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el radical libre y
AH el antioxidante:
X
+ AH XH + A
El nuevo radical formado es mucho ms estable que el inicial.
Por el contrario, en las reacciones SET el antioxidante transfiere un electrn para
reducir un compuesto, incluyendo metales, carbonilos y radicales, y seran reacciones de
este tipo, siendo de nuevo X
+ AH X
-
+ AH
+
AH
+ H2O A
+ H3O
+
X
-
+ H3O
+
XH + H2O
M(III) + AH AH
+
+ M(II)
En principio, estas reacciones dependen mucho ms del disolvente que las HAT;
sin embargo, se ha visto que el disolvente puede ejercer una influencia clara en el
ORAC y el ABTS, a pesar de ser mtodos HAT (Fernndez-Pachn, Villao et al.
2005)
Estas reacciones son tambin dependientes del pH. Son mtodos muy sensibles
al cido ascrbico y al cido rico, que juegan un papel importante en el mantenimiento
del status redox del plasma. Algunos elementos traza y contaminantes (sobre todo
1. ANTECEDENTES
3"
metales) pueden interferir con estos mtodos, resultando en una alta variabilidad y una
baja reproducibilidad y consistencia de los resultados.
Las reacciones HAT vienen determinadas por la entalpa de disociacin, de
manera que un compuesto que la tuviera baja facilitara la abstraccin del tomo de H.
As mismo, se ha observado que ciertos aspectos estructurales, como la presencia de un
grupo hidroxilo en posicin orto o la posible formacin de enlaces intermoleculares
entre distintos sustituyentes, pueden contribuir a reducir la entalpa de disociacin,
facilitando la formacin de un radical estable. Por el contrario, las reacciones SET
dependen del potencial de ionizacin (Siquet, Paiva-Martins et al. 2006).
A continuacin, se describen brevemente algunos de los principales mtodos
para la determinacin de la capacidad antioxidante, segn usen mecanismos de las
reacciones HAT, SET, o ambas
1.3.2.2 '6todos de medida de capacidad antio%idante 0ue utili7an
mecanismos de "eacciones 5A)
ORAC (Oxygen Raical A!sor!ance Capacity"
Se trata de un mecanismo HAT. Mide la capacidad de captacin de un radical
especfico, el peroxilo, generado a partir de la molcula orgnica AAPH, que se trata de
un iniciador de tipo azo-. Estos radicales atacarn a la molcula de fluorescena,
produciendo fluorescena oxidada, que ya no emite fluorescencia y, produciendo, por
tanto, un descenso en la misma (longitud de onda de excitacin 493 nm. y de emisin
515 nm.) En presencia de antioxidantes, stos reaccionan con los radicales peroxilo y la
fluorescena mantendr la misma emisin de fluorescencia. Por tanto, se lleva a cabo
una comparacin entre el descenso en la fluorescencia producido en presencia y en
ausencia de un antioxidante (Ou, Hampsch-Woodill et al. 2001). A las concentraciones
empleadas, el AAPH tiene una ratio respecto al antioxidante mucho mayor que el
ABTS
+
en el TEAC, con lo que se asegura que los radicales peroxilo interaccionarn
con el antioxidante (Cao, Booth et al. 1998).
Inicialmente, la reaccin se llevaba a cabo con beta-ficoeritrina (-PE), una
protena aislada de Porphyridium cruentum, como fuente de radicales peroxilo. Sin
embargo, la -PE no proporciona resultados reproducibles y no es fotoestable, por lo
que despus de una cierta exposicin a la luz se puede fotodegradar. Adems, se ha
visto que forma ciertos enlaces no especficos con polifenoles, que hacen que se
subestime la capacidad antioxidante. Finalmente, la muestra comercial slo tiene un 30
% de pureza. Por esta razn, se busc una alternativa, que es la fluorescena- 3,6-
dihydroxy-spiro [isobenzofuran-1 [3H], 9 [9H]-xanthen]-3-ona (Ou, Hampsch-Woodill
et al. 2001).
No obstante, se debe recordar que el ORAC mide la capacidad de captacin de
un ROS en concreto (presente, en cualquier caso, en una molcula que no se encuentra
en el organismo), pero en el cuerpo humano se forman muchos otros que se deberan
1. ANTECEDENTES
3!
medir por otros mtodos (Ou, Hampsch-Woodill et al. 2001). Otro inconvenientes de
este mtodo son que la cintica de la reaccin puede variar en funcin de la
concentracin de antioxidante.
#RA$ (#otal Raical%trapping Antioxiant $ara&eter"
Determina la captacin de radicales peroxilo, en este caso generados a partir del
ABAP. La oxidacin es inicialmente inhibida durante un periodo de tiempo lag phase-
por el antioxidante, y lo que se hace es comparar la duracin de este periodo (T) para la
muestra y para el Trolox. (Ghiselli, Serafini et al. 1995). La Figura 1.4 muestra el
descenso en la fluorescencia frente al tiempo que se produce en ausencia del
antioxidante (izquierda) y la lag-phase que se genera al aadir un antioxidante
(derecha), retrasando el inicio de la prdida de fluorescencia.
Figura 1.4. Evolucin de la intensidad respecto al tiempo en el mtodo TRAP (Ghiselli, Serafini et al.
1995)
Distintos autores han usado muchos puntos finales diferentes, lo que dificulta la
comparacin de los resultados. Adems, no todos los antioxidantes poseen una lag-
phase claramente establecida (Prior, Wu et al. 2005).
#O'C (#otal oxyraical scavenging capacity"
Se basa en la oxidacin del cido alfa-ceto-gamma-metilbutrico a etileno por la
accin de radicales hidroxilo, peroxilo y peroxinitrito generados a partir del 2,2-
azobisamidinopropano (ABAP). La formacin de etileno, que es parcialmente inhibida
por la presencia de antioxidantes, es monitorizada por el anlisis del espacio de cabeza
por GC (Gas Cromatography). El valor TOSC se halla comparando el rea de la muestra
con la de un patrn (Winston, Regoli et al. 1998).
Recientemente se propuso una modificacin en este mtodo para expresar los
resultados en equivalentes Trolox, solucionando uno de los principales problemas del
mtodo original, que, aunque era una tcnica muy rpida, no tena una expresin clara
de resultados.
1. ANTECEDENTES
39
No obstante, la reaccin tiene una cintica que no hay una relacin dosis-
respuesta entre la cantidad de antioxidante y el porcentaje de inhibicin, lo que dificulta
la comparacin entre distintos alimentos (Prior, Wu et al. 2005).
