UNIVERSIDADE DE SO PAULO FACULDADE DE CINCIAS FARMACUTICAS DE RIBEIRO PRETO DEPARTAMENTO DE CINCIAS FARMACUTICAS

Validao de Mtodos Analticos

Prof Dr Cristiane Masetto de Gaitani crisgai@fcfrp.usp.br

Ribeiro Preto - 2012

CONCEITO A validao deve garantir, atravs de estudos experimentais, que o mtodo atenda s exigncias das aplicaes analticas, assegurando a confiabilidade dos resultados (ANVISA) A validao de mtodos assegura a credibilidade destes durante o uso rotineiro, sendo algumas vezes mencionado como o processo que fornece uma evidncia documentada de que o mtodo realiza aquilo para o qual indicado para fazer (USP)

Validao no Laboratrio 2 Tipos Validao Completa

Estudo Interlaboratorial

METODOLOGIA OFICIAL No Brasil IPT (Instituto de Pesquisas Tecnolgicas)

LEGISLAO
Brasil
ANVISA NMETRO Resoluo ANVISA RE no 899, de 29/05/2003 DOQ-CGCRE-008, de maro/2007

IUPAC
ISO/IEC 17025 General Requirements for the Competence of Testing and Calibration Laboratories, 1999

FDA
Guidance for Industry, Bioanalytical Method Validation, 2001 Guidance for Industry, Analytical Procedures and Methods Validation, 2000

ICH
Validation of Analytical Procedures: Definitions and Terminology, Q2A (CPMP/ICH/381/95), 1995 Validation of Analytical Procedures: Methodology, Q2B (CPMP/ICH/281/95), 1995

European Medicines Agency

Guideline on bioanalytical method validation EMEA/CHMP/EWP/192217/2009, 21 July 2011 Committee for Medicinal Products for Human Use (CHMP)

LEGISLAO
ANVISA - RE n 899, 29/05/03 INMETRO - DOQ-CGCRE-008 03/03

PROCESSO DE VALIDAO
estudos de validao sejam representativos variao da faixa de concentrao adequada tipos de amostras adequados

OS PARMETROS ANALTICOS DEVEM SER BASEADOS NA INTENO DO USO DO MTODO Tipo de anlise Freqncia uso Parmetros a serem analisados

QUANTIFICAO DO COMPOSTO DE INTERESSE

Padronizao externa Padronizao interna Superposio de matriz Adio de padro

Padronizao externa - substncia na amostra

- solues de concentraes conhecidas (padro referncia) - Erros de preparo das amostras - Erros de preparo padro - Erros de leituras

Padronizao externa

Padronizao interna

- soluo-padro de concentrao conhecida - adio de um padro interno (concentrao conhecida)

PADRO INTERNO IDEAL

Padro interno ideal Puro, estvel e no-reativo; Pouco voltil; No deve estar presente na amostra; Completamente resolvido dos demais picos; Deve eluir prximo aos picos de interesse; Propriedades fsico-qumicas semelhantes aos compostos analisados.

Padronizao interna

Superposio de matriz

- adio do padro da substncia em diversas concentraes em uma matriz similar da amostra

- padronizao interna - padronizao externa

compensar o efeito da matriz ou de possveis interferentes matriz pode interferir na pr-concentrao, extrao, separao ou deteco da substncia de interesse melhor correspondncia com a composio da amostra

Superposio de matriz

Electropherograms of human plasma spiked with 1.00 mg/mL of IMAT and 1.25 mg/mL of LID (IS) (A) and human blank plasma (B). (1) IMAT and (2) LID (IS). Electrophoretic conditions: uncoated fused-silica capillary, 46.5 cm total length, 38.0 cm effective length, 50 mm id, 30 kV of voltage, 351C capillary temperature, detection at 200 nm, hydrodynamic injection at a pressure of 50 mbar for 20 s.

