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Universit Paris Nord - Institut Galile

Laboratoire de Bio-ingnierie de Polymres Cardiovasculaires Inserm U698

Thse de doctorat
Prsente par

Sidi Mohammed DERKAOUI


Pour lobtention du grade de Docteur de lUniversit Paris Nord Discipline : Sciences de lingnieur Spcialit : Gnie biologique et mdical

Revtement bioactif pour stents mtalliques : Synthse, caractrisation et biocompatibilit

Soutenue le 02 dcembre 2008 devant la commission dexamen : Rapporteurs: M. H. F. Hildebrand M. D. Labarre M. G. Legeay M. L. Feldman

Examinateurs:

Directeur de thse : M. D. Letourneur Co-directeur : M. T. Avramoglou

Remerciements
Les recherches qui ont fait lobjet de ce mmoire ont t menes au Laboratoire de Bioingnierie de Polymres Cardiovasculaires de linstitut Galile, universit Paris 13 dirig par Monsieur Didier Letouneur, Directeur de Recherche CNRS, Inserm U698, Universit Paris 13, Villetaneuse. Je souhaite donc naturellement remercier tout dabord les instigateurs de ce projet de recherche original et porteur, notamment mon directeur de thse Monsieur Didier Letourneur qui ma accueilli au sein de lquipe de Bio-ingnierie de polymres cardiovasculaires. Il a su la fois soutenir mes travaux, tout en me laissant une grande libert de manuvre quant au droulement et lorganisation de mes recherches. En complment, le soutien financier quil a pu mapporter a permis de mener terme cette thse. Je souhaite galement exprimer toute ma gratitude Monsieur Thierry Avramoglou matre de confrences, Inserm U698, Institut Galile, Universit Paris 13, la fois instigateur de ce projet de recherche mais galement source dun soutien sans faille vis--vis des orientations de mes travaux. La confiance quil a su rapidement maccorder, alors que jtais encore en DEA, ma permise de mimpliquer totalement dans ce projet. Jai pu apprcier sa disponibilit exceptionnelle et totale concernant mes interrogations sur tous les points scientifiques, son intrt mon gard, enfin sans lui cette thse naurait jamais vu le jour. Je suis trs reconnaissant monsieur Denis Labarre, Professeur, Universit Paris SudXI, UMR CNRS 8612 Facult de Pharmacie, Chatenay-Malabry, ainsi qu Monsieur Hartmut Frdric Hildebrand, Directeur de Recherche INSERM, Groupe Recherche Biomatriaux, Laboratoire de Biophysique UPRES EA 1049, Facult de Mdecine "H. Warembourg", Lille davoir accept dtre rapporteurs de ce travail. Je suis honor de la prsence dans ce jury de Monsieur Gilbert Legeay, Dlgu Scientifique, Centre de Transfert de Technologie du Mans, Le Mans et de Monsieur Laurent Feldman, Professeur-Praticien Hospitalier, Service de Cardiologie, CHU X. Bichat, Paris. Quils soient remercis davoir accept de juger ce travail. Je suis trs reconnaissant Madame Isabelle Bataille, matre de confrences, Inserm U698, Institut Galile, Universit Paris 13, de mavoir beaucoup aid chaque fois que javais besoin delle. Mes remerciements les plus sincres Madame Danielle Chaubet, matre de confrences, Institut Galile, Universit Paris 13 et Monsieur Frdric Chaubet, Professeur Universit Paris 13 de leur sympathie. i

Jai beaucoup appris sur les techniques de la chimie en particulier en RMN au cours de mes discussions avec Madame Christel Barbaud, Professeur universit Paris 13, quelle trouve ici ma profonde gratitude et ma sympathie. Je tiens remercier Madame Amlie Labb, Matre de confrences, Universit Paris 13 de sa collaboration pour les manipes et la rdaction du troisime article. Je voudrais galement exprimer ma gratitude envers toutes les autres personnes qui de faon directe ou indirecte mont aid dans ce travail, notamment Monsieur, Marc Lecouvey Matre de Confrences, Universit PARIS XIII et le Docteur Cdric Lorthioir, CNRS Thiais. Enfin, ce travail est l'aboutissement de longues annes d'tude, auxquelles l'amour et le soutien de ma famille : ma mre, mes sur et mon frre. Et a mon pouse Sihem, je voudrais rappeler mon amour et ma reconnaissance pour sa comprhension, sa prsence affectueuse mes cts et le plus beau cadeau de ma vie, nos enfants : Lina, Anas et Lylia.

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Abrviations et anglicismes
AFM : microscopie force atomique AIBN : L ','-azobisisobutyronitrile ATR-FTIR : Attenuate Total Reflection Fourier Transform Infrared Ce(IV) : Ion crium ltat doxydation +4 BMA : n-Butyl Methacrylate BSA : Albumine de srum bovin DH : dextrane-graft-PHEMA DBM: dextrane-graft-(PBMA-co-PMMA) DMA : Analyse mcanique dynamique DMEM : Milieu nutritif pour la culture cellulaire DMSO : Dimthyl sulfoxyde D.O : Densit optique DSC : Analyse enthalpique diffrentielle EDTA : Lacide ethylnediamine ttraactique EMA : Ethyle mthacrylate FM : Fucane-graft-PMMA FB : Fucane-graft-PBMA GPC : Chromatographie par permation de gel HB : Hparine-graft-PBMA HEMA : 2-hydroxythyle mthacrylate HM : Hparine-graft-PMMA HUVECs : Human Umbilical Vein Endothelial Cells KBr : Bromure de potassium MEB : microscopie lectronique balayage MMA : Mthyle mthacrylate PB : Pullulane-graft-PBMA PBMA : Poly (mthacrylate de butyle) PBS : Solution saline quilibre par un tampon phosphate PM : Pullulane-graft-PMMA PMMA : Poly (mthacrylate de mthyle) RMN : Rsonance magntique nuclaire SVF : Srum de Veau Ftal Tg : Temprature de transition vitreuse iii

THF : Ttrahydrofurane TMS : Trimthylsylil TNF : facteur de ncrose tumorale PDGF : Platelet-Derived Growth factor bFGF: basic Fibroblast Growth Factor TGF: Transforming Growth Factor

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Sommaire

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Sommaire
Remerciements............ Abrviations et anglicismes Sommaire..................... i iii iv 1 7 9 9 9 10 10 11 11 11 12 13 13 14 14 15 15 16 16 16 18 18 20 20 20 21 21 21 22 23 23 23 24 24 25 26 26 27

Introduction gnrale... I. Revue bibliographique.................


I.1. Le systme vasculaire........... I.1.1. La paroi vasculaire structure de lartre.......... a. L'intima .................... b. La mdia .................. c. L'adventice ............... I.1.2. Les cellules vasculaires... I.1.2.1. Les cellules endothliales .... I.1.2.2. Les cellules musculaires lisses. I.1.3. La matrice extracellulaire............ I.1.4. Le sang..................... I.1.4.1. La coagulation.......... I.1.4.1.1. La voie intrinsque ... I.1.4.1.2. La voie extrinsque... I.1.4.2. La fibrinolyse... I.1.4.3. Linflammation............ I.1.5. Principales pathologies vasculaires I.1.5.1. Epidmiologie des maladies cardiovasculaire............. I.1.5.2. Lathrosclrose ................. I.1.5.3. Physiopathologie de lathrosclrose................... I.1.5.3.1. Gense de la plaque .......... I.1.5.3.2. Formation de la plaque mature.......... I.1.5.3.3. Profils volutifs de la plaque stable .... I.1.5.4. La stnose ............ I.1.6. Langioplastie.......... I.1.6.1. Mcanisme de langioplastie au ballonnet... I.1.6.2. Les stents et leur implantation I.1.7. La Restnose........... I.1.7.1. Les mcanismes de la restnose... I.1.7.2. Thrombose, inflammation, migration et prolifration . I.1.8. Stents bioactifs. I.1.8.1. Stents imprgns dhparine. I.1.8.2. Stents Cypher, enrob de sirolimus .......... I.1.8.3. Stents Taxus, enrob de paclitaxel.... I.1.8.4. Stents actifs et stents nu.... I.1.8.5. Thrombose lie au stents actifs I.1.8.6. Retard de r-endothlialisation

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I.2. Les biomatriaux et la biocompatibilit................. I.2.1. Dfinition dun Biomatriau................ I.2.2. La Biocompatibilit ............ I.2.3. Interaction sang biomatriaux..... I.2.4. ladhsion cellulaire. I.2.4.1. Interaction polymres cellules.. I.2.4.1.1. Morphologie de surface ............ I.2.4.1.2. Hydrophilie des polymres............ I.2.4.1.3. Adsorption de protines sur la surface.. I.2.5. Les polymres synthtiques..... I.2.6. Les polymres bioactifs... I.2.7. Les mtaux... I.2.8. Les polysaccharides................. I.2.8.1. Lhparine............. a. Lactivit anticoagulante de lhparine......... b. Lactivit anticomplmentaire de lhparine ... c. Lactivit antiprolifrative de lHparine......... I.2.8.2. Le fucane.............. a. Lactivit biologique des fucanes......... b. Lactivit anticoagulante des fucanes... c. Lactivit anticomplmentaire des fucanes .. d. Lactivit antiprolifrative des fucanes. I.2.8.3. Le dextrane........... I.3. Modifications chimiques des polysaccharides............... I.3.1. La polymrisation radicalaire ......... I.3.2. Le systme rdox......... I.3.2.1. Lamorage... I.3.2.2. La propagation.. I.3.2.3. la terminaison...

28 29 29 30 31 31 33 33 34 34 35 35 35 36 37 37 38 38 38 39 39 39 39 40 40 40 41 41 41 43 45 45 45 45 45 45 45 46 46 46 47 47 47 47 48 48 48 49 49

II. Matriels et mthodes.............


II.1. Synthse....................... II.1.1. Les amorceurs ....................... II.1.1.1. L'azobisisobutyronitrile .................... II.1.1.2. Le Crium IV...................... II.1.2. Les monomres mthacrylates .................. II.1.2.1. Purification des monomres mthacrylates................. II.1.2.2. Le mthyle mthacrylate................. II.1.2.3. Le butyle mthacrylate.................... II.1.2.4. LEthylmthacrylate. .. II.1.2.5. Le (2-hydroxythylmthacrylate) ... II.1.3. Les polymres naturels (les polysaccharides) ... II.1.3.1. Le dextrane.......... II.1.3.2. Le Fucane II.1.3.3. Le Pullulane............ II.1.3.4. Lhparine... II.1.4. Synthse des polymres mthacrylates ..... II.1.5. Synthse des copolymres.. II.1.5.1. Description de la raction de greffage.... II.1.5.2. Caractristiques et mise au point de la raction de greffage... vii

II.1.5.3. Greffage des mthacrylates sur les polysaccharides............. II.1.5.4. Purification des copolymres.............. II.1.5.4.1. La dialyse......... II.1.5.4.2. La lyophilisation . II.1.5.4.3. Extraction des homopolymres acryliques.. II.2. Les techniques de caractrisation des copolymres. II.2.1. Linfrarouge a transforme de Fourier... II.2.2. La rsonance magntique nuclaire............... II.2.3. Analyse thermique diffrentielle ............... II.2.4. Mesure de la viscosit................ II.2.5. Chromatographie dexclusion strique (CES) ...... II.3. Etude de la solubilit des copolymres et ralisation des films.. III.3.1. La solubilit des polymres...... III.3.2. Prparation des films de polymres . II.4. Caractrisation et analyse des films de copolymres................... II.4.1. Dtermination de la topographie des films par Microscopie Force Atomique....... II.4.2. Proprits mcaniques des copolymres........ II.4.2.1. Tests de fluage. II.4.2.2 Analyse mcanique dynamique (DMA) .. II.4.3. Mesure de langle de contact sur les diffrents films de polymres.. II.5. Enduction des stents par les copolymres II.5.1. Analyse des surfaces de stents enduits....... II.5.1.1. Par microscopie optique.. II.5.1.2. Par microscopie lectronique balayage (MEB) ....... II.6. Evaluation biologique. II.6.1. Lignes cellulaires . II.6.2. Milieux de cultures ................ II.6.3. Entretien des cellules en culture................. II.6.3.1. Dconglation des cellules.. II.6.3.2. Passage des cellules........... II.6.3.3. Conglation et cration de stocks de cellules............... II.6.4. Prparation des films de polymre la culture cellulaire..... II.6.4.1. Lavage et strilisation des films de polymre..... II.6.4.2. Conditionnement des films de polymres la culturecellulaire..... II.6.4.3. Ensemencement des cellules sur les films de polymres... II.6.4.4. Cintique de prolifration des cellules sur les diffrents supports .... II.6.4.5. Comptage des cellules..... II.6.4.6. Observation des cellules sous microscope fluorescence ..... II.6.4.7. Evaluation de la migration des C sur films de copolymre DB et sur fond de puits.. II.6.4.8. Ladhsion et la prolifration des cellules HUVECs sur stents..................

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III. Rsultats................
III.1. Introduction au premier article........... III.1.1. Premier Article (synthse, caractrisation du dextrane-graft-polymthylemthacrylate) III.2. Introduction au second article ........ III.2.1. deuxime Article (synthse, caractrisation du dextrane-graft-polybutylmthacrylate) III.3. Introduction au troisime article.

65 67 69 85 89 109

III.3.1. Troisime Article.. 113 III.3.2. complment troisime Article....... 125

III.4. Autres rsultats.. 141 III.4.1. Synthse dautres polymres bioactifs. III.4.1.1. Effet du milieu ractionnel sur le dextrane ... III.4.1.2. Effet du milieu ractionnel sur la chane de PMMA. III.4.2. Caractrisation........... III.4.2.1. caractrisation infrarouge...... III.4.2.2. Tests de solubilit de diffrents copolymres et ralisation des films... III.4.3. Proprits thermiques et mcaniques III.4.3.1. Analyse thermique diffrentielle (DSC) ... III.4.3.2. Analyse mcanique sous sollicitations dynamiques.. III.4.4. Fluage des copolymres DB1, DB2 et DB3..... 143 145 145 146 146 147 148 148 149 150

III.4.3. Culture cellulaire.... 153 III.4.3.1. Proprits biologiques des diffrents copolymres synthtiss. III.4.3.1.1 tude cintique de prolifration des cellules HUVECs... III.4.3.1.2. Cintique de prolifration des CMLs sur les diffrents supports... III.4.3.2. Prolifration des cellules HUVECs et CMLs sur les diffrents supports J5.. III.4.3.3 Morphologie cellulaire sur les diffrents films de copolymres................. 153 153 154 155 156 159

IV. Discussion.....

V. Conclusion.................. 167 Rfrences bibliographiques.............. 171 Annexe............... 181

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Introduction

Introduction gnrale

Introduction

Introduction gnrale
Les maladies cardiovasculaires sont aujourd'hui la premire cause de mortalit devant le cancer dans les pays dvelopps, et lathrosclrose est lune des principales formes de ces maladies. Elle se manifeste par un paississement de la face interne des artres, rduisant la lumire artrielle ou bloquant le flux sanguin : cest la stnose. Cette pathologie artrielle correspondant une inflammation chronique lie linteraction entre les lipoprotines modifies, les cellules inflammatoires, macrophages drivs des monocytes circulants et lymphocytes T, et les lments cellulaires de la paroi artrielle. Cette inflammation conduit un processus ractionnel cicatriciel de la paroi artrielle impliquant les cellules musculaires lisses et la production de matrice extracellulaire. Certaines de ces lsions inflammatoires, trop importantes ou trop brutales, vont conduire des lsions qui vont se compliquer par une rupture ou une rosion de plaque et une thrombose artrielle. Les prsentations cliniques de la maladie athrosclreuse sont videmment multiples et fonction de lartre touche. Latteinte coronaire et linfarctus du myocarde dominent par leur frquence et leur svrit suivis de prs par les atteintes carotidiennes et les accidents vasculaires crbraux. Mais la maladie reste souvent silencieuse et le patient le plus souvent asymptomatique. Selon les tudes menes par lOMS dans le cadre du programme MONICA (Multinational Monitoring of Trends and Determinants in Cardiovascular Deseases), 6 millions de personnes (45.6% de tous les dcs) meurent la suite dune maladie cardiovasculaire dans les pays dvelopps. Dautres tudes pidmiologiques montrent cependant que le dveloppement de lathrosclrose ne doit pas tre considr comme un hritage inluctable de lindustrialisation et de lurbanisation. Un facteur important mentionner, est le fait que souvent des gens en ge moyen, cest dire au sommet de leur productivit, sont gravement atteints par ces maladies induisant un problme socio-conomique majeur. Les campagnes dinformation pour une meilleure hygine de vie (rgime alimentaire, tabagisme et sdentarit) ayant un impact limit, la lutte contre les maladies cardiovasculaires reste essentiellement curative. Le dveloppement de lathrosclrose et lextension des thromboses implique des traitements lourds par injections intraveineuses, ainsi que le recours la pose de stents au niveau du site stnos, avec un risque toujours important de restnose. En effet la pose dun stent dans l'artre cre un dommage svre sur tous les lments composant le vaisseau sanguin. Suite la dilatation, l'endothlium est dnud de sa couche protectrice, favorisant ainsi un environnement thrombognique. La lame lastique interne se trouvant dans la mdia est endommage, les cellules musculaires lisses situes dans la profondeur de la paroi subissent un tirement et une destruction invitable, la matrice extra-cellulaire composant la 3

Introduction mdia et l'adventice est galement perturbe. On assiste ventuellement un phnomne de cicatrisation du site endommag. Cette intervention entrane chez environ un tiers la moiti des patients, la migration et la multiplication des cellules musculaires lisses conduisant une nouvelle rduction de la lumire artrielle. Combattre ce phnomne de restnose a t la proccupation de trs nombreuses quipes de recherches. Ainsi les stents ont t dvelopps grande chelle depuis les annes 1990. Une perce technologique rcente a permis la mise au point de stents enrobs dune substance pharmacoactive qui rduit lincidence du risque de restnose. Agissant comme rservoir mdicamenteux, ces endoprothses dune nouvelle gnration ont montr une diminution de la prolifration no-intimale. Toutefois lallongement du dlai de cicatrisation d au retard de la rendothlialisation induit par le mdicament antimitotique a t associ avec la survenue de thrombose. Mme sils sont dj employs en trs grand nombre en clinique, la nature des polymres employs et le type de principe actif (antitumoraux/antimitotiques) sont galement des aspects dinquitudes majeures. Le problme de la restnose persiste galement malgr les avancs thrapeutiques lies au stents bioactifs. Les groupes de recherche ont beaucoup de difficults cibler des lments cls dans ce processus puisqu'il y a un trs grand nombre de mdiateurs dans le phnomne la restnose. Cependant, nous avons la certitude que les cellules musculaires lisses et les cellules endothliales jouent un rle important dans ce phnomne. En parallle, de nombreuses tudes ont mis en vidence que les polymres naturels ou synthtiques pouvaient avoir des proprits biologiques vis--vis des cellules impliques dans la restnose. Notre tude sest donc oriente vers cette voie de recherche afin de tirer profit de deux types de polymres. Lobjectif est de mettre au point un biomatriau nouveau pouvant servir dans la confection dun revtement permanent pour stents. Ce revtement, combinant les proprits biologiques des polymres naturels (polysaccharides) et les proprits mcaniques des polymres synthtiques (polymthacrylates), serait capable dinhiber la prolifration des cellules musculaires lisses toute en prservant la migration et la prolifration des cellules endothliales. Seule une approche pluridisciplinaire prenant en compte simultanment les aspects physico-chimiques, mcaniques et biologiques peut permettre de dvelopper un tel revtement. Notre recherche porte donc sur le choix des principaux constituants de ce revtement, dune part des polysaccharides comme le dextrane, le fucane et lhparine connus pour leurs activits biologiques et dautre part un polymre de type mthacrylique (polymthylmthacrylate et polybutylmthacrylate) car les monomres mthacryliques disponibles sur le march sont suffisamment varis pour offrir la possibilit de contrler finement les proprits mcaniques et physico-chimiques du revtement voulu. 4

Introduction Notre premier objectif devait permettre de greffer dune manire covalente les monomres mthacryliques sur les polysaccharides. Pour cela la synthse dcrite dj par dautres groupes avec diffrents polymres repose sur l'initiation d'une polymrisation radicalaire partir du polymre hydroxyl (polysaccharide) grce une mthode redox utilisant les ions crium IV. Aprs sparation et purification, les copolymres ont t caractriss par spectroscopie infrarouge (IR), par rsonance magntique nuclaire (RMN) et par analyse thermique diffrentielle (DSC). Il fallait mettre au point dans une deuxime tape, la confection des films de copolymres. Pour cela, les copolymres purifis ont t solubiliss dans un mlange de solvants. Les solvants retenus sont l'eau et le THF, ces deux solvants tant parfaitement miscible l'un l'autre. La solubilit optimale n'est obtenue que pour une plage troite de proportion d'eau dans le THF, cette proportion varie d'ailleurs avec la nature du polymthacrylique. Lors de la formation des films par dpt et vaporation des solvants, la tension de vapeur trs diffrente entre l'eau et le THF nous impose de conduire cette tape sous atmosphre contrle. Caractriss par des tests danalyse mcanique dynamique (DMA), microscopie force atomique (AFM) et angle de contact, les films ont t soumis des tests de culture cellulaire afin dexplorer les effets biologiques des diffrents copolymres sur les cellules endothliales et les cellules musculaires lisses. La dernire tape tait de choisir le copolymre appropri afin denduire des stents mtalliques. Il tait alors ncessaire de vrifier, par les mthodes spectroscopiques et microscopiques appropries, que les surfaces des stents taient biens recouverts par le copolymre. Finalement une tude comparative de ladhsion et prolifration des cellules endothliales directement sur stents recouverts de copolymres et stents nus a t ralise in vitro.

Le manuscrit prsente dans la premire partie une revue bibliographique permettant de faire le point sur les connaissances et de prciser le contexte de ltude. Les principaux matriels et mthodes utiliss pour synthtiser et caractriser les proprits et les effets des copolymres sont exposs dans une deuxime partie. Lensemble des rsultats exprimentaux sont, quant eux, prsents dans la troisime partie sous forme dinsertion darticles (publi ou en prparation), regroups dans la partie rsultats et discussion, mais faisant chacun lobjet dune tude spare et ventuellement de complments de rsultats. Au nombre de trois : Le premier article dcrit la mise au point et loptimisation de la technique du greffage du polymthylemthacrylate sur le dextrane Synthesis and characterization of a new 5

Introduction polysaccharide-graft-polymethacrylate copolymer for 3D hybrid hydrogels . Il a t accept pour publication en aot 2008 dans la revue Biomacromolecules. Le second article intitul Dextran-graft-polybutylmethacrylate films for cardiovascular engineering dcrit la synthse et la caractrisation dun deuxime copolymre dextrane-graftpolybutylmthacrylate. Afin de comparer les proprits physico-chimiques et mcaniques, trois types de ce copolymre sont synthtiss diffrente concentration du dextrane. Leffet de ces copolymres sur la prolifration de cellules endothliales et cellules musculaires lisses a t tudi. Il doit tre soumis la revue Tissue Engineering. Nous dvelopperons enfin dans un troisime article intitul Copolymers dextran-graftpolybutylmethacrylate for stent coating la prparation dun revtement pour stents en acier 316L. Ce revtement constitu de film de copolymre (dextrane-graft-polybutylmthacrylate) est caractris par diffrentes mthodes physico-chimiques, ainsi que son effet sur la culture des cellules endothliales in vitro. Des rsultats complmentaires sont en cours dobtention avec une collaboration avec le Pr Digo Mantovani (Qubec, Canada). Cet article doit tre ensuite soumis Biomaterials. Des rsultats galement obtenus avec dautres monomres et dautres polysaccharides terminent ce chapitre. La dernire partie est consacre une discussion de lensemble des rsultats et propose des perspectives permettant dapprofondir lanalyse et lutilisation de copolymres synthtiss.

Revue bibliographique

I. Revue bibliographique

Revue bibliographique I.1. Le systme vasculaire Le systme cardio-vasculaire a pour fonction d'apporter aux tissus et organes l'oxygne et les nutriments qui leurs sont ncessaires et de les dbarrasser du dioxyde de carbone et des mtabolites. Son rle est galement de rpartir de manire homogne la chaleur interne gnre par lactivit biologique. Les besoins des diffrents organes tant trs divers et variables dans le temps, le systme cardiovasculaire doit pouvoir assurer la distribution sanguine de faon adapte et ajustable.

I.1.1. La paroi vasculaire structure de lartre Les vaisseaux sanguins sont constitus de trois tuniques morphologiquement distinctes (figure 1). De lintrieur vers lextrieur du vaisseau on distingue : lintima, la mdia et ladventice. Limportance et la complexit de ces trois tuniques dpendent du vaisseau sanguin et peuvent tre trs grandes ou rduites une simple monocouche cellulaire.
Adventice Limitante lastique externe Mdia

Intima

Endothlium Membrane basale Limitante lastique interne

Figure 1. Structure de la paroi dune artre

a. L'intima est principalement constitue de lintrieur vers lextrieur, dune monocouche de cellules endothliales et dune fine couche de tissu conjonctif. Ces cellules endothliales sont directement en contact avec le sang circulant et donc avec les mtabolites, les hormones, et tout ce que peut transporter le sang. Cette couche est identique quelque soit le territoire vasculaire et il y a trs peu de diffrences dans sa structure. Il faut noter cependant que dans les artres lastiques, lintima, trs paisse peut contenir des cellules musculaires lisses (CMLs) 9

Revue bibliographique particulires dites myointimales. Quelque soit le diamtre de la paroi, il y a toujours une seule couche de cellules endothliales. Ces cellules endothliales sont en forme de losange et leur juxtaposition constitue une mosaque. Leur grand axe est orient dans le sens de lcoulement sanguin, cette orientation tant dtermine par les forces de cisaillement appliques leur surface. b. La mdia est la tunique moyenne, la plus paisse. Elle est limite de part et d'autre par les membranes limitantes lastiques interne et externe, elle est compose de cellules musculaires lisses et d'un rseau de collagne, lastine, et de mucopolysaccharides. Suivant la prdominance de fibres lastiques ou de cellules musculaires on distingue les artres lastiques, gros vaisseaux proximaux, opposes aux artres musculaires, les petites artres priphriques particulirement doues de vasomotricit. La mdia contient exclusivement des cellules musculaires lisses et des constituants extracellulaires : fibres lastiques, fibrilles dlastine, faisceaux et fibrilles de collagne, protoglycanes. Cette couche est trs variable selon les diffrents territoires vasculaires, et la prsence et lorganisation aussi bien des fibres lastiques que des CMLs varient selon la fonction des vaisseaux. Dans les artres lastiques (artres brachio-cphaliques, artres sous-clavires, carotides, iliaques, artres pulmonaires et aorte), la mdia est constitue de plusieurs lames lastiques concentriques entre lesquelles on retrouve les CMLs. Le nombre de ces lames lastiques est fonction du diamtre de lartre. Les CMLs et les lames lastiques forment une unit lamellaire. Le nombre dunits lamellaires est proportionnel au diamtre du vaisseau, et augmente progressivement avec le poids et la taille chez les diffrents animaux. Cette organisation en structure lamellaire nexiste que dans les artres lastiques, les artres musculaires ne possdant pas cette architecture. Les artres musculaires possdent une lamelle lastique interne (limitante lastique interne) et externe (limitante lastique externe) qui sparent la mdia respectivement de lintima et de ladventice, et quelques lamelles lastiques entre les diffrentes couches de CMLs. Dans ces deux types dartres, les CMLs sont arranges de faon concentrique. Dans certains types dartres, on peut voir la prsence de CMLs entre lintima et la mdia (notamment dans les artres coronaires et les artres rnales). c. L'adventice est peu ou trs prsente selon le type de vaisseaux. En gnral, ladventice est constitue de fibres de collagne. Elle contient galement quelques fibres lastiques paisses et des fibroblastes. Son organisation est peu prs la mme quel que soit le type de vaisseau, en effet cette couche permet lencrage du vaisseau aux tissus environnants. Cependant, dans les veines, trs souvent la mdia et ladventice sont difficiles distinguer. 10

Revue bibliographique

Les proprits mcaniques des diffrentes couches constituant les artres dpendent de leur quantit dlastine, qui varie avec le diamtre du vaisseau. Chaque type de vaisseau est donc conu de telle faon pouvoir supporter la pression du flux sanguin en se dformant en consquence.

I.1.2. Les cellules vasculaires I.1.2.1. Les cellules endothliales Les cellules endothliales ont des fonctions de transport actif et passif de nombre de constituants sanguins parmi lesquels les lipoprotines. Les cellules endothliales peuvent laborer des produits ayant une action sur les lments figurs du sang et sur la paroi vasculaire elle-mme, en particulier sur la mdia. Parmi les composs produits par les cellules endothliales, on trouve la prostacycline qui inhibe les fonctions plaquettaires et qui est vasodilatatrice (et par consquent agit sur les fibres musculaires lisses de la mdia) ; on trouve galement lendothline, qui est un peptide possdant un effet vasoconstricteur important sur les cellules musculaires lisses. Lendothlium est sensible des stimulis grce une grande varit de rcepteurs membranaires (muscariniques, alpha 2 adrnergiques, vasopressine, srotonine....). L'endothlium joue un rle important dans l'homostasie, la contractilit, la multiplication cellulaire et les mcanismes inflammatoires des vaisseaux sanguins [1]. Cette couche opre ses diffrentes fonctions en maintenant la surface luminale non-adhsive et en ayant des proprits fibrinolytique, anticoagulante et antithrombotique [2]. Lorsqu'une agression de lnedothlium se produit (suite des pathologies telles le diabte ou de circonstances particulires telles que le tabagisme ou lobsit), il survient un drglement dans la fonction de l'endothlium, entranant plusieurs vnements graves comme les vasospasmes, le dveloppement d'un thrombus ou l'athrosclrose [3]. La dysfonction de l'endothlium conduit invitablement un processus de remodelage vasculaire marqu par des altrations structurelles et fonctionnelles et qui a pour objectif de redonner au vaisseau la protection ncessaire sa survie. Mais ce faisant, les fonctions risquent de devenir inoprantes parce que les facteurs de rparation, une fois activs, amnent habituellement leur part de problmes. Une couche endothliale vierge est sans doute la meilleure source de prvention contre des vnements telles que la thrombose artrielle, et l'athrosclrose [4].

I.1.2.2. Les cellules musculaires lisses Les cellules musculaires lisses ont une fonction contractile qui assure la vasomotricit et le tonus artriel. La vasomotricit est rgule par les messagers agissant sur les cellules 11

Revue bibliographique endothliales qui leur tour transmet l'ordre aux cellules musculaires lisses par l'intermdiaire d'un second messager. En outre, les cellules musculaires lisses assurent des fonctions mtaboliques en particulier la scrtion de matrice extracellulaire de la mdia et le catabolisme des lipoprotines LDLs.

I.1.3. La matrice extracellulaire La matrice extracellulaire (MEC) est un rseau tridimensionnel de macromolcules qui constituent la charpente des tissus, elle forme un support pour ladhsion et la migration cellulaires, et gnre les signaux relatifs lenvironnement des cellules (mcano-transduction). Les macromolcules de la matrice extracellulaire sont regroupes en plusieurs catgories : les collagnes, llastine, les glycoaminoglycanes, les glycoprotines de liaison et les intgrines [5]. La proportion de chacun de ces lments est trs variable selon le tissu considr. Dans la paroi vasculaire, ce sont les cellules musculaires lisses qui synthtisent la MEC incluant une matrice fibrillaire insoluble et une membrane basale sur laquelle adhrent les cellules. Les liens entre la matrice et le cytosquelette via le complexe de protines trans-membranaires (intgrines) constituent un lien physique entre les cellules et la MEC comme le montre la figure 2, Les interactions qui en dcoulent jouent un rle important dans les nombreuses voies de signalisations [6]. Ainsi des pathologies de la paroi vasculaire sont associes des dfauts qui impliquent les liens molculaires entre le cytosquelette et la matrice extracellulaire. La MEC, via les modulations, la synthse et lorganisation tridimensionnelle de ces diffrents composants, exerce diffrents effets sur la croissance et le phnotype des cellules du systme cardiovasculaire [7]. Les intgrines sont les rcepteurs qui transmettent les forces et les changements de structure de la MEC au cytosquelette [8]. Ainsi en connectant le cytosquelette la MEC et en contrlant les interactions cellules-matrice, les intgrines donnent la cellule la capacit de percevoir lenvironnement et de rpondre aux changements de ce dernier et de le modifier [9].

Figure 2. Interface cellule matrice extracellulaire [10] 12

Revue bibliographique I.1.4. Le sang Le sang est un tissu msenchymateux liquide contenu dans les espaces vasculaires. Il comprend une phase aqueuse de composition complexe, le plasma qui est compos son tour de nombreuses protines dont les fonctions sont trs spcifiques et les lments figurs sont reprsents par des cellules nucles, les leucocytes (globules blancs), et par des cellules anucles, les hmaties (globules rouges) et les plaquettes. Le sang remplit des fonctions indispensables la vie, le transport de loxygne et des substances nutritives vers les cellules et des produits de dgradation du mtabolisme cellulaire vers les monctoires, des hormones produites par les glandes endocrines vers les cellules cibles. Une autre fonction du sang qui est lhmostase cette fonction est dfinit comme le maintien de la composition du milieu intrieur en particulier les liquides interstitiel et intracellulaire, et le maintien de la temprature corporelle. Le sang joue un rle essentiel dans la dfense de lorganisme contre les infections et agressions grce aux anticorps et aux globules blancs, contre la perte sanguine elle-mme grce au systme de la coagulation.

I.1.4.1. La coagulation Le sang est un fluide en quilibre dynamique avec son environnement dont la moindre modification peut entraner des consquences graves, la plus courante tant la formation de thrombus. Diffrents mcanismes maintiennent cet quilibre, l'tude in vivo des modifications conduisant l'arrt du saignement aprs traumatisme d'un petit vaisseau a permis de distinguer diffrentes squences : d'abord une adhsion des plaquettes aux fibres de collagne formant l'ossature du vaisseau, puis une agrgation des plaquettes entre elles, aboutissant la formation du "clou hmostatique" ce phnomne peut tre observ lorsque le sang est plac en prsence d'une surface trangre [11]. La coagulation implique l'activation par protolyse d'une dizaine de protines plasmatiques qui interagissent entre elles et avec des surfaces cellulaires procoagulantes l'aide d'ions calcium. La coagulation passe par la production de thrombine, enzyme pivot de l'hmostase qui conduit la conversion du fibrinogne soluble en fibrine insoluble constituant l'armature du caillot sanguin [12]. La thrombine et la fibrine stabilisent le clou hmostatique . La gnration de thrombine est l'aboutissement de deux voies diffrentes de la coagulation appeles voie intrinsque et voie extrinsque [13] (figure 3).

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Figure 3. Cascade de la coagulation selon les voies intrinsque et extrinsque ainsi que le mcanisme de la fibrinolyse [14]

I.1.4.1.1. La voie intrinsque Nomme ainsi car tous les lments qui lui sont ncessaires sont dans le sang. Elle fait intervenir le facteur XII (Hageman), qui s'active en facteur XIIa quand il entre en contact avec certains types de surfaces, incluant les fibres de collagne qui sont sous-jacentes l'endothlium. La catalyse d'un certain nombre de facteurs de la coagulation est ainsi amorce jusqu'au facteur activ Xa.

I.1.4.1.2. La voie extrinsque Nomme ainsi car un lment cellulaire extrieur au sang lui est ncessaire. Cet lment est une protine non plasmatique appele thromboplastine tissulaire . Elle se trouve la surface de diverses cellules dont les fibroblastes. La voie extrinsque fait intervenir le facteur VII, qui se lie la thromboplastine tissulaire qu'elle active en facteur VIIa. Elle se poursuit par l'activation des facteurs IX et X en IXa et Xa.

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Revue bibliographique I.1.4.2. La fibrinolyse La fibrinolyse est un processus enzymatique de dissolution de la fibrine. En effet il existe un quilibre physiologique entre le systme de la coagulation et celui de la fibrinolyse. La fibrinolyse permet la dissolution des dpts fibrineux intra et extravasculaires. Elle permet plus de prvenir laccumulation de fibrine que de dissoudre une thrombose dj constitue. Le systme fibrinolytique prsente de nombreuses analogies avec celui de la coagulation, il comporte des activateurs et des inhibiteurs (rgulateurs). Lenzyme principale qui intervient lors de la fibrinolyse est la plasmine, elle est gnre par clivage peptidique sous laction dactivateurs du plasminogne, tels que le tPA synthtis par les cellules endothliales [15].

