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PRCTICA

CURVA DE CRECIMIENTO

I.

INTRODUCCIN Los cultivos bacterianos actan como suspensiones coloidales, absorbiendo y reflejando la luz que incide sobre ellos. La turbidimetra mide la entidad de luz transmitida por la suspensin, mientras que la medida de la luz difractada recibe el nombre de nefelometra. Por estos procedimientos se puede estimar el nmero de bacterias en el cultivo, ya que, dentro de un rango, la luz absorbida o difractada por una suspensin bacteriana es directamente proporcional a la concentracin de clulas en el cultivo. El espectrofotmetro es el aparato que se utiliza para la medida de la luz transmitida. Este aparato proporciona luz monocromtica por medio de un filtro que permite slo el paso de la longitud de onda elegida. La cantidad de luz transmitida por una suspensin bacteriana es medida por una clula fotoelctrica e inversamente proporcional a la cantidad de bacterias. Normalmente la multiplicacin bacteriana no se expresa como disminucin de la luz transmitida (transmitancia), sino como aumento de la luz absorbida (absorbancia), ya que esta ltima es directamente proporcional al nmero de bacterias presentes en la suspensin. La relacin entre la transmitancia y la absorbancia se expresa matemticamente de la siguiente manera: Absorbancia = 2 - log % de transmitancia Para la medida de la luz difractada se emplea e! nefelmetro. Para el manejo prctico de los cultivos bacterianos en estudios de turbimetria es muy til el uso de matraces con brazo lateral, ya que permite la realizacin de medidas sin necesidad de tomar muestras del cultivo, evitando as el riesgo de contaminacin por la manipulacin.

II.

OBJETIVOS 1) Determinar los principios generales en un crecimiento microbiano. 2) Realizar una curva de multiplicacin bacteriana.

Prctica 9: Curva de crecimiento


III. FUNDAMENTO TERICO Durante el crecimiento celular, todos los constituyentes de la clula aumentan en cantidad, en la mayora de organismos el crecimiento continuo hasta que la clula se divide en dos nuevas clulas, proceso denominado fisin binaria. Cada una de las clulas hijas recibe, un cromosoma completo, copias de todas las macromolculas, monmeros e iones inorgnicos. El intervalo para la formacin de dos clulas a partir de una se llama generacin y el tiempo requerido para que esto ocurra se llama tiempo de generacin o tiempo de duplicacin,na entre los microorganismos, algunos crecen rpidamente y se dividen en solo 20 a 30 minutos, otros requieren de una a tres horas, otros de varias horas o incluso das. 3.1. CURVA DE CRECIMIENTO Si se inocula un medio liquido con clulas microbianas, procedentes de un cultivo que ha crecido a saturacin, en el que se ha determinado el nmero de clulas variables por minuto peridicamente y trazamos una grfica de ello, se obtiene una curva de crecimiento. Esta curva se divide en cuatro fases fundamentalmente y son las siguientes: 1. Fase de Rezago.- Llamado fase de adaptacin, los microorganismos se encuentran desprovistos de metabolitos, enzimas y otros constituyentes que deben ser sintetizados hasta alcanzar concentraciones que permitan que el crecimiento se reinicie. 2. Fase Exponencial.- Llamada fase logartmica, es consecuencia de la divisin celular y las nuevas clulas crecen en progresin geomtrica, se sintetiza nuevo material celular a velocidad constante aumentando la masa en forma exponencial. 3. Fase Estacionaria.- Los nutrimentos se agotan y se acumulan productos metablicos txicos. Aqu cesa el crecimiento de una poblacin. 4. Fase de Declinacin.- Llamada fase de muerte celular en el cultivo, varia con el microorganismo y condiciones de cultivo, la velocidad de mortalidad aumenta hasta alcanzar un nivel sostenido.
Fases de Crecimiento
Latencia
Rezago Adaptacin

Exponencial
Logaritmo Divisn celular Crecimiento

Estacionaria
Nutrientes se agotan Acumulan metabolitos txicos Sesa crecimiento

Muerte
Declinacin

9,0

Log 10 organismos viables/ml

8,0

Viables

Turbidez (densidad ptica)

0,75

Densidad ptica

0,5 7,0 0,25

6,0

5,0 Tiempo

0,1

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IV. PARTE EXPERIMENTAL 4.1 MATERIALES Y REACTIVOS - Cubres - Cultivo E. Coli sobre un slant de agar nutritivo - Cubetas - Caldo Luria Bertani estril - Jeringa descartable de 10 cc. - Contmetro Equipo - Mechero Bunsen - Estufa de incubacin a 37C - Microscopio - Espectrofotmetro V. METODOLOGIA 5.1. CRECIMIENTO EN MEDIO LQUIDO Curva de Crecimiento.- Las clulas que estn creciendo en un cultivo discontinuo (en un matraz en agitacin) normalmente experimentan cuatro diferentes estadios de crecimiento: una fase de latencia (lag), una fase de crecimiento estacionado, y una fase de muerte. Las clulas en fase de latencia, que proceden de una alcuota de un cultivo anterior que ha sido transferida a un medio nuevo, no crecen en seguida. Primero tienen que adaptarse al nuevo medio antes de comenzar a crecer a un ritmo rpido. La duracin de esta fase de latencia depende de numerosos factores: la edad y genotipo del inculo, de la temperatura, de la concentracin en nutrientes del cultivo viejo y nuevo, de la aireacin, y de la concentracin de toxinas que pueden haberse formado en el cultivo viejo. Una vez que las clulas empiezan a crecer rpidamente, se dice que han entrado en la fase de crecimiento logartmica (log) o exponencial. En este estadio las clulas crecen rpidamente, y a diferencia de las clulas de las fases de latencia y estacionaria, la mayora de las clulas se hallan en el mismo estado fisiolgico. La velocidad de crecimiento durante la fase log depende del nivel de nutrientes y de la aireacin de cultivo. La constante de velocidad de crecimiento (u) sirve para definir la velocidad de crecimiento de un cultivo durante un crecimiento equilibrado: u = In2/g (g es el tiempo medio de duplicacin o tiempo de generacin). Conforme se consumen los nutrientes en un crecimiento discontinuo y se van acumulando productos inhibitorios, la velocidad de crecimiento va disminuyendo, hasta llegar a detenerse al llegar el cultivo a la fase estacionaria. En la fase estacionaria las clulas no estn todas en el mismo estado fisiolgico; algunas todava se estn dividiendo mientras que otras ya han comenzado a morirse. Pero la poblacin total se mantiene constante. Conforme se agota la mayor parte de