Ajimura et al., Electrophoresis 2011, 32, 18851892

Adio de padro
-adio de diferentes concentraes do analito matriz, que j contm uma quantidade desconhecida do mesmo -a concentrao do analito na matriz biolgica determinada pela extrapolao da reta, definida pelas demais concentraes analisadas

Parmetros analticos para validao de mtodos

SELETIVIDADE
Capacidade de avaliar, de forma inequvoca, a substncia de interesse na presena de componentes que possam interferir na anlise.
Comparar matriz isenta da substncia de interesse e matriz + padro Uso de detectores que comparam o pico obtido na separao com o de um padro (arranjo de diodos, espectrmetro de massas) Mtodo da adio de um padro Coleta do composto de interesse e posterior anlise com mtodos ou tcnicas especficas

Parmetros analticos para validao de mtodos

SELETIVIDADE

A - Branco de plasma B Plasma fortificado com o padro

Parmetros analticos para validao de mtodos

SELETIVIDADE

Chemical structures of isradipine (IRD) and impurity D and electropherogram obtained following the analysis of buffer (A); a standard solution containing racemic IRD and IRD impurity D (B)
Aguiar et al., Electrophoresis 2011, 32, 26732682

Parmetros analticos para validao de mtodos

LINEARIDADE Corresponde capacidade do mtodo em fornecer resultados diretamente proporcionais concentrao da substncia em exame, dentro de uma determinada faixa de aplicao.

Regresso linear (r) ANVISA = 0,99 INMETRO = 0,90

Parmetros analticos para validao de mtodos

LINEARIDADE
Calculada pelo mtodo dos mnimos quadrados avaliando o coeficiente de correlao (regresso linear) ICH e ANVISA IUPAC e FDA mnimo 5 concentraes mnimo 6 concentraes
200 180 160 140

(S)-THD 2-SO (FE) (R)-THD 2-SO (FE)

Altura 10 (mm)

120 100 80 60 40 20 0 0

Y = 0,79497 + 0,02321 X r = 0,99783 Y = 0,3988 + 0,0288 r = 0,99818 X

1000

2000

3000

4000

5000

6000
-1

7000

Concentrao plasmtica (ng mL )

Grfico de calibrao para anlise dos enantimeros da THD 2-SO no intervalo de concentraes plasmticas de 25-5000 ng mL-1, referente linearidade

Parmetros analticos para validao de mtodos

LINEARIDADE
O coeficiente de correlao linear (r) freqentemente usado para indicar o quanto pode ser considerada adequada a reta como modelo matemtico Como os desvios da linearidade so muitas vezes difceis de serem detectados visualmente, pode-se verificar a sua adequao por meio do clculo dos resduos entre os valores medidos e os valores calculados a partir da equao de regresso A disperso das medidas (valores de y) deve ser independente da concentrao do padro de calibrao, seguindo uma distribuio normal, propriedade conhecida como homoscedasticidade Homoscedasticidade: igual (homo) disperso (scedasticidade), isto , igual varincia Heteroscedasticidade: forte disperso dos dados em torno de uma reta

Parmetros analticos para validao de mtodos

LINEARIDADE

Parmetros analticos para validao de mtodos

LINEARIDADE Opes Fazer duas curvas analticas com intervalos menores um novo intervalo de trabalho pode ser estabelecido Empregar o modelo de regresso ponderado - maior importncia para dados com baixa varincia e menor importncia para dados com alta varincia

Parmetros analticos para validao de mtodos

LINEARIDADE

Residual plots for linearity of RAC in vitamin mineral complex (A) and in swine feed (B).