$C( (Ensayo e foto)ui&ilu&iniscencia* $HO#OCHE+"
El ensayo engloba la generacin fotoqumica de radicales libres superxido O
2
-
combinado con una deteccin CL. El ensayo se inicia por excitacin ptica de un
fotosensibilizador (S) resultante de la generacin del anin radical superxido
S + hv + O
2
[S*O
2
] S
+
+ O
2
-
La reaccin completa del mecanismo no se conoce. Hay dos tipos bsicos de
radicales presentes en el sistema de medida PCL: O
2
-
y radicales lumnicos. As, en el
sentido estricto, la capacidad antioxidante representa la capacidad antiradical. Los
radicales libres son detectados con un reactivo CL, luminol, el cual acta a la vez como
un fotosensibilizador y como un reactivo de deteccin de radicales de oxgeno. Los
ACW y ACL son usados como medida de capacidad antioxidante hidroflica y
lipoflica, respectivamente, de muestras biolgicas. La hidroflica se evala por medias
de la fase lag (L) en segundos
I = I
0
I
1
Donde I
0
y I
1
son respectivamente los parmetros de blanco y muestra.
La medida de capacidad antioxidante lipoflica es evaluada por el grado de
inhibicin de PCL (I), de acuerdo con la frmula
I = 1
S
S
0
,
Donde S
0
es la integral bajo la curva del blanco y S es la integral bajo la curva de la
muestra.
El cido ascrbico y Trolox se usan como reactivos de calibracin para la
hidroflica y lipoflica respectivamente, en rangos de 0-2 nmol. En contraste con otras
medidas de la capacidad antioxidanet PHOTOCHEM no necesita un valor exacto de pH
o temperatura (Prior, Wu et al. 2005).
C,A (Crocin ,leac-ing Assay"
Se trata de un mecanismo HAT, basado en la oxidacin (decoloracin) de la
crocina, un derivado natural de carotenoides, por radicales peroxilo generados a partir
del AAPH. Se mide la tasa de decoloracin de la crocina en presencia y en ausencia de
antioxidantes a 443 nm., donde la crocina presenta un mximo de absorbancia. Los
resultados se expresan en equivalentes de Trolox.
1. ANTECEDENTES
4&
crocin-H (naranja) + ROO
crocin
(blanqueado) +ROOH
crocin-H (naranja) + ROO
+ AH crocin
+ ROOH + A
Se han planteado diversas crticas a este mtodo (Prior, Wu & Schaich, 2005),
como que la relativamente baja longitud de onda a la que se mide coincide con muchos
pigmentos alimentarios, como los propios carotenoides. Por otro lado, la crocina es una
mezcla de pigmentos naturales extrados del azafrn y que presenta una gran
variabilidad entre distintos lotes, lo que limita su aplicacin a gran escala. Adems, los
mecanismos de reaccin de diferentes antioxidantes con la crocina pueden variar
mucho, lo que dificulta la interpretacin de los resultados.
No obstante, y dada la variabilidad existente entre los distintos protocolos
publicados para este mtodo, un trabajo reciente (Ordoudi and Tsimidou 2006)
analizaron paso a paso este mtodo, solventando alguno de los problemas anteriormente
indicados, como los productos que se pueden utilizar como fuente de crocina, y
proponiendo la aplicacin de nuevos parmetros.
Oxiaci.n e las (D(/s
Se trata de una reaccin HAT. La oxidacin de las lipoprotenas LDLs por los
radicales libres es un proceso que ocurre en los seres vivos y es una de las primeras
etapas en el proceso de la aterosclerosis. En este mtodo se induce la oxidacin de
LDLs aisladas de distintos individuos mediante diferentes elementos y compuestos,
como Cu 2+ o AAPH y despus se mide la absorbancia a 234 nm., a la cual absorben
los dienos conjugados generados durante el proceso de oxidacin de las LDLs.
La absorbancia se va modificando con el tiempo en tres fases: una lag-phase, en
la que los dienos no se han comenzado a formar por la presencia de antioxidantes en la
muestra y, por tanto, no aumenta; una fase de propagacin, en la que aumenta de
manera exponencial por la formacin de dienos; y un fase de descomposicin de los
mismos, en la que la absorbancia tiende a bajar lentamente.
Se han propuesto una gran cantidad de parmetros que se pueden medir en este
ensayo, desde la comparacin de la duracin de la lag-phase entre un blanco y una
muestra con antioxidante (en la que esta fase ser ms larga), la cantidad inicial de
dienos conjugados, la cantidad mxima de los mismos (Hurtado, Cald et al. 1997) u
otro parmetro, el CLT50, que mide la cantidad de antioxidante necesaria para aumentar
la lag-phase en un 50 % respecto al control (Snchez-Moreno 2002).
1.3.2.3 '6todos de medida de capacidad antio%idante 0ue utili7an
mecanismos de "eacciones SE)
FRA$ (Ferric Reucing Antioxiant $o0er"
Se trata de una reaccin SET, que se basa en la reduccin del complejo de la
tripiridiltriazina frrica al complejo ferroso por un antioxidante en medio cido (Benzie
1. ANTECEDENTES
41
and Strain 1996). Esta reaccin produce un cambio de color que es monitorizado
midiendo la absorbancia a 595 nm durante 4 minutos, segn el mtodo original, aunque
este tiempo fue posteriormente ampliado hasta 30 minutos (Pulido, Bravo & Saura-
Calixto, 2000), ya que a los 4 minutos muchos compuestos todava no haban acabado
de reaccionar. Los resultados se expresan en equivalente Trolox (mol Trolox/g o mol
Trolox/L), tras elaborar una curva de calibrado de este compuesto, un anlogo
hidrosoluble de la vitamina E muy utilizado en la expresin de resultados de capacidad
antioxidante.
Figura 1.5 Mecanismo de reaccin en el mtodo FRAP
Se han planteado diversas crticas a este mtodo:
Se lleva a cabo a un pH no fisiolgico (Prior and Cao 1999).
Como el potencial de reduccin del Fe (III) a Fe (II) es de 0,77 V,
cualquier compuesto con un potencial redox inferir podra reducir al Fe
(III), sobreestimando el valor de FRAP (Ou, Huang et al. 2002).
A 593 nm pueden absorber otros compuestos, como la bilirrubina
oxidada, que produce biliverdina, aumentando el valor de FRAP (Prior
(Prior and Cao 1999); (Ou, Huang et al. 2002).
Hay compuestos como el cido ascrbico que, adems de reducir el ion
frrico a ferroso, pueden reaccionar con ste ltimo para generar nuevos
radicales libres (Cao, 1998) Por ejemplo, en fluidos biolgicos, el Fe (II)
puede interaccionar con agua oxigenada para producir radical hidroxilo
(Ou, Huang et al. 2002).