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los nutrientes, el nmero de clulas que mueren sobrepasa al nmero de clulas que se producen, y el cultivo entra en la fase de muerte. Realizacin (Fig. 1) (Todas las maniobras que se describen a continuacin se deben realizar en condiciones de esterilidad en las proximidades del mechero.) 1. Aadir solucin salina estril al slant de E. coli hasta cubrirlo completamente (entre 2 y 3 mi) y resuspender las bacterias en la solucin salina por agitacin. 2. Tomar 0.5 ml de la suspensin bacteriana con una pipeta estril y aadirlos a un matraz con 50 ml de Caldo Luria Bertani estril. 3. Incubar el matraz en un bao termostatado a 37 C, con agitacin (200 rpm). 4. Medir la absorbancia del cultivo a distintos tiempos (longitud de onda aconsejada: (540 nm). Ajustar el espectrofotmetro a 100 % de transmitancia con un tubo conteniendo Caldo Luria Bertani estril antes de cada medida. 5. Recoger alcuotas de 9 ml del cultivo cada 15 minutos de incubacin y colocadas en refrigeracin hasta su lectura 6. Dibujar una curva de multiplicacin con los datos obtenidos, colocando en el eje de abscisas los valores de tiempo y en el de ordenadas los de absorbancia.

Prctica 9: Curva de crecimiento

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VI. RESULTADOS

Tabla N.1: Recopilacin de Datos Muestra 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Tiempo 0 15 30 45 60 75 90 105 120 135 150 165 180 195 210 Absorvancia 0.075 0.082 0.095 0.108 0.126 0.196 0.280 0.344 0.390 0.461 0.428 0.434 0.432 0.440 0.452

Grafica 1: Absorvancia vs. Rango de tiempo


0.500 0.450 0.400 0.350

ABSORVANCIA

0.300

0.250
0.200 0.150 0.100 0.050 0.000 0 50 100 TIEMPO (MIN) 150 200 250

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VII. OBSERVACIONES

Cuanto mayor pasaba el tiempo, se observaba que el cultivo tena mayor turbidez

En la grfica se puede distinguir, las fases de crecimiento de la Escherichia Coli

Grafica 2: Fases de crecimiento de la E. Coli


0.500 0.450 0.400 0.350

Absorvancia

0.300 0.250

FASE EXPONENCIAL

FASE ESTACIONARIA

0.200
0.150 0.100 0.050 0.000 0 50 100 Tiempo (min) 150 200 250

FASE LAG

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CUESTIONARIO:
1. Por qu se calibra el espectrofotmetro a 100% de transmitancia con medio de cultivo estril? Porque con este medio sin inoculo la muestra no presenta turbidez y es transparente lo que determina un estado inicial donde la luz emitida no es absorbida por la muestra, sino nicamente por el medio Cuando el medio no contiene aun al microorganismo se considera un estado cero, por tanto al calibrar el espectrofotmetro con el medio nicamente, los valores de absorbancia registrados solo considerar a los microorganismos 2. Por qu motivo puede ser de alguna forma til conocer la curva de multiplicacin de una bacteria? Para conocer los tiempos en que dura cada una de las etapas del crecimiento de un microorganismo, reconocer los periodos de Acostumbramiento, de crecimiento, estacionario y el periodo de muerte; para nuestro caso solo se puede identificar las fases de acostumbramiento y de crecimiento Estos datos se pueden utilizar en el control de un anlisis de este mismo microorganismo, ya sea de control de crecimiento para aprovechar su velocidad de multiplicacin, o tambin para conocer la velocidad de infeccin que puede producir 3. Identificar en la grfica las fases del desarrollo microbiano.

Grafica 3: Fases de crecimiento de la E. Coli


0.500 0.450 0.400 0.350

Absorvancia

0.300 0.250 0.200 0.150 0.100 0.050 0.000 0

FASE EXPONENCIAL

FASE ESTACIONARIA

FASE LAG

50

100 Tiempo (min)

150

200

250

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VIII. CONCLUSIONES

Se realiz la curva Absorbancia vs tiempo identificando las etapas de crecimiento microbiano de la E. Coli. La Absorbancia mide la turbidez en que tiene el cultivo, la turbidez indica la cantidad de microorganismos presentes.

IX.

BIBLIOGRAFA

CRECIMIENTO BACTERIANO - Benintende, Silvia y Sanchez, Cecilia Ctedra Microbiologa Agrcola REPRODUCCIN Y CRECIMIENTO MICROBIANO Universidad Central de Venezuela MICROBIOLOGIA INUSTRIAL Dictado de clases Ing. Marcia Quequezana