Parmetros analticos para validao de mtodos

PRECISO
A preciso de um mtodo analtico est relacionada com a disperso das medidas ao redor do seu valor mdio. - desvio padro absoluto (), n>20 - n geralmente pequeno, e o que se calcula a estimativa do desvio padro absoluto (s).

estimativa do desvio padro relativo ou coeficiente de variao

Parmetros analticos para validao de mtodos

PRECISO

Parmetros analticos para validao de mtodos

PRECISO
A preciso em validao de mtodos considerada em trs nveis diferentes:

Repetibilidade

Preciso intermediria

Reprodutibilidade

Parmetros analticos para validao de mtodos

PRECISO Repetibilidade (preciso intra-corrida)

concordncia entre os resultados de medies sucessivas de um mesmo mtodo, efetuadas sob as mesmas condies de medio (analista, instrumento e condies, local, curto intervalo de tempo)

- ANVISA Mnimo de 9 determinaes (ex: 3 nveis de concentrao, 3 rplicas) ou 6 determinaes de 1 concentrao - INMETRO 7 ou + repeties

Parmetros analticos para validao de mtodos

PRECISO Repetibilidade (preciso intra-corrida)

RAC Nominal concentration (g mL-1) Within-day (na = 3) Analyzed concentration (g mL-1) Day 120.0 1 2 3 1 2 3 1 2 3 121.5 123.0 120.3 1.0 1.1 0.9 100.2 100.8 100.3 120.9 1.0 100.8 VMC 150.0 153.3 151.1 152.2 0.1 2.4 0.1 102.2 100.8 101.5 152.2 1.4 101.5 Swine Feed 12.0 11.7 11.1 11.2 5.4 7.4 6.8 97.9 92.1 93.0 11.3 6.8 94.3

180.0 177.8 178.8 177.1 1.6 2.2 1.6 98.8 99.3 98.4 177.9 1.5 98.8

9.6 9.4 9.0 9.1 3.9 8.6 8.0 97.6 93.8 94.2 9.1 6.9 95.2

14.4 13.8 13.0 13.3 6.3 9.4 13.2 96.1 90.2 92.5 13.4 9.7 92.9

Precision (RSD, %)b

Accuracy (%)

Between-day (n = 3) Analyzed concentration (g mL-1) Precision (RSD, %) b Accuracy (%)

Parmetros analticos para validao de mtodos

PRECISO Preciso intermediria (preciso inter-corridas)

indica o efeito das variaes dentro do laboratrio devido a eventos como diferentes dias ou diferentes analistas ou diferentes equipamentos ou uma combinao destes fatores
RAC Nominal concentration (g mL-1) Within-day (na = 3) Analyzed concentration (g mL-1) Day 120.0 1 2 3 1 2 3 1 2 3 121.5 123.0 120.3 1.0 1.1 0.9 100.2 100.8 100.3 120.9 1.0 100.8 VMC 150.0 153.3 151.1 152.2 0.1 2.4 0.1 102.2 100.8 101.5 152.2 1.4 101.5 180.0 177.8 178.8 177.1 1.6 2.2 1.6 98.8 99.3 98.4 177.9 1.5 98.8 Swine Feed 9.6 12.0 9.4 9.0 9.1 3.9 8.6 8.0 97.6 93.8 94.2 9.1 6.9 95.2 11.7 11.1 11.2 5.4 7.4 6.8 97.9 92.1 93.0 11.3 6.8 94.3 14.4 13.8 13.0 13.3 6.3 9.4 13.2 96.1 90.2 92.5 13.4 9.7 92.9

Precision (RSD, %)b

Accuracy (%)

Between-day (n = 3) Analyzed concentration (g mL-1) Precision (RSD, %) b Accuracy (%)

Parmetros analticos para validao de mtodos

PRECISO
Reprodutibilidade (preciso inter-laboratorial) grau de concordncia entre os resultados das medies de uma mesma amostra, efetuada sob condies variadas (mudana de operador, local, equipamentos, etc.) INMETRO - No mnimo 5 laboratrios

Parmetros analticos para validao de mtodos

EXATIDO
grau de concordncia entre os resultados individuais encontrados em um determinado ensaio e um valor de referncia aceito como verdadeiro A exatido de um mtodo analtico definida como a diferena entre o valor obtido (mdia) e o valor verdadeiro presente na amostra