I.1.4.3. Linflammation Linflammation se dfinit par lensemble des phnomnes ractionnels dclenchs par lorganisme en rponse une agression, cest une raction de dfense immunitaire. Ce mcanisme peut relever de nombreuses causes : Infectieuses (bactrienne, virale, parasitaire) Immunologiques Tumorales Ncrose tissulaire Traumatisme physique (intervention chirurgicale, brlure) Traumatisme chimique (surfaces de biomatriaux, microcristaux) Le phnomne de linflammation permet larrive des leucocytes dans le foyer inflammatoire. Les premiers en place sont les polynuclaires, puis ils sont remplacs par les cellules mononucles. Parmi celles-ci, les macrophages qui participent cette phase grce leur plus grande capacit de phagocytose. Sy associent des lymphocytes et des plasmocytes qui participent la rponse immune. Toutes les cellules prsentes sur le site inflammatoire sont actives et scrtent de nombreux mdiateurs : histamine, srotonine et prostaglandines, cytokines : IL1, IL6, TNF (facteur de ncrose tumorale) et interfrons, radicaux libres. Dans le cas de lartre, les mdiateurs de linflammation participent au recrutement et la migration des cellules musculaires lisses, induisent leur prolifration. Les mdiateurs de linflammation mettent en jeu des phnomnes de production en cascade, des synergies deffet et des boucles damplification par le biais notamment du systme du complment. Celui-ci implique plus de 30 protines du plasma et des membranes cellulaires, il peut tre activ par deux voies, la voie classique et la voie alterne. La voie classique est active par la formation du complexe antigne anticorps, tandis que la voie alterne est dclenche spontanment par la prsence des substances comme les polysaccharides des parois bactriennes, des endotoxines ou 15

Revue bibliographique encore par des surfaces artificielles [16]. Entre autres la nature chimique et le degr d'hydrophobie des surfaces d'implants modulent le degr de la raction inflammatoire et l'adhsion des leucocytes [17]. Ces mcanismes interviennent lors d'un contact d'un biomatriau avec un tissu vivant, ce contact de surfaces artificielles perturbe l'hmostase et gnre une rponse inflammatoire [18] aprs activation de multiples systmes plasmatiques et cellulaires. Ce systme rpond finalement aux mmes squences physiopathologiques que celles qui rgissent la cicatrisation aprs une lsion cutane.

I.1.5. Principales pathologies vasculaires Les principales pathologies touchant le systme vasculaire, se sont lathrosclrose, la thrombose, la formation danvrismes et la dissection. Lathrosclrose est la principale forme de ces pathologies, cest pour cela que nous nous y intresserons particulirement.

I.1.5.1. Epidmiologie des maladies cardiovasculaire Les maladies cardio-vasculaires sont la principale cause des dcs dans les pays occidentaliss, elles seraient responsables d'environ 50 % des dcs rpertoris. L'incidence de ces maladies est variable d'un pays un autre, en France il y a environ 180 000 dcs annuels lis aux maladies cardiovasculaires, soit 32 % des dcs totaux, avec 50 000 dcs par infarctus du myocarde, ce qui en fait la premire cause de mortalit en France, suivi de prs par les accidents vasculaires crbraaux [19], cette incidence est plus leve dans le nord de la France que dans le sud. Dans le monde, l'incidence de la maladie est leve dans les pays d'Europe du Nord (Scandinavie, Irlande, cosse et en Amrique du Nord). Elle est beaucoup plus faible dans les zones mditerranennes, dans les pays asiatiques et dans les pays mergents. La prvalence de l'athrosclrose est corrle avec le stade d'industrialisation d'une contre, les habitudes alimentaires et le mode de vie [20]. noter qu'aux tats-unis et en Europe de l'ouest, les complications de l'athrosclrose ont diminu de 30% ces trente dernires annes la fois grce aux progrs de la prvention des facteurs de risque et aux progrs des thrapeutiques la fois mdicamenteuses et interventionnelles.

I.1.5.2. Lathrosclrose Lathrosclrose est la principale pathologie des artres coronaires, elle se caractrise par une perte des proprits structurales de la paroi artrielle [21]. Une obstruction partielle ou totale de lartre par une plaque athrosclrotique conduit une stnose (figure 4) ou une occlusion. Cette maladie est donc responsable d'ischmie (angor) et de ncrose (infarctus) du myocarde [22]. 16

Revue bibliographique Lathrosclrose est dfinie par lOrganisation Mondiale de la Sant comme une association variable de remaniements de l'intima des artres de gros et moyen calibre, consistant en une accumulation locale de lipides (formation de dpts lipidiques par le cholestrol en excs), s'imprgnant progressivement de glucides complexes, de sang et de produits sanguins, de tissus fibreux, de dpts calciques et de plaquettes, le tout s'accompagnant de modifications de la tunique intermdiaire (la mdia) [23]. Cest une pathologie artrielle correspondant une pathologie inflammatoire chronique lie linteraction entre les lipoprotines modifies, les cellules inflammatoires, macrophages drivs des monocytes circulants et lymphocytes T, et les lments cellulaires de la paroi artrielle [24]. Cette inflammation chronique conduit un processus ractionnel cicatriciel de la paroi artrielle impliquant les cellules musculaires lisses et la production de matrice extracellulaire [25]. Certaines de ces lsions inflammatoires, trop importantes ou trop brutales, vont conduire des lsions qui vont se compliquer par une rupture ou une rosion de plaque et une thrombose artrielle [26]. Les prsentations cliniques de la maladie athrosclreuse sont videmment multiples et fonction de lartre touche. Latteinte coronaire et linfarctus du myocarde dominent par leur frquence et leur svrit suivis de prs par les atteintes carotidiennes et les accidents vasculaires crbraux. Mais la maladie reste souvent silencieuse et le patient le plus souvent asymptomatique [27].

Figure 4. Reprsentation schmatique dune artre stnose vue en coupe; rduction de la lumire de lartre par la plaque athrosclrotique [21] .

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Revue bibliographique I.1.5.3. Physiopathologie de lathrosclrose Les tudes exprimentales les plus rcentes, associes aux observations anatomopathologiques faites sur des plaques humaines, permettent daffirmer aujourdhui que lathrosclrose est une maladie inflammatoire chronique des grosses artres localisation intimale [21, 28], et que lagent dagression entranant la raction inflammatoire est trs probablement le cholestrol-LDL modifi notamment par oxydation [29-31] comme montre la figure 5.

Figure 5. Les Principes de base de Synthse du Cholestrol [32].

I.1.5.3.1. Gense de la plaque Les diffrents mcanismes qui contribuent la gense, puis la complication de la plaque d'athrosclrose sont maintenant bien connus [33]. Les diffrents stades volutifs de l'athrosclrose comme le montre la figure 6 sont : la strie lipidique, la lsion fibro-lipidique et lsion complique [34]. La premire tape de l'athrosclrose est la pntration passive et l'accumulation des lipoprotines de basse densit (LDL-Cholestrol) dans l'intima [35]. Ce phnomne est directement en relation avec la quantit de LDL-Cholestrol plasmatique [36]. Cette infiltration lipidique est suivie d'une modification oxydative des LDL par diffrents mcanismes notamment enzymatiques [37]. Ensuite viens le recrutement des monocytes du sang qui se transforment en macrophages et cellules spumeuses. La dysfonction de lendothlium, notamment secondaire la prsence des LDL oxyde qui favorise l'adhsion des monocytes circulant au niveau de la surface de l'endothlium. Ces monocytes pntrent ensuite l'espace sous endothlial et se transforment en macrophage sous l'influence de diffrents facteurs : le MCP-1 (monocyte chemotactic protein-1) est ncessaire au passage des monocytes entre les cellules endothliales; le M-CSF (monocyte-colony stimulating factor) est ncessaire la diffrenciation 18

Revue bibliographique des monocytes en macrophages et leur prolifration. Ces macrophages vont alors jouer un rle dltre important dans les diffrentes tapes de l'athrosclrose, essentiellement en entranant une raction inflammatoire chronique locale et la production de cytokines pro-inflammatoire [38]. Ces cytokines inflammatoires vont gnrer la fois la croissance de la plaque, et sa fragilisation. D'autres macrophages se chargent en LDL oxydes et se transforment en cellules spumeuses [39, 40].

Figure 6. Les diffrentes tapes de la constitution de la strie lipidique et de la plaque dathrosclrose [41] . A : infiltration et oxydation des LDL dans l'intima, B : Inflammation de la paroi artrielle, C : Transformation des monocytes en macrophages et cellules spumeuses, D : les LDL oxydes favorisent la formation du thrombus, E : lsion athrosclreuse.

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Revue bibliographique I.1.5.3.2. Formation de la plaque mature Le cur lipidique de la plaque est constitu de lipides extra et intracellulaire, ce centre lipidique de la plaque est isol de la lumire artrielle par une chape fibreuse constitue de cellules musculaires lisses, de collagnes et d'une matrice extracellulaire. Ces cellules musculaires lisses proviennent de la mdia, migrant travers la limitante lastique interne vers lintima o elles prolifrent sous linfluence de facteurs de croissance tels que le PDGF (platelet derived growth factor) [42]. Cette raction de croissance est tributaire dun changement de phnotype des cellules musculaires lisses (transition dun phnotype diffrenci contractile vers un phnotype ddiffrenci scrtoire ). La thrombine semble aussi jouer un rle important [43, 44]. Lintgrit de la chape fibreuse est un lment dterminant de la stabilit des plaques dathrosclrose [45]..

I.1.5.3.3. Profils volutifs de la plaque stable L'volution sur des annes de la plaque se fait par une progression parallle du centre lipidique et de la chape fibreuse. Progressivement cette plaque d'athrome fait protrusion dans la lumire artrielle entranant donc la formation d'une stnose artrielle. Longtemps cette stnose reste modeste grce des phnomnes compensateurs de l'artre appels remodelage vasculaire (l'artre se dilate pour compenser la protrusion de la plaque). Ce mcanisme est ensuite dpass et la stnose devient significative et serre [46].

I.1.5.4. La stnose L'athrosclrose est caractrise par la prsence d'une plaque athromateuse qui prend de l'expansion dans la lumire du vaisseau et abaisse significativement le dbit sanguin des sujets. Cette plaque cre ce que l'on appelle une stnose. Avec l'assistance d'un systme morphomtrique informatis, Kragel et al. ont pu dfinir les diverses composantes prsentes dans la plaque athrosclrotique [47]. Il ressort de cette tude que les tissus fibreux composent la majorit de la plaque, soit 80%, alors que les lipides extracellulaires et le calcium en reprsentent 5%. Les 15% rsiduels consistent en des composs varis. Dans une situation stable, le caractre fibreux de la plaque lui confre une protection contre des fissures possibles et permet d'viter des risques d'accidents critiques, voire mortels, pour le patient. La complexit de la plaque athrosclrotique est indniable suite ces observations, d'o l'importance de bien connatre le milieu o se produisent les vnements afin de pouvoir cerner toute la problmatique entourant l'athrosclrose. Le vaisseau dficient a donc t dcortiqu par plusieurs groupes de recherche afin de rcolter le maximum d'informations sur le mcanisme de l'athrosclrose. 20

Revue bibliographique I.1.6. Langioplastie L'angioplastie est galement appele angioplastie par ballonnet, ou encore angioplastie coronarienne transluminale percutane (ACTP). Cest une revascularisation coronarienne qui consiste restaurer lapport sanguin au myocarde travers les artres coronaires par dsobstruction mcanique de la lumire artrielle. Depuis la premire angioplastie coronaire, ralise par Gruntzig en 1977 [48], cette technique beaucoup moins traumatisante que le pontage, connat un essor spectaculaire, avec 117000 procdures au cours de anne 2007.

I.1.6.1. Mcanisme de langioplastie au ballonnet Le principe de cette technique, cest la dilatation par ballonnet sous contrle radioscopique pour craser la plaque athromateuse et remodeler le vaisseau. Cette mthode consiste introduire, via l'artre fmorale, un cathter muni d'un ballonnet l'intrieur du systme artriel et de le positionner au site stnos. Une fois en position, l'oprateur gonfle le ballonnet afin d'craser la lsion contre la paroi, favorisant le rtablissement d'un calibre coronaire correct et permettant ainsi une perfusion myocardique suffisante (figure 7) [49]. Les rsultats de cette mthode sont fascinants, puisqu'un taux de succs de l'ordre de 90% est couramment atteint. Cette rjouissance est de courte dure, puisquil y a rapparition d'une nouvelle lsion au site dilat dans les six premiers mois suivants la chirurgie [50]. On dnombre 30 60% [51-54] de patients victimes de cette rocclusion nomme restnose.

Figure 7. Angiographie de lartre carotide interne A : stnos 95% ; B : aprs dilatation par ballonnet I.1.6.2. Les stents et leur implantation Lintroduction des stents la fin des annes 80 a constitu une tape dcisive dans le dveloppement des techniques de cardiologie interventionnelle [55, 56]. Le stent est form dun 21

Revue bibliographique cylindre en grillage mtallique, il agit la manire dun petit ressort pour maintenir la circulation sanguine dans une artre dont le conduit sest rtrci (stnose) comme le montre la figure 8. Ces endoprothses sont dsormais la principale technique dangioplastie coronaire percutane en France, comme dans les autres pays occidentaux avec un taux de russite non ngligeable [57]. La principale limite de cette technique est la survenue de restnose au site dimplantation du stent. Compar la technique dangioplastie simple, le placement du stent coronaire a un plus grand taux du succs clinique, avec une frquence infrieure de restenose et de revascularisation du vaisseau cible [58, 59]. Cependant, cet avantage peut tre li un risque important de complications vasculaires long terme [53]. Les stents peuvent provoquer une inflammation de la paroi vasculaire et une prolifration de cellules musculaires lisses qui conduisent la diminution de la lumire artrielle. La biocompatibilit de ces stents peut tre amliore en modifiant leur surface, par greffage ou adsorption de molcule bioactives ou par enrobage du stent par un film de polymre contenant un principe actif [60].

Figure 8. Les diffrentes tapes A : avant infarctus du myocarde, B : pendant infarctus du myocarde, C : angioplastie par ballonnet, D : pose de stent [61]

I.1.7. La Restnose La restnose est une rponse cellulaires au traumatisme artriel caus par l'angioplastie [62] et qui implique une interaction complexe entre cellules inflammatoires, protines sanguines [63] et les lipides plasmatique [64] dune part et les plaquettes [65], les cellules endothliales et les cellules musculaires lisses [66] dautre part . La rocclusion des artres reprsente un enjeu 22

Revue bibliographique considrable puisqu'on lui attribue l'chec de plusieurs centaines de milliers d'interventions et un cot estim 2 milliards de dollars par anne dans le systme de sant amricain. Elle constitue en quelque sorte une forme acclre d'athrosclrose dont les consquences sont trs graves [67].

I.1.7.1. Les mcanismes de la restnose Le gonflement du ballonnet et la pose de stent dans l'artre crent un dommage svre sur tous les lments composant le vaisseau sanguin. Suite la dilatation, l'endothlium est dnud de sa couche protectrice favorisant un environnement thrombognique. La lame lastique interne se trouvant dans la mdia est endommage, les cellules vasculaires musculaires lisses subissent un tirement et une destruction invitable, et la matrice extracellulaire composant la mdia et l'adventice est galement perturbe. On assiste ventuellement un phnomne de cicatrisation du site endommag [68].

I.1.7.2. Thrombose, inflammation, migration et prolifration Le processus de cicatrisation se produit immdiatement aprs le dommage qui est initi par les vnements thrombotiques tels que la dposition et l'agrgation plaquettaire; la formation d'une thrombose par l'accumulation de fibrine et la libration de substances issues des plaquettes (ex. PDGF, bFGF, TGF qui vont agir sur les cellules musculaires lisses, les cellules inflammatoires et fibroblastes) [42]. Les vnements inflammatoires caractrisent le deuxime processus fondamental et dbutent par l'adhsion des leucocytes, l'activation des lymphocytes et monocytes circulantes [69]. Une fois ces cellules actives, leur principale fonction est de relcher les cytokines et les facteurs de croissance dans le milieu [70]. Quelques jours aprs le dommage, la thrombose et l'inflammation du vaisseau stimulent la migration des cellules musculaires lisses et provoque leur prolifration dans l'intima pour former une nouvelle couche appele: nointima. La diminution de la lumire est la consquence directe de cette cascade dvnements.

I.1.8. Stents bioactifs Afin damliorer les effets nfastes dus la pose des stents, qui entranent comme nous lavons vu prcdemment, une hyperplasie intimale lie la raction de cicatrisation de lartre, la modification chimique de la surface des stents par une association un agent thrapeutique constitue un dveloppement important depuis 1998 [71]. Cette modification a pour but de rduire la prolifration nointimale, dviter les ractions de thromboses et dinflammation, principales causes du phnomne de la restnose. Et depuis lintroduction des stents actifs et le dveloppement de cette technique le taux de restnose a t rduit moins de 10%. 23

Revue bibliographique I.1.8.1. Stents imprgns dhparine La premire exprience clinique utilisant un stent imprgn actif a t ralise avec un stent en acier inoxydable auquel taient lies de faon covalente des molcules dhparine [72], en se liant lantithrombine III circulante, lhparine fixe au stent inhibe la formation de thrombine dans lenvironnement du stent, elle inhibe aussi lagrgation plaquettaire [71] . Dans ltude multicentrique Benestent-II [73], la proportion de cas avec thrombose subaigu intrastent tait trs faible (0,4%), et le risque de restnose plus faible que dans le groupe tmoin trait par une angioplastie au ballonnet seul (16% contre 31 %). Toutefois, labsence de groupe tmoin recevant un stent classique ne permettait pas de conclure lefficacit spcifique du stent recouvert dhparine. Ces rsultats encourageants ont ouvert la voie au dveloppement dautres stents bioactifs dlivrant des molcules limitant la restnose intrastent, le sirolimus et le paclitaxel.

I.1.8.2. Stents Cypher, enrob de sirolimus La rapamycine (sirolimus) est un antibiotique naturel de la classe des macrolides, produit par un micro-organisme (champignon) Streptomyces hygroscopicus, cette molcule joue un rle dimmunosuppresseur [74] par linhibition de la transduction du signal initi par linterleukine IL2 au niveau des lymphocytes T. R. Gallo et al. [75] ont montr que des injections systmiques de rapamycine diminuent denviron 50% lhyperplasie intimale des coronaires de porc aprs une angioplastie au ballonnet; cet effet intervient via une augmentation de lexpression de la protine p27 (un inhibiteur des kinases dpendantes des cyclines) et une diminution de la phosphorylation de la protine du rtinoblastome (Rb). Il rsulte de cette chane dvnements molculaires une inhibition de la prolifration des cellules musculaires lisses (arrt en phase G1, effet cytostatique), mais aussi de leur migration, ce qui fait de la rapamycine un candidat potentiel pour la prvention des restnoses. Suzuki et al. [76] ont test leffet dun stent recouvert de rapamycine dans un modle de restnose coronaire chez le porc. Le copolymre (non biodgradable) utilis dans cette tude tait une association de poly-n-butyl mthacrylate et de polythylne-vinyl actate contenant environ 185 g de rapamycine. Lactivit prolifrante 7 jours et la surface nointimale 4 semaines taient diminues de 50% dans le groupe recevant le stent recouvert de rapamycine, par rapport au groupe recevant le stent mtallique sans polymre. Ces stents lution de sirolimus rduisent considrablement le risque de restnose intrastent aprs une intervention coronarienne percutane comparativement au stent nu [77-79] Les rsultats de ltude randomise RAVEL ont confirm ces rsultats: aprs un suivi de 6 mois, 26% des patients du groupe tmoin avaient une restnose angiographique, contre 0% dans le groupe rapamycine. Et 210 jours, 72,9% des patients taient indemnes dvnements 24

Revue bibliographique cliniques (dcs, infarctus ou restnose ncessitant une nouvelle procdure de revascularisation) dans le groupe tmoin, contre 96,7% dans le groupe rapamycine [80]. Dans ltude SIRIUS [81], qui est ralise chez une population de patients plus svrement atteints, les stents au sirolimus diminuent la survenue 9 mois de revascularisation, qui est retrouve chez 8,6 % des patients ayant reu un stent au sirolimus contre 21 % chez les patients tmoins. Une autre tude [82] dmontre l'efficacit de ces stents aprs deux annes de suivit.

I.1.8.3. Stents Taxus, enrob de paclitaxel Le paclitaxel (Taxol), agent naturel prsent dans lcorce de lif du Pacifique (Taxus brevifolia), est une molcule cytotoxique utilise dans le traitement des cancers de lovaire. Responsable dune polymrisation et de la stabilisation de la tubuline, principale protine implique dans la formation des microtubules du fuseau mitotique, le paclitaxel favorise l'assemblage de la tubuline en microtubules et stabilise les microtubules forms, ce qui empche la division cellulaire, cette drogue bloque la mitose en interphase et entrane la mort cellulaire [83]. Heldman et al. [84] ont implant dans des artres coronaires de porcs un stent mtallique recouvert dun film de paclitaxel (0 187 g/stent) dilu dans de lthanol, sans adjonction de polymre. Aprs 4 semaines de suivi, on observe une rduction de lhyperplasie intimale intrastent dpendante de la dose utilise, mais aussi la prsence dune hmorragie intra-intimale dont limportance semble galement lie la dose de paclitaxel utilise. A. Farb et al. [85] ont utilis un stent recouvert de paclitaxel (0 42 g/stent) stabilis par une couche de glatine et de sulfate de chondrotine. Une diminution de 35% 50% de lhyperplasie intimale de lartre iliaque de lapin est observe aprs 4 semaines de suivi, mais leffet protecteur nest plus observ aprs 90 jours. Par ailleurs, on note un excs, dpendant de la dose de paclitaxel, dhmorragies intimales, de dpts de fibrine et dinflammation vasculaire. Dans le mme modle, D.E. Drachman et al. [86] ont utilis un stent recouvert du copolymre poly(lactide-co-caprolactone) contenant 200 g de paclitaxel: lpaississement intimal est diminu de 50% 60% 1 mois, 2 mois et 6 mois, mais on observe un excs de fibrine et dinfiltrat inflammatoire, un dfaut de matrice extracellulaire et un retard net de rendothlialisation persistant 6 mois. Plusieurs tudes randomises ont t ralises avec des stents recouverts de paclitaxel. Dans ltude TAXUS II [87], les patients ayant reu un stent librant du Taxol avec une cintique lente et modre ont une obstruction luminale, mesure par chographie endocoronaire, de seulement 8% contre 20% dans les groupes tmoins, aboutissant une diminution nette du risque de restnose angiographique (2% 5% contre 20% 24% pour les sujets tmoins).

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Revue bibliographique I.1.8.4. Stents actifs et stents nu. Les taux de rintervention sont trs proches si on compare les stents bioactifs entre eux (sirolimus et paclitaxel) [88]. Par contre si on compare les stents nus avec les stents bioactifs au cours de linfarctus le taux de rintervention du vaisseau cible est rduit avec les stents bioactifs sans influer significativement sur la mortalit ni sur le taux de rinfarctus [89]. Cela est due la laugmentation du taux de thrombose par les stents actifs contrairement au stents nu qui sont moins thrombogne mais prsentent un risque plus lev de restnose (figure 9).

Figure 9 : Complications des stents coronariens. a : stent mtallique, b :stent bioactif [90]

I.1.8.5. Thrombose lie au stents actifs Malgr l'amlioration considrable des endoprothses coronaires lie l'utilisation de stents actifs au sirolimus ou au paclitaxel, le risque d'une thrombo-occlusion d'une artre traite n'est pas nul et peut tre responsable de complications parfois graves, d'autant que susceptibles d'intervenir aprs la phase d'hospitalisation qui, aujourd'hui, ne dpasse pas en rgle gnrale trois jours dans la plupart des centres d'angioplasties coronaires. Au cours des premiers mois suivant limplantation, le risque nest rduit que denviron 2 3% par rapport aux stents nus. Dautres tudes ont montr par la suite que la thromboses de stents actifs, est denviron 0,6% par an, ce qui est au-dessus des valeurs des stents nus [91-93]. Dautres travaux sur lartre iliaque du lapin ont montr que les zones de chevauchement de stents taient le sige dun retard de r-endothlialisation encore plus marqu que les zones 26

Revue bibliographique sans chevauchement. Ce retard de r-endothlialisation peut jouer un rle majeur dans la survenue de thrombose sur stent actif [94].

I.1.8.6. Retard de r-endothlialisation Lallongement du dlai de cicatrisation endothliale induit par le mdicament antiprolifratif a t associ avec la survenue de thrombose de stent tardive au del du premier mois, priode habituellement dcrite pour les stents nus. La question a alors t pose dun risque accru de thrombose sur stents actifs comparativement aux stents nus. Dans le monde rel de langioplastie coronaire avec stent non enrob, lincidence de la thrombose est actuellement value moins de 1%. Lincidence de ce phnomne avec le stents actifs a fait lobjet dune surveillance trs troite. Dans ltude TAXUS IV portant sur plus de 1200 patients, la thrombose sur stent est observe dans 0,6% des cas. Concernant le stent lution de sirolimus, le registre e-Cypher a permis une analyse prcise de diffrentes composantes de la thrombose de stent : 0,1% de thrombose aigue (phase hospitalire) ; 0,55% de thrombose subaigu (premier mois) ; et 0,30% de thrombose tardive (au del du premier mois).

Lensemble de ces donnes est rassurant, lincidence de thrombose sur stents actifs reste faible sous rserve de maintenir lassociation aspirine et clopidogrel (antiagrgant plaquettaire) de faon plus prolonge [95]. Comme le montre la figure 10, le sirolimus et le paclitaxel inhibent aussi bien la migration que la prolifration des cellules musculaires lisses et rduit ainsi la restnose. Dautre part, ces substances inhibent galement le homing, la prolifration ainsi que la diffrenciation des cellules prcurseurs endothliales; par ailleurs, elles inhibent la migration et la prolifration des cellules endothliales limitrophes et induisent lexpression de facteurs tissulaires qui accroissent potentiellement, la thrombognicit du stent [96]. Dautre part, le polymre comme la structure du stent peuvent entraner une raction dhypersensibilit dans la paroi vasculaire.

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Revue bibliographique

Figure 10. Effets biologiques des stents librant des mdicaments dans la circulation coronarienne [97] Finalement, les stents bioactifs actuellement disponibles ne sont pas encore optimaux. Il faudrait trouver un support inhibant aussi bien la migration et la prolifration des cellules musculaires lisses, qui soit anti-inflammatoire, possde des proprits antithrombotiques et stimule la rgnration et la migration des cellules endothliales, soit localement, soit par la stimulation des cellules endothliales prognitrices. Pour linstant, ce profil nest pas encore obtenu avec une seule substance, bien que certaines molcules couvrent une partie de ces proprits. Il est donc possible que le problme soit rsolu par la combinaison de plusieurs substances.

I.2. Les biomatriaux et la biocompatibilit Les besoins de la prservation de lintgrit corporelle, la rparation des lsions dorganes ont conduit lutilisation de matriaux non-vivants au contact de lorganisme. Ces procdures dj utilises dans lantiquit ont conduit la recherche scientifique dfinir beaucoup plus prcisment le concept de biomatriau. Les biomatriaux doivent avoir la fois des proprits mcaniques adaptes la fonction attendue et des proprits biologiques garantissant une interaction sans inconvnient au niveau de l'interface matriau-tissus [98]. C'est ainsi que dans le domaine de la substitution vasculaire 28

Revue bibliographique artrielle de petit calibre, cette double exigence passe par la mise au point de matriaux combinant des proprits structurales garantissant un comportement mcanique satisfaisant et des proprits biologiques vitant la survenue de phnomnes de coagulation. Cependant, pour des applications en contact avec le sang, il est trs difficile de trouver des matriaux rpondant aux deux conditions la fois.

I.2.1. Dfinition dun Biomatriau La Socit Europenne des Biomatriaux (European Society for Biomaterials) a nonc en 1986 la dfinition dun biomatriau. Cette dfinition a t amende en 1991, lors de la confrence de Chester (UK) : Un biomatriau est un matriau conu pour interagir favorablement avec les systmes biologiques, quil participe la constitution dun dispositif vise diagnostique ou celle dun substitut de tissu ou dorgane ou encore celle dun dispositif de supplance (ou dassistance) fonctionnelle . Le domaine des biomatriaux est donc trs vaste et regroupe plusieurs milliers de produits, dorigine naturelle pour certains ou drivant directement du domaine des matriaux de synthse, pour les autres, condition de leur absence deffet dltre pour lorganisme [99]. Les biomatriaux peuvent tre class en quatre groupes : Mtaux et alliages mtalliques, Cramiques, Polymres synthtiques, Matriaux dorigine naturelle.

I.2.2. La Biocompatibilit Quelle que soit sa qualit, un biomatriau reste un corps tranger et son introduction dans lorganisme entrane une raction plus ou moins importante du tissu environnant. Dans ce concept la biocompatibilit a t dfinie de faon consensuelle sous lgide de la mme socit (European Society for Biomaterials), comme la capacit dun matriau induire une rponse approprie de lhte dans une application spcifique [100]. La biocompatibilit signifie dune part que le matriau nest pas lorigine de phnomnes locaux ou systmiques nfastes pour la sant du receveur (toxicit, carcinognicit) et dautre part que les tissus du receveur et les fluides physiologiques en particulier le sang ne sont pas susceptibles daltrer le matriau au dtriment de ses qualits intrinsques ou au risque de gnrer des produits de dgradation toxiques. Alors que des millions de dispositifs mdicaux sont implants chez lHomme chaque anne avec un taux de succs trs raisonnable, tout implant non dgradable va induire chez lhte un passage linflammation aige et mme une rponse un corps tranger long terme. Dans le contexte de limplantation, ces rponses doivent tre perues comme tant des rponses locales invitables, ltendue et la dure de la raction inflammatoire caractrisent la biocompatibilit du 29

Revue bibliographique biomatriau [101]. Ainsi, le degr de perturbation des mcanismes homostatiques et ltendue des rponses physiopathologiques sont des mesures de la raction de lhte qui peuvent permettre de dterminer la biocompatibilit dun biomatriau et ses chances dutilisation en tant quimplant [102, 103]. Par contre, un matriau qui provoque une raction adverse dans une application donne nest pas forcment condamner doffice puisquil peut tre tout fait biocompatible dans une autre application [104]. La notion de biocompatibilit nest donc pas une proprit intrinsque dun matriau mais plutt une proprit dusage lie une application particulire. Dans linteraction entre limplant et les tissus adjacents, les caractristiques physicochimiques de la surface dun matriau sont certainement parmi les paramtres les plus critiques considrer pour comprendre, prvoir et donc orienter la rponse initiale de lhte favorablement en fonction du rle de limplant, amliorant ainsi sa biocompatibilit. Les proprits de limplant dans son ensemble, encore appeles proprits de masse (composition intrieure), vont plutt dterminer le succs de limplant long terme [105]. Pour une valuation plus globale de la biocompatibilit dun systme implantable, il faut tenir compte non seulement du matriau qui le compose mais aussi des additifs, des rsidus et/ou contaminants de fabrication, des produits de dgradation, de linteraction de toutes les composantes et des caractristiques du produit fini. Une valuation du biomatriau isol ne savre pas suffisante pour prvoir la raction cause par le produit fini aprs son implantation [106]. Finalement, il nexiste pas de dfinition absolue de la biocompatibilit puisque le monde des biomatriaux est en perptuelle volution. Mais dun point de vue thorique, la rponse de lhte recherche, est toute interaction positive entre le matriau implant et les tissus avoisinants qui rsulte en une participation active des cellules priphriques dans le bon fonctionnement de limplant. La biocompatibilit correspond un processus dynamique bidirectionnel qui implique les effets temporels de lhte sur le matriau et du matriau sur lhte. Lorsquil est biocompatible, un matriau ne doit pas affecter ngativement lhte et vice versa.

I.2.3. Interaction sang biomatriaux Le choix dun matriau dpend de la fonction quil doit remplir et de la dure de son utilisation. cet effet, diffrents types de matriaux polymres ou mtalliques sont aujourdhui utiliss au contact du sang, ainsi lorsquun matriau est expos un environnement biologique, il induit naturellement diffrentes ractions telles que la coagulation du sang, lactivation du systme du complment et des interactions cellulaires. 30

Revue bibliographique Le premier vnement dcrit lors du contact sang-matriau est en gnral une adsorption non spcifique de protines plasmatiques. Elle est gnralement de faible affinit et le plus souvent dnaturante ; cette adsorption grossire concerne toutes les protines qui entre en comptition entre-elles. En effet le dplacement successif des protines plasmatiques adsorbes sur des surfaces artificielles, dpend de la concentration, de laffinit et de la vitesse de transport des protines. Ainsi une protine qui sadsorbe rapidement mais avec une faible affinit sera remplace par une protine moins abondante qui sadsorbe lentement avec une affinit leve. Ce processus est responsable de lactivation de la coagulation du sang ou formation du thrombus qui a lieu quelques minutes aprs le contact du sang avec le matriau. Afin de pallier une cascade dvnements nfastes pour lhte il savre donc primordial damliorer la biocompatibilit des prothses afin dinduire des ractions biospcifiques et bnfique pour lhte. Il sagit alors de pouvoir contrler les tapes prcoces de ladsorption pour dvelopper des matriaux hmocompatibles. Ceci a pu tre ralis par la mise en uvre des polymres biospcifiques, par exemple, lorsque lhparine est lie au stent dune manire covalente, elle inhibe la formation du thrombus [107, 108] et favorise lendothlialisation de la prothse.

I.2.4. ladhsion cellulaire Les interactions des cellules avec leur environnement sont dune importance cruciale pour leur devenir et leur comportement. Divers mcanismes entrent en jeu suivant le partenaire avec lequel la cellule interagit : une autre cellule ou la matrice extracellulaire. Cette matrice est forme de collagne, de protoglycans, dlastine, dacide hyaluronique, de kratine et de diverses glycoprotines qui vont interagir avec les cellules de manire spcifique.