Dado que el FRAP se define como una medida del poder antioxidante
total, se trata como iguales a los reductores y a los antioxidantes. Sin
embargo, el FRAP no implica a ningn prooxidante ni a ningn sustrato
oxidable. Igual que no todos los reductores que transforman el ion
ferroso en frrico no son antioxidantes, hay antioxidantes que no son
capaces de llevar a cabo esta reaccin, como es el caso del GSH, un
importante antioxidante natural que da resultados negativos en el FRAP
(Prior and Cao 1999)
Copper Reuction Assay (CU$RAC* AO$%123"
Recientemente se han estudiado variantes al FRAP usando Cu en vez de Fe
como Bioxytech AOP-490 y CUPRAC (Apak, Guclu et al. 2004). Estos ensayos estn
basados en la reduccin de Cu(II) a Cu(I) por la accin combinada de todos los
1. ANTECEDENTES
42
antioxidantes (agentes reductores) en una muestra. En el ensayo AOP-490,
bathocuproine (2,9-dimethyl-4,7-diphenyl-1,10-phenanthroline) forma un complejo 2:1
con Cu(I), rindiendo a cromoforo con un mximo de absorbancia a 490 nm. El ensayo
CUPRAC usa un compuesto relacionado neocuproine (2,9-dimethyl-1,10-
phenanthroline), el complejo Cu(I) el cual absorbe a 450 nm. Una curva de la dilucin
generada por los estndares del cido rico se us para convertir la absorbancia de la
muestra a equivalentes de cido rico.
Figura 1.6. Estructuras de bathocuproine y neocuproine usadas en el ensayo de reduccin de cobre
Los complejos phenanthroline tienen una solubilidad en agua muy limitada y por
lo tanto debe ser disuelto en solventes orgnicos como el etanol 95 %. Sin embargo, el
-caroteno no reaccionar con el reactivo CUPRAC en etanol acuoso y requiere
dicloroetano, lo que limita la miscibilidad. (Apak, Guclu et al. 2004). Los valores de
CUPRAC son comparables a los de TEAC para polifenoles, mientras que los de FRAP
son considerablemente ms bajos.
El cobre, bien libre o en complejo phenanthroline, tiene un potencial redox ms
bajo que el hierro, as que las reacciones son ms selectivas: azucares y cidos ctricos,
que comnmente interfieren con FRAP, no son oxidados en CUPRAC. Pero tambin
hay que tener en cuenta que para bajos potenciales redox se incrementa el ciclo redox,
as que la reduccin de cobre puede ser un indicador incluso ms sensible del potencial
de la activiad pro-oxidante de los antioxidantes (Prior, Wu et al. 2005).
1.3.2.$ '6todos de medida de capacidad antio%idante 0ue utili7an
mecanismos de "eacciones 5A) # SE)
#EAC (#rolox E)uivalent Antioxiant Capacity" o A,#' (4cio 5*56%azino!is%7%
etil!enzotiazolin%8%sulf.nico"
Se trata de una reaccin SET, basada en la capacidad de los antioxidantes para
capturar el radical catinico ABTS+ (cido 2,2' azinobis-3-etilbenzotiazolina-6-
sulfonico), captura que produce un descenso en la absorbancia a 658 nm. El descenso
producido por el Trolox es comparado con el producido por el antioxidante que se est
analizando en el mismo tiempo.
1. ANTECEDENTES
43
El radical se puede generar enzimticamente con mioglobina o peroxidasa de
rbano; qumicamente con Mn O2, K2S2O8 o radical perxido; electroqumicamente
(Villao, Fernndez-Pachn et al. 2005). En el mtodo original se generaba el radical
directamente en presencia del antioxidante, con metamiglobina y perxido de
hidrgeno; ste oxidaba la metamioglobina, que a su vez oxidaba el ABTS. Sin
embargo, se vio que algunos polifenoles, como la quercetina, podan interaccionar con
los reactivos, impidiendo la formacin del radical y dando un valor de capacidad
antioxidante sobreestimado, por lo que se pas a generar el radical previamente a la
adicin del antioxidante (Re, Pellegrini et al. 1999).
No obstante, se han planteado algunas crticas a esta modificacin, en el sentido
de que los polifenoles, adems de reaccionar con el radical para dar lugar a la molcula
original, pueden dar lugar a otros compuestos; esto generara problemas a la hora de
determinar la estequiometra de la reaccin entre el ABTS y un compuesto o relaciones
de estructura-actividad, ya que el clculo no se podra basar en los moles de molcula
no radiclica recuperados (Pinelo, Sineiro et al. 2006) Tambin puede ocurrir que los
compuestos polifenlicos formen aductos con el radical, por lo que no toda la prdida
de absorbancia se debera a que el radical volviera a su forma inicial; en este sentido, se
ha observado la formacin de estructuras de este tipo entre el radical catinico y la
catequina y el floroglucinol (Prior, Wu et al. 2005).
De hecho, la correlacin entre los valores de ABTS y el contenido en polifenoles
determinado por Folin es superior a los 2 min. de empezar la reaccin que a los 15 min.,
lo que se podra deber a que en la primera parte de la reaccin son los polifenoles los
que reaccionan, mientras que en la segunda parte son otros metabolitos derivados
(Villao, Fernndez-Pachn et al. 2005).
Tambin se ha propuesto medir la absorbancia a 414 nm., donde el radical
presenta otro mximo y el lmite de deteccin es inferior, pero tienen lugar ms
interferencias que a 734 nm. Estas interferencias aumentan la coloracin y llevan a una
infravaloracin de la capacidad antioxidante, porque se mide una reduccin en el color
inferior a la que realmente se produce (Arnao. 2001).
D$$H (5*5%ip-enyl%9%picryl-yrazyl"
En este mtodo se sita el DPPH
A
'
(
5
1
5
)
*
*M T8.1.9
5. RESULTADOS Y DISCUSIONES
"&
,epetitividad # linealidad usando el espect"ofotmet"o de placas 8)Be"mo Scientific
'ultisEan Do:
La repetitividad se determin llevando a cabo 8 repeticiones del protocolo
completo de anlisis en condiciones de repetitividad, utilizando como muestra Trolox.
Se obtuvieron los siguientes resultados expresados en desviacin estndar relativa
(DER):
Tabla 5.4. Resultados estudio repetitividad del mtodo DPPH en espectrofotmetro de placas
Repeticin mM Trolox Media Desv. Estand CV (%)
1
0,5225
0,5319 0,0164 3,10
2
0,5175
3
0,54
4
0,53
5
0,51
6
0,5475
7
0,56
8
0,5275
La linealidad se comprob mediante la curva de calibracin, en donde se
aadieron concentraciones de Trolox hasta 1 M, tomando como variable dependiente la
diferencia de absorbancia a 515 nm despus de una hora de reaccin (Figura 5.4).
% M =?33(2' N =?10=2
.O M =?998(
=?====
=?1===
=?2===
=?3===
=?&===
=?(===
=?0===
= =?2 =?& =?0 =?8 1 1?2
A
'
(
.