ANVISA, ICH Mnimo de 9 determinaes (ex: 3 nveis, 3 rplicas)

Parmetros analticos para validao de mtodos

EXATIDO

Parmetros analticos para validao de mtodos

EXATIDO Como avaliar exatido: materiais de referncia comparao de mtodos ensaios de recuperao

Parmetros analticos para validao de mtodos

EXATIDO
MATERIAIS DE REFERNCIA CERTIFICADOS (CRM) Os CRM so materiais de referncia acompanhados de um certificado que possui o valor de concentrao de uma dada substncia, ou outra grandeza para cada parmetro e uma incerteza associada NIST ("National Institute of Standards and Technology" - USA) LGC ("Laboratory of the Government Chemist" - UK) USP, FAPAS ("Food Analysis Performance Assessment Scheme" UK)

Parmetros analticos para validao de mtodos

EXATIDO
MATERIAIS DE REFERNCIA CERTIFICADOS (CRM) Os valores obtidos pelo laboratrio (a mdia e a estimativa do desvio padro de uma srie de replicatas) da mesma amostra padro devem ser comparados com os valores certificados do material de referncia, para verificar a exatido do mtodo Clculo: erro relativo (ER, %); teste de hipteses; ndice z, erro normalizado Erro relativo (ER, %), exatido (% bias)

Parmetros analticos para validao de mtodos

EXATIDO
Parmetros Concentrao Nominal (g mL ) a Intra-dia (n = 6) Concentrao analizada (g mL ) b Preciso (CV, %) c Exatido (E, %) d Inter-dia (n = 2) Concentrao analizada (g mL ) b Preciso (CV, %) c Exatido (E, %)
-1 -1 -1

(-)-(R)-IRD 50,00 51,93 3,87 3,86 51,97 3,46 3,95 100,00 99,66 2,66 -0,34 98,39 4,60 -1,61 150,00 150,93 2,72 0,62 151,32 1,65 0,88 50,00 50,57 4,52 3,15 50,72 2,99 1,44

(+)-(S)-IRD 100,00 100,57 3,50 0,57 99,97 2,87 -0,03 150,00 149,81 3,16 - 0,13 151,33 1,42 0,89

Parmetros analticos para validao de mtodos

EXATIDO
COMPARAO DE MTODOS Consiste na comparao entre resultados obtidos empregando-se o mtodo em desenvolvimento e os resultados conseguidos atravs de um mtodo de referncia, avaliando o grau de proximidade entre os resultados obtidos pelos dois mtodos, ou seja, o grau de exatido do mtodo testado em relao ao de referncia Esta abordagem assume que a incerteza do mtodo de referncia conhecida

Parmetros analticos para validao de mtodos

EXATIDO
ENSAIOS DE RECUPERAO A recuperao (ou fator de recuperao), R, definida como a proporo da quantidade da substncia de interesse, presente ou adicionada na poro analtica do material teste, que extrada e passvel de ser quantificada -Padres da substncia adicionada matriz isenta da substncia ou amostra (fortificao, incorporao, dopagem, enriquecimento, termos provenientes do ingls spiking) -Limitao a substncia adicionada no est na mesma forma que a presente na amostra -Efeitos dos componentes da matriz devem ser investigados