I.2.4.1. Interaction polymres cellules Pour crotre et survivre in vitro ou en contact avec un polymre, les cellules en culture ont besoin dadhrer et de staler sur le support utilis pour leur culture. Ladhsion cellulaire sur des substrats tels que la matrice extracellulaire ou dautres supports artificiels est un processus fondamental dans la formation des tissus, dans la diffrenciation cellulaire et dans la morphogense. De ce fait, linteraction des cellules avec des surfaces polymriques constitue un point crucial dans certaines applications biomdicales et biotechnologiques. Chaque type dinteraction dpendra de la nature et de la distribution des sites dinteraction du polymre avec les domaines de liaison prsent sur la cellule ou dans la protine si linteraction est mdie. Dans les conditions physiologiques les protines du srum recouvrent 31

Revue bibliographique rapidement le matriau, les cellules adhrentes sont alors en contact dune couche protique pradsorbe sur le polymre [109]. Cette couche gnralement une paisseur de 2 5 nm. Ensuite ltalement cellulaire intervient si les conditions sont favorables, avec un temps de temps de latence de 20min aprs lensemencement. Pendant ces 20 min les cellules forment le contact avec le matriau et commence adhrer. Ltalement se produit pendant la phase G1 et la phase S du cycle cellulaire. La prolifration cellulaire peut alors dbuter. Ladhsion, ltalement et la prolifration cellulaire dpendent des proprits physicochimiques des polymres. Parmi ces proprits, on peut citer la morphologie, la composition chimique de la surface, sa mouillabilit et ladsorption protique, qui dpend dailleurs en partie de la mouillabilit. Enfin, ces interactions peuvent tre spcifiques ou bien non spcifiques. Interactions non spcifiques : Elles sont le rsultat dun processus dabsorption physicochimique. La membrane cellulaire est constitue dune bicouche lipidique qui retient plusieurs types de molcules tels que les protines, les polysaccharides Elles prsente ainsi une structure htrogne appele mosaque fluide. Lorsque la cellule entre en contact avec un substrat, plusieurs points dinteraction peuvent stablir ; ceux-ci sont gnrs par des combinaisons complexes dinteractions non spcifiques de type hydrophobe, ionique ou Van der Waals entre la membrane cellulaire et la surface du matriau. Interactions spcifiques : Les cellules peuvent interagir fortement et de faon trs spcifique avec une surface contenant des sites dinteractions ou des rcepteurs prsent dans une conformation et une densit appropries. Il peut sagir de composants du matriau, dans ce cas, linteraction est directe ou de sites de reconnaissance appartenant des protines adsorbes la surface, dans ce cas on parle dinteractions mdies par des protines. Il est bien tabli que les cellules qui ont besoin de raction dadhsion pour exprimer leurs fonctions, possdent leur surface des lments de reconnaissance indispensables. De nombreuses cellules adhrentes prsentent une dpendance vis--vis du srum in vitro. La manire dont le substrat adsorbe les composants du srum (slection des protines, conformation des protines adsorbes) conditionne le comportement des cellules qui adhrent ce substrat. Ltalement des cellules sur le substrat est accompagn dun rarrangement du cytosquelette, phnomne indispensable la survie et la prolifration de la plupart des cellules. Les composants du srum responsables de cet effet ont t identifis par de nombreuses quipes. Les protines capables de mdier lattachement et ltalement cellulaires sont la fibronectine, lalbumine, le fibrinogne, la laminine, et la vitronectine. Ces protines avec le collagne et les 32

Revue bibliographique protoglycanes composent la matrice extracellulaire qui comble les espaces extracellulaires aussi bien in vivo quin vitro. Chaque type dinteraction dpendra de la nature et de la distribution des sites dinteraction du polymre avec les domaines de liaison prsents dans la cellule ou dans la protine dattachement si linteraction est mdie. Ces interactions directes ou mdies gnrent diffrents signaux dans les cellules et induisent des modifications de la croissance cellulaire, de lexpression phnotypique, de la morphologie ou de lactivit biologique des cellules. Plusieurs sites de liaison cellules-support ont t dcrits, on peut citer : Les adhsions focales, cest les sites les plus forts dadhsion, souvent observs aux extrmits des cellules. Les protines extracellulaires impliques dans ce type dadhsion sont gnralement la vitronectine et la fibronectine qui se lient aux rcepteurs cellulaires nomms intgrines. Ce type dadhsion est responsable de la mobilit cellulaire [110]. Les contacts ferms, ils entourent gnralement les sites dadhsion focale. Par ailleurs, de nombreuses proprits du support ont t dcrites comme influenant le comportement des cellules en culture. Bien que chaque type cellulaire requiert des proprits diffrentes vis--vis dun support, les trois paramtres retenus pour une bonne adhsion et prolifration sont les suivants : Morphologie de surface Hydrophilie des polymres Adsorption de protines sur la surface

I.2.4.1.1. Morphologie de surface Certaines caractristiques morphologiques de la surface des biomatriaux, telles que la porosit, la courbure, la texture, sont connues pour influencer ladhsion cellulaire un substrat extracellulaire. La morphologie de surface dun biomatriau est gnralement htrogne, les discontinuits ou pores de celui-ci doivent tre assez petits pour permettre aux extensions cytoplasmiques cellulaires dadhrer et de former ainsi de sorte de ponts. De mme la rugosit doit tre faible pour permettre au cytosquelette dpouser la forme de la surface, une cellule ne peut pas staler sur une surface trs anguleuse.

I.2.4.1.2. Hydrophilie des polymres La nature des groupements chimiques ports par le polymre influence leur mouillabilit. Lhydrophilie ou lhydrophobie des polymres est corrle lnergie libre de surface. Il a t dcrit que des polymres entirement hydrophiles ou hydrophobes sont dfavorables ladhsion cellulaire. De nombreuses tudes ont montr que laffinit dadsorption et la quantit des 33

Revue bibliographique protines adsorbes augmentaient avec le caractre hydrophobe de la surface adsorbante [111]. De mme plus la protine est hydrophobe, mieux elle est adsorbe, surtout si le support est luimme hydrophobe.

I.2.4.1.3. Adsorption de protines sur la surface Les protines prsentes dans le milieu environnant ou scrtes par les cellules peuvent sadsorber linterface solide-liquide. Ladsorption de protines peut tre exploite pour modifier la surface dun matriau. Les fluides biologiques ou le milieu de culture complment par du SVF ont une composition complexe et riche. Lors du premier contact entre le milieu environnant et la surface, de leau, des ions et des soluts de faible poids molculaire sadsorbent rapidement la surface. Ladsorption de protines ensuite est la rsultante de lensemble de ces interactions solide-liquide. Les principes qui dterminent ladsorption de protines un biomatriau incluent ladsorption de monocouches de composs de faibles poids molculaires, les proprits de surface des protines, la concentration des protines dans le milieu environnant, leur coefficient de diffusion et les ractions de comptition qui stablissent entre diffrentes protines, leffet de la nature de la surface du biomatriau pour la slectivit dadsorption des protines. Plus gnralement, les protines ont tendance se dposer trs rapidement sur une surface. Les proprits individuelles des surfaces et les proprits spcifiques des protines dterminent ensuite lorganisation de la couche de protines adsorbes et la nature de cette couche dfinit son tour la rponse des cellules sur ces surfaces. Des expriences in vivo avec des prothses vasculaires de petit diamtre ont montr que ladsorption des protines sriques ne suffit pas une parfaite hmocompatibilit [112, 113]. La formation dune couche de cellules endothliales est indispensable afin dobtenir une hmocompatibilit long terme [114].

I.2.5. Les polymres synthtiques Les polymres sont des matriaux faciles mettre en forme, de plus, il existe une vaste varit de monomres dont les associations conduisent une large gamme de proprits mcaniques. Certains polymres produits en grande quantit pour des applications industrielles sont galement utiliss dans le domaine biomdical. Bien que ces matriaux ne soient pas vraiment biocompatibles (ils sont thrombognes et ncessitent ladministration danticoagulants), ils sont utiliss dans des applications de courtes dures tels que cathters, canules, tubulures dhmolyse et de circulation extracorporelle. Il sagit du polythylne (Intramedic), du polychlorure de vinyle (Tygon) et de certains polyurthannes.

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Revue bibliographique Les prothses vasculaires sont les plus souvent confectionnes en fibres de polytrphtalate dthylne (Dacron) ou bien en polyttrafluorothylne expans (Goretex). Ces matriaux sont destins des applications de long terme car leur surface structure leur confre une bonne flexibilit et une bonne stabilit. Selon le diamtre du vaisseau remplacer, locclusion de la prothse peut avoir lieu suite la formation du thrombus. En effet dans les prothses de diamtres suprieurs 6mm, le dbit sanguin est suffisamment important pour viter ce problme. En revanche, la formation du thrombus dans les vaisseaux moins larges provoque locclusion de la prothse.

I.2.6. Les polymres bioactifs Les polymres se prtent bien aux modifications chimiques. Il est possible par exemple de fixer des groupements chimiques fonctionnels sur une chane macromolculaire pour lui confrer des proprits biologiques particulires. Il est galement possible dassocier de manire covalente ou non des molcules biologiques des polymres synthtiques. La conception des polymres synthtiques doit tre adapte aux applications pour lesquelles ils sont destins. Pour des applications biomdicales, les polymres doivent rpondrent des critres stricts de non toxicit. La microstructure ainsi que ltat de surface de ces polymres dtermine lhmocompatibilit.

I.2.7. Les mtaux Ils sont utiliss dans des situations ncessitant des rsistances mcaniques considrables. Les mtaux les plus couramment utiliss sont lacier inoxydable (316L, Fe/Cr18/Ni10/Mo3), et des alliages base de titane (prothses dentaires). Tous sont nanmoins thrombognes, lacier inoxydable 316L est utilis pour fabriquer des stents. Dans le but de rendre ces matriaux non thrombognes, plusieurs recherches porte sur la modification de leur surface, tout en prservant leurs proprits mcaniques.

I.2.8. Les polysaccharides Les polysaccharides sont les macromolcules les plus abondantes sur terre et dans les ocans [115]. Ces macromolcules sont les lments structuraux majeurs de la paroi des cellules vgtales et des algues marines (cellulose, carraghnanes, alginates), on les trouve aussi dans les carapaces des insectes et crustace (chitosane). On peut les classer sous deux catgories selon leur fonction biologique : polysaccharides de rserve : la molcule source d'nergie pour les tres vivants est le glucose, principalement. On aura alors l'amidon chez les vgtaux et le glycogne chez les animaux. Polysaccharides structuraux : la cellulose qui participent la formation des 35

Revue bibliographique structures organiques chez les vgtaux. Dautres polysaccharides entrent dans la composition de la capsule entourant certaines bactries et virus et peuvent tre impliqus dans des mcanismes de reconnaissance cellulaire. Dans le milieu vivant, les polysaccharides jouent des rles trs divers, ils sont impliqus dans de nombreux processus physiologiques comme la catalyse de raction enzymatiques ou les phnomnes de reconnaissances cellulaires. Certains polysaccharides prsentent un intrt biomdical, dont lhparine qui est largement utilis dans le traitement des thromboses [116], la comprhension des mcanismes daction biochimiques de ces polysaccharides ncessite leur analyse structurale, leur modification par diffrentes mthodes afin disoler des sites spcifiques pour des ligands donns ou la caractrisation des groupements chimiques spcifiques des interactions. Sur le plan chimique, les polysaccharides sont des hydrates de carbone qui ont pour formule gnrale ([Cx(H2O)y)]n). Ce sont des polymres forms d'un certain nombre de monosaccharides. Ils constituent donc une famille trs importante de molcules souvent ramifies. Ils ont tendance ne pas prendre de forme particulire : on dit qu'ils sont amorphes. On distingue deux catgories de polysaccharides : les homopolysaccharides constitus du mme monosaccharide et les htropolysaccharides forms de diffrents monosaccharides. La nature de lunit saccharidique et le type de liaison glycosidique varient dun polysaccharide un autre mais ils ont tous en commun le fait dtre trs hydroxyls et donc hydrophiles. Mais ces polysaccharides nont pas toujours les proprits physico-chimiques souhaits pour les diffrentes applications, ils peuvent tre modifis par des ractions chimiques grce aux fonctions hydroxyles afin de leurs confrer de nouvelles proprits.

I.2.8.1. Lhparine Lhparine est un polyholoside htrogne sulfat, dorigine animale, cette macromlcule est essentiellement localise dans les mastocytes (foie, poumon, viscres). Cette molcule a t dcouverte par McLean en 1916 et isole par Howell en 1917. Lhparine est utilise comme agent antithrombotique depuis 1940 [117]. Appartenant la famille des glucosaminoglycanes (mucopolysaccharides) sa masse molaire varie de 4.000 40.000 daltons. Cette molcule est constitue dun enchanement linaire rptitif d'un "disaccharide rgulier" : acide L-iduronique sulfat en position 2, reli par une liaison 1 4 une D-glucosamine disulfate sur la fonction amine et en position 6 (glucosamine-N, 6-O-disulfate). On distingue deux types dhparines ; lhparine standard (ou hparines non fractionnes = HNF) et les hparines de bas poids molculaire (ou hparines fractionnes = HBPM).

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Revue bibliographique a. Lactivit anticoagulante de lhparine La proprit la plus connue de lhparine est son activit anticoagulante. Cette proprit est due la prsence dune squence particulire, diversement substitues par des groupes sulfates, sulfamates et actyles. Cette squence possde une forte affinit pour lantithrombine, ce qui permet une inhibition efficace de la thrombine, facteur cl de la coagulation.. Il savre que seulement un tiers des molcules contenues dans lhparine standard (non fractionne) est capable de se fixer lantithrombine, et les deux tiers restant nont aucune affinit pour cet inhibiteur plasmatique. Parmi ce tiers apte oprer cette activation, seul les masses molculaires suffisantes (entre 6 et 12kDa) sont capables dinhiber tous les facteurs de la coagulation sensibles lhparine, dont la thrombine. Le site de liaison de lhparine lantithrombine est constitu dune squence pentasaccharique dont la structure est parfaitement dtermine et confirme par synthse chimique. Cest cette squence qui est responsable de lactivit anticoagulante de lhparine par la formation dun complexe ternaire entre la thrombine, lantithrombine et lhparine. Ainsi lhparine favorise l'inhibition de la thrombine qui convertit le fibrinogne en fibrine insoluble, constitutive du thrombus figure 10.
Facteur dclenchant

Antithrombine
Facteur X Facteur Xa

Prothrombine (facteur II)

Thrombine (facteur IIa)

Fibrinogne

Fibrine (caillot)

Figure 10. Antithrombine et hparine. Le systme de la coagulation (trs simplifi sur ce schma) est maintenu en quilibre laide dinhibiteurs physiologiques parmi lesquels lantithrombine qui joue un rle rgulateur fondamental. Lhparine se lie lantithrombine, induit un changement de conformation de cette protine qui renforce la vitesse dinhibition de la thrombine ( 4 000 fois) et du facteur Xa ( 500 fois) [10].

b. Lactivit anticomplmentaire de lhparine En plus de sa capacit inhiber la coagulation, lhparine est galement capable dinhiber lactivation du complment diffrentes tapes, ces deux activits indpendantes l'une de l'autre, rsident dans des sites diffrents. L'hparine rgule l'activit du complment et interagit avec les 37

Revue bibliographique protines du systme du complment en interfrant sur la formation des C3 convertases des voies classique et alterne, inhibe la liaison du facteur B au fragment C3b et interfre avec lassemblage de C5b-9 [118]. Physiologiquement, lactivation de ces composs initie la raction inflammatoire et intervient dans la rponse immunitaire afin dliminer les agents infectieux. Lactivit anticomplmentaire de lhparine est surtout lie aux fonctions sulfates.

c. Lactivit antiprolifrative de lHparine Si le rle anticoagulant et antithrombotique de l'hparine sont bien tablis, lhparine joue aussi un rle dinhibiteur des cellules musculaires lisses [119]. De nombreux travaux ont montr que lhparine inhibe la prolifration des CMLs [120] in vitro et in vivo rduit leur migration et module le mtabolisme de la matrice extracellulaire. Cet effet est du une interaction spcifique entre lhparine et les CMLs, ainsi Garg et al ont russi dterminer la squence responsable de cette inhibition [121].

I.2.8.2. Le fucane Le nom fucane est un terme gnrique dsignant une famille de polysaccharides sulfats extraits de la paroi des algues brunes (phophyces), et plus ou moins riches en units L-fucose. Ils sont rpartis en trois groupes : les fucodanes ou homofucanes, les ascophyllanes ou xylofucoglucuronanes et les sargassanes ou glucuronofucogalactanes. La composition chimique des fucanes est trs variable selon lespce (Ascophyllum nodosum, Fucus vesiculosus, Fucus spiralis, Pelvetia canaliculata), lge, lhistorique de lalgue, lhabitat, la saison de rcolte ainsi que les conditions dextraction. Les fucanes possdent des structures trs htrognes, gnralement avec un haut poids molculaire [122].

a. Lactivit biologique des fucanes Les fucanes au mme titre que d'autres polysaccharides sulfats, prsentent des activits biologiques diverses dont certaines peuvent se rvler intressantes en pharmacologie [123]. En effet, leur structure proche de celle de l'hparine ou des glycosaminoglycannes en gnral, leur permet d'interagir avec un certain nombre de molcules de l'organisme humain. Grce ces capacits de reconnaissance, les fucanes interagissent avec des protines solubles ou structurales, impliques dans des processus biologiques comme la coagulation sanguine, l'inflammation [122] et la prolifration cellulaire.

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Revue bibliographique b. Lactivit anticoagulante des fucanes Les fucanes catalysent fortement linhibition de la thrombine par les inhibiteurs plasmatiques cofacteurs de lhparine, lantithrombine, et surtout par le deuxime cofacteur de lhparine [124]. De plus, des fucanes de bas poids molculaires obtenus par dgradation radicalaire possdent une activit anticoagulante qui toutefois reste faible par rapport celle de lhparine.

c. Lactivit anticomplmentaire des fucanes Les fucanes sont de puissants inhibiteurs des deux voies du systme de complment in vitro. La masse molculaire et la composition chimique des fucanes dterminent leur activit anticomplmentaire. Cette activit augmente quand la proportion de xylose, de galactose et dacide glucuronique augmente. concentrations gales, les fucanes sont 5 fois plus actifs que lhparine dans linhibition de la voie classique et possdent une activit similaire lhparine dans linhibition de la voie alterne du complment [125]. Les fucanes empchent la formation des C3 convertases classiques. Ils interfrent dans le mcanisme dactivation de la protine C1 ou inhibent le clivage de la protine C4 et linteraction entre C4b et C2. Ces composs empchent la formation et la fonction de la C3 convertase alterne en bloquant la fixation du facteur B la protine C3b et en interfrant dans la stabilisation du complexe par la properdine.

d. Lactivit antiprolifrative des fucanes Une tude de cintique de synthse dADN par incorporation de thymidine tritie a montr que les fucanes de faible masse molculaire (19 kDa), inhibent la prolifration des cellules musculaires lisses, en bloquant la progression du cycle cellulaire en phase G0/G1, de plus, les fucanes sont internaliss par les cellules sans que l'on puisse dire si cette internalisation est ncessaire l'activit antiprolifrative[126].

I.2.8.3. Le dextrane Le dextrane (C6H10O5)n est un polyglucoside naturel synthtis par des bactries de la famille lactobacillus. Il est constitu d'units -D-glucose essentiellement lies entre elles par des liaisons glucosidiques alpha 1-6 (95%) et parfois alpha 1-3 (5%) [127]. Ce polysaccharide gnralement une trs grande solubilit en milieu aqueux et dans certain solvant organique trs polaire comme le DMSO du fait de la forte proportion de liaison glycosidique de type -D(16), cette proportion leve confre au dextrane une meilleure stabilit dans les conditions acides ou basiques. 39

Revue bibliographique Le dextrane est dgrad par une enzyme la dextranase produite par les bactries et non par les tissus [128]. Il est produit de faon industrielle partir du saccharose par les glucosyltransfrases de la souche Leuconostoc mesenterode [129]. Sa quasi-inertie biologique fait du dextrane l'objet de nombreuses applications, allant des additifs alimentaires jusqu'aux utilisations pharmaceutiques et mdicales.

I.3. Modifications chimiques des polysaccharides Les modifications des polysaccharides par des ractions chimiques ont principalement comme but une modification de leurs caractristiques physico-chimiques pour amliorer ou leur confrer de nouvelles proprits [130-132]. Ces proprits aussi bien biologiques que physicochimiques dpendent de la nature, du degr de substitution ou daddition, ainsi de la distribution des nouveaux motifs sur la chane polysaccharidique. Cette possibilit de modification chimique des polysaccharides est trs vaste. Dans notre tude nous nous limiterons la raction entranant une liaison covalente entre le polysaccharide et un polymre mthacrylate comme cest montr par D. Labarre et al [133]. Et du fait de leurs nombreuses fonctions hydroxyles, ces polysaccharides peuvent tre modifis grce une mthode redox utilisant les ions crium (IV) [134-136].

I.3.1. La polymrisation radicalaire La polymrisation radicalaire est une raction en chane qui, comme son nom lindique fait intervenir des radicaux libres comme espce propagatrice. Les radicaux libres rsultent d'une rupture homolytique de liaisons covalentes. Les radicaux ont une dure de vie trs brve lie leur grande ractivit. Il est par consquent ncessaire de pouvoir engendrer facilement des radicaux, de manire les engager dans des ractions ultrieures. Trois mthodes majeures permettent dengendrer des radicaux : la photolyse, la thermolyse et les processus redox. Nous nous intressons spcialement au processus redox qui fait lobjet de notre tude.

I.3.2. Le systme redox Ce sont des ractions doxydo-rduction qui sont ralises par action des cations mtalliques, comme le crium IV, le plomb IV, le cobalt III ou de largent II sur des acides carboxyliques, conduisant la formation dun radical. Ce mcanisme se dcompose en trois tapes : Lamorage, au cours duquel des radicaux sont forms, la propagation, o, partir dun radical, un nouveau radical est form, la terminaison, qui conduit la disparition des espces radicalaires.

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Revue bibliographique I.3.2.1. Lamorage Cette tape est galement nomme initiation. Elle comprend deux ractions successives. La premire est la gnration de radicaux dits primaires l'aide du crium. La deuxime raction est l'addition du radical primaire sur une premire unit monomre pour former le premier maillon de la chane polymre en croissance. Dune manire gnrale la premire raction qui constitue ltape et gouverne donc la vitesse globale du processus d'amorage. Polysaccharide-OH + Ce IV Polysaccharide-O + H+ + CeIII et/ou Polysaccharide-CH + Ce IV Polysaccharide-C + H+ + CeIII

I.3.2.2. La propagation La propagation est la principale tape de la polymrisation radicalaire. C'est au cours de cette tape que la chane macromolculaire se forme par addition successive d'units monomres sur le polysaccharide-radical en croissance. Chaque radical form est consomm par la raction suivante. Pour obtenir un processus efficace, il est ncessaire que la concentration en radicaux soit faible pour que les ractions de terminaison par combinaison des radicaux puissent tre ngliges. Cette tape de polymrisation est dterminante pour la structure et les proprits du matriau rsultant. Polysa-Mn + M polysa-Mn+1

I.3.2.3. la terminaison Les ractions de terminaisons sont relativement importantes puisquelles provoquent la disparition des radicaux. La croissance des chanes peut tre interrompue chaque instant par les ractions de terminaison au cours desquelles deux radicaux polymres se neutralisent soit par combinaison ou couplage, soit par dismutation Dans le premier cas, la raction de recombinaison, deux macro-radicaux reforment une liaison covalente : Polysa-Mn + Polysa-Mm polysa-Mn+m (combinaison) Dans le deuxime cas, la raction de dismutation, les deux macro-radicaux donnent lieu une raction de transfert d'hydrogne, suivie d'une recombinaison. Polysa-Mn + Polysa-Mm polysa-Mn + Polysa-Mm (dismutation) La proportion relative de ces deux modes de terminaison dpend essentiellement du type de monomre employ, de l'accessibilit des sites radicalaires, c'est--dire de lencombrement strique des sites actifs et de la concentration des radicaux. En chimie radicalaire, il est souvent utile de chercher diminuer au maximum linfluence de la terminaison par recombinaison puisquil sagit dun processus souvent mal contrl. 41

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Matriels&Mthodes

II. Matriels et mthodes

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Matriels&Mthodes II.1. Synthse II.1.1. Les amorceurs II.1.1.1. L'azobisisobutyronitrile L ','-azobisisobutyronitrile (AIBN) (Acros) (M = 146.21 g/mol), pur 99%, est purifi par solubilisation et recristallisation dans un mlange eau distille/thanol (10/90), 30C. Aprs dissolution de l'AIBN la solution est filtre, puis placs 4C pendant 24 heures. Les cristaux forms sont rcuprs par filtration, schs sous vide 30C et conservs 4C.

II.1.1.2. Le Crium IV Le crium IV est utilis sous forme d'ammonium crium nitrate (hexanitratocrate(IV) dammonium, (NH4)2[Ce(NO3)6] (548.22 g/mol) (Acros)), il est sch 60C pendant 24h et utilis sans purification supplmentaire.

II.1.2. Les monomres mthacrylates II.1.2.1. Purification des monomres mthacrylates Avant lemploi des monomres mthacrylates, il faut les dbarrasser de leurs inhibiteurs de polymrisation. Dans une ampoule dcanter, 100 mL de monomre lexception de lHEMA sont mlangs 10 mL d'une solution aqueuse alcaline (NaOH 5%, NaCl 20% ), aprs avoir bien mlang et laiss dcant, on obtient 2 phases (une phase aqueuse et une phase organique qui contient le monomre mthacrylate), on limine la phase aqueuse qui contient les inhibiteurs, la phase organique est lave 3 fois avec 10 mL d'eau distille, et on limine l'eau, on obtient ainsi du monomre mthacrylate que lon conserve 4C, labris de la lumire sous atmosphre dargon et sur tamis molculaire.

II.1.2.2. Le mthyle mthacrylate Le mthyle mthacrylate commercial (MMA) (Acros, France) (d = 0.943 ; M = 100.12g/mol) est pur 99%. Conserv 8C sous azote, labri de la lumire, jusqu' son utilisation.
CH3 H 2C O C C O CH3

Formule du mthyle mthacrylate 45

Matriels&Mthodes II.1.2.3. Le butyle mthacrylate Le butyle mthacrylate (BMA) (Acros, France) (d = 0.896 ; M = 142.2g/mol) est pur 99%. Il est conserv sous azote, 4 et labri de la lumire pour viter la polymrisation.

CH3 H 2C O C C O
(CH2)3

CH3

Formule du butyle mthacrylate II.1.2.4. LEthylmthacrylate. LEthyle mthacrylate (EMA) (Acros, France) (d = 0.915 ; M = 114.15g/mol) est pur 99%. Il est conserv sous azote, 4 et labri de la lumire pour viter la polymrisation.
CH3 H 2C O C C O CH2 CH3

Formule de lthyle mthacrylate II.1.2.5. Le (2-hydroxythylmthacrylate) Le 2-hydroxythylmthacrylate (HEMA) commercial (Acros, France) (d=1.073 ; M = 130.14) est pur 96%. Sa distillation sous vide permet dliminer le stabilisant qui inhibe la polymrisation. LHEMA purifi est conserv 4C, sous azote et labri de la lumire, jusqu son utilisation.
CH3 H2C O C C O (CH2)2 OH

Formule dhydroxythylmthacrylate 46

Matriels&Mthodes II.1.3. Les polymres naturels (les polysaccharides). II.1.3.1. Le dextrane Le dextrane de diffrente masse (M : 10; 40; 70; 73; 80.7; 264 kg/mol) (SIGMA, France) est sch avant toute utilisation 60C pendant 24h. Le dextrane-FITC 70 kg/mol cest du dextrane marqu la fluorescine isothiocyanate (FITC) afin dtre visualiser sous microscope fluorescence. 1-5% R = glucose 95% et plus R = H
OH OH n O CH2 O OR

Structure du dextrane

II.1.3.2. Le Fucane Le fucane (SIGMA, France) (M = 100; 50.5 kg/mol) est sch pendant 24h 60C. R = H ou SO3- ou acide glucuronique ou ose neutre

O CH3 SO3 OR n O

Structure du fucane II.1.3.3. Le Pullulane Le pullulane (Hayashibara, Japon) 500 kg/mol dgrad au rayon et chromatographi afin dobtenir des fractions de masses molaires moyennes de 50 kg/mol.

CH2 O OH

HO CH 2 O OH O OH OH n

OH

Structure du pullulane 47

Matriels&Mthodes II.1.3.4. Lhparine Hparine commerciale extraite de la muqueuse intestinale porcine (Sigma, France). Les fractions utilises ont une masse molaire moyenne de 17 19 kg/mol. Ce polysaccharide est soluble dans leau mais pas dans le mthanol ni dans lactone.

COOO OH O OSO3

CH2OSO3O OH NH SO3O n

Structure de lhparine II.1.4. Synthse des polymres mthacrylates Les homopolymres polymthylmthacrylate, polybutylmthacrylate, polythylmthacrylate et le polyhydroxythylmthacrylate (PMMA, PBMA, PEMA et PHEMA) sont synthtiss afin dtre compars nos polymres hybrides. Dans un racteur sphrique de 250 mL, 57 mL de tolune anhydre sont introduites sous une atmosphre d'azote. Le racteur tricol est alors quip de bouchons hermtiques jupes rabattables et dun rfrigrant. Sa temprature est port 70C par immersion dans un bain d'huile. Une fois que les 70C sont atteintes, 5.10-2 moles du monomre acrylique (MMA BMA, EMA et HEMA) ainsi que 5.10-3 moles d'AIBN dissous au pralable dans 2.5 mL de ttrahydrofurane (THF) sont additionns au solvant par injection l'aide d'une seringue. Les monomres sont introduits sparment afin d'tre mlangs au solvant avant l'addition de l'amorceur. Le temps de polymrisation a t fix 3 heures. En fin de raction les homopolymres sont rcuprs par prcipitation des solutions dans le mthanol (200 mL), puis recueillis par filtration sous vide et lavs avec une solution d'acide chlorhydrique dilue 0.1 mol.L-1 et de l'eau permute. Les polymres sont ensuite schs sous vide jusqu' poids constant.

II.1.5. Synthse des copolymres Plusieurs ractions de polymrisation ont t ralises afin de dterminer les meilleures conditions de synthse des copolymres polysaccharide-polymthacrylate. Les paramtres que nous avons fait varier sont la concentration damorceur (CeIV), la concentration des monomres mthacrylates, et la quantit du polysaccharide. Des synthses contrles sont ralises dans les mmes conditions de greffage sans lajout de polysaccharide. 48

Matriels&Mthodes II.1.5.1. Description de la raction de greffage La raction de greffage se fait en suspension, elle est amorce par loxydation du polysaccharide par le crium (IV), conduisant la formation dun radical libre, dun proton H+ et dun ion crium (III). Cette raction de polymrisation se fait en prsence de monomres acryliques et sous une atmosphre inerte (argon ou azote) en milieu trs acide (acide nitrique un pH proche de 1), elle est reprsente par le schma de la figure11 :

HO HO HO

HO O HO

Polymre
O

HO O HO

O HO HO HO

+ nCeIV
O

nCeIII + nH+ +

O HO O HO O

+ Monomere
HO O

O O HO

(a)

(b)

Figure 11. Reprsentation Schmatique de la polymrisation. (a) oxydation du poysaccharide par le CeIV. (b) greffage des monomres mthacrylates sur les sites radicalaires. II.1.5.2. Caractristiques et mise au point de la raction de greffage Ltude de linfluence de divers paramtres (masse du polysaccharide, volume du monomre mthacrylates et masse du crium) sur lapparition dun prcipit en suspension mesur par D.O et sur le rendement qui est dfini comme le rapport de la masse finale de copolymre sec obtenu la masse initiale du polysaccharide et de monomre acrylique introduit dans le milieu ractionnel.

II.1.5.3. Greffage des mthacrylates sur les polysaccharides Les procdures gnrales de synthse sont les suivantes : comme le montre la figure 12, dans un racteur de 1 litre quip de cinq cols, le polysaccharide est dissout dans 500mL dune solution aqueuse dacide nitrique 0.2 M, aprs 10 minutes dagitation sous une atmosphre dazote une temprature de 40C, le crium (IV) et le monomre MMA sont ajouts en mme temps. On note la variation du pH et la D.O en fonction du temps un intervalle de 5 minutes pendant 40 minutes, la raction peut tre considre comme acheve lors que le pH ne varie plus, ce qui est le cas aprs une quarantaine de minutes. Le pH est alors amen 8 par de la soude concentre et la solution obtenue est concentre laide dun rotavapor (Heidolph 94200) jusqu' 49

Matriels&Mthodes un volume denviron 20 mL, cette solution est versee goutte goutte dans environ 300 mL de mthanol pour obtenir un prcipit que lon laisse ensuite reposer pendant 4h. Le prcipit est alors recueilli et plac dans un boudin de dialyse. Toutes les autres synthses ont t ralises dans les mmes conditions de temprature et pendant la mme dure sous atmosphre inerte (argon ou azote).
Crium (IV) Azote Rfrigrant Monomres pH-mtre

40C Racteur cinq cols

Figure 12. Photo du montage de la raction de synthse II.1.5.4. Purification des copolymres II.1.5.4.1. La dialyse Les copolymres obtenus, ncessitent une purification avant dtre analyss. En effet, la prsence dimpurets, des chanes de polysaccharide et des monomres qui nont pas ragi peut perturber certaines analyses. Les diffrents copolymres sont donc purifis par dialyse. Cette technique permet de sparer les molcules selon leur poids molculaire grce lutilisation de membranes semi-permables dont les pores permettent aux particules de petite taille de diffuser travers la membrane. Les composs de poids molculaire infrieur au seuil de coupure de la membrane utilise sont limins, les molcules de taille plus importante sont conserves lintrieur de la membrane. Dans le cas prsent, la dialyse seffectue dans des membranes de cellulose de porosit 50 kDa (Spectra/Por 7). Des boudins de 25 cm de long sont remplies avec 50 mL de solution de copolymre purifier et mises dialyser sous un filet deau du robinet pendant 24h minimum. Ces boudins sont ensuite poss dans 2L leau distille durant 24h sous agitation. Le renouvellement de leau de dialyse seffectue toutes les 2 heures, le suivi de la conductivit permet dobserver lavancement de la purification. Ainsi les chantillons sont centrifugs, lavs deux fois avec 50mL dEDTA 10-2M pH 4.8 pour liminer le crium, suivit de plusieurs

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Matriels&Mthodes lavages leau distille. Les lavages sont arrts lorsque la conductivit de leau est constante et proche de 0. Les chantillons purifis sont congels avant dtre lyophiliss. II.1.5.4.2. La lyophilisation La ralisation de certaines analyses ncessite des chantillons en phase solide. Une tape de lyophilisation permet dliminer leau des chantillons par conglation et sublimation. Les chantillons dialyss sont congels -80C pendant 1h puis placs dans le lyophilisateur (Telstar Cryodos) dans des conditions permettant la sublimation des molcules deau (temprature d'environ 50C et pression de 1mBar). Aprs une nuit de lyophilisation les chantillons rcuprs se trouvent sous forme d'une poudre compltement anhydre.

II.1.5.4.3. Extraction des homopolymres acryliques Un essai ralis pralablement avec un mlange physique de dextrane et de PMMA (50% : 50% w/w) nous a permit de dterminer la dure de sparation des deux homopolymres par la mthode du Soxhlet (Behr Labor Technik) figure 13. La dure minimale trouve est de 6h. 0.5g de produit sch est purifi lactone dans un extracteur Soxhlet pendant 24h, afin dliminer tous les homopolymres mthacrylates forms, le copolymre pur obtenus est sch sous vide puis pes. Les mmes conditions ractionnelles et les mmes mthodes de purifications que prcdemment ont alors t utilises pour raliser dautres synthses avec dautres polysaccharides et/ou dautres monomres mthacrylates.

Vapeur d dac actone

Ac Actone condens condens

Figure 13. Photo Extracteur de soxhlet

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Matriels&Mthodes II.2. Les techniques de caractrisation des copolymres II.2.1. Linfrarouge a transforme de Fourier La spectroscopie Infra-Rouge est applicable tous types de composs (film de polymre, poudre ou liquide). Cette technique est plus souvent utilise pour vrifier la structure dun produit que pour lidentifier. Il est galement possible de calculer la concentration relative des composants dun copolymre en traant une courbe dtalonnage du mlange des deux homopolymres. Afin didentifier certains groupements chimiques prsents sur les polymres et les copolymres, on ralise des pastilles de 150 mg de KBr (bromure de potassium, qualit infrarouge, Fluka) 1% en masse dchantillon analyser. Lchantillon est mlang au KBr et broy, le mlange est sch sous vide 45C pendant 6 heures, press 15 tonnes durant 4 minutes puis stock 45C labri de lhumidit. Ces pastilles sont analyses laide dun spectrophotomtre infrarouge transforme de Fourier (Perkin Elmer 1600). Chaque spectre est le rsultat du cumul de 32 incrmentations afin de diminuer le bruit de fond. Tous les spectres sont analyss par le logiciel Thermo Nicolet.

II.2.2. La rsonance magntique nuclaire La spectroscopie RMN est un outil indispensable, pour la dtermination structurale des polymres synthtiss. Les chantillons sont analyss par spectroscopie RMN du proton (1H RMN) et du carbone (13C RMN) laide dun spectromtre (VARIAN. Unity Inova 500 MHz). Les polymres synthtiss sont solubiliss dans les solvants deutr, les tubes RMN sont remplis de 50 mg d'chantillon dissous dans D2O (pour le dextrane), ou dans le THF deutr (pour le PMMA), ou bien dans le DMSO deutri (pour le copolymre dextran-PMMA). Les dplacements chimiques propres chaque compos sont exprims par rapport au ttramthylsilane (TMS).

II.2.3. Analyse thermique diffrentielle Des mesures calorimtriques ont t ralises sur une DSC (Differential Scanning Calorimeter) Setaram DSC131. En pratique le principe consiste mesurer, la diffrence de flux de chaleur entre un creuset contenant l'chantillon et un creuset rfrence alors que ces derniers sont tous deux soumis une mme rampe de temprature. Dans le cas des copolymres, la DSC est un bon moyen danalyse de mise en vidence du type de greffage. Grce cette technique il est possible de trancher entre deux hypothses : soit le copolymre obtenu est un copolymre blocs, cest dire que la polymrisation du mthacrylate ne se ferait quaux extrmit des chanes de polysaccharide, auquel cas les deux tempratures de transition vitreuses (Tg) seraient 52

Matriels&Mthodes visibles en DSC ; soit lamorage de la polymrisation se fait tout au long de la chane de polysaccharide conduisant un polymre greff de type peigne auquel cas une seule Tg intermdiaire est observe. Cette technique a t utilise afin dtudier la temprature de transition vitreuse (Tg) pour caractriser le greffage des monomres mthacrylates sur les polysaccharides. Des chantillons de 50 mg, placs dans des creusets en aluminium percs ont t chauffs de -100 +200C, avec des rampes de monte en temprature de 10C/min sous azote. Tous les chantillons ont subi deux passages.