5
1
5
)
*
*M T8.1.9
5. RESULTADOS Y DISCUSIONES
"1
Figura 5.4. Recta patrn para el mtodo DPPH en espectrofotmetro de placas
Observando los datos de repetitividad, se obtiene que los coeficientes de
variacin estn en torno al 3 %, por tanto estos valores son aceptables
En la linealidad se observa como las R
2
son en ambos casos por encima del valor
0,99, as que se puede concluir que los mtodos son lineales
&.1.3 4e"acidad del m6todo F,AP
,epetitividad # linealidad usando el espect"ofotmet"o de placas 8)Be"mo Scientific
'ultisEan Do:
La repetitividad se determin llevando a cabo 8 repeticiones del protocolo
completo de anlisis en condiciones de repetitividad, utilizando como muestra sulfato de
hierro heptahidratado. Se obtuvieron los siguientes resultados expresados en desviacin
estndar relativa (DER):
Tabla 5.5. Resultados estudio repetitividad del mtodo FRAP en espectrofotmetro de placas
Repeticin
mg Fe
2+
/g materia
seca
Media Desv. Estand CV (%)
1
0,1943
0.2010 0,0064 3,18
2
0,1931
3
0,1973
4
0,2058
5
0,1971
6
0,2073
7
0,2035
8
0,2100
La linealidad se comprob mediante la realizacin del mtodo a diferentes
concentraciones de sulfato de hierro heptahidratado. Se empez con 0.75 mg/ml, y se
hicieron 5 diluciones sucesivas. (Figura 5.5)
5. RESULTADOS Y DISCUSIONES
"2
Figura 5.5. Recta patrn para el mtodo FRAP en espectrofotmetro de placas
El valor del coeficiente de variacin es 3,18 %, por lo que se puede concluir que
la repetitividad es totalmente aceptable
Como se puede observar las R
2
de esta recta patrn dan por encima de 0.99 por
lo tanto se puede considerar que existe una linealidad en el mtodo
% M 2?1429' N =?2&13
.O M =?999(
=
=?2
=?&
=?0
=?8
1
1?2
1?&
1?0
1?8
2
= =?1 =?2 =?3 =?& =?( =?0 =?4 =?8
A
'
(
.
5
9
3
)
*
5$:2;7 */3*1
5. RESULTADOS Y DISCUSIONES
"3
&.2 ES)3*IO CO'PA,A)I4O *EL ),A)A'IEN)O *E LA
'A)E,IA P,I'A AN)ES *E LA E+),ACCI-N
Los resultados obtenidos para los parmetros TPC y DPPH tras la extraccin
slido-lquido a diferentes temperaturas de las muestras liofilizadas y secadas a vaco se
muestran en la tabla 5.6. Para llegar a estos resultados se realiz un anlisis ANOVA
para los factores tratamiento (secado a vaco o liofilizado) y temperatura (20, 30, 40 y
50 C)
Tabla 5.6. Anlisis estadstico de la extraccin slido-lquido.
T (
C)
TPC (Folin-Ciocalteu) AA (DPPH)
LIOFILIZACIN
(mg/g)
SECADO POR
ESTUFA
LIOFILIZACIN
(mMTrolox/g)
SECADO POR
ESTUFA (mM
20 22,92 1,68
aA
22,55 0,8
aA
0.1371 0.0041
aA
0,1175 0,0025
aB
30 22,98 1,07
aA
23,21 0,49
aA
0.1758 0.0032
bA
0,1604 0,0065
bB
40 23,68 0,48
aA
23,65 0,38
aA
0.1679 0.0094
cA
0,1630 0,0034
bA
50 30,93 0,78
bA
26,30 1,53
bB
0,2470 0,0025
dA
0,2113 0,0140
cB
Letras minsculas indican diferencias significativas (=0,05) para las temperaturas de cada
tratamiento. Letras maysculas diferentes indican diferencias significativas (=0,05) entre los mtodos de
secado previos para cada temperatura
Una vez obtenida la tabla con todos sus datos, el estudio de los resultados
obtenidos se separan en dos grupos, TPC y DPPH.
Polifenoles totales 8)PC:
Desde el punto de vista del tratamiento y viendo los resultados obtenidos tras el
anlisis estadstico, se observa que a temperaturas de 20, 30 o 40 C no existen
diferencias significativas ( = 0,05) entre los diferentes secados. Sin embargo para una
extraccin a 50 C se obtuvieron diferencias significativas ( = 0,05) ya que hubo mayor
concentracin de polifenoles con un secado mediante liofilizacin frente a un secado a
vaco. Adems en todas las temperaturas la media de extraccin de polifenoles era
mayor en los casos de liofilizacin que en los de a vaco
Observando los datos de la tabla ANOVA para el factor temperatura se concluy
que para las temperaturas de 20, 30 y 40 C no haba diferencias significativas, pero sin
embargo para una extraccin a 50 C si que existan esas diferencias, y que adems los
extractos obtenidos a esta temperatura presentan contenidos en polifenoles superiores.
Parece que la temperatura de 50C marca un punto de inflexin en la extraccin
independientemente del pretratamiento de la muestra.
5. RESULTADOS Y DISCUSIONES
"4
As pues en el estudio realizado por Bucic-Kojic, Planinic et al. (2007) se haca
una extraccin slido-lquido de pepitas de uvas con una concentracin de 40 ml/g en
un medio etanol acuoso (50:50) y a rangos de temperaturas de 25 a 80 C, se obtuvieron
valores de fenoles totales entre 66,81 y 23,91 mg AG/g materia seca. Estos valores
variaban dependiendo del tamao de partcula, ya que consiguieron reducir este tamao
hasta 120 m. Cuando hacen el estudio para tamaos de partcula entre 400 y 600 m y
temperatura igual a 50 C, los resultados rondan los 20 mg AG/g extracto seco, por
tanto los valores obtenidos en nuestro estudio son algo mayores. Esta mejora podra ser
debida al secado previo por liofilizacin, ya que en el estudio de Bucic-Kojic en vez de
secar, lo que hace es moler la muestra y directamente envasarla al vaco y alamcenarla
en refrigeracin (4 C) hasta la extraccin.