Parmetros analticos para validao de mtodos

EXATIDO
Recuperao = concentrao obtida X 100 concentrao real
RAC Nominal concentration (g Within-day (na = 3) 1 2 3 Precision (RSD, %)b 1 2 3 Accuracy (%) 1 2 3 Between-day (n = 3) Analyzed concentration (g mL-1) Precision (RSD, %) b Accuracy (%) 120.9 1.0 100.8 152.2 1.4 101.5 177.9 1.5 98.8 9.1 6.9 95.2 11.3 6.8 94.3 13.4 9.7 92.9 121.5 123.0 120.3 1.0 1.1 0.9 100.2 100.8 100.3 153.3 151.1 152.2 0.1 2.4 0.1 102.2 100.8 101.5 177.8 178.8 177.1 1.6 2.2 1.6 98.8 99.3 98.4 9.4 9.0 9.1 3.9 8.6 8.0 97.6 93.8 94.2 11.7 11.1 11.2 5.4 7.4 6.8 97.9 92.1 93.0 13.8 13.0 13.3 6.3 9.4 13.2 96.1 90.2 92.5 mL-1) Day 120.0 VMC 150.0 180.0 9.6 Swine Feed 12.0 14.4

Analyzed concentration (g mL-1)

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LIMITE DE DETECO
menor concentrao da substncia em exame que pode ser detectada, mas no necessariamente quantificada, utilizando um determinado procedimento experimental Mtodo Visual Mtodo Relao Sinal-Rudo Mtodo baseado em parmetros da curva analtica

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LIMITE DE DETECO

Mtodo visual
matriz com adio de concentraes conhecidas da substncia de interesse, de tal modo que se possa distinguir entre rudo e sinal analtico pela visualizao da menor concentrao visvel

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LIMITE DE DETECO
Mtodo relao sinal-rudo - aplicado para mtodos analticos que mostram o rudo da linha de
base - comparao entre a medio dos sinais de amostras de baixas concentraes conhecidas do composto de interesse na matriz e um branco destas amostras - concentrao mnima na qual a substncia pode ser facilmente detectada

Relao sinal-rudo 2:1 ou 3:1

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LIMITE DE DETECO Mtodo baseado em parmetros da curva analtica

s = estimativa do desvio padro do coeficiente linear da equao S = coeficiente angular da curva analtica (slope)

Parmetros analticos para validao de mtodos

LIMITE DE QUANTIFICAO
Representa a menor concentrao da substncia em exame que pode ser medida, utilizando um determinado procedimento experimental COMPROMISSO: CONCENTRAO/PRECISO/EXATIDO

De acordo como mtodo analtico e seu respectivo uso

Parmetros analticos para validao de mtodos

LIMITE DE QUANTIFICAO
Mtodo Relao Sinal-Rudo Mtodo baseado em parmetros da curva analtica Quintuplicata da menor concentrao (preciso e exatido)

Parmetros analticos para validao de mtodos

LIMITE DE QUANTIFICAO
Mtodo relao sinal-rudo - aplicado para mtodos analticos que mostram o rudo da linha de
base -comparao entre a medio dos sinais de amostras de baixas concentraes conhecidas do composto de interesse na matriz e um branco destas amostras

Relao sinal-rudo 10:1

Parmetros analticos para validao de mtodos

LIMITE DE QUANTIFICAO Mtodo baseado em parmetros da curva analtica

s = estimativa do desvio padro do coeficiente linear da equao S = coeficiente angular da curva analtica (slope)

Parmetros analticos para validao de mtodos

LIMITE DE QUANTIFICAO QUINTUPLICATA

Linearity, limits of detection and quantification of the methods for RAC in VMC and in swine feed
RAC Linear equation Correlation coefficient (r) Range (g mL-1) Fcalb p value RSD (%)c LOD (g mL-1) LOQ (g mL-1) RSD (%)d RE (%)e
a

VMC y = 3921x + 11809 0.9984 90-210 1.44 0.27 2.9 1.0 2.5 0.5 4.9

Swine Feed y = 33212x 39725 0.9979 6.5-14.4 0.85 0.54 3.9 2.0 4.0 7.3 3.5

Parmetros analticos para validao de mtodos

ROBUSTEZ
Mede a sensibilidade que o mtodo apresenta face a pequenas variaes As mudanas introduzidas refletem as alteraes que podem ocorrer quando um mtodo transportado para outros laboratrios, analistas ou equipamentos