II.2.4. Mesure de la viscosit La viscosit des solutions organiques des diffrents copolymres obtenus est mesure dans un viscosimtre de type Ubbelohde, (figure 14). Ce viscosimtre possde un rservoir communiquant avec trois tubes : un capillaire au centre et un tube de chaque ct. Le rservoir contient une quantit suffisante de liquide (environ 5 mL). Une pression est applique dans le tube de droite pour faire monter le liquide travers le capillaire centrale vers les olives infrieure et suprieure. Une fois que le liquide se trouve dans lolive suprieure, les ouvertures sont remises pression atmosphrique. Le liquide scoule librement et le temps dcoulement entre deux repres est mesur. Le capillaire choisi a un diamtre de 0.4 mm. Les concentrations choisies sont comprises entre 0.1 et 1% (m/v) pour cela on prpare une solution mre 2 % soit 0.25g pour 12.5 mL de DMSO, partir de cette solution des dilutions sont faite pour obtenir les concentrations (m/v) suivantes : 0.1% ; 0.2% ; 0.3% ; 0.4% ; 0.5% ; 0.6% ; 0.8% et 1%. Une courbe talon est trace laide de la viscosit du dextrane de masses 10; 40; 70; 80.7 et 264 kg/mol. La relation entre la viscosit intrinsque et la masse molculaire M est calcul grce la relation de Mark-Houwink : [] = K.Ma o K et a sont des constantes caractristiques de la macromolcule. [] Reprsente la viscosit intrinsque, elle est dtermine partir dune rgression linaire.

Figure 14. Viscosimtre de type Ubbelohde 53

Matriels&Mthodes II.2.5. Chromatographie dexclusion strique (CES) Cette technique appele aussi filtration sur gel permet de sparer les molcules en fonction de leur poids molculaire. La phase mobile est liquide tandis que la phase stationnaire est compose de perles poreuses non absorbantes. Les grosses molcules (dont le diamtre est suprieur celui des pores) sont exclues et sont donc lues les premires. Les petites et moyennes molcules sont lues plus tardivement, car incluses dans le gel, leur migration est freine. Les soluts sont donc lus dans l'ordre inverse des masses molculaires. Il existe une relation linaire entre le volume d'lution et le logarithme de la masse molculaire. Dans le cadre de notre tude la CES a t utilis pour comparer la masse du dextrane 70 kg/mol non trait avec celle du dextrane trait dans les mmes conditions de synthse en absence de lamorceur et du monomre. Les trois chantillons (dextrane non trait, traitement pendant 40min et traitement pendant 2h) ont t caractriss par CES sur gel (dtecteurs rfractomtre et viscosimtre, Viscotek, GB), l'aide d'une colonne (TSK GMPWXL, Tosohaas, Japon), talonne avec des standards de Pullulane. Les chantillons analyser sont prpars ( 10mg/mL) et lus avec une solution de PBS (137 mMNaCl, 10 mM phosphate, 2.7 mM KCl ) tamponne pH 7.4. 100l de lchantillon sont injects, le dbit de 0.5mL/min est rgl par une pompe (Viscotek GPC max VE2001, GB). Le volume hydrodynamique des trois chantillons a t obtenu et compar aprs un traitement des donns par le logiciel (Omnisec 3.0, Viscotek, GB).

II.3. Etude de la solubilit des copolymres et ralisation des films La solubilisation dun compos dans un systme donn implique des phnomnes physicochimiques et des interactions inter-molculaires favorables entre le solut et le solvant ; les proprits de solubilit dun compos dans un solvant donn permettent donc de dduire certaines caractristiques structurales de ce compos. De plus, un polymre soluble se prte mieux divers caractrisations ainsi qu la formation de dpts minces sur un substrat.

II.3.1. La solubilit des polymres Une quantit de 40mg de polymres schs est mlange 1mL de diffrents solvants organiques (leau, dimthyl sulfoxyde, dichloromethane, actone, tetrahydrofurane, dioxane et chloroforme), agite pendant 24h temprature ambiante pour des tests de solubilits. Les chantillons de copolymres non solubles dans des solvants purs ont t test avec des mlanges deau et de solvants organiques allant de 5%/95% jusqu 95%/5% v/v.

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Matriels&Mthodes II.3.2. Prparation des films de polymres Pour les films destins des tests mcaniques, des mini-prouvettes sont fabriques partir de polymres lyophiliss solubilises dans un mlange THF/H2O. Les solutions sont coules dans des moules rectangulaires en aluminium dune gomtrie de 2cm sur 0.5cm. Une quantit de 20 mg de copolymre solubilis dans 0.5mL du mlange de solvants est ncessaire compte tenu des pertes ayant lieu sur les paroi des moules. Le moule contenant le copolymre solubilis est plac dans une cloche en verre sous une atmosphre contrle suture en THF et en prsence de CaCl2 afin dabsorber leau. Le systme est laiss temprature ambiante, aprs 24h, les films de copolymres sont rcuprs par un dmoulage dans un bain ultrason. Les prouvettes sont dcoupes afin dobtenir des films dune longueur de 1.5cm et dune largeur de 0.5cm. Lpaisseur des films est mesure par un micromtre, elle est de lordre de 0,035cm. Pour servir de supports la culture cellulaire, les films de copolymres sont prpars dans les mmes conditions et sont dposs dans des cristallisoirs en verre de 16mm de diamtre. La taille des disques de copolymre obtenus est de 2 cm2 qui correspond parfaitement la taille des plaques de 24 puits. Tous les films sont ensuite schs 24h dans une tuve ventile 30C. Les homopolymres mthacrylates solubiliss dans du THF pur ont permit dobtenir des films utilis en tant que tmoin. Aucun film ne peut tre obtenu avec les polysaccharides. Par ailleurs le recyclage des films par dissolution dans le mme solvant est possible.

II.4. Caractrisation et analyse des films de copolymres II.4.1. Dtermination de la topographie des films par Microscopie Force Atomique La Microscopie Force Atomique (AFM pour Atomic Force Microscopy), est un outil indispensable pour la caractrisation et ltude des proprits fondamentales des structures de basse dimensionnalit. Lutilisation de lAFM permet danalyser la topographique tridimensionnelle des surfaces, avec une trs haute rsolution pouvant aller jusqu la rsolution atomique. Les mesures de rugosit ont t effectues avec cette technique sur des films de copolymres, des films dhomopolymres, des stents nus et des stents enduits de polymres laide dun microscope force atomique (Nanoscope III Digital instruments dimension 3100). Toutes les surfaces ont t tudies en mode semi-contact (tapping) pour une analyse morphologique de surfaces de 10 x 10 m2. Des acquisitions dimages topographiques et dimage de phase ainsi que les mesures de rugosit sont obtenues en utilisant le logiciel WSxM version 3. Lobservation des films et des stents en AFM oblige la fixation des chantillons sur des supports en verre.

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Matriels&Mthodes II.4.2. Proprits mcaniques des copolymres La connaissance des caractristiques mcaniques des copolymres synthtiss est ncessaire afin de dterminer le comportement des revtements aprs enduction des stents.

II.4.2.1. Tests de fluage Le film de polymre rpond une contrainte par une dformation, il existe deux phase successives pour la rponse contrainte-dformation, la phase quasi lastique rversible : le film de polymre peut revenir dans son tat initial lorsquil nest plus sollicit, et la phase irrversible : le film de polymre ne peut plus revenir dans son tat initial et la rupture apparat au terme de cette phase. Dans notre tude et afin de tester les diffrents films de polymres plusieurs charge 100g ; 125g ; 150g et 175g sont suspendus lextrmit des films de longueur de 15mm, largeur de 5mm et dune paisseur de 0.035mm. La dformation des films est suivit par prise de photos chaque minute jusqu' la rupture. Des courbes sont tracs pour le pourcentage de dformation en fonction du temps.

II.4.2.2 Analyse mcanique dynamique (DMA) Une des manifestations les plus spectaculaires de la transition vitreuse est la variation des proprits mcaniques qui surviennent aux environ de Tg. En effet, lorsquon sollicite le matriau par une contrainte cyclique (sinusodale), et dans les limites de la rponse linaire, on peut dfinir le module de Young complexe (E* =E'+iE"), Dont la partie relle E', appele module lastique, traduit le comportement lastique conservatif du matriau. La partie imaginaire E", appele module de perte, caractrise le comportement visqueux du matriau. Le rapport des deux modules (tan = E"/ E') est appel facteur de pertes. Une des techniques de mesure trs rpandue est de tester la rponse du matriau une dformation priodique de frquence constante tout en imposant une monte en temprature. Ainsi pour un polymre entirement amorphe, on observe aux environs de la Tg calorimtrique un pic de tan (T) et une diminution abrupte du module lastique (E'). Dans ce travail, Les mesures mcaniques dynamiques sont ralises en traction en utilisant un appareil DMA Q800 (TA instruments). Les films de copolymres de 15mm de longueur, 5mm de largeur et 0.035mm dpaisseur globale, sont tests en mode isochrones (1Hz) lors dune chauffe une vitesse de 3.0 C/min de-100 +200C et une dformation dynamique de lordre de 0.03%.

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Matriels&Mthodes II.4.3. Mesure de langle de contact sur les diffrents films de polymres La mesure de langle de contact entre une goutte deau pure et une surface plane et propre permet de dterminer la mouillabilit de surface du matriau. Plus langle de contact est lev plus le matriau a un caractre hydrophobe figure 15. Pour cela les angles de contact sont mesurs par un appareil Krss, model DSA 10- Mk2. Cet instrument comprend un logiciel, qui permet une mesure automatique des angles de contact. Ils sont mesurs sur un ct de la goutte deau dpose (2L). Pour chaque matriau, 3 surfaces prpares de faon indpendante sont utilises. Les angles de contact sont mesurs partir de 5 gouttes dposes en diffrents endroits sur chaque chantillon considr. Les rsultats correspondent une moyenne sur lensemble de ces mesures.

< 90

> 90

Caractre hydrophile Caractre hydrophobe

Figure 15. Angle de contact II.5. Enduction des stents par les copolymres Tous les stents utiliss dans cette tude sont des stents en acier 316L (Guidant, Ireland) dun diamtre interne expans de 3.5mm et dune longueur de 23mm. Le recouvrement de ces stents par les copolymres se fait par immersion. Les stents dploys sont introduit verticalement dans une solution de copolymre solubilis pralablement dans le mlange THF/H2O pendant 20 secondes temprature ambiante. Un mouvement de rotation axial est effectu pendant lenduction. Les stents sont ensuite extraits et schs dans des conditions contrles, c'est--dire dans une atmosphre sature en THF et en prsence du CaCl2 pendant une nuit. Il est utile dvaluer la tenue du revtement de polymre sur le stent dans des conditions qui sapprochent de celles qui seront subies au moment de la pose au bloc opratoire. Le sertissage des stents recouverts de copolymre sch sur ballonnet se fait dans leau afin de protger le revtement. Lexpansion se droule galement en immersion dans leau : le ballonnet est gonfl une pression de 4 bars puis dgonfl et le stent dploy est recueilli pour analyser la tenue du revtement en copolymre.

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Matriels&Mthodes II.5.1. Analyse des surfaces de stents enduits II.5.1.1. Par microscopie optique Les surfaces de stents enduits sont observes laide dune loupe binoculaire. Elles sont aussi observes par un microscope optique transmission Zeiss Axiovart100. Pour le revtement utilisant le dextran-FITC, lobservation est effectue au microscope fluorescence. Le traitement des images est effectu au moyen du logiciel Adobe Photoshop.

II.5.1.2. Par microscopie lectronique balayage (MEB) Si lchelle macroscopique les films semblent toujours uniformes et sans dfaut leurs microstructures peuvent tre htrognes et sous forme dagrgats. La microscopie lectronique balayage peut tre une bonne technique afin dexaminer la microstructure du films ou du revtement de stent. Pour cela des examens des surfaces des stents et des films de copolymres ont t raliss laide dun microscope lectronique balayage (Leica S-440, Grande Bretagne). Pour les rendre conductrices les surfaces des chantillons sont recouvertes dune fine couche mtallique dor-palladium de 2 nm dpose par vaporation cathodique au moyen dun mtalliseur (Polaron, Grande Bretagne).

II.6. Evaluation biologique Si les mthodes physico-chimiques permettent de caractriser la composition chimique et les caractristiques physiques des copolymres synthtiss, lanalyse du comportement cellulaire induit par ces matriaux offre des informations capitales sur le devenir de ce dispositif. Lanalyse in vitro avec des tests de culture cellulaire permet de dterminer les effets des diffrents films de copolymres sur ladhsion et la prolifration cellulaire. Nous ne nous intressons quau systme vasculaire faisant intervenir ladhsion et la prolifration des cellules endothliales et des cellules musculaires lisses.

II.6.1. Lignes cellulaires La lign de cellules endothliales HUVECs (cellules endothliales humaines issues de veine de cordon ombilicale) utilises pour raliser les tests de cultures cellulaires provient de lAmerican Type Culture Collection (ATCC). Les cellules musculaires lisses (CMLs) utilises appartiennent une ligne nomme RB1 qui est issue du lapin.

II.6.2. Milieux de cultures Tous les milieux et additifs, y compris le srum, utiliss en culture cellulaire ont t obtenus auprs de la socit Gibco. Les cellules endothliales (HUVECs) et les cellules 58

Matriels&Mthodes musculaires lisses (CMLs) sont cultives dans du milieu de culture DMEM (Dubbelco's Eagle Medium) additionn de 10% de srum de veau ftal, de 2% de L-glutamine (concentration finale : 2 mM), et de 1% dantibiotiques (concentration finale : pnicilline 100 UI.mL1, streptomycine 100 g.mL1) (toutes les proportions tant exprimes en rapport volumique). Les cellules sont cultives 37C dans un incubateur Heraeus, sous atmosphre humide 5% de CO2.

II.6.3. Entretien des cellules en culture II.6.3.1. Dconglation des cellules Les cellules HUVECs et les cellules CMLs sont dcongeles de faon trs rapide pour augmenter la viabilit cellulaire. Le cryotube est rchauff rapidement dans un bain-marie 37C, puis avant mme la complte dconglation, les cellules sont transfres dans un tube centrifuger, contenant 10 mL de DMEM 10% de SVF. Les cellules sont centrifuges pendant 3 minutes 150 G (1000 T/min, R = 134 mm), le surnageant est ensuite limin et les cellules sont re-suspendues dans 15 mL de DMEM 10% SVF et transfres dans un flacon bouchon ventil de 75 cm2 (Costar). Le milieu est chang le lendemain afin de dbarrasser la culture des cellules mortes et non adhrentes.

II.6.3.2. Passage des cellules La confluence des cellules est atteinte en 4 5 jours, il est ncessaire pour entretenir la culture d'effectuer une rcolte des cellules par trypsinisation et rensemencement dans d'autres botes de culture (chaque trypsinisation correspond un passage). Pour effectuer un passage le milieu de culture est aspir puis les cellules sont rinces 2 fois avec du milieu PBS sans calcium ni magnsium. Ensuite la trypsine (trypsine/EDTA 1:250) est ajoute raison de 3 mL pour une bote de 75 cm2, puis les cellules sont places dans l'incubateur au maximum pendant 3 minutes. On peut alors frapper latralement sur la bote pour dcoller toutes les cellules et homogniser la pipette la suspension cellulaire. Du milieu de culture contenant 10% SVF est ajout pour inhiber l'action de la trypsine et une fraction correspondant 1/10 de cette nouvelle suspension cellulaire est alors place dans une nouvelle bote de culture contenant dj 10 mL du milieu de culture 10% de SVF.

II.6.3.3. Conglation et cration de stocks de cellules Les cellules en phase exponentielle de croissance sont rinces rapidement deux fois avec du milieu de culture de base sans srum puis dtaches par action de la trypsine (3 mL de trypsine pour une bote de 75 cm2) pendant 3 minutes 37C. La trypsine est inhibe par 59

Matriels&Mthodes addition de milieu DMEM 10% de SVF (7 mL de milieu complet sont ajouts). La concentration de cellules dans la suspension est value par comptage avec un Coulter Counter ZM (Coultronics) et centrifuge 150 G (1000 T/min) temprature ambiante pendant 3 minutes. Le surnageant est limin et le culot est mis en suspension dans du SVF contenant 10% de DMSO (dimthylsulfoxyde test pour la culture cellulaire, Sigma) raison de 2.106 cellules/mL. Cette suspension cellulaire est aliquote raison de 0.5 mL dans des cryotubes (106 dans chaque cryotube) et ensuite congele 20 C pendant 2h puis 80C. Grce ce lent refroidissement les cellules se contractent en liminent leur eau et seul de la glace extracellulaire est forme. Le stock ainsi constitu est conserv au conglateur 80 C.

II.6.4. Prparation des films de polymre la culture cellulaire Les films de copolymre sous forme de disques de 16mm de diamtre sont schs dans une tuve ventile 50C, puis pour extraire toute trace de THF susceptible dinfluer sur la rponse cellulaire, les disques sont maintenus sous vide 50C dans une tuve pendant 24h minimum. Pour les films de lhomopolymre PBMA qui nous ont servi de tmoin, la culture cellulaire est faite directement dans les cristallisoirs car ces films sont trs fragiles et cassants.

II.6.4.1. Lavage et strilisation des films de polymre Avant toute exprience de culture cellulaire, les supports sont abondamment lavs leau distille strile pendant 3 jours minimums, leau est change chaque jour. Ensuite les films de polymres sont striliss pendant 15 min pour chaque face sous rayonnement ultraviolets 254 nm et conserv dans du PBS strile temprature ambiante pour prvenir dventuelles contaminations. Tout au long de cette tape les disques sont maintenus sous agitation.

II.6.4.2. Conditionnement des films de polymres la culture cellulaire Afin de tester la prolifration des cellules HUVECs et des CMLs sur les diffrents films, les polymres synthtiss sont conditionns. La veille de lensemencement, les films de polymres sont placs au fond des plaques de 24 puits. Ayants le mme diamtre que les puits, les disques se maintiennent par effet ventouse au fond des puits. La face choisie pour servir de support aux cellules est la face qui na jamais t en contact avec le moule lors de la formation des films. Les films mis en place sont alors incubs dans du milieu de culture complet. Cette tape est ncessaire pour sassurer dun quilibre en ions et en protines entre le milieu et la surface des polymres. Tous les autres supports (pions dacier 316L, stents) utiliss dans la culture cellulaire ont t traits de la mme manire. 60

Matriels&Mthodes II.6.4.3. Ensemencement des cellules sur les films de polymres Les cellules HUVECs et CMLs sont dtach dune ou plusieurs bote de culture et runies en une seule suspension pour chaque type cellulaire. 0.5 mL de la concentration cellulaire obtenue sont rajouts 9.5 dIsoton II. Le comptage des cellules est ralis laide du compteur de cellules (Coulter Counter ZM). Les films de copolymres striliss et conditionns pour la culture cellulaire sont dposs au fond de botes de 24 puits. Les cellules sont ensemences une concentration de 5000 cellules/puits, le volume de chaque puits est complt 1mL avec le milieu complet et les plaques sont alors ranger dans lincubateur. Des puits vierges sont utiliss comme tmoins. La viabilit des cellules est valu par un test dexclusion au bleu Trypan (Gibco), 100L de suspension cellulaire sont mlangs 100L de solution de bleu de trypan, les cellules mortes sont permables au colorant et deviennent bleu. Une goutte du mlange est dpose sur un hmacytomtre de Malassez. Observe sous le microscope invers, cette grille de numration permet de dterminer la proportion de cellules mortes dans la suspension qui doit tre infrieure 10%.

II.6.4.4. Cintique de prolifration des cellules sur les diffrents supports La prolifration des cellules est effectue sur 5 jours et le nombre de cellules par puits est compt chaque jour. Le comptage des cellules ayant adhr et prolifr sur les diffrents supports (films et pions en acier 316L) a lieu au bout de 1 ; 2 ; 3 ; 4 et 5 jours dincubation 37C. Pour ce faire, les supports contenus dans deux puits sont rincs deux fois avec du tampon PBS. Les cellules sont dcolles des supports par action de 500l de Trypsine-EDTA. Cette solution est ajoute 9.5mL disoton et les cellules sont comptes laide du compteur de particule. Une courbe reprsentant le nombre de cellules dtaches des supports en fonction du temps dincubation est alors tablie.

II.6.4.5. Comptage des cellules Les comptages des cellules sont effectus laide dun compteur de particule (Coulter Counter ZM - Coultronics). Pour cela les cellules sont dtaches par incubation avec la trypsine pendant 2mn, places dans un milieu de culture ne contenant pas de srum de veau ftal. 500L de suspension sont ajouts 9.5mL dIsoton II, une solution la fois isotonique et conductrice (Coultronics). Cette nouvelle suspension est dnombre grce un compteur de particule qui prlve le milieu par 500L. une multiplication des valeurs du compteur par 40 permet dobtenir le nombre des cellules par mL de solution.

61

Matriels&Mthodes II.6.4.6. Observation des cellules sous microscope fluorescence Les cellules sont observes laide dun microscope fluorescence pour tous les supports opaques (stents et pions en acier 316L). Lobservation des cellules ncessite leur coloration par un produit fluorescent. Pour cela les cellules adhrentes sur le matriau sont rinces avec du milieu de culture sans srum avant dtre fixes dans une solution de 10% (v/v) formaldhyde pur (Sigma) dans du milieu sans SVF pendant 10 minutes 4C, puis permabilises dans du Triton x 100 0.1% (v/v) dans du PBS pendant 5 minutes. Les cellules laves une fois avec du PBS sont princubes avec du BSA (Sigma) 1% (v/v) dans du PBS pendant 30min afin de diminuer le bruit de fond. Les filaments dactine sont visualiss grce un marquage avec une solution phallodin FluoProbes547 (Interchim) 5% (v/v) dans du PBS pendant 20min temprature ambiante et labri de la lumire. Les noyaux des cellules sont marqus avec du DAPI (20g/mL) pendant 20 minutes temprature ambiante et labri de la lumire. Les photos sont prise par une camra (spot, diagnostic instrument inc.) associer un microscope fluorescence (Axiolab HBO50, Zeiss) et sont analys par un logiciel de traitement dimages (image-Pro Plus). Les images prsentes rsultent de la superposition des deux clichs. Le premier clich, effectu avec un filtre laissant pass la fluorescence rouge, rvle le cytosquelette des cellules. Le second clich ralis avec un filtre permable la fluorescence bleu montre lADN des cellules (noyau) color en bleu.

II.6.4.7. Evaluation de la migration des HUVECs sur films de copolymre DB et sur fond de puits Lvaluation de la migration des cellules HUVECs sur des films de copolymres DB (dextrane-graft-polybutylmthacrylate) est base sur les mesures de la vitesse de colonisation in vitro dune surface du copolymre. Cette vitesse est compare celle observe sur le fond de puits des plaques de culture cellulaire (polystyrne ayant subit un traitement de surface). Des cellules HUVECs (5 x 103 cellules) sont ensemences sur un film DB plac au fond de plaque de 24 puits. Le mme nombre de cellules est ensemenc directement sur fond de puits pour servir de rfrence. Au bout de 5 jours, les cellules tant confluence, une blessure de 0.4 mm de largeur est pratique laide dune pointe de micropipette. Les cellules sont ensuite laves avec du PBS et incubes dans le milieu DMEM complet. Les cellules sont observes en microscopie optique (x 10) et photographies laide dun appareil photo numrique. Les photos de lencoche sont prises au mme endroit 0h ; 8h ; 24h ; 32h ; 48h et 56h. Des mesures de la surface envahie par les celles sont ralises laide du logiciel image-Pro Plus. La migration cellulaire est exprime sous la forme dun histogramme prsentant la surface restant dnude en fonction du temps. 62

Matriels&Mthodes II.6.4.8. Ladhsion et la prolifration des cellules HUVECs sur stents Une tude de comparative de la prolifration des cellules HUVECs sur des stents nu et des stents enduits de copolymre DB a t ralise. Les stents recouvert de DB copolymre sont dposs au fond des plaques de culture cellulaire. Striliss par exposition au rayon UV 254 nm pendant 30 min. Des cellules HUVECs sont ensemences raison de 5 x 105 cellules par stent, 1mL de milieu de culture complet est ajout, les botes contenant des stents sont incubes 37C. Aprs 3 jours les cellules sont fixes sur les stents marques la phallodin et au DAPI et sont observes et photographies sous microscope fluorescence.

63

64

Premier article

III. Rsultats

65

66

Premier article III.1. Introduction au premier article Les polysaccharides sont une source importante de structures macromolculaires. Ils possdent des proprits biologiques intressantes, mais leurs proprits mcaniques sont mdiocres. Ils sont gnralement solubles dans le milieu aqueux, et ne peuvent donc gnralement pas former directement de films stables. Leur modification chimique est donc une voie afin de leur confrer des proprits mcaniques amliores. Ainsi, le greffage ralis dans ce travail par des polymres mthacryliques pourrait conduire de nouveaux biomatriaux aux proprits innovantes. Une partie importante a consist mettre au point les paramtres de la technique de greffage par copolymrisation radicalaire de polymthylemthacrylate sur le dextrane afin de servir de
modle de synthse pour lutilisation dautres monomres mthacryliques et dautres polysaccharides.

Dans cet article nous prsentons donc, dune part la technique de greffage et la caractrisation du copolymre dextrane-graft-polymthylemthacrylate (DM). Afin de mieux matriser les paramtres de greffage, une approche exprimentale a consist faire varier la quantit du dextrane (de masse molaire 70 kg/mol), la concentration de lamorceur (criumIV) et la concentration du monomre mthyle mthacrylate, puis toute une srie de purification du produit obtenu afin dtre caractris. Dautre part, une nouvelle technique de ralisation de films de copolymre qui a t dveloppe dans le but de tester la biocompatibilit de ce nouveau biomatriau. Dans ltude des conditions de polymrisation en solution aqueuse, le milieu reste limpide en labsence de polysaccharide et il a t impossible dobtenir un polymre. linverse, en prsence du dextrane, le milieu devient laiteux et il y a formation de polymre. Dans une premire partie et afin didentifier la nature et la composition du produit synthtis, lchantillon a t soumis une analyse infrarouge, une analyse RMN et une tude de viscosit. La spectroscopie infrarouge du copolymre rvle la fois des bandes caractristiques du dextrane et les bandes caractristiques du polymthylemthacrylate, de mme pour lanalyse RMN. Le taux de dextrane dans le copolymre est de lordre de 30%. La viscosit intrinsque du copolymre final est suprieure celle du dextrane du dpart. Ceci est compatible avec une augmentation de la masse due un greffage de chanes de MMA sur le dextrane. Dans une seconde partie, les tests de solubilit rvlent que le copolymre obtenu nest soluble ni dans leau, ni dans le THF, mais en revanche, il est soluble dans un mlange eau/THF (20/80). Ce qui nous a permis de raliser des films dans des conditions contrles (sous une atmosphre sature en THF et en prsence de CaCl2). Une analyse d'images sur des microphotographies MEB permet de dterminer lhomognit des films. Il est intressant de 67

Premier article noter la microstructure homogne et monophase des films de copolymre puisque, mme un grossissement important, aucune sparation de phase na pu tre observe alors que les deux polymres impliqus sont rputs incompatibles. Dans la troisime partie, nous nous sommes intresss au comportement thermomcanique du copolymre, en utilisant, de faon complmentaire deux techniques d'analyses, la DSC (analyse calorimtrique diffrentielle) et la DMA (analyse thermomcanique). Ces deux techniques sont utilises pour caractriser le type de greffage et confirmer lexistence dune liaison covalente entre les deux constituants. Alors que pour un mlange physique des deux polymres, il est observ deux Tg distinctes, une seule Tg apparat sil y a rellement une liaison covalente entre le dextrane et le polymthylemthacrylate. Nous avons propos que les macromolcules obtenues avaient une structure de greffage en peigne mais des caractrisations plus approfondies sont ncessaires (collaboration Amlie Labb au laboratoire). Enfin, pour les tests de cytocompatibilit, des cellules endothliales humaines ont t ensemences directement sur les films de copolymre. Daprs cette tude, nous avons constat que les films de copolymre dextran-graft-polymthylemthacrylate sont biocompatibles et aucune diffrence nest observe par rapport la culture tmoin.

68

Premier article

III.1.1. Premier Article

Synthesis and characterization of a new polysaccharide-graftpolymethacrylatecopolymer for 3D hybrid hydrogels


S.M. Derkaoui, T. Avramoglou, C. Barbaud, D. Letourneur*

INSERM, U698, Bio-ingnierie de Polymres Cardiovasculaires, Institut Galile, Universit Paris 13, 93430 Villetaneuse, France

* Correspondence to: Didier Letourneur, PhD Inserm, U698, Bio-ingnierie de Polymres Cardiovasculaires, Institut Galile, Universit Paris 13, 99 Av. J.-B. Clment, 93430 Villetaneuse, France Fax: +33 1 49 40 30 08 e-mail: didier.letourneur@galilee.univ-paris13.fr

69

Premier article Abstract Hybrid materials constituted by hydrophobic and hydrophilic biocompatible macromolecules are useful for biomedical applications. In this context, a well-known acrylic monomer (methyl methacrylate) was polymerized and grafted onto the polysaccharide dextran using ceric ammonium nitrate as a redox initiator in aqueous nitric acid medium. The effects of concentrations of dextran, acrylic monomer and ceric ions on the copolymerization yields were investigated in detail. The obtained polymers were studied by solubility measurements, Fourier transform infra-red spectrometry,
13

C nuclear magnetic resonance spectroscopy, and

viscosimetric analysis. Interestingly, we found conditions to form transparent and homogeneous thin films or 3D structures with hybrid properties. Indeed, the copolymer but not dextran or PMMA could be dissolved in water/THF (20/80 v/v). The thermo-mechanical properties of the resulting copolymer analyzed by differential scanning calorimetry and dynamic mechanical analysis showed the occurrence of a single glass transition temperature, and a marked difference with the two homopolymers. The cytocompatibility of the copolymer with human endothelial cells was evidenced by the normal cell adhesion, proliferation and morphology after 5 days in culture on these gels. In conclusion, this type of copolymer with hybrid properties of two biocompatible macromolecules could be of great interest as 3D scaffold or for coating in biomedical applications.

Keywords : dextran, methyl methacrylate, copolymer, biocompatible materials, thermomechanical properties

70

Premier article 1. Introduction Polymers are widely used for their tailor-made properties and represent the largest class of materials for biomedical devices such as vascular grafts 1, drug delivery system 2, resorbable implants 3, and matrices for tissue engineering and coating of biomaterial surfaces 4-7. However, combining the advantageous properties of natural and synthetic polymers is often a challenge because of the immiscible features of such polymers 8-11. For instance, it would be advantageous to combine hydrophilic and hydrophobic polymers to develop biomaterials for drug delivery. Indeed, the hydrophobic part of the polymer may act as drug carrier, while the hydrophilic part ensures biological interactions. For coating purposes, such hybrid polymers must be stable and resist deformation. The aim of our study was to obtain hybrid materials in which the physicochemical and biological properties of the two components are well combined. In this context, we synthesized grafted amphiphilic copolymers and make homogenous 3D structures endowed of viscoelastic properties. We used an acrylic monomer for the hydrophobic structure and polysaccharide as a hydrophilic part. Indeed, both polyacrylate and polysaccharides are already used in preclinical or clinical applications polysaccharides, heparin
16-19 12-15

. Among the wide family of

and dextran

20-23

have largely demonstrated interesting properties

for the use in biomaterials. Dextran also allowed easy chemical substitutions for the coupling on or the mimicking of biological molecules
10,27-29 24-26

. In fact, the development of new biocompatible

polysaccharide materials is still an intense area of research in the field of polymeric biomaterials . The present work describes a simple and reproducible method to synthesize new amphiphilic materials that are suitable for biomedical applications. In this study, we used dextran for the graft copolymerization of an acrylic monomer with ceric ammonium nitrate for initiator. Other investigators have used this strategy with heparin, dextran or carrageenan
30-34

. The

different parameters (concentrations of initiator, acrylic monomer and dextran) and conditions of solubilization allowed us to obtain 3D structures compatible with human cells with new hybrid thermomechanical properties.

2. Experimental section 2.1. Products Dextrans of different molecular weights (MW in kg/mol: 10; 40; 70; 80.7; 264 kg/mol) were purchased from Sigma for molecular weight assessment. Dextran (70 kg/mol) was also used for synthesis (see below). It was dried in vacuum oven at 60C for 24 h. Methyl methacrylate monomers were obtained from Acros France and were purified by washing with 5% NaOH and 20% NaCl, followed by distilled water. Ammonium cerium (IV) nitrate (Acros 71

Premier article France) was dried at 80C under vacuum for 24h. Solvents were of the highest commercially available purity.

2.2. Graft copolymerization we synthesized the copolymers by varying the concentrations of dextran and ammonium cerium(IV) nitrate and the concentration of acrylic monomer in the reaction mixture by radical polymerization with ceric ion/nitric acid redox initiator in aqueous medium
35-38

. The general

experimental procedure was as follows: the reactions were carried out into 1 L five-neck flask equipped with stirrer and condenser, and the flask was immersed into thermostated oil bath and was purged by nitrogen gas. In the typical reaction, dry dextran (0.5 g, 70 kg/mol) was dissolved in 500 mL of nitric acid (0.2 M) and the reactor was placed in oil bath at 40C. After the complete dissolution of the polysaccharide to form a homogeneous solution (10 min), 5 mL of solution of Ce(IV) (2.4 10-4 mol/L) and 2 mL of methyl methacrylate were simultaneously added to the reaction mixture and after 40 min, the reaction product was allowed to cool at ambient temperature. The mixture was raised at pH 8 by addition of NaOH aqueous solution (10 M) and concentrated with a rotavapor. Then, the product was poured into 200 mL of methanol to induce precipitation. The particle suspensions were dialyzed under water for 48 h, washed twice with 50 mL of EDTA (10-2 M), followed by three washes with 50 mL distilled water in order to remove cerium ions and the dextran who did not react. The purified copolymer was frozen at -20C and lyophilized for 24 h. Homopolymer was extracted with acetone. Exactly 1.000 g of crude dried product was taken and extracted in a soxhlet for 24 h to remove the homopolymers and the remaining products. Pure copolymer was dried under vacuum and weighted. The obtained copolymer was named dextran-graft-poly(methyl methacrylate) (DM).

2.3. Characterizations 2.3.1. Infra-red spectral analysis The infra-red spectra of dextran, PMMA and copolymer DM were obtained from a PerkinElmer 1600 spectrometer. Dried samples (1.5 mg) were ground with 150 mg KBr powder and pressed into pellets for FT-IR examination. Omnic software was used for data acquisition and analysis.

2.3.2. NMR analysis


13

C-NMR spectra of dextran, PMMA and copolymer DM were recorded by using Varian

Gemini 200 MHz spectrometer in deutered dimethyl sulfoxide-d6 at ambient temperature.

72

Premier article Tetramethylsilane (TMS) was used as an internal standard. Before use, all products were lyophilized twice with deuterium oxide (D2O). 2.3.3. Viscosity measurements Viscometric measurements were carried out using an Ubbelohde capillary viscometer (0.3 mm diameter). The temperature was regulated at 25C by circulating bath. A standardization curve was drawn (viscosity vs molecular weight) with dextrans of various molecular weights dissolved in DMSO. Solutions were prepared by dissolving the copolymer in the same solvent (DMSO).

2.4. Preparation of 3D structures Discs or films were prepared using 15 mg of dried homopolymer PMMA solubilized in THF. Copolymer DM was dissolved in 1mL of THF/H2O (80/20) treated in ultrasonic bath for 1 h. Dextran gave any 3D structures. To obtain discs, solutions were poured in Petri dishes for 24 h at room temperature in saturated atmosphere of THF and in presence of CaCl2 to absorb water. Thin films were stripped from the mould and dried in oven at 30C. A morphological analysis of cross-section of films was carried out using a Leica S-440 scanning electron microscope (SEM). All 3D structures were extensively washed with water before any biological and mechanical assays.