En el trabajo de Pinelo, Sineiro et al. (2006) se estudi la extraccin slido-
lquido de subproductos de la vinificacin. Las condiciones eran las mismas que para el
trabajo presente, salvo que el secado se produca en un horno durante 48 horas con aire
caliente recirculado. Los resultados que se obtuvieron en ese trabajo fueron de una
cantidad de fenoles totales de 6,9 21,8 mg AG/g extracto seco (la variacin se debe a
la cantidad de muestra inicial). Por lo tanto en el mejor de sus casos no se llegaba al
menor de los valores de este trabajo. As pues se puede pensar que un posible factor
clave a la hora de una mejor extraccin puede ser el secado previo. Esto puede ser
debido a la sobreexposicin que sufren las muestras de Pinelo, ya que es posible que los
polifenoles puedan sufrir degradaciones al estar tanto tiempo y en presencia de oxgeno
Actividad antio%idante
Comparando los dos pretratamientos a las temperaturas de 20, 30 y 50 C hubo
diferencias significativas entre los mtodos de secado, pero sin embargo a 40 C estas
diferencias no fueron lo suficientemente grandes como para ser significativas. Se puede
hacer una evaluacin global y pensar que en principio s que existen diferencias entre
los mtodos de secado independientemente de la temperatura a la que se extraiga
Sin embargo analizando las temperaturas dentro de cada mtodo de secado, se
observa que para la liofilizacin cada una de las extracciones a una temperatura supona
un grupo independiente, es decir, que existan diferencias significativas entre todas, y
que conforme aumentaba la temperatura la actividad antioxidante era mayor. Para el
secado a vaco sin embargo se formaban tres grupos diferenciados, ya que para las
extracciones a temperaturas de 30 y 40 C no existan diferencias significativas, pero s
que se diferenciaban con respecto a las otras dos extracciones. Al igual que en el secado
con liofilizacin cuanto mayor fue la temperatura de extraccin mayor fueron los
valores de actividad antioxidante
De forma general para la extraccin analizando la actividad antioxidante se
confirm que los mayores valores se obtenan conforme aumentaba la temperatura de
extraccin, y que al comparar los mtodos de secado previos, resultaba mejor actividad
antioxidante cuando las semillas de uva se secaban mediante liofilizacin.
5. RESULTADOS Y DISCUSIONES
"5
Makris, Boskou et al. (2007) hicieron un estudio para analizar la influencia del
solvente (etanol) en rangos del 21 al 57 % respecto del agua. La extraccin se realizaba
tras haber secado las muestras en un horno, y con las muestras sin triturar. La
concentracin era de 5.5 ml/g, y no especificaba la temperatura de extraccin. Los
resultados que obtena eran muy inferiores a los obtenidos en este trabajo, ya que en
fenoles totales extraan entre 7,957 y 13,75 mgAG/g y en actividad antioxidante 0,0594
0,0855 mmol Trolox/g.
Haciendo una comparacin global de la extraccin slido-lquido teniendo en
cuenta la cantidad de fenoles totales y la actividad antioxidante (medida por DPPH), se
concluy que los mejores valores se obtenan tras secar las muestras con un proceso de
liofilizacin y una posterior extraccin a una temperatura de 50 C.
&.3 OP)I'IFACI-N *E LAS CON*ICIONES *E E+),ACCI-N
ASIS)I*A PO, 3L),ASONI*OS
&.1.1 'odelo de supe"ficie de "espuesta
Se pretenda encontrar las condiciones de extraccin que permitan obtener la
mayor riqueza polifenlica y actividad antioxidante en los extractos.
Los factores experimentales a variar fueron la temperatura de extraccin, la
intensidad de los ultrasonidos y el tiempo de tratamiento. Con los datos de la
bibliografa y los estudios previos realizados se fij el dominio experimental de inters,
para cada uno de los factores, del siguiente modo:
Para la intensidad de los ultrasonidos interesaba estudiar el rango
completo de intensidades proporcionadas por el equipo (20 - 100 %).
Para la temperatura, Aunque es conocido que el rendimiento de la
extraccin aumenta de forma importante a partir de los 50 C (Adj,
Lozano et al. 2010; Tabaraki and Nateghi 2011; Galvan D'Alessandro,
Kriaa et al. 2012), el rango de temperaturas de extraccin se fij de
forma que no se alcanzasen temperaturas que pudiesen producir
degradaciones de los compuestos polifenlicos (10 - 50 C).
El tiempo de tratamiento se fij a partir de los datos de la bibliografa,
fijando como mximo 50 minutos, tiempo al que, en las referencias
bibliogrficas consultadas (Soria and Villamiel 2010; Virot, Tomao et al.
2010) se tiene, con un margen de seguridad, un comportamiento
asinttico en la respuesta del rendimiento de extraccin (5 50 minutos).
Los niveles de los factores se muestran en la tabla 5.7, atendindose a su
codificacin
5. RESULTADOS Y DISCUSIONES
"6
Como el inters es obtener extractos con una elevada capacidad antioxidante, las
variables respuesta medidas fueron la actividad antioxidante mediante el mtodo DPPH
y mediante el mtodo FRAP, y el contenido en polifenoles totales mediante el mtodo
de Folin-Ciocalteu.
Se llevaron a cabo un total de 69 experimentos utilizando un diseo central
compuesto en estrella (2^2 + estrella), con dos replicaciones, para el estudio de los
efectos lineales, cuadrticos y las interacciones de primer orden, de los tres factores
estudiados (temperatura de extraccin, la intensidad de los ultrasonidos y el tiempo de
tratamiento), a 5 niveles cada uno (Tabla 5.8).
Tabla 5.7. Niveles de los factores utilizados en el diseo experimental (diseo central compuesto
en estrella: 2^2 + estrella).
Valor Temperatura
(
o
C)
Tiempo
(min)
Intensidad
(%)
1,68 50 50 100
1 42 41 90
0 30 27,5 60
-1 18 14 30
-1,68 10 5 20
5. RESULTADOS Y DISCUSIONES
""
Tabla 5.8. Diseo experimental.
Prueba T Tiempo Intensidad Prueba T Tiempo Intensidad
1 1,0 1,0 1,0 36 1,68 0,0 0,0
2 0,0 0,0 0,0 37 0,0 0,0 1,68
3 0,0 0,0 0,0 38 0,0 0,0 0,0
4 -1,0 1,0 1,0 39 1,0 -1,0 -1,0
5 0,0 0,0 -1,68 40 0,0 0,0 0,0
6 0,0 0,0 0,0 41 -1,68 0,0 0,0
7 0,0 0,0 0,0 42 1,0 -1,0 1,0
8 0,0 -1,68 0,0 43 0,0 0,0 0,0
9 -1,0 -1,0 -1,0 44 -1,0 -1,0 1,0
10 0,0 1,68 0,0 45 0,0 0,0 0,0
11 -1,0 1,0 0,0 46 1,0 1,0 -1,0
12 0,0 0,0 0,0 47 1,0 1,0 1,0
13 1,68 0,0 0,0 48 0,0 0,0 0,0
14 0,0 0,0 1,68 49 0,0 0,0 0,0
15 0,0 0,0 0,0 50 -1,0 1,0 1,0
16 1,0 -1,0 -1,0 51 0,0 0,0 -1,68
17 0,0 0,0 0,0 52 0,0 0,0 0,0
18 -1,68 0,0 0,0 53 0,0 0,0 0,0
19 1,0 -1,0 1,0 54 0,0 -1,68 0,0
20 0,0 0,0 0,0 55 -1,0 -1,0 -1,0
21 -1,0 -1,0 1,0 56 0,0 1,68 0,0
22 0,0 0,0 0,0 57 -1,0 1,0 -1,0
23 1,0 1,0 -1,0 58 0,0 0,0 0,0
24 1,0 1,0 1,0 59 1,68 0,0 0,0
25 0,0 0,0 0,0 60 0,0 0,0 1,68
26 0,0 0,0 0,0 61 0,0 0,0 0,0
27 -1,0 1,0 1,0 62 1,0 -1,0 -1,0
28 0,0 0,0 -1,68 63 0,0 0,0 0,0
29 0,0 0,0 0,0 64 -1,68 0,0 0,0
30 0,0 0,0 0,0 65 1,0 -1,0 1,0
31 0,0 -1,68 0,0 66 0,0 0,0 0,0
32 -1,0 -1,0 -1,0 67 -1,0 -1,0 1,0
33 0,0 1,68 0,0 68 0,0 0,0 0,0
34 -1,0 1,0 -1,0 69 1,0 1,0 -1,0
35 0,0 0,0 0,0
5. RESULTADOS Y DISCUSIONES
"!