Mtodo cromatogrfico: proporo solvente orgnico, pH e fora inica, temperatura,

Parmetros analticos para validao de mtodos

ROBUSTEZ so realizados oito ensaios com uma combinao fatorial dos efeitos e verifica-se qual o efeito ou combinao de efeitos que apresentam variaes. permite no s avaliar a robustez do mtodo, como tambm ordenar a influncia de cada uma das variaes nos resultados finais, indicando qual o tipo de influncia de cada uma dessas variaes

Parmetros analticos para validao de mtodos

ROBUSTEZ

Csar e Pianetti, Brazilian Journal of Pharmaceutical Sciences vol. 45, n. 2, abr./jun., 2009

Parmetros analticos para validao de mtodos

ROBUSTEZ

Csar e Pianetti, Brazilian Journal of Pharmaceutical Sciences vol. 45, n. 2, abr./jun., 2009

Parmetros analticos para validao de mtodos

ROBUSTEZ

Csar e Pianetti, Brazilian Journal of Pharmaceutical Sciences vol. 45, n. 2, abr./jun., 2009

Parmetros analticos para validao de mtodos

ESTABILIDADE DOS PADRES E AMOSTRAS

- Para gerar resultados confiveis e reprodutveis, as amostras, os padres e reagentes usados devem ser estveis por um perodo razovel - Esta estabilidade importante em termos de temperatura e tempo - Embora a estabilidade de dias ou meses seja mais desejvel, em alguns casos as solues precisam ser preparadas antes de cada anlise

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ESTABILIDADE DOS PADRES E AMOSTRAS

Nominal concentration (g/mL) Short-term room temperaturea 0.50 5.00 Freeze-thaw cyclesa 0.50 5.00 Long-term storage at -20 Ca 0.50 5.00

IMAT p-valueb RSDc (%) 0.57 0.60 0.14 0.20 0.76 0.32 10.50 8.54 13.60 4.72 8.33 8.76

Curta durao: 12 horas (temperatura ambiente) Longa durao: 1 semana (freezer) 3 Ciclos de congelamento e descongelamento

Ajimura et al., Electrophoresis 2011, 32, 18851892

Parmetros analticos para validao de mtodos

REVALIDAO
a reavaliao de um mtodo analtico validado em resposta a uma mudana em algum aspecto do mtodo Situaes: Alteraes de reagentes e equipamentos, por mudana de fornecedor, troca de componentes ou desgaste do equipamento pelo uso constante Alterao na proposta e/ou nvel de qualidade desejados Uso apenas aps um certo perodo de tempo Pequenas variaes - ROBUSTEZ

Parmetros analticos para validao de mtodos

CONCLUSES
Conceitos em constante evoluo Tcnicas cromatogrficas e eletroforticas primordiais dos procedimentos de validao Legislao: ANVISA e INMETRO A validao deve ser desenvolvimento e execuo planejada antes de seu so alvos

Embora possa ser um processo trabalhoso, a qualidade dos resultados gerada diretamente relacionada qualidade do processo

REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
ANVISA - AGNCIA NACIONAL DE VIGILNCIA SANITRIA. GenricosLegislao-Resoluo-RE no. 899, de 29 de maio de 2003. Disponvel em http://www.anvisa.gov.br/legis/resol/2003/re/899-03.htm. Acesso em 14 de maio de 2008. RIBANI, M.; BOTTOLI, C. B. G.; COLLINS, C. H.; JARDIM, I. C. S. F.; MELO, L. F. C. Validao em mtodos cromatogrficos e eletroforticos. Quim. Nova, v. 27, p.771-780, 2004. UNITED STATES PHARMACOPEIA. 31th ed. Rockville: United States Pharmacopeial Convention, 2008.

Cassiano, N. M.; Barreiro, J. C.; Martins, L. R. R.; Oliveira, R. V.; Cass, Q. B. Validao em mtodos cromatogrficos para anlises de pequenas molculas em matrizes biolgicas. Quimica nova, 32, 1021-1030, 2009.