2.5. Thermo-mechanical analysis 2.5.1. Differential scanning calorimetry (DSC) Thermal behavior of polymers (dextran, PMMA, DM) was analyzed with a Setaram DSC131 thermal analyzer, operating in combination with the liquid nitrogen cooling accessory. The furnaceswere purged with nitrogen and samples were passed in temperature range from -50 to 200C at heating rate of 10C/min. In each case, two consecutive scans were carried out on each sample. The glass transition temperature (Tg) of the polymers was taken as the midpoint in the shift of heat flow baseline. A simple mixture of dextran and PMMA was also used as control.

2.5.2. Dynamic mechanical analysis (DMA) DMA was used to analyze loss modulus, storage modulus and tan of films obtained from PMMA, and copolymer DM. Dextran could not be used since this polymer gave any film. Films of 15 X 5 X 0.035 mm were analyzed on dynamic-mechanical analyzer, DMA Q800 (TA Instruments). The equipment was operate in a single cantilever bending mode at 1 Hz in frequency, amplitude 5 m and a heating rate of 3C/min from -100C to +200C.

73

Premier article 2.6. HUVEC cell culture For all cell cultures, films were sterilized by exposure of each surface sample to UV at 254 nm for 15 min. Human umbilical venous endothelial cells (HUVECs) were obtained from ATCC. They were seeded either on tissue culture plates or on the films at a cell density of 5 103 cell/cm2. Cells were cultured with DMEM (Gibco) with 4.5 g/l of glucose and 2% L-glutamine supplemented with 10% calf serum and 1% of penicillin and streptomycin. The cells were incubated for 5 days at 37C in 5% CO2/95% air in a humidified incubator. With the transparency of 3D structures, the cell morphology on films was directly observed by conventional optical microscopy.

3. Results and discussion 3.1. Copolymerization conditions for dextran graft polymethylmethacrylate (DM) For studying the graft polymerization, yield was quantified and solubility of copolymer DM was tested. The polymerization yields are presented in Table 1. In the absence of dextran, no polymer was formed. In all other experiments, polymerization occurred after 10 min of addition of the Ce(IV) and monomers, and led to the formation of suspensions of colloidal particles. Interestingly, the compounds DM1 to DM12 were found to be soluble in a mixture of water/THF (20/80 v/v). The reaction conditions affording the maximum percentage of grafting of monomer onto dextran (0.125 to 2 g/L) were determined by varying the concentrations of ceric ammonium nitrate (1.2 to 4 10-4 mol/L) and methylmethacrylate (1.2 to 3.7 10-2 mol/L). Results showed that the weight of dextran, monomer and initiator have a significant effect on the polymerization with yields ranging from 10 to 50% (Table 1). The optimum conditions for the polymerization were 143 mmol/L of dextran, 0.24 mmol/L of Ce(IV) and 37 mmol/L of methyl methacrylate. By increasing the dextran content (DM 13, DM 14 and DM 15), lower yields were obtained and solubility of these compounds was not found (Table 1). The optimum conditions for DM 11 were thus kept for the following study. We then confirmed by solubility measurements the hybrid property of copolymer DM (Table 2). In contrast to dextran, copolymer DM was insoluble in water. In contrast to PMMA, copolymer DM was insoluble in most organic solvents (Dichloromethane, Acetone, Chloroform, Dioxane, THF), but was soluble in a mixture of water/THF (20/80).

74

Premier article Table 1: Effects of dextran, initiator, and monomer (MMA) Concentrations on yield and solubility of series of Copolymer DMs in water, THF or a 20/80 (v/v) Mixture of Water and THF reagents
copolymer DM Dextran mol x 10 DM0 DM1 DM2 DM3 DM4 DM5 DM6 DM7 DM8 DM9 DM10 DM11 DM12 DM13 DM14 DM15 0 1.8 1.8 1.8 1.8 1.8 1.8 7.1 7.1 7.1 7.1 7.1 7.1 14.3 14.3 14.3
-6

Solubility in MMA
-4

Ce(IV) mol/L x 10 2.4 1.2 2.4 4.0 1.2 2.4 4.0 1.2 2.4 4.0 1.2 2.4 4.0 1.2 2.4 4.0

Yield (%)
-2

mol/L x 10 3.7 1.8 1.8 1.8 3.7 3.7 3.7 1.8 1.8 1.8 3.7 3.7 3.7 3.7 3.7 3.7

H2O

THF

H2O/THF 20/80(v/v)

0 13 18 17 15 19 11 23 21 19 25 48 37 21 15 11

+ + + + + + + + + + + + -

Table 2: Solubility of the studied polymers in various solvents


Polymer Solvents Water DMSO Dichloromethane Acetone Chloroform Dioxane THF Water / THF 10/90 20/80 50/50 Dextran S S PMMA I S Copolymer DM I S

I I I I I
I I I

S S S S S
I I I

I I I I I
I S I

S: soluble; I: insoluble; Water/THF mixtures are v/v

3.2. Physico-chemical characterizations of copolymer DM Infrared spectra of pure PMMA (a), dextran (b), and copolymer DM (c) are presented on Figure 1. Copolymer DM exhibited a broad absorption band characteristic of hydroxyl groups of 75

Premier article dextran at 3400 cm-1, and an additional band of carbonyl groups at 1730 cm-1 of acrylic polymer. Semiquantitative analysis gave a 20-30% ratio of dextran in DM copolymer.

Fig.1. Infrared spectra of polymers : a) PMMA ; b) Dextran ; c) copolymer DM The


13

C-NMR spectra were recorded for the copolymer DM in deutered dimethyl

sulfoxide-d6 , the only common solvent (Table 2) for dextran, PMMA and copolymer DM. The spectra reported on figure 2 for copolymer DM showed the characteristic peaks of PMMA and dextran. As reported in literature, all peaks of dextran are located between 65 and 100 ppm, a chemical shift (a) at 100 ppm who is attributed to the anomeric carbon of glucose unit of dextran, the peaks (f) C-CH2 of dextran at 68 ppm, (k) for PMMA (O-CH3) at 55 ppm, and (j) carbonyl groups (C=O) of PMMA at 180 ppm. The
13

C-NMR spectroscopy was also used to confirm

quantitatively the percentage of dextran in the copolymer. By comparing peak integrals assigned to dextran and PMMA (the (a)/(j) ratio) in copolymer DM, we calculated that the copolymer contains 30% of dextran.

76

Premier article

Fig.2. 13C-NMR spectra of copolymer DM in deutered DMSO Figure 3 represents the intrinsic viscosity versus the known molecular weight of various dextrans in DMSO. The viscosity of copolymer DM ( = 0.48) was higher than the viscosity of the starting 70 kg/mol dextran ( = 0.37). The extrapolation of the viscosity value for copolymer DM gave an apparent molecular weight of 140 kg/mol.

Fig.3. Viscometric results obtained with copolymer DM in DMSO

77

Premier article 3.3. Preparation of 3D structures In contrast to dextran and PMMA, copolymer DM could be dissolved in a 20/80 mixture of water/THF (Table 2). Then, the solution containing copolymer DM could be molded in Petri dishes after evaporation for 24 h at room temperature as reported in Materials and Methods. The morphologies of dry DM films were influenced by the evaporation conditions. In the case of natural evaporation, films presented micro-phase separation and became opaque and brittle, whereas in the case of controlled evaporation for both solvents (THF and water), homogenous and transparent structures were obtained (Fig. 4a). Scanning electron microscopy provided additional information on morphology. Figure 4b evidenced the compact and homogenous structure of a thin DM film. Interestingly, the resulting films from copolymer DM were found insoluble in water (in contrast to dextran) even after days of immersion, and were thus suitable for been tested in biomedical applications.

Fig.4. Morphology of DM disc after controlled evaporation (a); SEM image (cross-section) of a thin DM film (b). 3.4. Thermo-mechanical analysis of copolymer DM The determination of the glass transition temperature was carried out for dextran, PMMA, and copolymer DM. The thermograms are reported on Figure 5. Tg of the two homopolymers, dextran (Fig. 5a) and PMMA (Fig. 5b) were 152C and 118C, respectively. A single Tg was obtained at 126C for copolymer DM (Fig. 5c). This value is thus intermediate as compared to the homopolymers. In contrast, a simple physical mixture of dextran with PMMA exhibited two distinct transitions (Fig. 5d).

78

Premier article

Fig.5. DSC thermograms of : (a) Dextran, (b) PMMA, (c) copolymer DM Dynamic mechanical analysis enables the assessment in a large range of temperature of the mechanical behavior of the 3D structures, including 37C, which is the working temperature for biomedical materials. The results on Figure 6 are reported for DM and PMMA, since dextran gave any film. The figure illustrated three parameters: (a) the storage modulus (E), (b) the loss modulus (E), and (c) tan which is the ratio (E/E). Data indicated a storage modulus E at 37C for DM of 4100 MPa, and for PMMA of 5700 MPa. As expected, both polymers showed a continuous decrease of the storage modulus with increasing temperatures (Fig. 6a). The loss modulus curve for copolymer DM was clearly shifted to higher temperatures as compared to PMMA (Fig. 6b). The maximum signal of tan is related to the molecular mobility transition, such as the glass transition temperature in DSC thermograms. The temperature dependence of the Tan (Fig. 6c) showed a maximum peak that was also used for the determination of the glass transition temperature: PMMA (109C) and DM (141C). The differences with DSC values were attributed to the presence of water tightly associated to polymer, which induced changes in both the storage and loss modulus. All together, these results evidenced the hybrid properties of the resulting copolymer DM structures that are significantly different from the two corresponding homopolymers, dextran and PMMA.

79

Premier article

Fig.6. Dynamic-mechanical spectra of PMMA (----) and copolymer DM (_____) : storage modulus (a), loss modulus (b) and Tan (c) as function of temperature. Dextran gave any film.

3.5. Cell biocompatibility Studies were performed to evaluate the in vitro cytocompatibility of DM films with human umbilical vein endothelial cells (HUVECs). Surfaces of DM films were not previously modified with cell adhesive proteins or peptides before cell cultivation. The adhesion of cells on the transparent DM films was directly observed under the microscope, and no morphological alterations were observed as compared to control cultures. The morphology of cells on DM films was normal as shown on Figure 7. Proliferation of HUVECs was also studied until 5 days after seeding at low cell density. Cell density strongly increased from sparse cells to an almost confluent layer on the DM surface after 5 days. These results strongly suggested a high compatibility with human cells of these structures, which will be studied in detail for vascular biomaterial purposes 10.

80

Premier article

Fig.7. Adhesion studies demonstrated that human endothelial cells (HUVEC) adhere and proliferate on DM film (Original magnification 12.5 x)

3.6. Copolymerization scheme Graft copolymerization of acrylic monomer onto polysaccharide was carried out using acrylic monomer and Ce(IV) as an initiator, as previously reported by others
30-38

. By adjusting

the different conditions indicated in the Material section, we were able to obtain a compound with a peculiar behavior. Indeed, the solubility experiments evidenced a narrow range of solvents for copolymer DM (DMSO is the only common solvent to dextran-PMMA-DM, and THF/water only for copolymer DM). Thermo-mechanical properties were also evaluated above, and DSC for copolymer DM evidenced a single Tg, as well as in dynamic mechanical spectra. In contrast to a linear di-bloc polymer, the proposed mechanism for grafting is outlined on Figure 8. The overall mechanism of copolymerization would consist of three steps, namely (1) free radical formation where the hydroxyl groups of dextran form a complex with ceric ions, (2) chain propagation, the complex dissociate, giving rise to free radical sites onto oxygen of polysaccharide and acrylic polymer chain propagate and (3) termination of the chain, by recombination of radicals. Experiments are currently in progress to definitively define the precise structure of this promising biocompatible copolymer.

81

Premier article

(a)
CH2 O H H H OH H OH O H OH CH2 H OH O H CH2

(b)
CH2 CH2 H OH O H O H H H OH H O O H O H H OH O H

(c)
O H H O O H

H OH H H

+ nCe (IV)
O

H OH H H

+ nCe (III) + n H+
O

+ monomer (MMA)

OH

O H H OH H OH O H O

CH2

Fig.8. Schematic representation of the proposed polymerization process. (a) dextran, (b) dextran oxidation by Ce(IV) with formation of free radicals, (c) grafting of acrylic monomers on free radicals (This representation does not imply that all glucosidic units are substituted).

4. Conclusion The purpose of this work was to study the copolymerization of dextran with metyl methacrylate. These compounds were chosen as model systems for copolymerization of polysaccharides with polyacrylates able to be included in bioartificial polymeric materials 10,19,39. Materials with improved mechanical properties were thus obtained by controlled reaction of dextran with acrylic monomer using ceric ammonium nitrate
36-38

. Interestingly, the obtained

copolymer DM formed 3D homogenous and transparent structures such as thin films or discs, and was highly compatible with human endothelial cells. Indeed, a peculiar solubility of the copolymer was found in mixtures of THF/H2O. Thermal and mechanical analysis evidenced intermediate properties between acrylic polymer and dextran. Furthermore, the morphological analysis indicated that graft copolymers were more stable than the homopolymers. Therefore, hybrid polymeric materials obtained from copolymerization between a synthetic acrylic monomer and a polysaccharide such as dextran could provide new biocompatible materials with improved properties.

Acknowledgements This work was supported by Inserm, University Paris 13, and IFR Paris Nord-Plaine de France. The authors wish to express their gratitude to Dr. Cdric Lorthioir (CNRS Thiais, France) for his excellent technical assistance in DMA tests, and E. Guenin (University Paris 13, School of Medicine) for NMR spectra.

82

(P M M A)

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(7) (8) (9) (10) (11) (12) (13) (14) (15) (16) (17) (18) (19) (20) (21) (22) (23) (24) (25) (26) (27)

Premier article (28) (29) (30) (31) (32) (33) (34) (35) (36) (37) (38) (39) Kirkpatrick, C. J.; Krump-Konvalinkova, V.; Unger, R. E.; Bittinger, F.; Otto, M.; Peters, K. Biomolecular Engineering 2002, 19, 211-217. Thbaud, N.-B.; Pierron, D.; Bareille, R.; Le Visage, C.; Letourneur, D.; Bordenave, L. J Mater Sci Mater Med 2007, 18, 339-345. Yagci, C.; Yildiz, U. European Polymer Journal 2005, 41, 177-184. Ramana Reddy, G. V.; Muthulakshmi, A.; Dulcy Evangelin, C.; Rajendran, P. Polymer International 2001, 50, 354-359. Bertholon, I.; Labarre, D.; Besnard, M.; Vauthier, C. Macromolecules 2006, 39, 35593567. Chauvierre, C.; Labarre, D.; Couvreur, P.; Vauthier, C. Macromolecules 2003, 36, 6018-6027. Pourjavadi, A.; Zohuriaan-Mehr, M. J. Starch 2002, 54, 140-147. Arslan, H.; Hazer, B. European Polymer Journal 1999, 35, 1451-1455. Shah, S. B.; Patel, C. P.; Trivedi, H. C. Carbohydrate Polymers 1995, 26, 61-67. Huang, C.-F.; Kuo, S.-W.; Lin, H.-C.; Chen, J.-K.; Chen, Y.-K.; Xu, H.; Chang, F.-C. Polymer 2004, 45, 5913-5921. Mahner, C.; Lechner, M. D.; Nordmeier, E. Carbohydrate Research 2001, 331, 203-208. Abed, A.; Deval, B.; Assoul, N.; Bataille, I.; Portes, P.; Louedec, L.; Henin, D.; Letourneur, D.; Meddahi-Pelle, A. Tissue Engineering Part A 2008, 14, 519-527.

84

Deuxime article

III.2. Introduction au second article

85

Deuxime article III.2. Introduction lissue du premier article, nous nous sommes rendus compte des avantages mais galement des inconvnients du copolymre dextrane-graft-PMMA (DM). En effet, ce copolymre est biocompatible mais il est rigide et prsente des proprits mcaniques limites. Ceci nous a conduit changer les monomres mthylmthacrylates par des monomres n-butylmthacrylates (BMA). Comme nous lavons expliqu larticle, les conditions de synthses restent les mmes. Trois copolymres sont synthtiss avec diffrentes proportions de dextrane et de BMA (11/89, 30/70 et 37/63; dextrane/BMA en masse) et sont nomms respectivement DB1, DB2 et DB3. Purifis et caractriss par infrarouge, DSC, les produits de synthse permettent de raliser trois types de films DB1, DB2 et DB3. Les proprits mcaniques de ces films sont tudies par DMA, le PBMA seul est exclu de ce test car il est trs fragile et cassant. Ltat de surface est caractris par la mesure de langle de contact et par AFM. Une tude comparative, de prolifration des cellules endothliales et des cellules musculaires lisses a t ralise sur ces films afin de dterminer leurs comportements vis--vis de ces trois copolymres. Nous avons complt cette tude par un test de comparaison de la migration des cellules endothliales sur copolymre et sur fond de puits de plaques de culture traites pour la culture cellulaire. Au cours de la synthse, on a constat une diminution du pH du milieu ractionnel pendant les ractions, ce qui traduit la libration d'ion hydrogne. Aprs 8 minutes environ, le milieu ractionnel change de couleur et devient de plus en plus laiteux ce qui correspond la formation de micelles de copolymres en suspension. L'opacit du milieu ractionnel est suivi par l'tude de la densit optique (650 nm) chaque 5 minutes depuis le dbut de la raction. Aprs 40 minutes la formation dun palier indique la fin de la raction de polymrisation. La spectroscopie infrarouge nous a permis deffectuer une analyse qualitative et quantitative des copolymres synthtiss. Nous avons ainsi mis en vidence la prsence simultane du dextrane et du BMA dans les trois chantillons. Cette technique nous a aussi servi quantifier le rapport du dextrane/PBMA dans chaque copolymre. Le pourcentage de dextrane dans le copolymre augmente avec laugmentation de la masse introduite de dextrane. Lanalyse par DSC permet de mettre en vidence et de comparer les Tg des trois chantillons et dun mlange dextrane + PBMA. Les trois copolymres prsentent une seule Tg, avec une valeur qui augmente avec la quantit du dextrane. Le mlange physique, lui, prsente deux Tg distinctes. Ltude de la solubilit montre que nos trois chantillons ne sont solubles ni dans leau ni dans le THF, mais ils sont solubles dans le mlange eau/THF 10%/90% v/v. Ceci nous a conduit 86

Deuxime article raliser trois types de films sous des conditions contrles. Quelque soit la quantit de dextrane, les films obtenus sont monophass et parfaitement transparents. Une autre mthode de dtermination du point de transition vitreuse de nos copolymres est utilise avec l'analyse mcanique dynamique (DMA). Comme pour les rsultats de la DSC, les mesures par DMA soulignent la prsence dune seule transition vitreuse (Tan prsente un seul pic qui correspond la Tg) apparaissant une temprature Tg qui augmente avec la quantit dextrane dans le copolymre. Nous avons par ailleurs constat une diffrence de valeurs entre les Tg obtenues par DSC et celles obtenues par DMA, diffrence qui peut tre attribue aux molcules deau lies. En effet, en DMA les chantillons subissent un seul passage temprature leve et leau joue le rle de plastifiant. Les mesures dangle de contact leau voluent avec la quantit de dextrane dans le copolymre. Le rsultat de ces mesures montre que le PBMA seul prsente langle de contact le plus lev c'est--dire le plus hydrophobe. Pour les copolymres, laugmentation de la quantit du dextrane conduit une diminution de langle de contact. Laugmentation significative de langle de contact entre les trois copolymres (de 57 80) peut tre attribue la quantit du dextrane prsent en surface. La rugosit et la topographie de surface des films PBMA et des copolymres ont t analyses par microscopie AFM. Les rsultats de mesures de rugosits montrent quil existe pas de diffrence notable entre les trois types de copolymres DB. Lensemble des rsultats de culture cellulaire montre que la proportion du dextrane dans le copolymre joue un rle majeur sur la prolifration cellulaire. Cette diffrence dans les rponses cellulaires peut sexpliquer par les interactions diffrentes des protines dadhrence adsorbes sur les surfaces, les trois copolymres tant de mme nature chimique. De plus, nous remarquons que le copolymre contenant 11% de dextrane favorise la croissance des cellules endothliales et inhibe la prolifration des cellules musculaires lisses ce qui est une proprit trs intressante pour des applications cardiovasculaires. Nous avons galement pu observer que le film de copolymre favorise la migration des cellules endothliales et de faon plus efficace que les puits traits pour la culture cellulaire. Cette action sur la rendothlialisation est galement susceptible dactivits trs favorables pour le dveloppement de ces produits pour le recouvrement de dispositifs biomdicaux.

87

88

Deuxime article

III.2. Second article

Films of dextran-graft-polybutylmethacrylate for vascular tissue engineering

S.M. Derkaoui, T. Avramoglou, C. Barbaud, D. Letourneur*

INSERM, U698, Bio-ingnierie de Polymres Cardiovasculaires, Institut Galile, Universit Paris 13, 93430 Villetaneuse, France

* Correspondence to Didier Letourneur, PhD Inserm, U698, Bio-ingnierie de Polymres Cardiovasculaires, Institut Galile, Universit Paris 13, 99 Av. J.-B. Clment, 93430 Villetaneuse, France Fax: +33 1 49 40 30 08 e-mail: didier.letourneur@galilee.univ-paris13.fr

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Deuxime article Abstract We have synthesized new structures made of amphiphilic copolymer dextran-graftpolybutylmethacrylate to evaluate their behaviors with vascular cells for the purpose of endothelialized tissue engineering devices. Grafting of butylmethacrylate onto dextran has been carried out using ceric ammonium nitrate as initiator. Three copolymers were obtained (11, 30 and 37% dextran) and homogeneous thin films were successfully prepared. In contrast to dextran, the resulting films were stable in water, and copolymers characterized by FTIR, DSC and DMA evidenced hybrid properties between the parent homopolymers. Surfaces of films were smooth when analyzed by AFM (roughness 2 +/-1 nm) but greatly differed in their hydrophilicity by increasing the dextran content (water contact angle from 99 to 57). In contrast to polybutylmethacrylate where the proliferation of vascular smooth muscle cells (VSMCs) was excellent but very low for endothelial cells, the copolymer containing 11% of dextran was excellent for endothelial cells and very limited for VSMCs. Increasing the dextran content in the copolymers decreased the proliferation for both vascular cell types. Finally, an in vitro wound assay evidenced that copolymer with 11% dextran is even more favorable for EC migration than tissue-culture polystyrene. Altogether, these results indicated that these copolymers with an appropriate composition could be of interest for endothelial cell regeneration. Keywords : Cell proliferation and migration; Copolymer; Dextran; Endothelial Cells; Polymer film; Polybutylmethacrylate; Vascular smooth muscle cells.

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Deuxime article 1. Introduction The development of amphiphilic copolymers based on copolymerization of hydrophilic and hydrophobic parts is of great importance due to their versatility and potential applications in regenerative medicine [1-4]. For instance, methacrylic polymers have been widely studied as a biocompatible matrix for use in tissue engineering [5-9]. Some other synthetic polymers showed physicochemical and mechanical properties comparable to those of the biological tissues to substitute, but were not sufficiently biocompatible. In this context, natural biological polymers such as polysaccharides possess good biocompatibility [10-12] , but their mechanical properties are often inadequate. Improvements of the characteristics of synthetic polymers could be attained by the addition of biological components in the macromolecule structures. The resulting materials could combine the appropriate mechanical properties of the synthetic polymer with the biocompatibility of the natural polymer. The main difficulty is the thermodynamic incompatibility of natural and synthetic polymers that is the result of enthalpy and entropy barriers caused by the differences in hydrophilicity/hydrophobicity. This incompatibility is a frequent phenomenon observed for many polymer mixtures and results in phase separation [13,14]. In order to overcome this problem, we and others have already investigated graft copolymerization of a synthetic polymer (polymethylmethacrylate) onto a natural macromolecule (dextran) using ceric ammonium nitrate as a redox initiator [15-18]. This strategy consisted on the creation of free-radical grafting sites on the dextran backbone by reaction with cerium IV, the radicals so formed, initiated copolymerization with methylmethacrylate monomers [19-22]. We described here new compounds obtained from graft polymerization of dextran with butylmethacrylate that were used to prepare a series of films, differing in their wettability by varying the concentration of dextran, and we studied their behaviors with vascular cells. We found that films with a peculiar composition were able to greatly enhance endothelial cell growth and migration, but not vascular smooth muscle cell proliferation.

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Deuxime article 2. Materials and methods 2.1. Materials Dextran 70000 g/mol obtained from SIGMA, France, was dried under vacuum at 60C for 24h. Butylmethacrylate monomers were obtained from Acros, France, and were purified by washing with NaOH 5%, NaCl 20%, followed three times by distilled water. Ce(IV) ammonium nitrate and nitric acid were obtained from Acros, France.

2.2. Procedure for graft copolymerization Three types of copolymers were synthesized by varying the amount of dextran. The general experimental procedure was as follow: the reactions were carried out into 1L five-neck flask equipped with stirrer and condenser then the flask was immersed into thermostated oil bath at 40C and purged by nitrogen gas. Three different mass ratios of dextran to BMA (0.125/2; 0.5/2; 0.75/2 w/w) were used. Dextran was dissolved in 500mL of nitric acid 0.2M for 10min. 5mL of solution of Ce(IV) dissolved in HNO3 0.2M (2.4 10-4 mol/L) and 2g of monomers were simultaneously added. The system was continuously stirred for 50 min and the solution was neutralized to pH 8 by addition of NaOH aqueous solution (10M) and concentrated with rotavapor. Methanol was used as a non-solvent to precipitate the polymeric material, that was washed with 50mL EDTA 10-2M to remove cerium ions. The three purified copolymers named DB1, DB2 and DB3 were frozen at -20C and lyophilized for 24h. In order to obtain pure graft copolymers, the resulting products were extracted with acetone in a soxhlet for 24h. Pure copolymers were dried under vacuum and weighted.

2.3. Preparation of films Preparation of copolymers films was carried out by dissolving 6% (w/v) of copolymers in mixture THF/H2O 90/10 (v/v). 500L of the transparent solution obtained was molded in Petri dishes (15mm in diameter) for 24h at room temperature in saturated atmosphere of THF and in presence of CaCl2 to absorb water. After solvent evaporation, films were released from the mold upon addition of distilled water, while in the case of PBMA (very fragile), the films were soaked in distilled water for 2h and then carefully removed from the Petri dishes. The samples were air dried for 24h to remove the solvent and obtained films are 35m in thickness. The films were rinsed several times with PBS. Films of copolymers were cut for mechanical tests in the shape of 15mm x 5mm, but PBMA film was not prepared because it was very brittle.

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Deuxime article 2.4. Infra-red spectral analysis The infra-red spectra of copolymers films (DB1, DB2 and DB3) were obtained using a Perkin-Elmer 1600 spectrometer. Each film was mounted on the sample holder. The atmosphere spectrum was subtracted as background for each scan. Each spectrum was obtained at a resolution of 1 cm-1 using 32 scans. Omnic software was used for data acquisition and analysis. Fourier transform infra-red (FT-IR) spectroscopy was also used to semi-quantitatively estimate the percentage of dextran in the copolymers using physical mixtures of dextran and PBMA at different ratios. A quantity of 15 mg of fine KBr powder was mixed with 1.5mg of physical blend of dextran/PBMA weight ratio (5/95, 10/90, 15/85, 20/80, 25/75, 30/70, 35/65 and 40/60). We used the integrated area of (O-H) band at 3400cm-1 with different concentrations of dextran, PBMA and each synthesized copolymer.

2.5. Differential scanning calorimetric analysis (DSC) Thermal behavior of homopolymers (dextran and PBMA) and all copolymers (DB1, DB2 and DB3) were performed with a Setaram DSC131 thermal analyzer, operating in combination with the liquid nitrogen cooling accessory. A mixture of dextran + PBMA (50%, 50% w/w) was also tested. The furnaces were purged with nitrogen and samples were passed in temperature range from -50 to +200C at heating rate of 10C/min. In each case, two consecutive scans were carried out on each sample. The glass transition temperature (Tg) of the products was taken as the midpoint in the shift of heat flow baseline.

2.6. Dynamic-mechanical analysis (DMA) on copolymer films DMA test was used to analyze loss modulus, storage modulus and tan of all films of copolymers (DB1, DB2 and DB3). PBMA was not tested because it was rigid and very fragile at room temperature. Films of 15 x 5 x 0.035 mm were analyzed on dynamic-mechanical analyzer, DMA Q800 (TA Instruments). The equipment has operated in a single cantilever bending mode at 1Hz in frequency, amplitude 5m and a heating rate of 3C/min from -100 to +200C.

2.7. Contact angle measurements For an evaluation of surface wettability, the water contact angles of films were measured at room temperature using a contact angle system (Krss, model DSA 10- Mk2). A droplet of deionized water (2L) was put on the air-side surface of the films and after 10s the contact angle was measured. The process was monitored by a video contact angle system. Ten measurements were carried out for each simple (PBMA, DB1, DB2 and DB3; dextran gave any film) and the obtained values were averaged. 93

Deuxime article

2.8. Topography and roughness (AFM) Atomic force microscopy (AFM) was performed to determine the surface roughness and the uniformity of coating. All films were imaged with a Nanoscope III Digital instruments dimension 3100 atomic force microscope (Veeco Metrology Group) and a resonance frequency range 50-100Hz. Three areas per sample were imaged under Tapping contact mode and analyzed with WSxM 3.0 beta 10.0 to obtain roughness (Ra) and peak heights of each film. All measurements were performed under ambient conditions.

2.9. Cell adhesion and proliferation on copolymer films Endothelial cells (human umbilical vein endothelial cells (HUVEC from ATCC) and smooth muscle cells (aortic vascular smooth muscle cells (VSMCs, line Rb1 ), were used in this study. The films (15 mm in diameter) were placed on the bottom of 24-well plates, and the two surfaces were submitted to UV at 254nm for 15min. The ECs and VSMCs cells were seeded on each film at 5x103 cell/cm2. Cells were cultured in Dulbeccos Modified Eagles Medium (DMEM, Gibco) with 4.5 g/L of glucose and 2% L-glutamine supplemented with 10% calf serum and 1% of penicillin and streptomycin. The cells were incubated for 5 days at 37C in air containing 5% CO2 and in a humidified incubator. The transparency of all films allowed to see the cell morphology with a classical inverted phase contrast light microscope (Zeiss, Axiovert 100). The kinetics of proliferation has been determined daily for 5 days after starting cell culture. The cell layer adhering to the each disc was washed twice with PBS 1x to remove remaining materials and loose cells and the cells were detached with trypsin/EDTA 0.25/0.02 (w/v), resuspended and counted with a Coulter (Coulter Counter ZM). The mean cell number from two wells per tested material was counted. Results are averaged from two separate experiments.

2.10. Endothelial cell migration In vitro migration assay of ECs was performed as described [23,24]. Briefly, ECs at 5x103 cell/cm2 were seeded into 24-well plates, where DB1 film has been placed on the bottom of wells. Equivalent numbers of cells were also seeded directly into in 24-wells of tissue culture treated polystyrene surface (TCPS) as a reference surface. After 5 days, EC monolayers were scraped (denuded) using a 10L plastic micropipette tip and washed by sterile phosphate buffered saline solution (PBS, 0.01M, pH = 7.4), afterwards PBS was replaced with DMEM. Area of migration was observed with optical microscopy and measured at 8, 24, 32, and 48 hours after taken pictures by a digital camera (Pentax istD). 94

Deuxime article 3. Results and discussion 3.1. Synthesis of the graft copolymers In this work, three types of dextran-graft-polybutylmethacrylate copolymers were synthesized via redox initiation in 500mL of acidified aqueous solution. The decrease in pH of the reaction mixture, as well as increase of optical density (appearance of tiny white particles shortly after the cerium and monomer addition) suggested initiation of copolymerization as shown in Figure 1. In contrast, no grafting polymer was observed in the absence of dextran or butylmethacrylate monomer. Three copolymers (DB1, DB2 and DB3) were successfully synthesized by increasing the dextran content in the starting solution. Interestingly, the resulting copolymers were not soluble in any solvents of the parent homopolymers (Table 1) but only in a mixture 90/10 of THF/water.
0.4 0.34 0.28 0.22 0.16 0.1 0 10 20 30 40 50 60 0.25 0.2 0.15 0.1 0.05 0

Time (min)
Fig. 1. Variation of pH () and optical density () during copolymerization. Dextran-graftpolybutylmethacrylate copolymers were synthesized via redox initiation. The decrease in pH (left), as well as increase of optical density at 650 nm (right) was plotted as a function of time. No change was observed in the absence of dextran or butylmethacrylate monomer.

95

O.D at 650nm

pH

Deuxime article

3.2. Infra-red analysis As shown in Figure 2, the comparison of FT-IR spectra of PBMA (a), dextran (b) and all copolymers DB1 (c), DB2 (d) and DB3 (e) showed the presence of typical absorption band of PBMA at 1730 cm1 corresponding to C=O stretching vibrations, and characteristic band for dextran corresponding to OH stretching absorption at 3400 cm-1. The intensity of O-H band increased with increasing proportion of dextran in copolymers. Semi-quantitative analysis of the integrated area of the 3400 cm1 peak as previously described [25], gave a calibration curve using physical mixtures of dextran and PBMA of known proportions (Fig. 3) and an estimate of the content of dextran in the copolymers (11, 30 and 37 % in dextran for DB1, DB2 and DB3, respectively).

96

Deuxime article

1730

3400

% Transmittance

b c d e

4000

3500

3000

2500

2000

1500

1000

500

Wavenumbers (cm-1)
Fig. 2. Fourier transform infra-red spectra of (a) PBMA, (b) dextran, (c) DB11, (d) DB30 and (e) DB37. Note the presence of typical absorption band of PBMA at 1730 cm1 corresponding to C=O stretching vibrations, and characteristic band for dextran corresponding to OH stretching absorption at 3400 cm-1.
50 40 37 % of dextran 30.1 20 11.5
y = 0.0019x - 10.393 R = 0.97

0 0

10000

20000

30000

40000

FTIR estimated surface area of OH bands

Fig. 3. Fourier transform infra-red spectroscopy was used to semi-quantitatively estimate the percentage of dextran in the copolymers. Physical blends of dextran/PBMA (5/95, 10/90, 15/85, 20/80, 25/75, 30/70, 35/65 and 40/60) were used for the integrated area of (O-H) band at 3400cm-1. Surface area estimated by IR according to the percentage of dextran (a) DB1, (b) DB2 and (c) DB3. 97

Deuxime article 3.3. Differential scanning calorimetric analysis The determination of the glass transition temperature is a useful tool to evaluate the miscibility of polymers. Miscible polymers by grafting show a single Tg that is different and intermediate between those of the single components . Figure 4 shows the DSC curves of dextran (a), PBMA (b), physical mixture dextran + PBMA (c), and all DB copolymers (d, e, f). When dextran and PBMA were physically blended in equal amounts (Fig. 4c), two separate Tg were obtained, very close to the Tg of the single homopolyers (28C for pure PBMA, and 153C for pure dextran). Each DB copolymer showed a single glass transition, with an intermediate value compared to the parent homopolymers. These values greatly differed from copolymers when methylmethacrylate was used instead of butylmethacrylate. Tg value of DB copolymers increased with increasing percentage of dextran in copolymer (31C, 38C, 42C for DB1, DB2 and DB3, respectively) as previously observed . Thus, the existence of a single glass transition of the copolymers confirmed the successful grafting of BMA onto dextran in all synthesized copolymers. Therefore, the graft copolymer obtained was not a simple physical mixture between dextran and PBMA macromolecules.

Dextran

Tg = 152C

DB1

Tg = 31C

Exo
-40 -20 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 -40 -20 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180

PBMA Heat flow

Tg = 28C

DB2

Tg = 38C

-40

-20

20

40

60

80

100

120

140

160

180

-40

-20

20

40

60

80

100

120

140

160

180

PBMA + Dextran Tg1 = 28C Tg2 = 153C

DB3

Tg = 42C

-40

-20

20

40

60

80

100

120

140

160

180

-40

-20

20

40

60

80

100

120

140

160

180

Temperature (C)

Fig. 4. DSC curves showing the glass transition temperature (Tg). Curves for (a) dextran, (b) PBMA, (c) mixture of dextran + PBMA (50% + 50%), (d) DB1, (e) DB2 and (f) DB3 are reported in temperature range from -50 to +200C at heating rate of 10C/min. In each case, two consecutive scans were carried out on each sample. The Tg was taken as the midpoint in the shift of heat flow baseline.