Tabla 5.9. Cantidad de fenoles totales y actividad antioxidante de las pruebas de superficie de
respuesta
Prueba Folin (mg AG/g materia
seca)
DPPH (mM
Trolox/g materia
FRAP (mg Fe
2+
/g
materia seca)
1 73,82 2,35 0,8342 0,0476 99,06 7,74
2 81,40 4,48 0,7824 0,0477 73,20 4,26
3 79,55 2,48 0,7770 0,0444 61,85 2,66
4 90,36 5,15 0,8439 0,0567 60,92 4,12
5 83,59 3,79 0,7372 0,0635 68,87 4,01
6 75,52 4,16 0,7559 0,0304 74,39 3,40
7 82,77 2,70 0,6491 0,0368 70,11 4,54
8 79,96 2,52 0,5911 0,0319 107,95 6,93
9 68,32 1,21 0,5629 0,0407 84,28 5,02
10 82,26 3,24 0,6342 0,0433 74,57 4,82
11 70,70 6,48 0,5132 0,0326 71,44 3,67
12 83,71 2,05 0,6151 0,0371 62,66 2,46
13 80,87 1,69 0,7254 0,0426 96,21 5,39
14 71,02 2,22 0,6286 0,0221 86,20 3,82
15 78,01 6,87 0,6432 0,0424 83,37 2,91
16 82,64 5,48 0,6534 0,0374 76,07 4,05
17 87,01 1,32 0,6287 0,0295 89,80 3,79
18 80,99 4,47 0,5032 0,0387 80,96 6,29
19 88,11 16,61 0,5821 0,0287 95,18 4,77
20 73,08 7,00 0,5749 0,0305 90,92 6,47
21 80,68 3,70 0,6267 0,0415 94,75 5,98
22 84,49 3,83 0,6492 0,0444 95,21 3,40
23 84,88 2,15 0,5586 0,0378 91,74 7,99
24 87,44 4,55 0,6846 0,0321 92,87 5,18
25 93,08 3,04 0,6830 0,0424 83,76 4,02
26 80,78 2,20 0,6604 0,0434 80,63 4,15
27 70,20 2,74 0,6112 0,0535 90,79 3,94
28 75,41 1,22 0,6704 0,0507 89,77 4,93
29 79,31 3,68 0,6421 0,0512 90,04 5,71
30 82,20 1,84 0,6802 0,0381 82,43 5,44
31 70,03 2,55 0,6226 0,0315 102,20 4,77
32 67,82 1,78 0,5767 0,0336 56,79 2,69
33 69,36 2,97 0,6584 0,0335 81,73 4,03
34 81,90 2,64 0,6329 0,0229 85,08 3,14
35 61,37 2,21 0,6283 0,0355 77,51 4,29
36 75,83 4,37 0,7349 0,0527 86,48 5,21
37 68,90 4,28 0,6842 0,0382 69,43 7,58
38 70,79 2,39 0,6051 0,0204 79,73 4,34
39 72,95 3,39 0,6028 0,0371 81,70 4,88
40 69,18 2,62 0,6304 0,0290 76,90 5,35
41 73,43 2,52 0,3954 0, 0275 69,78 2,30
42 64,75 3,79 0,5574 0,0271 67,97 3,08
43 71,74 4,13 0,6114 0,0310 65,64 3,13
44 79,96 1,72 0,7042 0,0375 73,80 3,94
5. RESULTADOS Y DISCUSIONES
"9
45 80,10 2,56 0,6971 0,0294 88,11 4,21
46 86,39 3,19 0,6808 0,0361 75,32 6,75
47 88,73 2,67 0,7053 0,0397 88,13 2,51
48 74,19 3,07 0,6986 0,0453 76,10 5,60
49 81,54 2,51 0,5769 0,0386 70,96 1,54
50 80,11 3,37 0,5240 0,0294 68,09 2,90
51 72,47 1,79 0,5849 0,0299 65,83 2,21
52 89,03 2,77 0,6395 0,0367 76,90 3,12
53 86,67 2,54 0,6016 0,0282 77,89 3,44
54 80,56 2,33 0,5010 0,0245 76,23 2,02
55 80,12 1,39 0,5851 0,0336 82,67 3,86
56 90,04 2,43 0,5758 0,0340 85,88 2,60
57 73,98 2,84 0,4451 0,0211 72,20 2,51
58 89,95 2,73 0,6132 0,0429 91,04 5,82
59 89,89 1,79 0,6249 0,0086 80,68 3,04
60 91,63 2,66 0,6077 0,0376 75,32 4,73
61 83,62 1,67 0,6217 0,0337 83,72 3,83
62 84,29 2,95 0,6145 0,0299 81,22 2,93
63 87,19 3,94 0,6463 0,0247 74,32 3,82
64 84,99 2,68 0,6050 0,0397 71,64 4,34
65 83,19 2,04 0,5766 0,0188 78,71 3,30
66 83,77 2,50 0,6194 0,0310 90,95 5,81
67 87,12 3,00 0,8640 0,0192 82,89 2,67
68 75,18 2,03 0,6395 0,0367 84,38 4,44
69 87,82 2,80 0,9075 0,0297 82,40 1,97
Se ajustaron los modelos de superficie de respuesta (RSM) para las tres variables
(actividad antioxidante DPPH, actividad antioxidante FRAP e ndice de polifenoles
Folin-Ciocalteu).
El software estadstico MINITAB 16 se utiliz para ajustar un modelo de
segundo orden a las variables independientes, utilizando la siguiente ecuacin:
=
<
=
+ + + + =
k
i
j i
i j
j i ij i ii
k
i
i i
e x x b x b x b b y
1
2
1
0
Donde:
y = variable dependiente a modelizar (variable respuesta: actividad antioxidante DPPH,
actividad antioxidante FRAP o polifenoles totales Folin-Ciocalteu).
x
i
y x
j
=variables independientes (factores).
b
0
, b
i
, b
ii,
b
ij
= coeficientes de regresin.
e = error.
