolvimento capaz de promover recuperao da atividade esplnica. Isto tem sido observado experimentalmente na reduo significativa nos ndices de mortalidade por infeco graves.15,19,22,23,24 As fases de regenerao na rea de resseco esplnica, se assemelham histologicamente quelas observadas no autotransplante esplnico, onde temos na avaliao inicial tecido de granulao, clulas fagocticas e desenvolvimento de fibras reticulares, procurando adquirir um padro concntrico. Em seguida h uma proliferao vascular, com artrias e veias procurando constituir o aspecto final da polpa vermelha; a cpsula adquire grau de regenerao com trabculas, clulas plasmticas e fagocitose por macrfagos. Finalmente, aps 45 dias, a estrutura tecidual esplnica adquire aspecto histolgico semelhante ao tecido normal.24,28 A diferena bsica para o autotransplante que h um retardo na capacidade e funo fagoctica do autotransplante e isto representa papel importante na defesa imunolgica no ps-operatrio. Estudos experimentais demonstram que a resistncia infeco maior em animais submetidos a esplenectomia parcial que aqueles com esplenose.19,24

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A observao da eficcia da funo esplnica pode ser evidenciada atravs de avaliao clnica de resposta a agentes infecciosos, laboratorial com o retorno normalidade dos nveis sricos de substncias como opsoninas, tuftsina, plaquetas e imunoglobulinas do tipo IgM, do clareamento da circulao sangnea de substncias como clulas-alvo e corpsculos de Howell-Jolly. Este efeito protetor pode ser observado na capacidade de intensificar a resposta imunolgica do animal de experimentao, quando submetido a infeces respiratrias, abdominais e sistmicas. Estudos clnicos demonstraram a ausncia de complicaes aps esplenectomia subtotal.15,16,19,20 Estudos cintilogrficos tambm tm sido utilizados para avaliar a eficcia de funo esplnica. Esta avaliao baseada em estudos clnicos e experimentais. A imagem cintilogrfica esplnica alcanada aps a captura dos macrfagos com enxofre coloidal marcado com tecncio 99 ( m Tc 99 ). Uma alta concentrao de radioatividade na rea esplnica indica captao de entercitos levados por calor e sugere funo de filtrao. O aumento da imagem no perodo ps-operatrio tardio no deve ser considerado apenas o aumento do contorno do remanescente esplnico, mas um aumento da funo de filtrao.15,16,19 A superfcie de corte do bao o local de maior atividade celular. A proliferao de clulas reticulares ento agrupadas em torno dos seios sangneos entrepassados com vasos tortuosos estreitados contendo corpsculos sangneos. As clulas de cada espao, esto ainda altas e relacionadas s clulas reticulares. Estas estruturas, portanto, parecem ser os seios venosos se originando da proliferao de clulas reticulares. Algumas poucas camadas de fibroblastos ento alinhadas paralelamente ao eixo de superfcie de corte e firmemente aderidas ao omento abdominal e pncreas. A cpsula original que circunda a maioria do remanescente esplnico fina e expande em direo polpa.15,28 O tecido esplnico submetido a esplenectomia subtotal sofre uma hipertrofia compensatria a partir do seu remanescente. Tem sido observado um aumento considervel no seu peso lquido um a dois meses aps o procedimento cirrgico. Isto resultado, em primeiro momento, da proliferao de clulas reticulares seguida pela formao de seios venosos, produo de polpa branca e vermelha, ou mesmo uma limitada hematopoiese. Um processo semelhante observado no curso da hipertrofia e quele do enxerto esplnico. Em ambos os casos, a clula dominante a clula reticular onde podemos observar, leuccitos, linfcitos, clulas plasmticas, corpsculos vermelhos, moncitos

de vrios tipos e endotlio dos srios venosos. A autlise de clulas esplnicas libera substncias termolbeis que estimulam a migrao de leuccitos dos vasos sangneos.17,19 CONCLUSES Aps anlise do presente estudo e avaliao da literatura podemos concluir que: 1. A vascularizao bem definida do bao permite a realizao de esplenectomias segmentares, elemento importante na manuteno da funo imunolgica. 2. A regenerao do bao em ratos evidente, sem complicaes ao exame macroscpico. 3. Histologicamente, o tecido esplnico apresenta padro de regenerao gradual da rea de resseco onde, com o tempo de evoluo, ele passa por fases que vai desde uma reao inflamatria inicial aps 15 dias de seguimento ps-operatrio at atingir as caractersticas semelhantes ao tecido esplnico normal aps 45 dias de evoluo.

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__________________________________________________________________________________________________________ Torres OJM, Macedo EL, Picciani ERG, Nunes PMS, Costa JVG, Carvalho AB, Lobato Jr PS. Histological study of splenic regeneration in rats underwent to subtotal splenectomy. Acta Cir Bras [serial online] 2000 Apr-Jun;15(2). Available from: URL: http://www.scielo.br/acb. SUMMARY: An increase susceptibility to overwhelming infection is now a well-recognized complication of splenectomy. A number of alternatives to splenectomy have been proposed that could possibly prevent this complication of the asplenic state. The present study analize the histological regeneration of the splenic tissue in rats underwent to subtotal splenectomy. Thirty adult male Wistar rats were used, weighing 160 to 210g. The rats were underwent to subtotal splenectomy, divided into three groups of ten rats each, and analized after 15, 30, and 45 days. After this period of time the splenic tissue were withdrawn and submitted to histological examination. The splenic tissue structure on the 15th day was irregular without necrosis. The histological examination on the 30th day, the splenic tissue in the capsule was now with a greater development. After 45th day, an important similarity was observed between the splenic tissue recovered and the normal spleen in all its details. The present study showed that the spleen underwent to subtotal splenectomy regenerat completely in a period of 45 days . SUBJECT HEADINGS: Histology. Regeneration. Spleen __________________________________________________________________________________________________________ Endereo para correspondncia: Dr. Orlando Torres Rua Ipanema, 01 Ed. Luggano Bloco I / 204 So Lus - MA 65076-060 e-mail: o.torres@uol.com.br Data do recebimento: 06/12/1999 Data da reviso: 12/02/2000 Data da aprovao: 04/04/2000

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