98

Deuxime article 3.4. Mechanical properties of copolymer films As indicated above (Table 1), the solubility of copolymers was only found for a specific mixture of THF/water. Copolymers films were thus obtained by dissolving copolymers in THF/H2O 90/10 (v/v), and after controlled solvent evaporation, thin films were obtained. The films from copolymers were homogenous, transparent and insoluble in water (in contrast to dextran). PBMA could not be used for mechanical assessment since it was too fragile. The dynamic-mechanical analysis (DMA) is a powerful technique to study the graft polymerization of different compounds. This technique also enable the evaluation of the mechanical behavior at 37 C, of interest for biomedical use. DMA results are composed of three parameters: (a) the storage modulus (E), (b) the loss modulus (E), and (c) Tan which is the ratio (E/E), for determining the occurrence of molecular mobility transition, such as the glass transition temperature (Tg). It can be consider that the detection of a single peak in Tan is a sufficient criterion to assume the miscibility. The data shown in figure 5 a, revealed a storage modulus E of about 480 MPa for DB1, 680 MPa for DB2 and 1010 MPa for DB3 at 37 C, that increased with increasing amount of dextran. In all cases, E decreased with increasing temperature, as usual for polymers. The elastic modulus, i.e. the stiffness, decreased with increasing amount of dextran in copolymers as shown in figure 5 b. On the other hand, temperature dependence of the Tan showed a maximum peak which was used for the determination of the glass transition temperature as showed in figure 5 c: DB1 (57C), DB2 (60C) and DB3 (64C). These values were thus much lower than for pure polymethylmethacrylate (109C) or dextran-graft-polymethylmethacrylate (141C) [26,27]. Similar to DSC results, each film exhibited one glass transition relaxation confirming the graft copolymerization. Differences in values with DSC could be attributed to the presence of water tightly associated to copolymers, which induced changes in mobility of macromolecules.

99

Deuxime article
6.0 Storage modulus E (GPA)

0.6 Loss modulus E (GPA)


a

b 0.4

4.0

2.0

0.2

0 -100 -50 0 Temperature (C) 50 100

0 -100 -50 0 Temperature (C) 50 100

1.5 c Tang (E/E) 1

0.5

0 -50 0 50 Temperature (C) 100 150

Fig. 5. Dynamic-mechanical analysis for copolymer films. Storage modulus E (a), Loss modulus E (b) and Tang (E/E) (c) as function of temperature of films from copolymers DB1 (.), DB2 (-------) and DB3 (________). PBMA was too fragile to be characterized.

3.5. Water contact angle of the films Hydrophilicity was evaluated by water contact angle () measurement, an indication of surface wettability. The static water contact angles on the films are shown in Figure 6. The higher contact angle indicates lower hydrophilicity. As a consequence, PBMA exhibited the highest contact angle ( = 99) and was the most hydrophobic material. DB1 ( = 80) and DB2 ( = 73) film had moderate level of wettability, whereas DB3 ( = 57) film showed the lowest contact angle. Contact angle on copolymer films exhibited a progressive decrease with increasing dextran content (Fig. 6), thus indicating increased hydrophilicity. This result was expected, given the highly hydrophilic nature of dextran.

100

Deuxime article
120

Contact Angle (degrees)

80

40

0 0% 30% Dextran content (wt%) 11% 37%

Fig. 6. Water contact angle of films of PBMA, DB1 (11% dextran), DB2 (30% dextran) and DB3 (37% dextran). Contact angle with water was obtained using the sessile drop method with 10 measurements per tested surface.

3.6. Topography and roughness of the films All films were further characterized by Atomic Force Microscope in tapping mode imaging to obtain information on the surface morphology. DB films exhibited smooth surface, with no notable trends in topographical features upon increasing of dextran content (Fig. 7). The values for roughness of films were quite similar (PBMA Ra = 1.9; DB1 Ra =1.6 ; DB2 Ra = 2 ; DB3 Ra = 2.7). Roughness observed on surface of DB films make them interesting and promising for biological applications in cell adhesion, and physical immobilization of biomolecules.

101

Deuxime article

Fig. 7. Atomic Force Microscopy of (a) PBMA, (b) DB1, (c) DB2 and (d) DB3 (scale X, Y 2m/div). All films were imaged under Tapping contact mode with a resonance frequency range of 50-100Hz. Three areas per sample were imaged and analyzed to obtain roughness (Ra) and peak heights of each film.

3.7. Cell proliferation on films Biocompatibility of the materials was tested by seeding ECs and VSMCs on films. After 6 h cultivation, analysis of the VSMC morphology on PBMA film showed that cells changed from spherical to fusiform shape, and spreaded out of its pseudopodia, indicating clear cell adhesion, but no adhesion of ECs on hydrophobic PBMA. After 5 days, VSMCs attained confluence on PBMA (never with ECs), and VSMC proliferation and morphology were comparable to the control cultures on TCPS. As shown in Figure 8, analysis of cell numbers indicated that on copolymer film DB1 (concentration of dextran 11%), ECs proliferated very well and reached confluence after 5 days (Fig. 8a), in contrast to VSMCs that did not proliferate on DB1 (Fig. 8b). This marked difference for DB1 film was somehow unexpected, but could be related to a peculiar surface tension of the film and its subsequent adhesion of serum proteins that could differentially interact with cell receptors involved in cell adhesion. A detailed study of protein adsorption should be carried out to study this effect. When the dextran content in copolymers increases to 30% or 37%, the number of spreading cells (ECs and VSMCs) decreased considerably, and proliferation for both types of cells was very limited (Fig. 8). This result indicated that EC proliferation is sensitive to the hydrophobic/hydrophilic properties of films, the chemical components being the same between the copolymers. In this context, many studies have proved that surface characteristics of 102

Deuxime article biomaterials such as wettability, greatly affect the cell adhesion and growth on the materials [28,29]. It can be explained that preferential adsorption of some serum proteins like fibronectin and vitronectin from culture medium modulated adhesion and cell growth. In the work of Risbud et al., PMMA substrates were exposed to radio-frequency argon and nitrogen plasmas to decrease the water contact angle [30,31]. They found that the untreated PMMA surface did not support endothelial growth and PMMA treated by plasma was better but exhibited growth rates lower than the TCPS. The chemical approach reported here by graft polymerization allowed to obtain fine tunable properties for excellent endothelialization. Surface roughness is another important parameter in biomedical materials, that may affect cell adhesion and can compromise hemocompatibility in the case of vascular prostheses[32-34] . According to the AFM results, the roughness is similar among the different films. Consequently, the proportion of dextran in the copolymer that greatly affected the hydrophilicity, seems the main parameter to obtain the favorable endothelialization of the surface.

Fig. 8. Effect of film copolymers on cell adhesion and proliferation. (A) ECs and (B) VSMCs were cultured on PBMA or copolymers DB1, DB2, DB3. Pictures were taken after 5 days in culture (Original magnification 12.5 x). Cell growth curves for PBMA and copolymers DB1, DB2, DB3

103

Deuxime article 3.8. Endothelial cell migration The in vitro migration assay, created from a wound in a confluent EC monolayer, was used to assess the effect of DB1 on EC migration compared to TCPS (the other polymer surfaces did not allowed a confluent EC monolayer). Cell migration was measured as the denuded area in which ECs invading. As shown in Figure 9 (top, left panel), the cells on copolymer had extensively migrated from the edge of the scrape into the denuded space. They reach confluence at 32h on copolymer. In contrast, EC migration on TCPS was slower (Fig. 9, right panel), and migration area remained non-confluent until 48h. This evidenced that surface of DB1 film was appropriate for EC migration and proliferation. (a) DB1 (b) TCPS

0h

8h

24h

32h

48h

104

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0.3

bottom of wells TCPS DB1

Denuded area (mm2)

0.2

0.1

0 0 8 24 32 48 56 Incubation time (hrs)

Fig. 9. EC migration of a denuded EC monolayer on DB1 film (top, left panel) or on TCPS (top, right panel). Bar is 100m for each picture. Bottom panel : Quantitative analysis of EC migration versus time. Area of migration was observed with optical microscopy and measured at 8, 24, 32, and 48 hours.

4. Conclusion The aim of this study was to synthesize new copolymers having the biological biologic properties of polysaccharides and the mechanical properties of polyacrylate. A series of copolymers of dextran and butylmethacrylate was successfully synthesized by radical polymerization and characterized by various techniques. IR, DSC and DMA revealed that the graft copolymerization has been taken place and the miscibility between the two different natures of polymers could be obtained. In contrast to dextran, homogenous and transparent films were easily prepared from all DB copolymers. The properties were enhanced as compared to our previous report with dextrangraft-polymethylmethacrylate . In particular, DB1 was able to inhibit VSMC proliferation, and at the same time to support endothelial cell proliferation and migration. Lastly, cell adhesion and proliferation can be controlled by varying the content of dextran incorporated into the DB copolymer. Moreover, DB retained the excellent characteristics of dextran and PBMA for applications in tissue engineering. Therefore, a potential benefit of this approach is the availability of bioactive surfaces with tunable properties of interest for vascular tissue engineering.

105

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ACKNOWLEDGMENTS This work was supported by Inserm, University Paris 13, and IFR Paris Nord-Plaine de France. The authors wish to express their gratitude to Dr. Cdric Lorthioir (CNRS Thiais, France) for his excellent technical assistance in DMA tests, and V. Guegen (Institut Galile, Universit Paris 13, France) for her help in contact angle measurements.

106

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14. 15. 16. 17. 18.

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23. 24. 25. 26. 27. 28. 29. 30. 31.

32. 33. 34.

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Troisime article

III.3. Introduction au troisime article

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Troisime article III.3. Introduction Les avantages du copolymre dextrane-graft-polybutylemthacrylate (DB) cits dans le second article, nous ont conduit tester ce copolymre comme revtement sur des stents mtalliques en acier 316L. Ce revtement a t caractris par ATR-FTIR, son tat de surface est tudi par AFM et MEB. La distribution du dextrane dans le copolymre et sur la surface des stents enduits est analyse par microscopie fluorescence grce au copolymre synthtis avec un mlange dextran, dextrane-FITC 90%, 10% m/m. Une tude comparative de prolifration des cellules HUVECs et SMCs a t ralise sur les plots 316L et films DB. Le protocole retenu est lvaluation de la prolifration des cellules sur les surfaces des plots et des films DB en procdant au dtachement et au comptage quotidiens des cellules. Nous avons complt cette tude par un test in vitro, une comparaison de lendothlialisation entre sur des stents enduits avec le copolymre DB et sur des stents nus. Lanalyse par ATR-FTIR du revtement nous rvle la prsence simultane du dextrane et du PBMA. Il napparat aucune diffrence significative entre les spectres des copolymres (DB) cits dans le second article et le revtement dpos sur lacier 316L. Le copolymre solubilis dans le mlange eau/THF 90%/10% v/v, nous a permit denduire les stents aprs un schage dans des conditions contrles. Des surfaces correspondant 10 m2 de stents nus et des stents enduits expanss ont t observs par microscopie AFM en mode tapping. Les images topographiques des surfaces des stents nus rvlent une rugosit moyenne de (Ra = 22), cette rugosit a diminue avec le recouvrement des stents (Ra = 16). Une observation au microscope fluorescence des stents enduits par le copolymre contenant du dextrane-FITC, nous rvle que le dextrane est distribu dune manire homogne. Afin de confirmer ces rsultats et de vrifier le comportement du recouvrement, nous avons complt cette analyse par une tude au MEB. Lobservation directe du revtement sur les stents a ncessit la mtallisation de la surface, cette observation avant et aprs expansion confirme que le revtement effectu est homogne et suit parfaitement la dformation du stent aprs lexpansion sans craquelures ni perte de matire. Ltude de la prolifration sur des supports en 316L et sur des films de copolymre et le comptage quotidiens, montre dune part, que la prolifration des CMLs est retarde, et dautre part la prolifration des HUVECs et beaucoup plus importante lorsque lacier 316L est revtu par DB film. Ces rsultats indiquent que ce revtement favorise la prolifration des HUVECs, tandis quil inhibe la croissance des CMLs.

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Troisime article Une observation des cellules directement sur les stents (supports opaques) laide dun marquage fluorescent avec la phallodine nous permet de voir la diffrence de prolifration des HUVECs sur les stents nus et les stents enduits. Apres 5 jours de prolifration, les cellules endothliales sont fixes sur les stents marques par la phallodine et sont observes en microscopie fluorescence. Les rsultats montrent que la prolifration des cellules HUVECs est plus importante sur les stents recouvert du DB que sur les stents nus.

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Troisime article

III.3.1. Troisime Article

Dextran-graft-polybutylmethacrylate copolymer for stent coating


S.M. Derkaoui1, A. Labb1, T. Avramoglou1, C. Barbaud1, S. Tehrani2, S Holvoet2, D. Mantovani2, D. Letourneur1 *

INSERM, U698, Bio-ingnierie de Polymres Cardiovasculaires, Institut Galile, Universit Paris 13, 93430 Villetaneuse, France

Laboratory for Biomaterials and Bioengineering, Department of Materials Engineering;

University Hospital Research Center, Laval University, Quebec City, Quebec G1K 7P4, Canada.

ARTICLE EN PREPARATION

* Correspondence to: Didier Letourneur, PhD Inserm, U698, Bio-ingnierie de Polymres Cardiovasculaires, Institut Galile, Universit Paris 13, 99 Av. J.-B. Clment, 93430 Villetaneuse, France Fax: +33 1 49 40 30 08 e-mail: didier.letourneur@galilee.univ-paris13.fr

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Troisime article Abstract Amphiphilic copolymers based on copolymerization of hydrophilic and hydrophobic parts offer versatility and various applications in the field of biomedical devices. A new biocompatible copolymer dextran-graft-polybutylmethacrylate was synthesized. Coating of endovascular metallic prosthesis (stent) was successfully prepared and characterized by atomic force microscopy analysis and scanning electron microscope. The resulting coating of bare stents with copolymer was smooth and uniform with neither cracks nor detachment after balloon expansion. Interestingly, vascular cell adhesion and growth on the surface of stent was studied in vitro over 5 days. Results indicated that stent coated with copolymer improve adhesion and proliferation of endothelial cell and inhibits proliferation of smooth muscle cell. This type of new copolymer with tunable properties seems of great interest for medical devices.

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Troisime article Introduction Coronary stent implantation has become a common practice in cardiovascular surgery. However, restenosis remains by far the main complication of this technique. Indeed the endothelium injury resulting from the stenting involves, as an ultimate consequence, the proliferation of smooth muscle cells (SMCs) leading in some cases to thrombosis [1]. Indeed, migration and proliferation of SMCs is one of the important mechanisms in the formation of atherosclerotic plaques to cause in-stent restenosis [2]. One condition to avoid thrombus formation is to favour a fast re-endothelialisation of the arterial vessel after implantation and a limited proliferation SMCs. Metallic surfaces are not adequate to endothelial cell development and they generally induce the adhesion of platelets that stimulate the proliferation of SMCs. Surface treatments have been developed in response to this lack of biocompatibility. First of all, metallic surface roughness can be decreased by electropolishing [3, 4] to reduce platelets adhesion [5, 6] and avoid inflammation process. In addition, several studies refer to the stent covering by a polymeric layer for improving stenting in coronary arteries [7, 8]. This second strategy allowed to combine chemical modification and roughness reduction of the stent surface. Coating metallic stents by polymeric biocompatible materials have been described and several polymers have been examined such as polyurethane, poly(ethylene terephtalate), polyorganophosphazene, poly(l-lactic acid), polydimethylsiloxane[9]. These coatings build up a protective layer to the surrounding tissues against corrosion products of metallic stents [10, 11] while preserving metal mechanic properties. As cell adhesion is also depending on surface wettability [12], this parameter can be controlled by varying the nature and the composition of the polymeric material [13]. Thereby, highly hydrophobic surface are completely inert besides biological surroundings which limits the reconstruction of the arterial vessel. On the contrary, hydrophilic coatings are generally more blood compatible since platelets are less absorbed [14] and they facilitate the growth of endothelial cells by promoting the attachment of high-densitylipoprotein [12]. Among biocompatible polymeric materials, methacrylate polymers and polysaccharides like dextran have been widely studied. Previous papers demonstrated the non-toxicity of dextran, which was widely developed as biocompatible hydrogel [15, 16]. On the other side, polymethacrylates are currently used in pharmaceutical or biomedical applications. Poly(n-butyl methacrylate) is a particularly interesting methacrylate polymer thanks to its mechanical properties. Furthermore it has already demonstrated its efficiency as biocompatible component of drug delivery stents.

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Troisime article The present work describes the results obtained with a new dextran-g-poly(n-butyl methacrylate) copolymer for stent coating. As already described in previous papers cerium(IV) ammonium nitrate was chosen as free radical initiator [17]. Radical grafting sites are created on the dextran backbone by reaction with Ce(IV) and initiate the copolymerization with n-butyl methacrylate leading to a grafted copolymer. Different dextran/n-butyl methacrylate ratios have been studied. By varying hydrophilic/hydrophobic balance of the copolymer the biological response can be optimized. In this context the adhesion of smooth muscle cells and endothelial cells has been examined for dextran/n-butyl methacrylate copolymer coated on stent.

2. Materials and methods 2.1. Materials 316L stainless steel stents with internal expanded diameters of 3.5 mm were used in all experiments (from Guidant, Ireland). FITC-dextran (70 kg/mol) (dextran labeled with fluorescein isothiocyanate) and Dextran 70 kg/mol was procured from SIGMA, France; it was dried in vacuum oven at 60C for 24h. Butyl methacrylate monomers were obtained from Acros France and were purified by washing with NaOH 5%, NaCl 20%, followed three times by distilled water. Ceric ammonium nitrate (CAN) and nitric acid was obtained from Acros France.

2.2. Synthesis of the copolymer The general experimental procedure was as follows: the reactions were carried out into 1L five-neck flask equipped with stirrer and condenser then the flask was immersed into thermostated oil bath at 40C and purged by nitrogen gas. The dextran and FITC-dextran were blended at mass ratios 90%, 10% respectively. Dextran labelled with FITC was used to evidence the distribution of polysaccharide in copolymer and the coating can be visualized by the use of FITC-dextran-graft-polybutylmethacrylate. The mixture of dextran was dissolved in 500mL of nitric acid 0.2M for 10 min. 5mL of solution of Ce(IV) dissolved in HNO3 0.2M (2.4 10-4 mol/L) and 2g of BMA monomers were simultaneously added. The system was continuously stirred for 40min after that, the solution was neutralized to pH 8 by addition of NaOH aqueous solution (10M) and concentrated with rotavapor. Methanol was used as a non solvent to precipitate the polymeric material, which was washed with 50mL EDTA 10-2M to remove cerium ions. The purified copolymers were frozen at -20C and lyophilized for 24h. In order to obtain pure graft copolymer, the resulting product was extracted with acetone in a soxhlet for 12h to remove PBMA homopolymer. Pure copolymers was lyophilised again, dried under vacuum and weighted.

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Troisime article 2.2. Copolymer solubility and stent preparation Obtained product was dissolved in mixture THF/H2O (90/10 v/v) at the rate of 6 % (w/v). Expanded stents were dip-coated by immersion in copolymer solution. After evaporating of solvent for 24h at room temperature in saturated atmosphere of THF and in presence of CaCl2 whos absorbs water, stents were air dried for 24h. This procedure left a fine copolymer film covering the surface of the stents. Therefore coated stents were mounted over a balloon, and hand-crimped after that stents were deployed by balloon inflation. Then all stent were rinsed several time with distilled water and PBS, the recovered stents are valid to characterization and cell seeding.

2.4 Characterization 2.4.1 Infra-red spectral analysis Attenuated total reflection-Fourier transform infrared spectroscopy (ATR-FTIR) was recorded on a Nicolet spectrometer. Plots of AISI 316L (Goodfellow) coated with PBMA and DB were mounted on the sample holder. The atmosphere spectrum was subtracted as background for each scan. Each spectrum was obtained at a resolution of 1 cm-1 using 64 scans. Omnic software was used for data acquisition and analysis.

2.4.2 Topography and roughness of stents (AFM) In this study, atomic force microscopy (AFM) was performed to determine the surface roughness and estimate the uniformity of coated and uncoated stents. Samples were imaged with a Nanoscope III, Digital instruments dimension 3100 atomic force microscope (Veeco Metrology Group) and a resonance frequency range 50-100 Hz. The scanning range was 1010 m2. Each sample was imaged under tapping contact mode and analyzed with WSxM 3.0 beta 10.0 to obtain roughness (Ra) which is the centreline average between the highest and the lowest points of the surface irregularities. All measurements were performed under ambient conditions.

2.4.3 Morphological evaluation of coated stents Fluorescein isothiocyanate labeled dextran (FITC-Dextran) was used in order to evaluate the homogeneity and distribution of dextran in coated layers. Fluorescent coating was analysed by confocal microscope using standard rhodamine and fluorescein filters. The morphology of coated stents was also investigated by scanning electron microscopy (SEM) before and after balloon expansion. The samples were mounted on aluminium stubs covered with adhesive conductive carbon tape and coated with a layer of gold/palladium. The micrographs were obtained at 5.0 kV on a scanning electron microscope Leica 340. 117

Troisime article 2.5 Cell adhesion and proliferation on the surface of stent Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC from ATCC) and vascular smooth muscle cells (VSMCs line Rb1 [18]), were used in this study. Coated stents were placed on the bottom of a 24-well tissue-culture polystyrene plate, and were sterilized by exposure to UV at 254 nm for 30 min. Bare metal stents were also used as a reference. HUVECs cells were seeded on each sample at 5 105 cell/stent. Cells were cultured in Dulbeccos modified Eagles medium (DMEM, Gibco) with 4.5 g/L of glucose and 2% L-glutamine supplemented with 10% calf serum and 1% of penicillin and streptomycin. The cells were incubated at 37C in air containing 5% CO2 and in a humidified incubator. The kinetics of proliferation of HUVEC and SMCs has been determined on discs of DB films and plots of AISI 316L. Daily and for 5 days after starting cultures, the cell layer adhering to the each disc and plots was washed twice with PBS 1X to remove remaining materials and loose cells. Then, cells were detached with trypsin/EDTA 0.25/0.02 (w/v), resuspended and counted with a Coulter (Coulter Counter ZM). The mean cell number from the two samples per tested material was counted and average used to determine the cell kinetics of proliferation.

2.5.1 Fluorescence staining of F-actin and nucleus After 5 days of incubation, cells were fixed with 10% of paraformaldehyde in DMEM at 4C for 10 min and permeablized with 0.1% Triton-X 100 for 5 min. Samples were rinsed with PBS and cells were incubated with PBS 1% BSA for 20 min. The F-actin was stained with red phalloidin FluoProbes 547 (INTERCHIM) diluted to 20% in PBS for 30 min; the nucleus was stained with DAPI (INTERCHIM). All samples were thoroughly washed three times with PBS before inspection with confocal microscopy.

3. Results and Discussion 3.1 Synthesis of the graft copolymers and stent coating Dextran-graft-polybutylmethacrylate copolymer has been synthesised by radical polymerisation using cerium. No grafting polymer was observed in the case of absence of dextran or butylmethacrylate monomers. The copolymer dissolved in mixture THF/H2O (90/10 v/v) at the rate of 6 % (w/v) was used to prepare a coating for stent covering as reported in the experimental part. Expanded stents were dip-coated by immersion in copolymer solution. After evaporating of solvent, a fine copolymer film covered the surface of the stents that were mounted over a balloon, and hand-crimped.

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Troisime article 3.2 ATR-FTIR characterization The surface chemistry of coated stent was investigated by ATR-FTIR. Fig.1 shows the FTIR spectra of PBMA (a), dextran (b) and DB coated stent (c). The FTIR spectra of the copolymers coating is compared with the spectra of the two respective homopolymers PBMA and dextran. In fact, in the spectra of the DB copolymer, we clearly observe the strong peak at 1730 cm-1, attributed to the stretching mode of the carbonyl groups of PBMA. Furthermore the existence of dextran is proved by the peak at 3400 cm-1, attributed to the hydroxyl groups. These results indicated the presence of dextran and butylmethacrylate simultaneously on the stent surface.
1730

3400

% Transmittance

4000

3500

3000

2500

2000

1500

1000

500

Wavenumbers (cm-1)

Fig.1. ATR-FTIR spectra of the homopolymers: PBMA (a), dextran (b) and copolymer (c).

3.3 Surface structure of the coating stents (AFM) AFM is a powerful tool for the topography of surfaces. Tapping mode AFM images of the surface of DB coated stent and uncoated stents are shown in Figure 2. It can be seen that the surface of the stent coated with DB is very smooth, with an average roughness of about 16nm. The roughness of uncoated stent is about 22nm. In addition, no damage of copolymer can be seen on the stent surfaces from AFM images; this indicates that stent can be successfully recovered with copolymer using dip-coating method. 119

Troisime article

Fig.2. Atomic Force Microscopy of: (a) uncoated stent (Ra=22nm), (b) coated stent (Ra = 16nm)

3.4 Coated stent morphology The evaluation of coating and distribution of polymer was performed with fluorescence as shown in figure 3 using FITC-dextran in the preparation of the copolymer. Analyses of the FITC-copolymer on stent indicate that the coating is homogeneous and continuous.

Fig.3. Fluorescence microscopic images of coated stent with DB (Scale bar, 100 m). Additional information on the characterization of the coating surface was obtained by SEM. DB coating on metallic stents was clearly visualized by scanning electron microscope. If the copolymer is not viscoelastic, the coating may break when the stent is dilated by an angioplasty balloon. As can be seen in Figure 4 (a) and (b), the DB coatings is uniform and smooth before (a) and after (b) dilatation by an angioplasty balloon. There are no fissures or destruction of the DB coating on the stent after expansion. This indicates that the DB coating on the stent has the ability to tolerate the compressive and tensile strains without cracking in the stent expansion process. Thus DB coating is able to withstand balloon expansion of the stent without separation from the metallic structure. 120

Troisime article

c unexpanded stent, and (b, c, d) after expansion.

Fig.4. SEM pictures of stent coated with DB copolymer at different magnifications.(a)

2.4 In vitro vascular cell proliferation Proliferation of endothelial cells and smooth muscle cells on DB film and non coated metallic 316L plots was study for a 5 days period. As shows in figure 5, proliferation analysis showed that the endothelial cells on DB film exhibited a rapid proliferation starting from 5.2 x 103 cells/cm2 at day 0 and reaching 70 x 103 cells/cm2 at day 5. In contrast, the proliferation of endothelial cells over 316L is very low starting from 5.2 x 103 cells/cm2 and reaching 5.8 x 103 cells/cm2. Interestingly, smooth muscle cell proliferation on DB film was very low as compare to endothelial cells. After 5 days incubation, SMC number only reached 23 x 103 cells/cm2. A low SMC proliferation was also observed in the case of 316L (14 x 103 cells/cm2).
8
HUVECs DB HUVECs 316L SMCs DB SMCs 316L

Cells/cm2 ( x 104 )

0 0 1 2 days 3 4 5

Fig.5. Comparison of EC and SMC proliferation on the DB films and 316L plots. 121

Troisime article A similar behaviour was observed with stents coated with copolymer as compared to uncoated stent. Figure 6 showed that endothelial cells exhibit high proliferation rate on stent coated with DB copolymer (Fig 6B) strongly suggesting that copolymer coating can significantly improve the ability to endothelialization.

Fig. 6. Confocal micrographs of F-actin stained EC on (a) uncoated stent, or (b) DB coated stent. Scale bars, 200 m.

Conclusion One major finding of this study is that the dextran-graft-butymethacrylate copolymer can be used as coating for stent. DB copolymer was successfully synthesized, thus this technique can be applicable to a wide range of polymers of the same families. The results obtained in this study evidence that DB coating is homogeneous and showed good mechanical properties and biocompatibility. Interestingly, importantly, our in vitro data of endothelialisation of stent reveals a major difference between the coated and uncoated stent. Therefore DB copolymer has the ability to stimulate endothelial cell proliferation and in contrast, to minimize vascular smooth muscle cell proliferation. These tunable properties obtained by the copolymer could be of great interest in various applications of cardiovascular medical devices.

122

Troisime article References: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 Welt, F. G. P. and Rogers, C. (2002) Arterioscler Thromb Vasc Biol 22, 1769-1776 Hong, S.-Y., Koh, Y.-S., Chung, K.-H. and Kim, D.-S. (2002) Thrombosis Research 105, 79-86 Scheerder, I., Sohier, J., Wang, K., Verbeken, E., Zhou, X. R., Froyen, L., Humbeeck, J., Piessens, J. and Werf, F. (2000) Journal of Interventional Cardiology 13, 179-185 Hadopoulos, M., Turgeon, S., Sarra-Bournet, C., Laroche, G. and Mantovani, D. (2006) Journal of Materials Science: Materials in Medicine 17, 647-657 Faucheux, N., Schweiss, R., Lutzow, K., Werner, C. and Groth, T. (2004) Biomaterials 25, 2721-2730 Chung, T.-W., Liu, D.-Z., Wang, S.-Y. and Wang, S.-S. (2003) Biomaterials 24, 46554661 Mani, G., Feldman, M. D., Patel, D. and Agrawal, C. M. (2007) Biomaterials 28, 16891710 Peng, T., Gibula, P., Yao, K.-d. and Goosen, M. F. A. (1996) Biomaterials 17, 685-694 Bertrand, O. F., Sipehia, R., Mongrain, R., Rodes, J., Tardif, J.-C., Bilodeau, L., Cote, G. and Bourassa, M. G. (1998) J Am Coll Cardiol 32, 562-571 Shih, C.-C., Shih, C.-M., Chen, Y.-L., Su, Y.-Y., Shih, J.-S., Kwok, C.-F. and Lin, S.-J. (2001) Journal of Biomedical Materials Research 57, 200-207 Uo, M., Watari, F., Yokoyama, A., Matsuno, H. and Kawasaki, T. (2001) Biomaterials 22, 677-685 Knetsch, M. L. W., Aldenhoff, Y. B. J. and Koole, L. H. (2006) Biomaterials 27, 28132819 Long, S. F., Clarke, S., Davies, M. C., Lewis, A. L., Hanlon, G. W. and Lloyd, A. W. (2003) Biomaterials 24, 4115-4121 Seeger, J. M., Ingegno, M. D., Bigatan, E., Klingman, N., Amery, D., Widenhouse, C. and Goldberg, E. P. (1995) Journal of Vascular Surgery 22, 327-336 De Groot, C. J., Van Luyn, M. J. A., Van Dijk-Wolthuis, W. N. E., Cade, J. A., Plantinga, J. A., Otter, W. D. and Hennink, W. E. (2001) Biomaterials 22, 1197-1203 Draye, J.-P., Delaey, B., Van de Voorde, A., Van Den Bulcke, A., De Reu, B. and Schacht, E. (1998) Biomaterials 19, 1677-1687 Derkaoui, S. M., Avramoglou, T., Barbaud, C. and Letourneur, D. to be published Nachtigal, M., Nagpal, M., Greenspan, P., Nachtigal, S. and Legrand, A. (1989) In Vitro Cell Dev Biol 25, 892898

123

124

Troisime article

III.3.2. Complment troisime Article

125

126

Troisime article

Recouvrement des stents mtalliques base de drivs de dextrane

Etude de la composition chimique, de la morphologie et des proprits mcaniques des recouvrements de poly(Dextrane-co-BMA)

127

Troisime article

Matriel et Mthodes

1.1 Prparation des chantillons 1.1.1 Lchantillon en acier


Les chantillons en acier inoxydable 316L (Goodfellow, Devon, PA, USA) sont poinonns en disques de 12.7 mm de diamtre. La composition (wt. %) de lacier est : Cr (18.00), Ni (10.00), Mo (3.00), Mn ( 2.00), Si (1.00), C ( 0.08), P ( 0.045), S (0.03), le reste tant du Fe.

1.1.2 Nettoyage des chantillons


Chaque chantillon est nettoy en utilisant trois solvants (actone, eau dionise et isopropanol) dans un bain ultrasons pendant 10 minutes pour chaque solvant. A chaque tape, les chantillons sont schs avec un jet dair comprim. Le nettoyage des chantillons est ncessaire pour liminer les contaminants organiques.

1.1.3 lectropolissage
Llectropolissage est utilis pour rduire la rugosit dune surface mtallique et la passiver, tout en la rendant plus homogne suivant une procdure rigoureuse et valide antrieurement dans notre laboratoire [29]. Llectropolissage comporte deux tapes. La premire tape est llectropolissage pendant 3 minutes dans une solution de glycrol (50% V/V), dacide phosphorique (35% V/V) et deau dionise (15% V/V) chauffe 90C. Un courant de 1.5 A est appliqu entre les deux lectrodes. Aprs lectropolissage, lchantillon est rinc leau dionise et sch avec de lair comprim. Il est alors tremp dans une solution acide chauffe 50C compose dacide fluorhydrique (2% V/V), dacide nitrique (10% V/V), et deau dionise (88% V/V) pendant 30s et enfin il est rinc leau dionise et sch lair comprim. Cette dernire tape de trempe acide est ncessaire pour rduire la couche doxyde prsente la surface de lchantillon.
Gnrateur (U, I)

Thermomtre

Couvercle

Bain (verre) Anode

O2

H2

Cathode

lectrolyte Agitateur magntique

Figure 1 : Schma de la cellule dlecropolissage [15].

128

Troisime article

1.2 Dpt
Les couches de polymre ont t dposes sur la surface de lacier inoxydable en trempant ce dernier dans la solution de PBMA ou dans la solution de poly[Dextrane-co-BMA].

1.3 Dformation plastique


Lors de leur implantation, les stents sont soumis une dformation plastique qui peut atteindre 25%. Pour avoir une couche de polymre approprie au recouvrement de stents, celleci doit rsister la dformation plastique in vitro simulant le dploiement in vivo. La mthode de dformation retenue est le Small Punch Test (SPT). Cette mthode a dj t utilise pour dformer des chantillons minces dacier inoxydable 316L dans les travaux de Byun et al [16, 17] dans le but dtudier leffet des radiations nuclaires sur les proprits mcaniques de cet acier. La figure 4 a) reprsente le schma du montage du SPT utilis pour dformer les chantillons. Les figures 4 b) et 4 c) illustrent respectivement un chantillon recouvert avant et aprs dformation.

Figure 2 : Dformation dun chantillon en acier inoxydable 316L. a) Schma du SPT, b) chantillon non dform et c) chantillon dform.

1.4 Etude de la composition chimique


1.4.1 Spectromtrie photolectrons induits par rayons X (XPS)
La composition en surface du PBMA et du copolymre poly[Dextrane-co-BMA] a t analyse par un spectromtre de photolectrons X (XPS PHI 5600-ci spectrometer Physical Electronics USA, Chanhassen, MN, USA). Des spectres de survol (balayage des nergies de liaison 129

Troisime article comprises entre 0 et 1400 eV) ont t acquis un angle de dtection de 45, en utilisant la raie K de la source daluminium (K = 1486.6 eV). galement, des spectres de haute rsolution (balayage dune rgion dfinie autour dune raie caractristique) ont t acquis en utilisant la raie K de la source de magnsium (K = 1253.6 eV). La profondeur danalyse de surface de cette technique est estime 5-10 nm. Le survol permet de dterminer la fraction atomique relative des lments prsents la surface de lchantillon. Le rapport C/O est calcul en utilisant la formule suivante :

La collecte dun spectre haute rsolution (HR) permet dvaluer la fraction de chacun des liens interatomiques dun lment. Par exemple, la dconvolution du pic HR du carbone donne la fraction de liaisons C=O, C-O et C-C par rapport tous les liens du carbone avec dautres atomes. Le tableau 1 montre les diffrentes nergies de liaison interatomique associes au carbone et prises en compte dans cette analyse. Liaisons chimiques C-C C-O C=O Energies de liaison 284.6 eV 286.3 eV 289.0 eV

Tableau 1 : nergies de liaison du carbone dans le spectre HR.

La courbe ajuste par rapport au spectre obtenu par XPS haute-rsolution pour le pic du C(1s) est dtermine par la mthode des moindres carrs faisant intervenir des combinaisons de courbes simules par des gaussiennes-lorentziennes (70% / 30%) en faisant lhypothse dun bruit de fond linaire comme propos par Shirley (en utilisant le logiciel CasaXPS). La calibration de la bande C(1s) a t effectue en prenant comme rfrence le pic de la liaison C-C 284.6 eV (annexes 1 et 2).