5. RESULTADOS Y DISCUSIONES
!&
En la siguiente tabla se expresan los resultados finales de cada prueba para su
contenido en fenoles totales y actividad antioxidante.
&.1.2 An@lisis de "e!"esin
El anlisis de la varianza para los modelos obtenidos de las tres variables
respuesta (TPC, DPPH y FRAP) bajo diferentes condiciones del tratamiento est
presentada en la tabla 5.10.
Tabla 5.10. Coeficientes de regresin, R
2
y p-valores de las tres variables respuesta
Trmino
TPC DPPH FRAP
Coeficiente p-valor Coeficiente p-valor Coeficiente p-valor
Promedio
78,1181 0,9936 0,6282 0,000 79,2657 0,9246
A:Temperatura
0,0084 0,4111 0,023266 0,077 -0,1548 0,0389
B:Tiempo
-0,8595 0,8328 -0,015779 0,227 -3,4449 0,6020
C: Intensidad
-0,2201 0,0681 0,025282 0,055 0,8547 0,4685
AA
1,7893 0,9410 0,020126 0,098 1,1024 0,1125
AB
0,8489 0,5080 -0,004440 0,712 0,5667 0,9599
AC
0,1099 0,3814 0,002796 0,816 -0,1127 0,7089
BB
-0,1008 0,4532 0,023029 0,178 3,4317 0,6992
BC
0,9033 0,9094 0,010304 0,544 -0,1075 0,9408
CC
1,0242 0,0003 0,038554 0,026 -0,8267 0,5408
R
2
7,33 0,855 24,36 0,043 12,32 0,514
Analizando los resultados de la tabla, los valores de R
2
indican que los modelos
de superficie respuesta obtenidos para los tres variables respuesta (TPC, DPPH y
FRAP) explican el bajo porcentaje de la variabilidad de los datos. Sin embargo aunque
estos valores de R
2
son bajos, se observa que en el ajuste encontrado para el mtodo
DPPH presenta una cierta significatividad.
A continuacin se exponen las grficas de las superficies de respuesta obtenidas
para cada una de las variables respuesta. En cada una de las grficas cada variable viene
representada frente a dos de las condiciones del tratamiento. Las unidades de las
condiciones de tratamiento en las grficas estn codificadas segn se explica en la tabla
5.7
5. RESULTADOS Y DISCUSIONES
!1
)PC
Figura 5.6. TPC frente a temperatura y tiempo
Figura 5.7. TPC frente a temperatura e intensidad
60
70
80
-2
0
60
70
80
90 90
-2
2
2
0
2
TPC (Folin) (mg A.G./g m.s.)
Temperatura
Tiempo
Grfica de superficie de TPC (Folin) vs. Temperatura; Tiempo
-2
0
60
70
80
90
-2
2
2
0
TPC (Folin) (mg A.G./ g m.s.)
Temperatura
Intensidad
Grfica de superficie de TPC (Folin) vs. Temperatura; Intensidad
5. RESULTADOS Y DISCUSIONES
!2
Figura 5.8. TPC frente a tiempo e intensidad
En general no observamos una clara tendencia en los valores de TPC para
ninguna de las combinaciones de los factores. Cuando se enfrentan tiempo con
intensidad (Figura 5.8), se obtiene que conforme aumenta el tiempo a una intensidad
media (valor 0), la cantidad total de polifenoles disminuye gradualmente. Sin embargo
al mximo de intensidad de ultrasonido conforme aumenta el tiempo se obtiene mayor
cantidad de polifenoles. Aunque no se observa claramente parece que los valores de
TPC tienden a aumentar con la intensidad y el tiempo de extraccin.
Al contrastar el tiempo con la temperatura (Figura 5.6) se obtiene que a una
temperatura media, 30 C, conforme aumenta el tiempo la cantidad de polifenoles
disminuye, pero para las dems temperaturas en general a mayor temperatura y mayor
tiempo este dato va incrementando.
70
80
-2
0
60
70
80
90 90
-2
2
2
0
TPC (Folin) (mg A.G./ g m.s.)
Tiempo
Intensidad
Grfica de superficie de TPC (Folin) vs. Tiempo; Intensidad
5. RESULTADOS Y DISCUSIONES
!3
*PP5
Figura 5.9. DPPH frente a temperatura y tiempo
Figura 5.10. DPPH frente a temperatura e intensidad
-2
0
0,4
0,6
0,8
-2
2
2
0
PP! (m"ol Trolo#/ g m.s.)
Temperatura
Tiempo
Grfica de superficie de PP! vs. Temperatura; Tiempo
-2
0
0,4
0,6
0,8
-2
2
2
0
PP! (m"ol Trolo#/ g m.s.)
Temperatura
Intensidad
Grfica de superficie de PP! vs. Temperatura; Intensidad
5. RESULTADOS Y DISCUSIONES
!4
Figura 5.11. DPPH frente a tiempo e intensidad
Las grficas de las superficies respuesta para el mtodo DPPH son bastante
claras, ya que muestran una tendencia general a que el aumento de las condiciones del
tratamiento produce un aumento en la actividad antioxidante. En las tres grficas el
punto de mxima actividad se encuentra cuando el tratamiento se realiza a mxima
temperatura de extraccin. Sin embargo tanto el tiempo de extraccin como en
intensidad de ultrasonido, los valores mximos se dan en el punto medio, aunque a
valores mximos de intensidad tambin producen buenos resultados.
0,4
0,6
-2
0
0,4
0,6
0,8 0,8
-2
2
2
0
PP! (m"ol Trolo#/ g m.s.)
Tiempo
Intensidad
Grfica de superficie de PP! vs. Tiempo; Intensidad
5. RESULTADOS Y DISCUSIONES
!5
F,AP
Figura 5.12. FRAP frente a temperatura y tiempo
Figura 5.13. FRAP frente a temperatura e intensidad
50
75
-2
0
100
-2
2
0
2
F$AP (mg Fe%& / g m.s.)
Temperatura
Tiempo
Grfica de superficie de F$AP vs. Temperatura; Tiempo
50
75
-2
0
50
75
100 100
-2
2
2
0
2
F$AP (mg Fe%& / g m.s.)
Temperatura
Intensidad
Grfica de superficie de F$AP vs. Temperatura; Intensidad
5. RESULTADOS Y DISCUSIONES
!6
Figura 5.14. FRAP frene a tiempo e intensidad
Para el mtodo de anlisis FRAP, los datos que se obtienen son bastante
inconcluyentes, ya que las grficas de superficie respuesta de las pruebas no muestran
picos marcados. De las tres variables, la que a primera vista influye en mayor medida es
la intensidad de ultrasonido (Figura 5.13 y 5.14), ya que a valores mximos de este
parmetro es cuando se obtienen los valores mximos de actividad antioxidante.
&.1.3 Optimi7acin de las condiciones de e%t"accin
Una vez obtenidas los resultados del modelo de superficie de respuesta, se
procede a optimizar la respuesta final maximizando los resultados de los tres parmetros
a analizar, dando evidentemente mayor importancia en el anlisis estadstico en este
estudio a la actividad antioxidante mediante el mtodo DPPH, puesto que en el estudio
de regresin realizado anteriormente fue el nico que present significatividad.
As pues, el resultado obtenido nos indica que las mejores condiciones de
extraccin slido-lquida asistida por ultrasonidos son las siguientes
50
75
-2
0
50
75
100 100
-2
2
2
0
2
F$AP (mg Fe%& / g m.s.)
Tiempo
Intensidad
Grfica de superficie de F$AP vs. Tiempo; Intensidad
5. RESULTADOS Y DISCUSIONES
!"
Tabla 5.11. Solucin global de la optimizacin de respuesta
PARMETRO
VALORES
CODIFICADOS
VALORES SIN
CODIFICAR
Temperatura de extraccin 1,68179 50 C
Tiempo de extraccin 1,68179 50 minutos
Intensidad de ultrasonido 1,68179 100 %
Teniendo en cuenta las condiciones ptimas para la extraccin slido-lquida
asistida por ultrasonidos, las respuestas pronosticadas para cada una de las variables
seran las siguientes:
TPC = 89,2560 mg AG/g materia seca
DPPH = 89,2560 mmol Trolox/g materia seca
FRAP = 90,7915 mg Fe
2+
/g materia seca
Casazza, Aliakbarian et al. (2012), realizan una extraccin slido-lquida asistida
por ultrasonidos (60 W) usando metanol como solvente a 25 C durante 60 minutos, y
en el que obtiene valores mximos de 55,98 mg AG/g, se comprueba que utilizando las
condiciones optimizadas antes pronosticadas, se obtendra una cantidad muy superior
(89,256 mg AG/g)a la obtenida en el estudio de Casazza. Una explicacin posible
podra ser que en el artculo la intensidad del ultrasonido es hasta cuatro veces menor
que la usada en el nuestro, y al fin y al cabo es un factor determinante en la extraccin.
Ghafoor, Hui et al. en 2009, hicieron un trabajo que planteaba objetivos
similares al aqu descrito. En este trabajo se pretendi optimizar las condiciones de
extraccin slido-lquida asistida por ultrasonido por medio de la metodologa de
superficie de respuesta para conseguir maximizar la obtencin de antocianos en pieles
de uva. Los parmetros a optimizar fueron temperatura y tiempo de extraccin, y la
concentracin de metanol. En este estudi se obtuvo que los mejores rendimientos eran
a tiempo de extraccin = 25,58 minutos, y temperatura = 50,65 C. Estos resultados
concuerdan con los de este estudio ya que la temperatura es prcticamente la misma, y
el tiempo, aunque es menor, tambin es verdad que en el estudio de Ghafoor, Hui et al,
no hacan extracciones ms extensas de 25 minutos. Por lo que en ambos estudios se
obtiene que tras realizar una superficie de respuesta, las condiciones ptimas eran las
mximas propuestas para cada trabajo. El hecho de que el tiempo de extraccin ptimo
en el estudio de Ghafoor sea inferior al nuestro puede ser debido a la mayor
extractabilidad de los antocianos de las pieles y al hecho de la utilizacin de metanol
como solvente.
6. CONCLUSIONES
!!
!. CONCLUSIONES
1. Tras realizar la verificacin de los mtodos de anlisis de cantidad de polifenoles
totales y actividad antioxidante, se determina que, atendiendo a su repetitividad
y linealidad, nos permitirn obtener unos resultados fiables.
2. Analizando los resultados de la ANOVA realizada para la extraccin slido-
lquida dependiendo del pretratamiento de secado usado en la muestra, se
obtiene que para observar diferencias significativas entre los pretratamientos
para el contenido en polifenoles es necesario alcanzar una temperatura de 50C.
3. Durante la extraccin slido-lquido de las muestras se observ que conforme
aumentaba la temperatura del tratamiento, se aumentaba los valores de
polifenoles totales y actividad antioxidante. Fue notable que hubo un aumento
considerable del rendimiento cuando se pasa de 40 a 50 C en la extraccin
slido-lquida, tanto cuando las muestras se haban tratado con secado por
liofilizacin o por estufa a vaco.
4. De forma general analizando la actividad antioxidante se confirm que los
mayores valores se obtenan conforme aumentaba la temperatura de extraccin,
y que al comparar los mtodos de secado previos, resultaba mejor actividad
antioxidante cuando las semillas de uva se secaban mediante liofilizacin.
5. Haciendo una comparacin global de la extraccin slido-lquida teniendo en
cuenta la cantidad de fenoles totales y la actividad antioxidante, se concluy que
los mejores valores se obtenan tras secar la muestra con un proceso de
liofilizacin y una posterior extraccin a una temperatura de 50 C
6. En la optimizacin de las condiciones de extraccin slido-lquida asistida por
ultrasonidos, el parmetro que mejor responde al anlisis estadstico es el DPPH,
por lo que ste ser el parmetro ms indicado a seguir para futuros estudios, ya
que es el que presenta un mejor ajuste al modelo.
7. La conclusin general que se obtiene de la optimizacin de las condiciones de la
extraccin slido-lquida asistida por ultrasonidos, es que los mejores
rendimientos se produjeron cuando los valores de las condiciones fueron
mximas (50 C, 50 minutos, 100 % intensidad ultrasonido
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8. ANEJOS
9!
#. ANEJOS
ANE=O 1
A continuacin vienen expuestas las grficas de control de temperatura de la
muestra en la extraccin slido-lquida asistida por ultrasonidos. Cada una de las
grficas es un ejemplo de cada una de las diferentes temperaturas
Grfica 8.1. Control de temperatura a 10 C
Grfica 8.2. Control de temperatura a 18 C
0
2
4
6
8
10
12
14
0 5 10 15 20 25 30
T
e
m
p
e
a
r
t
u
r
a
(
C
)
Tiempo (minutos)
Control a 10 C
0
5
10
15
20
0 10 20 30 40
T
e
m
p
e
r
a
t
u
r
a
(
C
)
Tiempo (minutos)
Control a 18 C
8. ANEJOS
99
Grfica 8.3. Control de temperatura a 30 C
Grfica 8.4. Control de temperatura a 42 C
Grfica 8.5. Control de temperatura a 50 C
0
5
10
15
20
25
30
35
0 5 10 15 20 25 30
T
e
m
p
e
r
a
t
u
r
a
(
C
)
Tiempo (minutos)
Control a 30 C
0
10
20
30
40
50
0 10 20 30 40
T
e
m
p
e
r
a
t
u
r
a
(
C
)
Tiempo (minutos)
Control a 42 C
0
10
20
30
40
50
60
0 5 10 15 20 25 30
T
e
m
p
e
r
a
t
u
r
a
(
C
)
Tiempo (minutos)
Control a 50 C