1.4.2 Spectroscopie infrarouge par rflexion totale attnue (FTIR-ATR)


Afin dtudier la structure chimique du revtement polymrique et son paisseur, la spectroscopie infrarouge par rflexion totale attnue (ATR-FTIR Spectrometer Nicolet, Madison, WI, USA) a t utilise. Cette mthode danalyse, sensible aux vibrations des liaisons chimiques, analyse en profondeur les chantillons sur environ 1 m. noter que cette technique de caractrisation nest pas sensible aux mtaux. 130

Troisime article

1.5 Etude de topographie


1.5.1 Microscopie lectronique balayage (MEB)
Lobservation de la surface des aciers recouverts a t ralise laide dun microscope lectronique balayage (JEOL JSM-35CF Scanning Electron Microscope, Jeol, Tokyo, Japon, avec une tension applique de 15 kV).

1.5.2 Microscopie force atomique (AFM)


Afin dobserver la morphologie et la rugosit des chantillons lchelle atomique, ces derniers ont t analyss par microscopie force atomique (AFM) avant et aprs la dformation plastique de 25%. Ces analyses ont t effectues laide dune pointe ultra fine de silicium de rayon de carbure de 2 nm. La valeur de la rugosit RMS (Root Mean Square) mesure sur chaque chantillon est identifie sur les images AFM par le terme R. Les observations avant dformation ont t faites sur des zones en bordure de lchantillon afin de ne pas lendommager en son centre ; celles ralises aprs dformation ont t effectues au centre. Cependant, le bord et le centre des chantillons pourraient avoir une composition chimique et une paisseur diffrentes.

131

Troisime article

2 Rsultats et discussions
2.1 Avant dformation
2.1.1 Composition chimique des chantillons non dforms
Le deux types chantillons ont t analyss par FTIR. Le but de cet analyse prliminaire est dobtenir la composition chimique des deux polymres mais galement destimer lpaisseur approximative de la couche polymrique. La figure 5 montre les spectres obtenus par FTIR pour le PBMA et le poly[Dextrane-co-BMA].

102 101 100 transm ittance 99 98 97 96 95 94 93 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500 nombre d'onde (cm-1)

Figure 3 : Spectres FTIR obtenus sur des aciers inoxydables 316L recouverts par : le poly(mthacrylate de butyle) et le poly[Dextrane-co-BMA].

Les donnes de la littrature confirment que le spectre noir observ sur la figure 5 est bien celui du poly(mthacrylate de butyle). En effet, nous observons un signal 1725 cm-1 correspondant la liaison C=O du PBMA. Les signaux 1470 cm-1 et 2970 cm-1 correspondent respectivement aux vibrations en dformation et en longation de la liaison C-H. Le signal 1250 cm-1 correspond la frquence dlongation de la liaison C-O. Le spectre en rouge prsente les pics caractristiques du poly(mthacrylate de butyle) et ceux caractristiques du dextrane. En effet, le signal 1668 cm-1 est attribu la frquence de vibration de la liaison C=O de la forme noncyclique du dextrane [18] et celui 3342 cm-1 correspond la vibration O-H du dextrane (une 132

Troisime article fraction de ce signal peut tre galement attribue leau). Lobservation de signaux de rflexion du mtal environ 400 cm-1 amne conclure que lpaisseur de notre couche polymrique dans les deux cas est infrieure 1 m. Les rsultats obtenus par XPS haute rsolution HR et prsents en figure 6 montrent une augmentation de la fraction C-O (correspondant la liaison C-OH du dextrane) pour les chantillons recouverts par le copolymre. Ceci pourrait confirmer la prsence des deux polymres dans le copolymre.

Figure 6: Histogramme prsentant les rsultats des analyses XPS HR des aciers inoxydables 316L recouverts par le PBMA (noir) et le poly[Dextrane-co-BMA].

2.1.2 Topographie des chantillons


Les images obtenues par AFM montrent la morphologie et la rugosit de la surface. La rugosit de lchantillon recouvert par le PBMA est approximativement de 24 nm et celle de lchantillon recouvert par le poly[Dextrane-co-BMA] est approximativement de 12 nm. Les images AFM des figures 7 et 8 ne montrent pas de dfauts de surface majeurs tels que de la dlamination ou des fissures. Toutefois, des trous sont visibles sur les chantillons recouverts par le PBMA. Ils rsultent certainement de lvaporation du solvant.

133

Troisime article

825.28 nm

RR=24.1 = 24.1 4.2 4.2 nm nm

4.0m
0.00 nm

Figure 7 : Image AFM de la surface dun chantillons dacier inoxydable 316L recouvert par le PBMA (20 m x 20 m).

374.08 nm

R = 12.3 3.0 nm

4.0m
0.00 nm

Figure 8 : Image AFM de la surface dun chantillon dacier inoxydable 316L recouvert par le poly[Dextrane-coBMA] (20 m x 20 m).

2.1.3 Aprs dformation plastique 2.1.4 Composition chimique des chantillons


La composition chimique du film polymrique aprs la dformation plastique de 25% a t analyse par XPS de survol et les rsultats sont prsents en figure 9.

134

Troisime article

Figure 9 : Histogramme prsentant les rsultats des analyses XPS de survol des chantillons recouverts par le PBMA et le poly[Dextrane-Co-BMA] avant et aprs dformation (def).

Aprs dformation plastique, lanalyse de la surface des chantillons par XPS ne fait apparatre aucun lment mtallique. Ceci nous indique que la distribution des fissures est infrieure 0,1% et que les films ne sont pas dlamins. Cependant, une variation de la fraction de C est observe aprs la dformation. Elle est peut-tre lie au rarrangement du polymre aprs la dformation.

2.2 Topographie des chantillons dforms


Les chantillons dforms ont galement t analyss par microscopie AFM. Laugmentation de la rugosit des chantillons aprs leur dformation est due lapparition de bandes de glissement. Les images font apparatre des zones plus fonces qui pourraient correspondre lapparition des fissures sur la surface des chantillons aprs la dformation. En comparaison lAFM (20 m x 20 m), le MEB permet dobserver la morphologie des chantillons sur une surface plus grande (400 m x 400 m). Les images obtenues et montres en figure 10 mettent en vidence la dchirure des chantillons dforms plastiquement. Ceci pourrait traduire un manque de cohsion de la couche polymrique soit un manque dlasticit. Les couches de polymre ne se sont pas dlamines et la surface mtallique nest pas observe, ce qui signifie que la dchirure ne sest pas propage linterface, elle est donc reste relativement superficielle. Ceci suggre une bonne adhsion entre la surface mtallique et le film polymrique. Il est intressant de noter que la gomtrie des dchirures diffre suivant la nature du polymre recouvrant lacier. En effet, les dchirures observes sur les chantillons recouverts par le PBMA sont plus larges et semblent interconnectes contrairement celles observes sur 135

Troisime article les aciers recouverts par le copolymre. Cette diffrence pourrait sexpliquer par une meilleure rsistance la dformation plastique du copolymre.

a 1)

b 1)

a 2)

b 2)

Figure 10 : Images obtenues par MEB des chantillons dacier inoxydables 316L recouverts par le PBMA (a1, a2 : grossissement plus important) ou par le poly[Dextrane-co-BMA] (b1, b2 : grossissement plus important) aprs dformation.

3 Conclusion
Les analyses par ATR-FTIR et XPS ont confirm les compositions chimiques des deux types de recouvrement : PBMA et poly[Dextrane-co-BMA]. Aprs dformation, la distribution des fissures est infrieure 0,1% car aucun lment mtallique nest dtect par XPS de survol. Ces analyses confirment donc la bonne adhsion entre les couches polymriques et la surface mtallique mais rvlent nanmoins une faiblesse dans la cohsion la dformation plastique. entre les couches polymriques. Le copolymre poly[Dextrane-co-BMA] semble avoir une meilleure rsistance

136

Troisime article

4 Les futurs travaux


Les mcanismes de fissuration laide des mthodes dimagerie prcdemment utilises (AFM, MEB) seront tudis. Leffet de diffrents pourcentages de dformation (5%, 10%, 15%, 20% et 25%) des chantillons recouverts sur leur topographie de surface sera suivie par AFM et MEB. Des analyses plus pousses de la composition chimique de ces recouvrements seront effectues en utilisant des mthodes plus sensibles : la spectroscopie lectronique NEXAFS induite par le rayonnement synchrotron et la spectromicroscopie dlectrons photo-excits par rayons X (XPEEM: X-ray PhotoElectron Emission Microscopy). En effet, les analyses (XPS, FTIR, MEB, et AFM) effectues sur les films CFX (de 40 et 100 nm dpaisseur) dposs sur les surfaces dacier inoxydable 316L dans notre laboratoire nont pas permis de dtecter des lments mtalliques en surface. Mais, les mthodes plus sensibles prcdemment cites ont permis de les mettre en vidence [19].

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Troisime article

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ANNEXES

Annexe 1 : Dconvolution du spectre XPS HR effectu sur lchantillon recouvert par le PBMA (en vert : spectre original, rouge : courbe ajuste pour le pic de la liaison C=O, bleu : courbe ajuste pour le pic de la liaison C-O, violet : courbe ajuste pour le pic de la liaison C-C).

Annexe 2 : Dconvolution du spectre XPS HR effectu sur lchantillon recouvert par le poly[Dextrane-co-BMA] (en vert : spectre original, rouge : courbe ajuste pour le pic de la liaison C=O, bleu : courbe ajuste pour le pic de la liaison C-O, violet : courbe ajuste pour le pic de la liaison C-C).

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140

Rsultats

III.4. Autres rsultats

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142

Rsultats III.4.1. Synthse dautres polymres bioactifs Dautres synthses ont t menes dans les conditions opratoires identiques celles cites dans le premier et le deuxime article mais cette fois avec dautres monomres et dautres polysaccharides (Tableaux 1 et 2). Les monomres mthacryliques (lthylemthacrylate et le 2hydroxythylemthacrylate) et les polysaccharides (le fucane, lhparine et le pullulane) utiliss nous ont permis dobtenir de nouveaux copolymres capables de former des films parfaitement homognes et transparents. Dans un but de mieux comprendre le mcanisme de greffage, un autre copolymre DBM a t synthtis avec un mlange de monomres (mthylemthacrylate et n-butylmthacrylate 50%/50%). Comme le montre le Tableau 1, aucun polymre nest obtenu en absence du dextrane lexception du 2-hydroxythylemthacrylate qui conduit la formation dun compos insoluble. Ceci tant d aux groupements hydroxyles qui gnrent des radicaux en prsence du crium. Ce monomre est exclu de la suite des tudes. Les autres rsultats montrent que les conditions utilises permettent dobtenir des copolymres avec un rendement final allant 21% 45%. Les rendements avant les cycles de purifications taient levs mais aprs lextraction l'eau et l'actone, environ 20% de la masse des copolymres est perdue. Ces lavages consistent liminer les monomres rsiduels et les homopolymres forms au cours de la synthse. Le rendement peut tre amlior en augmentant la quantit de crium, mais une quantit suprieure 3,6.10-3M, la solubilit des copolymres devient difficile voir mme impossible. La concentration optimale de crium pour avoir un bon rendement tout en prservant la solubilit du copolymre est de 2.4 10-4 M. concentrations en monomre et en ion crium (IV) constante, le rendement obtenu avec le dextrane est meilleur que celui obtenu avec les fucanes. L'explication tient probablement dans le nombre de sites susceptibles de former des radicaux libres, qui est plus faible sur les fucanes que sur le dextrane. Il est ainsi probable que les chanes de fucanes portent moins de greffons polymthacrylates que les chanes de dextrane. Des tudes complmentaires doivent confirmer cette observation.

143

Rsultats Tableau 1 : conditions de synthse en utilisant dautres monomres mthacryliques


Srie (A) A0 A1 A2 Srie (B) B0 B1 Srie (C) C0 C1 C2 Dextrane mol x 10-6 0 7.14 7.14 Dextrane mol x 10-6 0 7.14 Dextrane mol x 10-6 0 7.14 7.14 Ce(IV) mol/L x 10-4 2.4 2.4 2.4 Ce(IV) mol/L x 10-4 2.4 2.4 Ce(IV) mol/L x 10-4 2.4 2.4 2.4 EMA mol/l x 10-2 3.7 1.8 3.7 HEMA mol/l x 10-2 3.7 1.8 BMA+MMA 50%/50% mol/l x 10-2 3.7 1.8 3.7 Yield (%) 0 24 39 Yield (%) 49 58 Yield (%) 0 23 45 Solubilit dans H2O / Solubilit dans H2O Solubilit dans H2O / Solubilit dans THF / Solubilit dans THF Solubilit dans THF / Solubilit dans H2O/THF / + + Solubilit dans H2O/THF Solubilit dans H2O/THF / + +

Tableau 2 : conditions de synthse en utilisant dautres polysaccharides


Srie (D) D1 Fucane mol x 10-6 9.9 Ce(IV) mol/L x 10-4 2.4 MMA mol/l x 10-2 Rd (%) 3.7 BMA mol/l x 10-2 3.7 29 Solubilit dans H2O Solubilit dans THF Solubilit dans H2O/THF (v/v) + (20/80)

D2 Srie (E) B1

9.9 Hparine mol x 10-6 27

2.4 Ce(IV) mol/L x 10-4 2.4

37

Solubilit dans H2O -

Solubilit dans THF -

+ (10/90) Solubilit dans H2O/THF (v/v) + (20/80)

MMA Rd (%) mol/l x 10-2 3.7 BMA mol/l x 10-2 33

B2 Srie (F) F1

27 Pullulane mol x 10-6 10

2.4 Ce(IV) mol/L x 10-4 2.4

3.7 MMA mol/l x 10-2 3.7 BMA mol/l x 10-2

36 Rd (%) 37

Solubilit dans H2O -

Solubilit dans THF -

+ (10/90) Solubilit dans H2O/THF + (20/80)

F2

10

2.4

3.7

41

+ (10/90)

144

Rsultats III.4.1.1. Effet du milieu ractionnel sur le dextrane Afin de dterminer si les chanes du dextrane subissent une hydrolyse acide, Nous avons eu recours la chromatographie d'exclusion strique (SEC). Cette technique nous a permis de comparer la taille des macromolcules du dextrane avant et aprs synthse. Nous avons donc fait subir au dextrane T70 (70 kg/mol) les mmes conditions de synthse et de purification que pour les autres produits, mais en absence damorceur et de monomre. Les rsultats obtenus montrent que la taille des macromolcules (leur volume hydrodynamique, fig1.) aprs synthse ne varie pas; cela indique une absence dhydrolyse acide du dextrane dans nos conditions de synthse. Un autre test a t ralis en prsence du crium, cette fois la masse na pas pu tre value car le produit obtenu rticule et deviens insoluble dans leau.
(a)

(b) (c)

Figure 1. Analyse du dextrane par CES a) Dextrane non trait b) Dextrane trait dans les mmes conditions de synthse pendant 40 min c) Dextrane dans les mmes conditions de synthse aprs 2h. III.4.1.2. Effet du milieu ractionnel sur la chane de PMMA Comme pour lexprience prcdente, lhomopolymre PMMA a subit le mme traitement de synthse pendant 40min ou 24h. Aprs extraction et purification, il a t caractris par spectroscopie infrarouge. Comme le montre la figure 2, le PMMA a une faible hydrolyse partir de 40min qui se manifeste par lapparition de groupements hydroxyles (3400cm-1). Cest le 145

Rsultats temps utilis pour la copolymrisation. Ce signal saccentue au bout de 24h, mais il reste ngligeable devant le pic quivalent du dextrane du copolymre rsultant .

A:40min

%Transmittance

B:24h

4000

3500

3000

2500

2000

1500

1000

500

Nombre d'onde (cm-1) Figure 2. Spectre infrarouge du PMMA (A) : traitement pendant 40 min. (B) : traitement pendant 24h. III.4.2. Caractrisation III.4.2.1. caractrisation infrarouge Les rsultats des spectres infrarouges de la srie de synthse de copolymres base de fucane ou de pullulane sont prsents dans la figure 3. Tous les spectres des copolymres prsentent simultanment la bande du groupement carbonyle (caractristique du PMMA ou PBMA environ 1730 cm-1) ainsi que le pic des fonctions hydroxyle caractristique des polysaccharides 3400 cm-1. Pour le copolymre FB et FM, on retrouve les deux bandes dabsorption caractristiques des fucanes qui se situent 1250 cm-1 pour la vibration antisymtrique des S=O. De mme pour le PM et le PB, on retrouve les pics caractristiques du pullulane et ceux du polymthacrylate. Ces analyses indiquent simplement et rapidement les diffrentes bandes caractristiques des polymthacrylates et des polysaccharides.

146

Rsultats a
Pullulane FM

Fucane %Transmittance %Transmittance FB

PMMA

PM

PBMA

PB

4000

3500

3000

2500

2000

1500

1000

500

4000

3500

3000

2500

2000

1500

1000

500

Nombre d'onde (cm-1)

Nombre d'onde (cm-1)

Figure 3. Spectre infrarouge (FT-IR) des : (a) homopolymres, (b) copolymres

III.4.2.2. Tests de solubilit de diffrents copolymres et ralisation des films On a tent de trouver des solvants susceptibles de dissoudre les polymres synthtiss en vue d'tudier leurs proprits en solution et de les mettre sous forme de films. Des solvants connus des polymthacrylates et des polysaccharides ont t tests (Tableau 3). Aucun dentre eux na solubilis ces copolymres, sauf pour le DM cit dans le premier article, solubilis par le DMSO (figure 4.a) qui est un solvant commun du dextrane et du PMMA. Cependant, des mlanges des deux solvants eau/THF sest rvl susceptible de dissoudre ces macromolcules. En effet, ces copolymres comportent une partie hydrosoluble (le polysaccharide) et lautre partie soluble dans certains solvants organiques comme le montre le Tableau 3. Ce sont donc des polymres amphiphile. Les expriences montrent que le rapport des deux solvants dpend de la nature du mthacrylate utilis au cours de la synthse. Ces copolymres synthtiss possdant des proprits de solubilits diffrentes de celles des homopolymres correspondants. Il s'agit donc dun greffage covalent. Cette difficult trouver un bon solvant de nos produits a t un obstacle ltude plus dtaille de leur structure et ne nous a pas permis de raliser des spectres RMN ni de mesurer la masse de ces copolymres, la comparaison avec les homopolymres dans les mmes solvants ntant pas possible.

147

Rsultats

Tableau 3 : Tests de solubilit des polymres copolymre Solvants Eau DMSO DMF Dichloromthane Actone Chloroforme Dioxane THF Eau / THF 10/90 20/80 50/50 dextrane PMMA PBMA DE DH DB FM FB HM HB PB DBM S S I I I I I I I I I I S S S S S S S I I I I I I S S S S S I I I I I I I I I I I I S I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I S I I I I I I I I I I I S I I I I I I I I I S I I I I I I I I I I I S I I I I I I I I I S I I I I I I I I I I S I I I I I I I I I I S I I

Tous les polymres solubles dans le mlange H2O /THF sont capable de former des films (figure 4.b) dans les conditions contrles (cit dans le premier article), ces films sont parfaitement homognes et transparents, leur souplesse dpend de la nature et du rapport polysaccharide/polymthacrylate.

H2O

THF THF/H2O DMSO a b

Figure 4. (a) Tests de solubilits du DM ; (b) films de copolymre.

III.4.3. Proprits thermiques et mcaniques III.4.3.1. Analyse thermique diffrentielle (DSC) Lanalyse enthalpique diffrentielle permet de mettre en vidence la transition vitreuse des polymres. Lors de la premire monte en temprature deux endothermes sont observs, le 148

Rsultats premier environ 110C qui correspond llimination de leau libre prsente dans lchantillon, le second, autour de 185C est attribu aux molcules deau lies (figure 5.a). Ces endothermes sont observs uniquement au cours de la premire monte en temprature, mais ne sont plus observs lors du deuxime passage et les suivants. Il faut noter que pour tous les chantillons, la Tg nest pas affecte par les diffrents cycles thermiques. Le copolymre DBM prsente une seule Tg de 105C (figure 5.b) ; cette Tg est intermdiaire entre celle du DM (Tg = 126C ; cit dans le premier article) et celle du DB (Tg = 38C ; cit dans le second article). cela suggre que ce copolymre est effectivement constitu de 3 espces et associe dune part le dextrane et dautre part un copolymre (PMMA-PBMA).

Premier passage Exo

Heat flow

-40

40

80

120

160

200

DBM

Tg = 105C

-40

40

80

120

160

200

Temperature Figure 5. Thermogrammes du copolymre DBM (a) premier passage (b) deuxime passage

III.4.3.2. Analyse mcanique sous sollicitations dynamiques titre de comparaison, nous reprenons ici les spectres des PMMA, DM et DB (cits dans les deux premiers articles). Les spectres mcaniques du DBM correspondent lvolution des modules lastique (ou module de stockage E) et du module visqueux (ou module de perte E) lorsque la temprature augmente (la frquence de sollicitation tant constante et gale 1 Hz) Classiquement, on considre que la temprature de transition vitreuse correspond la temprature laquelle le dphasage entre la contrainte et la dformation est maximale. Ce dphasage not est nomm angle de perte. Selon cette mthode, et la frquence de sollicitation choisie, la transition vitreuse se produit une temprature de 92C infrieure celle observer en DSC probablement du fait des molcules deau lies qui jouent le rle de plastifiant. En outre, cette Tg est toujours intermdiaire entre la Tg du DM = 141C et celle de DB = 60C. 149

Rsultats Cela signifie que la viscolasticit du copolymre DBM peut tre modul par le rapport PBMA/PMMA.
6.0 Module lastique E (GPA) Module visqueux E (GPA) 0.6 36 65 73 125

a
4.0

b
0.4

2.0

0.2

0 -100 -50 100 0 50 Temprature (C) 1.5 150 200

0 -100 -50 0 50 100 Temprature (C) 150 200

60

92

109

141

c
DB
Tang (E/E)

DBM DM PMMA

0.5

0 -100 -50 0 50 100 Temprature (C) 150 200

Figure 6. Spectres mcaniques : (a) module de conservation en fonction de la temprature ; (b) module de perte ; (c) Tang

III.4.4. Fluage des copolymres DB1, DB2 et DB3 Les copolymres contenant du mthylemthacrylate sont rigides et cassants contrairement ceux synthtiss avec du butylmthacrylate qui sont beaucoup plus souples. Avant denduire les stents, nous avons donc men des essais de fluages en traction des copolymres DB1, DB2 et DB3 (cit dans le second article). Les taux de dformations peuvent atteindre les 380% voir plus dans certain cas (Figure 8), quant la rupture, elle dpend principalement de ltat du film.

150

Rsultats

a b
Figure 7. Film DB1 (a) sans sollicitation, (b) aprs sollicitation. Les rsultats exprimentaux sont obtenus partir dessais raliss temprature ambiante pour des masses accroches au film de copolymre allant de 100 g 200 g.

250%

200%

Dformation (%)

150%

100%

50%

0% 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 Temps (min)

Figure 8. Dformation (allongement relatif) en fonction du temps du film DB1 pour une charge de 100 g La courbe de fluage obtenue pour les diffrents films est dallure classique pour des corps visco-lastiques. Nous nobservons pas de dformation instantane. Llasticit retarde est responsable de la courbure de la courbe, alors que la composante visqueuse correspond lasymptote rectiligne observe pour les temps longs. Pour chaque type de film, nous avons obtenu un faisceau de courbe de fluage correspondant aux diffrentes charges appliques. Pour 151

Rsultats pouvoir comparer aisment les diffrents films les uns aux autres, nous avons caractris chacune des courbes de fluage par un paramtre unique qui est la pente lorigine. Nous avons alors ajust les courbes exprimentales une courbe thorique selon la mthode des moindres carrs. La courbe de fluage suit une fonction du type = a[1 exp(bt)] + ct o () est la dformation et (t) le temps. Les paramtres a, b et c sont ajust grce lutilisation du solveur du tableur Excel. Dans ces conditions, la pente lorigine reprsente la vitesse de dformation initiale donne par ab + c. Ces rsultats sont prsents la figure 9. La vitesse de dformation initiale de chaque film augmente avec la contrainte applique selon une relation quasi linaire. Si on note V1, V2 et V3 les vitesses de dformation initiales respectivement pour les trois films DB1, DB2 et DB3, nous pouvons remarquer que pour une charge donne, les vitesses de dformation initiale suivent toujours lordre suivant : V1 > V2 > V3. Or ce qui distingue les trois films, cest leur rapport polysaccharide/polymthacrylate, DB1 tant le moins riche en dextrane et DB3 le plus riche. La proportion de PBMA permet donc de moduler la souplesse des films.
0,3

DB1 DB2 DB3


y = 0,0019x - 0,0901

Vitesse de dformation (min-1)

y = 0,0019x - 0,1452 0,2

y = 0,0013x - 0,1035

0,1

0 75 100 125 150 175 200 225

Masse en gramme (contrainte)

Figure 9. vitesse de dformation en fonction de la contrainte des copolymres DB

152

Rsultats III.4.3. Culture cellulaire Avant de raliser lenduction des stents, les proprits biologiques de nos copolymres susceptibles de moduler la rponse cellulaire ont t tudies sur des chantillons sous forme de disques. Ces disques ont t obtenus en coulant des solutions des diffrents copolymres (dans le mlange eau/THF), dans des moules en verre de 16mm de diamtre. Aprs vaporation des solvants et conditionnement des films, les diffrents copolymres et homopolymres sont utiliss comme support de culture cellulaire. Les effets de modulation de ladhsion et la prolifration des cellules sur ces films de polymres, de compositions chimiques variables, sont analyss par le suivi des cintiques de prolifration. Les rsultats obtenus sont compars entre eux en utilisant la technique classique du dnombrement des cellules.

III.4.3.1. Proprits biologiques des diffrents copolymres synthtiss Une tude de comportement et de prolifration des cellules endothliales (HUVECs) et des cellules musculaires lisses (CMLs) au contact des surfaces a t systmatiquement ralise sur tous les films de copolymres synthtiss. Le protocole retenu est lvaluation de la prolifration des cellules en procdant au dtachement des cellules puis au comptage des cellules au compteur des particules chaque jour et cela pendant 5 jours. Les rsultats sont exprims en nombre des cellules par cm2 de surface des films. Cette tude a t complte par un examen des cellules sur les surfaces des films par microscopie fluorescence, ce qui nous a permis dobserver ltalement et la morphologie des cellules.

III.4.3.1.1. tude cintique de prolifration des cellules HUVECs Les rsultats rapports sur la figure 10 montrent que le temps de latence est presque le mme quelque soit le film test. Par contre, le temps de doublement est diffrent dune surface lautre. Le temps de doublement des cellules HUVECs est calcul par rgression linaire dans la zone de croissance exponentielle. Pour le DM, DB, HM et HB le temps de doublement est presque identique, de lordre de 20 heures (20.2h, 20.1h, 19.8h et 19.8h respectivement). Quatre copolymres (DM, DB, HM et HB) permettent un temps de doublement et un nombre de cellules endothliales J5 significativement suprieur ceux obtenu sur dautres surfaces (PMMA, PBMA, FM, FB et plot 316L). La densit cellulaire atteinte sur film de DB est rapidement assez importante (environ 63700 cellules/cm2 J5). ce stade, les cellules sont presque confluentes.

153

Rsultats

80000

PMMA DM DB HM HB

60000
Nombre de cellules HUVECs

FM FB 316L

40000

20000

0 0 1 2 3
Temps de culture (jours)

Figure 10. Cintique de prolifration des HUVECs

III.4.3.1.2. Cintique de prolifration des CMLs sur les diffrents supports Une tude similaire a t ralise sur les mmes supports mais avec cellules musculaires lisses. Les courbes de prolifration des CMLs sont prsentes sur la figure 11. Comme pour les HUVECs, le temps de doublement des CMLs sur les mmes supports (DM, DB, HM et HB) est plus important que sur les autres supports et correspond respectivement 26.3h, 24.3h, 22.6h, et 19.8h, ce qui est globalement plus long que les temps de doublement des cellules endothliales sur les mmes supports. Sur lacier 316L, les CMLs prolifrent mieux que les HUVECs ; leur temps de doublement est denviron 25h alors que ce temps de doublement na mme pas pu tre dtermin pour les cellules endothliales car ces cellules ont du mal se maintenir sur lacier nu.

154

Rsultats

80000

PMMA DM DB HM HB

60000 Nombres de cellules CMLs

FM FB 316L

40000

20000

0 0 1 2 3 Temps de culture (jours) 4 5 6

Figure 11. Cintique de prolifration des CMLs

III.4.3.2. Prolifration des cellules HUVECs et CMLs sur les diffrents supports J5 En reprenant les rsultats antrieurs, on peut raliser une comparaison de prolifration des cellules HUVECs et CMLs J5 (figure 12), Pour le PMMA, DM, HM, HB, FM, FB et lacier 316 L, aucune diffrence significative entre les HUVECs et des CMLs nest observe. Par contre, le DB favorise la prolifration des HUVECs par rapport celle des CMLs, ce qui est trs intressant si lobjectif est de favoriser une rendothlialisation .

155

Rsultats
80000
HUVECs CMLs

60000 Nombre de cellules (J5)

40000

20000

0 PMMA DM DB HM HB FM FB 316L polymres

Figure 12. HUVECs et CMLs J5 sur les diffrentes surfaces de polymres et sur plots 316L.

III.4.3.3. Morphologie cellulaire sur les diffrents films de copolymres Nous avons observ les cellules directement sur les diffrents supports en utilisant un double marquage fluorescent. Le premier est un marquage du cytosquelette la phallodine, le second est un marquage de lADN au DAPI. Les clichs obtenus lors de lobservation des cellules sur la surface des diffrents copolymres sont prsents sur la figure 13. Ltude de la morphologie cellulaire associe celle de la prolifration constitue un outil permettant de mieux comprendre le comportement des cellules adhrentes sur les surfaces de natures et de compositions chimiques varies. Lanalyse de clichs obtenus aprs cinq jours de culture, prsents la figure13, montre que ltalement et la morphologie des cellules varient dune surface une autre. Les cellules HUVECs stalent moins bien que les CMLs sur le PMMA, et beaucoup dentre elles restent quiescentes. loppos, les HUVECs stalent mieux sur le support DM et les CMLs ont une morphologie trs diffrente que celle observe sur le fond de puits de culture (figure 13.a). Sur les supports HM et HB, les cellules HUVECs atteignent la confluence et restent en monocouche. La morphologie des CMLs sur ces mmes supports est peu diffrente celle sur les fonds de puits. Ces supports ne semblent pas capables dinhiber les CMLs malgr la prsence de lhparine. Contrairement son action lorsquelle est soluble, lhparine immobilise dans nos copolymres est incapable de moduler la prolifration des cellules musculaires lisses et 156

Rsultats endothliales (figure 13.b). La figure 13.c montre que les HUVECs et les CMLs prsentent une morphologie normale sur ces supports FM et FB et comme pour le support hparin, la prsence des fucanes ne semble pas favoriser ou inhiber les cellules testes. Une comparaison de prolifration cellulaire entre le film DB et les plots dacier 316L prsente dans la figure 13.d, montre que les HUVECs prolifrent mieux sur les films DB que sur plots 316L. A loppos, les CMLs prolifrent mieux sur les plots de 316L que sur le DB. Le copolymre base de dextrane et de polybutylmthacrylate (DB) est donc le polymre qui prsente les meilleures proprits physiques et de slectivit cellulaire, et cest celui-ci qui sera utilis pour lenduction de stents mtalliques (Cf. article 3).

HUVECs PMMA

CMLs PMMA

HUVECs HM

CMLs HM

HUVECs DM

CMLs DM

HUVECs HB

CMLs HB

HUVECs FM

CMLs FM

HUVECs DB1

CMLs DB1

HUVECs FB

CMLs FB

HUVECs Plot 316L

CMLs Plot 316L

Figure 13. Observation des cellules en microscopie par fluorescence aprs cinq jours de prolifration (Grossissement : PMMA x 75 ; les autres films et plot x 250). 157

158

Discussion

IV. Discussion

159

160

Discussion

Discussion
Lobjectif de cette thse tait dallier au sein dun mme matriau les proprits biologiques des polysaccharides et les proprits mcaniques des polymthacrylates, en vue dobtenir un matriau susceptible denduire des stents mtalliques afin de limiter le phnomne de restnose. Lide de rtablir le flux sanguin grce une intervention chirurgicale sur lartre malade est ne en 1964 et la premire angioplastie russie a t ralise en 1977 par Andreas Grntzig. Bien que cette mthode permette de rtablir la lumire des artres, dans certains cas, lartre peut scraser (sur elle-mme) ds le dgonflement du ballon dangioplastie, puisquil ny a rien pour soutenir les parois de lartre. Ds 1912, Alexis Carrel avait pens au concept dun implant endovasculaire ayant pour but de maintenir lartre ouverte avec du verre et des tubes de mtal dans laorte de plusieurs chiens. Lopration avait chou, mais 80 ans plus tard, lide a t rutilise par Sigwart pour traiter un cas de restnose. Le principe consiste introduire un stent mont sur un ballon dangioplastie dans lartre malade au niveau de la zone obstrue. Lavantage du stent mtallique est quil permet de maintenir lartre ouverte grce aux forces mcaniques quil exerce sur ses parois. Cependant, les stents sont des corps trangers en contact avec les tissus sanguins, ils peuvent donc tre responsables dune raction inflammatoire qui se manifeste par laccumulation de plaquettes et de leucocytes vers le site dimplantation, par une migration et une prolifration de cellules musculaires lisses, et par la production de matrice extracellulaire entranant ainsi une hyperplasie intimale. Suite lobservation de ces phnomnes dinflammation, l'ide de recouvrir les stents avec une substance biocompatible qui permettrait d'viter le risque de thrombose li l'insertion du stent dans les vaisseaux sanguins est apparue. Ainsi, depuis quelques annes, plusieurs essais de recouvrement de stents ont t raliss. Le premier objectif du recouvrement des stents est dtablir une barrire protectrice entre le mtal et lenvironnement biologique afin dviter les phnomnes de corrosion lis aux ractions chimiques et biologiques de lorganisme de lhte. Pour cela, les films protecteurs doivent pouvoir suivre les dformations et les mouvements des stents sans se fissurer, ni crer de rsidus dans lorganisme o ils sont introduits. De plus, ils doivent tre biocompatibles, non toxiques et non cancrignes. En outre, il faut quils puissent rduire les rponses inflammatoires conduisant aux phnomnes de thrombose, de restnose ou dhyperplasie nointimale. Plusieurs types de recouvrements ont t labors. Les stents ont t recouverts avec des substances non-actives et des polymres. Cependant, ces stents ntaient pas beaucoup plus efficaces que les stents nus et certains polymres ntaient pas aussi biocompatibles quon lavait 161

Discussion cru, puisquils engendraient des ractions inflammatoires. Lautre stratgie qui nest pas exclusive de la premire approche est dutiliser localement des agents mdicamenteux tels que des agents immunosuppresseurs, des inhibiteurs de la prolifration cellulaire, des agents antiinflammatoires ou des agents activant la rgnration tissulaire introduits dans la formulation du revtement. Des tudes se dirigent galement vers la thrapie gnique artrielle qui consiste utiliser des stents recouverts dun polymre comme rservoirs pour une libration locale de matriel gntique.

Le but de ce travail tait donc dassocier pour le recouvrement de stents plusieurs proprits par la ralisation de nouveaux systmes macromolculaires. Nous avons port notre attention sur les proprits biologiques des polysaccharides et les proprits mcaniques des polymthacrylates. La combinaison des deux composs a t ralise grce une copolymrisation radicalaire en milieu aqueux utilisant le crium (IV) comme initiateur Redox.

Dans une premire tape, nous avons valid la technique de greffage du monomre mthacrylate de mthyl (MMA) sur le dextrane. En effet lobjectif tait de faire crotre un polyacrylate sur le dextrane afin dobtenir une liaison covalente entre ces deux polymres dont les proprits physico-chimiques sont totalement diffrentes. De plus, nous devions obtenir un produit soluble pour faciliter la caractrisation et la mise en oeuvre. Pour cela, les synthses ont t ralises dans un milieu dilu afin de limiter les recombinaisons radicalaires et les rticulations. Lexprience a rvl quen absence de polysaccharide ou de monomre, aucune polymrisation nest possible. Dautre part nous avons dtermin les concentrations en ractifs permettant dobtenir un copolymre nomm DM . Une fois le DM solubilis dans le DMSO, il a t caractris par spectroscopie infrarouge, RMN, mesures de viscosit et par calorimtrie (DSC). Linfrarouge et la RMN rvlent la prsence simultane du dextrane et du
polymthylemthacrylate, la viscosit montre que la masse du DM a doubl par rapport celle du dextrane dorigine. La DSC confirme quant elle le greffage covalent par la prsence dune seule temprature de transition vitreuse 126C, intermdiaire entre la Tg du dextrane (152C) et celle du polymthylmthacrylate (118C) alors quun simple mlange physique des deux polymres conserve deux Tg distincts.

Puisque le DMSO nest pas recommand pour les applications biomdicales, le DM a t solubilis dans un mlange eau/THF et des films ont t raliss sous une atmosphre sature en THF et en prsence de CaCl2. Les films obtenus sont parfaitement homognes et transparents. Leurs proprits mcaniques sous sollicitations dynamiques (DMA) ont t values, ces mesures ont rvl une plus grande souplesse du copolymre DM par rapport au PMMA. Cependant, les essais denduction de stents par le DM ont rvl que ces proprits mcaniques 162

Discussion restent insuffisantes. Au terme de cette premire tape, des tests de culture cellulaire ont cependant montr que ce copolymre nest pas cytoxique et prsente une bonne biocompatibilit.

Dans une seconde tape, un autre monomre a t slectionn dans un but damliorer les proprits mcaniques du copolymre. Les rsultats issus de ltude du DM ont permis de transposer les conditions de synthse avec un autre monomre acrylique qui est le n-butylmthacrylate. Trois copolymres ont t synthtiss avec diffrentes proportions de dextrane, appels DB1, DB2 et DB3, ils ont t caractriss par infrarouge, et DSC. La prsence des groupements chimiques caractristiques du dextrane (3400 cm-1 pour le groupement hydroxyle) et du PBMA (1730 cm-1 pour le groupement carbonyle) met en vidence la prsence simultane des deux composs. En comparant lintensit des pics correspondant au groupement hydroxyle, cette technique a permit aussi de quantifier la proportion relative de polysaccharide et de polyacrylate des trois chantillons DB. La comparaison des thermogrammes obtenus avec les copolymres montre qu linstar du DM, les copolymres DB prsentent une seule Tg. De plus, la valeur de cette Tg augmente avec la proportion de dextrane, ce qui est en accord avec la valeur leve de la Tg du dextrane. Les produits DB obtenus nous ont permit de raliser des films parfaitement transparent et homogne dans les mmes conditions que celles utilises avec DM. Lhydrophilie des films DB a t caractrise par mesure de langle de contact. Comme nous pouvions nous y attendre, langle de contact diminue quand le taux de dextrane augmente, langle de contact tant maximum pour le PBMA seul. Cela signifie que l'hydrophobicit peut tre modul par le rapport dextrane - PBMA. Les proprits mcaniques du DB ont t tudies par des tests de fluages et par DMA. Le PBMA tant trop cassant, il na pas t test. Les tests de fluages en traction raliss par la suspension dune rampe de masse (100g, 125g, 150g, 175g, 200g) lextrmit des films nous ont permit de dduire la vitesse de dformation en fonction de la contrainte. Les rsultats montrent que les films DB prsentent des proprits viscolastiques intressantes, et quil existe une relation linaire entre la masse suspendue lextrmit du film et la vitesse de dformation initiale. La comparaison entre les trois chantillons DB1, DB2 et DB3 rvle que la vitesse de dformation augmente avec la proportion du PBMA dans le copolymre, par consquent, la viscolasticit des copolymres peut tre module grce au contrle du rapport dextrane PBMA. Les mesures sous sollicitations dynamiques (DMA) montrent quil ny a pas de grandes diffrences entre les trois chantillons DB par contre une comparaison avec le DM rvle que les proprits mcanique des DB sont meilleures (pour les applications vises) que celles du DM.

163

Discussion Dans une logique de confirmer les rsultats de DSC et de DMA, nous avons procd la synthse dun autre copolymre en utilisant cette fois un mlange de monomres mthylemthacrylate et butylmthacrylate (50%/50%). Les conditions de synthse sont toujours les mmes. Le nouveau copolymre obtenu (dextrane-graft-(PMMA-co-PBMA)) appel DBM tait caractris par DSC et DMA et compar DM et DB. Les rsultats de DSC montrent que ce nouveau copolymre possde une seule Tg intermdiaire entre la Tg du DM et la Tg DB.. Les autres rsultats thermomcaniques rvlent que les proprits mcaniques du DBM sont galement intermdiaires entre celles du DM et des DB. Cela peut de plus tre modul en agissant sur le rapport PMMA - PBMA. Nous avons tendu cette tude lutilisation de lhparine ou de fucanes tant donn leurs proprits biologiques intressantes. Les copolymres obtenus, nomms HM, HB, FM et FB permettent de raliser des films parfaitement homognes et transparents. Ces copolymres ont les mmes proprits que ceux cits prcdemment.

La troisime partie consistait, valuer la biocompatibilit de tous les copolymres synthtiss. Pour cela des films confectionns sous forme de disque de mme diamtre que les fonds de puits des plaques 24-puits ont t tests avec les cellules endothliales (HUVECs) et des cellules musculaires lisses. Des cintiques de croissance de ces cellules sur ces films de copolymres montrent dune part quaucun de ces films nest cytoxiques et dautre part ils influencent ladhsion et la prolifration cellulaire, c'est--dire que la prolifration cellulaire est diffrente dun copolymre un autre. Les rsultats obtenus avec les HM, HB, FM et FB montrent que ces copolymres ninhibent pas la croissance des CMLs malgr la prsence dhparine et ou de fucane qui sous forme solublent sont dcrits comme inhibiteurs sur ces cellules. Parmi les copolymres, un se rvle particulirement slectif, cest le DB1. Ce copolymre favorise la croissance des cellules endothliales et limite la prolifration des cellules musculaires lisses. Un test comparatif entre ce copolymre et des plots dacier 316L confirme ces rsultats. tant donn es caractristiques biologiques et mcaniques, le DB1 a t slectionn pour enduire des stents mtalliques. Afin des mieux visualiser le revtement avant et aprs lexpansion du stent, une synthse tait ralise avec dextrane-FITC (dextrane fluorescent). Lobservation des stents sous microscopie fluorescence montre dune part que le dextrane est rparti dune manire homogne dans le revtement et dautre part que ce revtement est homogne sur la surface de stent. Une autre observation en microscopie lectronique balayage a confirm que ce revtement suit parfaitement la dformation du stents aprs expansion et reste sur son support sans craqueler ni scailler. Des expriences complmentaires ralises en 164

Discussion collaboration avec lquipe du Professeur Digo Mantovani Qubec confirment ces rsultats sur des plots mtaliques nus et recouverts. Les expriences qui doivent tre finalises trs prochainement permettent galement de mieux caractriser la surface chimique du revtement et ces proprits mcaniques sous dformation. Des expriences dendothlisation in vitro ont enfi t ralises avec des stents enduits de DB1 et des stents nus. Les rsultats montrent que les cellules endothliales colonisent beaucoup mieux les stents enduits que les stent nus.

Le bilan des rsultats obtenus pour les diffrents copolymres polysaccharide/polyacrylate montre que ces matriaux rpondent au cahier des charges minimal impos pour une enduction de stent savoir : bonne cohsion du revtement avec son substrat ; bonne souplesse du revtement de manire suivre les fortes dformations plastiques que subit le stent lors de sa mise en place ; simplicit de mise en uvre (enduction) ; possibilit de charger le support en principe actif (hydrophile ou hydrophobe) ; Biocompatibilit support favorable pour la migration et la prolifration des cellules endothliales.

Bien entendu dautres paramtres doivent tre explors pour confirmer la parfaite adquation entre ces matriaux et lusage que lon souhaite en faire. En particulier, il est ncessaire dvaluer lhmocompatilit des revtements obtenus et de vrifier par des essais in vivo chez des modles animaux que des stents recouverts de nos copolymres rduisent effectivement le risque de restnose.

La synthse de ces diffrents copolymres et de leurs utilisations pour le recouvrement de stents apparat ainsi comme particulirement intressante. Ces tudes doivent se poursuivre pour valider les diffrents aspects de ce projet qui pourrait dboucher sur des applications biomdicales sur les stents ou pour le recouvrement de dispositifs mdicaux.

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Conclusion

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Conclusion

Conclusion
Lobjectif de ce travail concernait la mise au point dun revtement bioactif pour stents mtalliques dans un but de limiter la restnose intra-stents. Cette pathologie issue dun mcanisme inflammatoire multifactoriel, implique en particulier une prolifration des cellules musculaires lisses vasculaires au dtriment des cellules endothliales. Les stents dnomms bioactifs utiliss actuellement en clinique comporte des agents antimitotiques et immunosuppresseurs. Nanmoins, ces molcules agissent indiffremment sur les cellules musculaires lisses et les cellules endothliales. Dans ce contexte, notre approche est denduire des stents mtalliques dun revtement permanent qui favorise la prolifration des cellules endothliales et inhibe les cellules musculaires lisses.

Nous nous sommes alors intresss aux polysaccharides qui peuvent moduler lactivit cellulaire. En effet plusieurs dentre eux sont dj utiliss dans le domaine mdical. Cependant, leurs proprits mcaniques restent trs limites, ils ne sont pas filmogne et sont gnralement solubles dans le milieu aqueux. Afin de rendre les polysaccharides compatibles avec lutilisation envisage, il fallait les combiner des polymres hydrophobes et filmognes. La possibilit de crer des radicaux libres partir de fonctions hydroxyles grce une raction Redox nous a permis denvisager une polymrisation radicalaire de diffrents mthacrylates.

Lensemble de ce travail a permis de montrer quil est parfaitement possible de synthtiser des polymres hybrides polysaccharide/polyacrylate qui soient filmognes malgr la nonmiscibilit des deux homopolymres. Ces polymres, de mise en uvre simple (dpt par vaporation de solvant) possdent les qualits mcaniques requises pour lenduction de stents appels subir de grandes dformations plastiques : souplesse et adhrence au substrat. Les revtements obtenus partir de ces copolymres sont insolubles en milieu aqueux et sont parfaitement stables dans les fluides biologiques.

En ce qui concerne lun des copolymres, il a t montr que le revtement obtenu favorise in vitro la migration et la prolifration des cellules endothliales au dtriment des cellules musculaires lisses, ce qui est un point essentiel dans la prvention de la restnose.

La nature amphiphile de nos films permet denvisager de les charger en principes actifs de nature hydrophile ou hydrophobe. Des tudes ont aussi t ralises afin dincorporer dans la structure des polymres naturels ayant des proprits thrapeutiques. Lhparine, qui est un 169

Conclusion anticoagulant utilis en clinique humaine, peut ainsi tre introduit par ce procd dans le recouvrement de stents. Dautres polysaccharides comme les fucoidanes, trs tudis au laboratoire pour leurs effets dans le domaine cardiovasculaire, sont galement introduits dans la composition du film de recouvrement du stent.

La technique de synthse et de recouvrement est donc adaptable une large gamme de polysaccharides et une grande varit de monomres. Ceci permet donc dadapter la composition aux proprits physiques ou biologiques souhaites.

Les proprits numres ci-dessus font des copolymres polysaccharide/polyacrylate dexcellents matriaux innovants pour des applications biomdicales, en particulier dans le domaine cardiovasculaire. Des expriences complmentaires et en tout premier lieu, des essais dhmocompatibilits (in vitro) et dimplantation in vivo chez le lapin, devront tre ralises. Cette approche est tout fait dans lexpertise du laboratoire Inserm U698. Les travaux raliss ouvrent ainsi la voie, nous lesprons de futures tudes plus dtailles sur le mcanisme de copolymrisation, sur linteraction de ces surfaces avec des constituants protiques impliqus dans ladhrence cellulaire, sur les possibilits de dlivrance locale de principes actifs (agents pharmacologiques, agents de thrapie gnique), et sur la validation prclinique et clinique de ces matriaux.

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ASAP Biomacromolecules, ASAP Article, 10.1021/bm800470z Web Release Date: October 1, 2008 Copyright 2008 American Chemical Society
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Synthesis and Characterization of a New Polysaccharide-graft-polymethacrylate Copolymer for Three-Dimensional Hybrid Hydrogels

S. M. Derkaoui, T. Avramoglou, C. Barbaud, and D. Letourneur*

Inserm, U698, Bio-inge! nierie de Polyme" res Cardiovasculaires, Institut Galile! e, Universite! Paris 13, 99 Avenue Jean-Baptiste Cle! ment, 93430 Villetaneuse, France

Received April 29, 2008

Revised August 22, 2008

Abstract:

Hybrid materials constituted by hydrophobic and hydrophilic biocompatible macromolecules are useful for biomedical applications. In this context, a well-known acrylic monomer (methyl methacrylate) was polymerized and grafted onto the polysaccharide dextran by the use of ceric ammonium nitrate as a redox initiator in aqueous nitric acid medium. The effects of concentrations of dextran, acrylic monomer, and ceric ions on the copolymerization yields were investigated in detail. The obtained polymers were studied by solubility measurements, Fourier transform infrared spectrometry, 13C nuclear magnetic resonance spectroscopy, and viscosimetric analysis. Interestingly, we found conditions to form transparent and homogeneous thin films or 3D structures with hybrid properties. Indeed, the copolymer, but not dextran or PMMA, could be dissolved in water/THF (20/80 v/v). The thermomechanical properties of the resulting copolymer analyzed by differential scanning calorimetry and dynamic mechanical analysis showed the occurrence of a single glass-transition temperature and a marked difference with the two homopolymers. The cytocompatibility of the copolymer with human endothelial cells was evidenced by the normal cell adhesion, proliferation, and morphology after 5 days in culture on these gels. In conclusion, this type of copolymer with hybrid properties of two biocompatible macromolecules could be of great interest as a 3D scaffold or for coating in biomedical applications.

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Synthesis and Characterization of a New Polysaccharide-graft-polymethacrylate Copolymer for Three-Dimensional Hybrid Hydrogels
S. M. Derkaoui, T. Avramoglou, C. Barbaud, and D. Letourneur*
Inserm, U698, Bio-inge nierie de Polyme ` res Cardiovasculaires, Institut Galile e, Universite Paris 13, 99 Avenue Jean-Baptiste Cle ment, 93430 Villetaneuse, France Received April 29, 2008; Revised Manuscript Received August 22, 2008

Hybrid materials constituted by hydrophobic and hydrophilic biocompatible macromolecules are useful for biomedical applications. In this context, a well-known acrylic monomer (methyl methacrylate) was polymerized and grafted onto the polysaccharide dextran by the use of ceric ammonium nitrate as a redox initiator in aqueous nitric acid medium. The effects of concentrations of dextran, acrylic monomer, and ceric ions on the copolymerization yields were investigated in detail. The obtained polymers were studied by solubility measurements, Fourier transform infrared spectrometry, 13C nuclear magnetic resonance spectroscopy, and viscosimetric analysis. Interestingly, we found conditions to form transparent and homogeneous thin lms or 3D structures with hybrid properties. Indeed, the copolymer, but not dextran or PMMA, could be dissolved in water/THF (20/80 v/v). The thermomechanical properties of the resulting copolymer analyzed by differential scanning calorimetry and dynamic mechanical analysis showed the occurrence of a single glass-transition temperature and a marked difference with the two homopolymers. The cytocompatibility of the copolymer with human endothelial cells was evidenced by the normal cell adhesion, proliferation, and morphology after 5 days in culture on these gels. In conclusion, this type of copolymer with hybrid properties of two biocompatible macromolecules could be of great interest as a 3D scaffold or for coating in biomedical applications.

Introduction
Polymers are widely used for their tailor-made properties and represent the largest class of materials for biomedical devices such as vascular grafts,1 drug delivery systems,2 resorbable implants,3 and matrices for tissue engineering and coating of biomaterial surfaces.4-7 However, combining the advantageous properties of natural and synthetic polymers is often a challenge because of the immiscible features of such polymers.8-11 For instance, it would be advantageous to combine hydrophilic and hydrophobic polymers to develop biomaterials for drug delivery. Indeed, the hydrophobic part of the polymer may act as drug carrier, whereas the hydrophilic part ensures biological interactions. For coating purposes, such hybrid polymers must be stable and resist deformation. The aim of our study was to obtain hybrid materials in which the physicochemical and biological properties of the two components are well combined. In this context, we synthesized grafted amphiphilic copolymers and made homogeneous 3D structures endowed with viscoelastic properties. We used an acrylic monomer for the hydrophobic structure and polysaccharide as a hydrophilic part. Indeed, both polyacrylate and polysaccharides are already used in preclinical or clinical applications.12-15 Among the wide family of polysaccharides, heparin16-19 and dextran20-23 have largely demonstrated interesting properties for use in biomaterials. Dextran also allowed easy chemical substitutions for the coupling to or the mimicking of biological molecules.24-26 In fact, the development of new biocompatible polysaccharide materials is still an intense area of research in the eld of polymeric biomaterials.10,27-29
* To whom correspondence should be addressed. Fax: +33 1 49 40 30 08. E-mail: didier.letourneur@galilee.univ-paris13.fr.

Table 1. Effects of Dextran, Initiator, and Monomer (MMA) Concentrations on the Yield and Solubility of a Series of Copolymer DMs in Water, THF or a 20/80 (v/v) Mixture of Water and THF reagents solubility in

dextran Ce(IV) MMA H2O/ copolymer (mol (mol/L (mol/L yield THF -6 -4 -2 DM 10 ) 10 ) 10 ) (%) H2O THF 20/80 DM0 DM1 DM2 DM3 DM4 DM5 DM6 DM7 DM8 DM9 DM10 DM11 DM12 DM13 DM14 DM15 0 1.8 1.8 1.8 1.8 1.8 1.8 7.1 7.1 7.1 7.1 7.1 7.1 14.3 14.3 14.3 2.4 1.2 2.4 4.0 1.2 2.4 4.0 1.2 2.4 4.0 1.2 2.4 4.0 1.2 2.4 4.0 3.7 1.8 1.8 1.8 3.7 3.7 3.7 1.8 1.8 1.8 3.7 3.7 3.7 3.7 3.7 3.7 0 13 18 17 15 19 11 23 21 19 25 48 37 21 15 11 + + + + + + + + + + + + -

The present work describes a simple and reproducible method for synthesizing new amphiphilic materials that are suitable for biomedical applications. In this study, we used dextran for the graft copolymerization of an acrylic monomer with ceric ammonium nitrate as the initiator. Other investigators have used this strategy with heparin, dextran, or carrageenan.30-34 The different parameters (concentrations of initiator, acrylic monomer, and dextran) and conditions of solubilization allowed us to obtain 3D structures that are compatible with human cells with new hybrid thermomechanical properties.

10.1021/bm800470z CCC: $40.75 2008 American Chemical Society Published on Web 10/01/2008

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Biomacromolecules, Vol. 9, No. 11, 2008

Derkaoui et al.
at 80 C under vacuum for 24 h. Solvents were of the highest commercially available purity. Graft Copolymerization. We synthesized the copolymers by varying the concentrations of dextran and ammonium cerium(IV) nitrate and the concentration of acrylic monomer in the reaction mixture by radical polymerization with a ceric ion/nitric acid redox initiator in aqueous medium.35-38 The general experimental procedure was as follows: The reactions were carried out in a 1 L ve-necked ask equipped with a stirrer and condenser, and the ask was immersed in a thermostatted oil bath and was purged by nitrogen gas. In the typical reaction, dry dextran (0.5 g, 70 kg/mol) was dissolved in 500 mL of nitric acid (0.2 M), and the reactor was placed in an oil bath at 40 C. After the complete dissolution of the polysaccharide to form a homogeneous solution (10 min), 5 mL of solution of Ce(IV) (2.4 10-4 mol/L) and 2 mL of methyl methacrylate were simultaneously added to the reaction mixture, and after 40 min, the reaction product was allowed to cool at ambient temperature. The mixture was raised to pH 8 by the addition of NaOH aqueous solution (10 M), and it was concentrated with a rotavapor. Then, the product was poured into 200 mL of methanol to induce precipitation. The particle suspensions were dialyzed under water for 48 h and were washed twice with 50 mL of EDTA (10-2 M), followed by three washes with 50 mL of distilled water to remove cerium ions and the dextran that did not react. The puried copolymer was frozen at -20 C and lyophilized for 24 h. Homopolymer was extracted with acetone. Exactly 1.000 g of crude dried product was taken and extracted in a Soxhlet for 24 h to remove the homopolymers and the remaining products. Pure copolymer was dried under vacuum and was weighed. The obtained copolymer was named dextran-graftpoly(methyl methacrylate) (DM). Characterizations. Infrared Spectral Analysis. The infrared spectra of dextran, PMMA, and copolymer DM were obtained from a PerkinElmer 1600 spectrometer. Dried samples (1.5 mg) were ground with KBr powder (150 mg) and were pressed into pellets for FT-IR examination. Omnic software was used for data acquisition and analysis. NMR Analysis. 13C NMR spectra of dextran, PMMA, and copolymer DM were recorded by the use of a Varian Gemini 200 MHz spectrometer in deutered dimethyl sulfoxide-d6 at ambient temperature. Tetramethylsilane (TMS) was used as an internal standard. Before use, all products were lyophilized twice with deuterium oxide (D2O). Viscosity Measurements. Viscometric measurements were carried out by the use of an Ubbelohde capillary viscometer (0.3 mm diameter). The temperature was regulated at 25 C by a circulating bath. A standardization curve was drawn (viscosity vs molecular weight) with dextrans of various molecular weights dissolved in DMSO. We prepared solutions by dissolving the copolymer in the same solvent (DMSO).

Table 2. Solubility of the Studied Polymers in Various Solventsa polymer solvents water DMSO dichloromethane acetone chloroform dioxane THF water/THF 10/90 20/80 50/50
a

dextran S S I I I I I I I I

PMMA I S S S S S S I I I

copolymer DM I S I I I I I I S I

S: soluble, I: insoluble. Water/THF mixtures are v/v.

Figure 1. Infrared spectra of polymers. (a) PMMA, (b) dextran, and (c) copolymer DM.

Experimental Section
Products. Dextrans of different molecular weights (MW ) 10, 40, 70, 80.7, and 264 kg/mol) were purchased from Sigma for molecular weight assessment. Dextran (70 kg/mol) was also used for synthesis (see below). It was dried in a vacuum oven at 60 C for 24 h. Methyl methacrylate monomers were obtained from Acros France and were puried by washing with 5% NaOH and 20% NaCl, followed by distilled water. Ammonium cerium(IV) nitrate (Acros France) was dried

Figure 2.

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C NMR spectra of copolymer DM in deutered DMSO.

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Figure 3. Viscometric results obtained with copolymer DM in DMSO.

Preparation of Three-Dimensional Structures. We prepared discs or lms by using dried homopolymer PMMA (15 mg) solubilized in THF. Copolymer DM was dissolved in 1 mL of THF/H2O (80/20) that was treated in an ultrasonic bath for 1 h. Dextran gave any 3D structures. To obtain discs, solutions were poured in Petri dishes for 24 h at room temperature in a saturated atmosphere of THF and in the presence of CaCl2 to absorb water. Thin lms were stripped from the mold and were dried in an oven at 30 C. A morphological analysis of the cross section of lms was carried out by the use of a Leica S-440 scanning electron microscope (SEM). All 3D structures were extensively washed with water before any biological and mechanical assays. Thermomechanical Analysis. Differential Scanning Calorimetry (DSC). The thermal behavior of polymers (dextran, PMMA, DM) was analyzed with a Setaram DSC131 thermal analyzer operating in

combination with the liquid nitrogen cooling accessory. The furnaces were purged with nitrogen, and samples were passed in a temperature range of -50 to 200 C at a heating rate of 10 C/min. In each case, two consecutive scans were carried out on each sample. The glasstransition temperature (Tg) of the polymers was taken as the midpoint in the shift of the heat ow baseline. A simple mixture of dextran and PMMA was also used as control. Dynamic Mechanical Analysis (DMA). DMA was used to analyze the loss modulus, storage modulus, and tan of lms that were obtained from PMMA as well as copolymer DM. Dextran could not be used because this polymer gave any lm. Films of 15 5 0.035 mm3 were analyzed on the dynamic mechanical analyzer DMA Q800 (TA Instruments). The equipment was operated in a single cantilever bending mode at a frequency of 1 Hz, an amplitude of 5 m, and a heating rate of 3 C/min from -100 to 200 C. HUVEC Cell Culture. For all cell cultures, lms were sterilized by the exposure of each surface sample to UV light at 254 nm for 15 min. Human umbilical venous endothelial cells (HUVECs) were obtained from ATCC. They were seeded on either tissue culture plates or lms at a cell density of 5 103 cell/cm2. Cells were cultured with DMEM (Gibco) with 4.5 g/L of glucose and 2% L-glutamine supplemented with 10% calf serum and 1% penicillin and streptomycin. The cells were incubated for 5 days at 37 C in CO2/air (5 and 95%, respectively) in a humidied incubator. With the transparency of 3D structures, the cell morphology on lms was directly observed by conventional optical microscopy.

Results and Discussion


Copolymerization Conditions for Dextran-graft-poly(methyl methacrylate) (DM). For the study of graft polymerization, the yield was quantied and the solubility of copolymer

Figure 4. (a) Morphology of DM disk after controlled evaporation and (b) SEM image (cross section) of a thin DM lm.

Figure 5. DSC thermograms of (a) dextran, (b) PMMA, (c) copolymer DM, and (d) dextran + PMMA.

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Figure 6. Dynamic mechanical spectra of PMMA (---) and copolymer DM (s). (a) Storage modulus, (b) loss modulus, and (c) tan as a function of temperature. Dextran gave any lm.

DM was tested. The polymerization yields are presented in Table 1. In the absence of dextran, no polymer was formed. In all other experiments, polymerization occurred after 10 min of addition of the Ce(IV) and monomers and led to the formation of suspensions of colloidal particles. Interestingly, the compounds DM1 to DM12 were found to be soluble in a mixture of water/THF (20/80 v/v). We determined the reaction conditions that afford the maximum percentage of grafting of monomer onto dextran (0.125 to 2 g/L) by varying the concentrations of ceric ammonium nitrate ((1.2-4) 10-4 mol/ L) and methyl methacrylate ((1.2-3.7) 10-2 mol/L). Results showed that the weight of dextran, monomer, and initiator have a signicant effect on the polymerization with yields ranging from 10 to 50% (Table 1). The optimum conditions for polymerization were 143, 0.24, and 37 mmol/L of dextran, Ce(IV) and methyl methacrylate, respectively. By increasing the dextran content (DM13, DM14 and DM15), we obtained lower yields, and the solubility of these compounds was not found (Table 1). The optimum conditions for DM11 were thus kept for the following study. We then conrmed the hybrid

property of copolymer DM by solubility measurements (Table 2). In contrast with dextran, copolymer DM was insoluble in water. In contrast with PMMA, copolymer DM was insoluble in most organic solvents (dichloromethane, acetone, chloroform, dioxane, THF) but was soluble in a mixture of water/THF (20/ 80). Physicochemical Characterizations of Copolymer DM. Infrared spectra of pure PMMA, dextran, and copolymer DM are presented in Figure 1. Copolymer DM exhibited a broad absorption band characteristic of hydroxyl groups of dextran at 3400 cm-1 and an additional band of carbonyl groups at 1730 cm-1 of acrylic polymer. Semiquantitative analysis gave a 20-30% ratio of dextran in DM copolymer. The 13C NMR spectra were recorded for the copolymer DM in deutered dimethyl sulfoxide-d6, the only common solvent (Table 2) for dextran, PMMA, and copolymer DM. The spectra reported in Figure 2 for copolymer DM showed the characteristic peaks of PMMA and dextran. As reported in literature, all peaks of dextran are located between 65 and 100 ppm, chemical shift a at 100 ppm is attributed to the anomeric carbon of the glucose unit of dextran, peak f is attributed to C-CH2 of dextran at 68 ppm, peak k is attributed to PMMA (O-CH3) at 55 ppm, and peak j is attributed to the carbonyl groups (CdO) of PMMA at 180 ppm. The 13C NMR spectroscopy was also used to conrm the percentage of dextran in the copolymer quantitatively. By comparing peak integrals assigned to dextran and PMMA (the a/j ratio) in copolymer DM, we calculated that the copolymer contains 30% dextran. Figure 3 represents the intrinsic viscosity versus the known molecular weight of various dextrans in DMSO. The viscosity of copolymer DM ( ) 0.48) was higher than the viscosity of the starting 70 kg/mol dextran ( ) 0.37). The extrapolation of the viscosity value for copolymer DM gave an apparent molecular weight of 140 kg/mol. Preparation of Three-Dimensional Structures. In contrast with dextran and PMMA, copolymer DM could be dissolved in a 20/80 mixture of water/THF (Table 2). Then, the solution containing copolymer DM could be molded in Petri dishes after evaporation for 24 h at room temperature, as reported in the Experimental Section. The morphologies of dry DM lms were inuenced by the evaporation conditions. In the case of natural evaporation, lms presented microphase separation and became opaque and brittle, whereas in the case of controlled evaporation for both solvents (THF and water), homogeneous and transparent structures were obtained (Figure 4a). Scanning electron microscopy provided additional information on morphology. Figure 4b evidenced the compact and homogeneous structure of a thin DM lm. Interestingly, the resulting lms from copolymer DM were found to be insoluble in water (in contrast with dextran) even after days of immersion and were thus suitable for being tested in biomedical applications. Thermomechanical Analysis of Copolymer DM. The determination of the glass-transition temperature was carried out for dextran, PMMA, and copolymer DM. The thermograms are reported in Figure 5. The Tg values of the two homopolymers dextran (Figure 5a) and PMMA (Figure 5b) were 152 and 118 C, respectively. A single Tg was obtained at 126 C for copolymer DM (Figure 5c). This value is thus intermediate as compared with the homopolymers. In contrast, a simple physical mixture of dextran with PMMA exhibited two distinct transitions (Figure 5d). Dynamic mechanical analysis enables the assessment of the mechanical behavior of the 3D structures over a large range of temperature, including 37 C, which is the working temperature

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Figure 7. Adhesion studies demonstrated that human endothelial cells (HUVECs) adhere and proliferate on DM lm (original magnication 12.5).

Figure 8. Schematic representation of the proposed polymerization process. (a) Dextran, (b) dextran oxidation by Ce(IV) with the formation of free radicals, and (c) grafting of acrylic monomers on free radicals. (This representation does not imply that all glucosidic units are substituted.)

for biomedical materials. The results in Figure 6 are reported for DM and PMMA because dextran gave any lm. The Figure illustrates three parameters: (a) the storage modulus (E), (b) the loss modulus (E), and (c) tan , which is the ratio (E/E). Data indicated a storage modulus E at 37 C of 4100 and 5700 MPa for DM and PMMA, respectively. As expected, both polymers showed a continuous decrease in the storage modulus with increasing temperatures (Figure 6a). The loss modulus curve for copolymer DM was clearly shifted to higher temperatures as compared with that for PMMA (Figure 6b). The maximum signal of tan is related to the molecular mobility transition, such as the glass-transition temperature in DSC thermograms. The temperature dependence of tan (Figure 6c) showed a maximum peak that was also used for the determination of the glass-transition temperatures of PMMA (109 C) and DM (141 C). The differences with DSC values were attributed to the presence of water tightly associated with polymer, which induced changes in both the storage and the loss modulus. All together, these results evidenced the hybrid properties of the resulting copolymer DM structures that are signicantly different from the two corresponding homopolymers, dextran and PMMA. Cell Biocompatibility. Studies were performed to evaluate the in vitro cytocompatibility of DM lms with HUVECs. Surfaces of DM lms were not previously modied with cell adhesive proteins or peptides before cell cultivation. The adhesion of cells to the transparent DM lms was directly

observed under the microscope, and no morphological alterations were observed as compared with control cultures. The morphology of cells on DM lms was normal, as shown in Figure 7. The proliferation of HUVECs was also studied until 5 days after seeding at low cell density. Cell density strongly increased from sparse cells to an almost conuent layer on the DM surface after 5 days. These results strongly suggested a high compatibility with human cells of these structures, which will be studied in detail for vascular biomaterial purposes.10 Copolymerization Scheme. Graft copolymerization of the acrylic monomer onto polysaccharide was carried out by the use of acrylic monomer and Ce(IV) as an initiator, as previously reported by others.30-38 By adjusting the different conditions indicated in the Experimental Section, we were able to obtain a compound with a peculiar behavior. Indeed, the solubility experiments evidenced a narrow range of solvents for copolymer DM. (DMSO is the only common solvent to dextran-PMMADM, and THF/water is only for copolymer DM.) Thermomechanical properties were also evaluated above, and DSC for copolymer DM as well as dynamic mechanical spectra evidenced a single Tg. In contrast with a linear dibloc polymer, the proposed mechanism for grafting is outlined in Figure 8. The overall mechanism of copolymerization would consist of three steps: (1) free radical formation in which the hydroxyl groups of dextran form a complex with ceric ions, (2) chain propagation, in which the complex dissociates and gives rise to free radical sites onto oxygen of the polysaccharide, and the

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acrylic polymer chain propagates, and (3) termination of the chain by the recombination of radicals. Experiments are currently in progress to dene the precise structure of this promising biocompatible copolymer denitively.

Conclusions
The purpose of this work was to study the copolymerization of dextran with methyl methacrylate. These compounds were chosen to be model systems for copolymerization of polysaccharides with polyacrylates that are able to be included in bioarticial polymeric materials.10,19,39 Materials with improved mechanical properties were thus obtained by the controlled reaction of dextran with acrylic monomer using ceric ammonium nitrate.36-38 Interestingly, the obtained copolymer DM formed 3D homogeneous and transparent structures such as thin lms or discs and was very compatible with human endothelial cells. Indeed, a peculiar solubility of the copolymer was found in mixtures of THF/H2O. Thermal and mechanical analysis evidenced intermediate properties between acrylic polymer and dextran. Furthermore, the morphological analysis indicated that graft copolymers were more stable than the homopolymers. Therefore, hybrid polymeric materials that are obtained from copolymerization between a synthetic acrylic monomer and a polysaccharide such as dextran could provide new biocompatible materials with improved properties. Acknowledgment. This work was supported by Inserm, the University of Paris 13, and IFR Paris Nord-Plaine de France. We thank Dr. Ce dric Lorthioir (CNRS Thiais, France) for excellent technical assistance in DMA tests and E. Guenin (University of Paris 13, School of Medicine) for NMR spectra.

References and Notes


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BM800470Z

Rsum
Les matriaux hybrides constitus de macromolcules hydrophiles et hydrophobes sont dun grand intrt dans le domaine biomdical. Dans ce contexte, des monomres acryliques ont t greffs sur des polysaccharides laide du criumIV. Les copolymres obtenus combinent les proprits biologiques des polysaccharides et les proprits mcaniques des polyacrylates. De faon intressante, nous avons trouv des conditions afin de raliser des films minces transparents et homognes ou des structures 3D avec les proprits hybrides. Le revtement dendoprothses vasculaires mtalliques (stents) avec ces copolymres est uniforme et lisse, sans craquelure ni dtachement aprs une expansion au ballonnet. Les rsultats montrent que les stents mtalliques enduits avec certains copolymres amliorent la prolifration et migration des cellules endothliales et inhibent la prolifration de cellules musculaires lisses. Ces copolymres sont ainsi dexcellents matriaux innovants pour des applications biomdicales, en particulier dans le domaine cardiovasculaire.

Abstract
Title: Bioactive coating for bare metal stent: Synthesis, characterization and biocompatibility
Hybrid materials constituted by hydrophobic and hydrophilic biocompatible

macromolecules are useful for biomedical applications. In this context, a well-known acrylic monomer was polymerized and grafted onto various polysaccharides using ceriumIV. The biological and mechanical properties of the two components are well combined in these copolymers. Interestingly, we found conditions to form transparent and homogeneous thin films or 3D structures with hybrid properties. The resulting coating of endovascular metallic prosthesis (stent) with copolymer was smooth and uniform, with neither cracks nor detachment after balloon expansion. Results evidenced that a stent coated with some of these copolymers improved proliferation and migration of endothelial cell and inhibited proliferation of vascular smooth muscle cells. These copolymers appear as excellent innovating materials for biomedical applications, in particular in the cardiovascular field.

Keywords Dextran; Polybutylmethacrylate; Copolymer; Stent; Endothelial Cells; Vascular Smooth Muscle Cells; Proliferation and migration.