GUIA DE BIOQUIMICA

1 BIOQUIMICA ESTRUCTURAL
a. Lpidos i. Definicin. Los lpidos, son un grupo de compuestos qumicamente diversos, solubles en solventes orgnicos (como cloroformo, metanol o benceno), y casi insolubles en agua. La mayora de los organismos, los utilizan como reservorios de molculas fcilmente utilizables para producir energa (aceites y grasas). Entre los lpidos tambin se encuentran cofactores de enzimas, acarreadores de electrones, pigmentos que absorben luz, agentes emulsificantes, algunas vitaminas y ormonas, mensa!eros intracelulares y todos los componentes no protecos de las membranas celulares. Los lpidos desempe"an importantes funciones en los seres vivos. Estas son, entre otras, las siguientes# estructural, energtica, protectora, tranportadora, reguladora del metabolismo, y reguladora de la temperatura. E$isten lipidos saponificables (acidos grasos, acilgliceridos, ceras y fosfolipidos) y no saponificables(esteroides). Los saponificables se idrolizan en soluciones alcalinas produciendo steres de cidos grasos. Los no saponificables no sufren idr%lisis alcalina y a este grupo pertenecen los terpenos, esteroides y prostaglandinas y todos los compuestos relacionados. &dems de los anteriores, e$isten lpidos anfipticos en cuya molcula e$iste una regi%n polar opuesta a otra apolar. Estos lpidos forman las bicapas lipdicas de las membranas celulares y estabilizan las emulsiones. ii. Composicin es!"#c!#"a de $os $pidos de "ese"%a de $os $pidos fo"mado"es de mem&"anas. Lpidos de reserva energtica (acilgliceridos) Los acilgliceridos son steres de la glicerina y de cidos grasos.

'i un cido graso esterifica uno de los grupos alco ol de la glicerina tendremos un monoaci$'$ic("ido, si son dos, undiaci$'$ic("ido, y si son tres, un !"iaci$'$ic("ido, !"i'$ic("ido, tambin llamados# '"asas ne#!"as. Los acilglicridos saponifican dando correspondientes !abones y glicerina. los

Lpidos formadores de membranas (fosfolipidos) 'on lpidos que forman parte de las membranas celulares. (erivan de la glicerina o de la esfingosina, un alco ol ms comple!o. Los derivados de la glicerina se llaman fosfo'$ic("idos y los que derivan de la esfingosina# esfin'o$pidos. (ebido a que son compuestos anfipaticos (parte polar )* del grupo +))* de los acidos grasos y parte no polar cadena idrocarbonada de los acidos grasos) desempe"an un papel estructural de gran importancia en los seres vivos pues constituyen las membranas celulares. ,stas estn formadas por una doble capa de fosfolpidos en la que estn integrados otros lpidos (colesterol, por e!emplo) y protenas. En el caso de la membrana plasmtica ay tambin oligosacridos. 1) *osfo'$ice"idos +$pidos con acido fosf"ico) -umicamente podemos definirlos como steres del cido fosfatdico y un compuesto polar, generalmente un aminoalco ol. El cido fosfatdico es, a su vez, un ster de un diacilglicrido y del cido fosf%rico. El alco ol es siempre una sustancia polar, soluble en agua, muy variada qumicamente (aminocido, base nitrogenada, etc). +omo e!emplo de fosfoglicrido podemos ver en la Fig.12 la estructura de la lecitina (fosfatidilcolina).

,) Esfin'o$ipidos 'u estructura molecular deriva de la uni%n del alco ol esfingosina y una sustancia polar que puede ser un aminoalco ol o un gl.cido. El ms conocido es la esfin'omie$ina.

iii. Es!e"o$es 'on lpidos no saponificables derivados del ciclo del esterano (ciclopentanoper idrofenantreno). /uc as sustancias importantes en los seres vivos son esteroides o derivados de esteroides. 0or e!emplo# el colesterol, los cidos biliares, las ormonas se$uales, las ormonas de la corteza suprarrenal, muc os alcaloides, etc. 0oseen de 12 a 13 tomos de carbono. El ciclopentanoper idrofenantreno o esterano, es una molcula de 42 carbonos formada por tres anillos e$agonales y uno pentagonal. En los esteroles, se a"ade una cadena lateral de 5 o ms tomos de carbono en el carbono 42 y un grupo alco ol o idro$ilo (6)*) en el carbono 7.

/olcula de esterano o ciclopentano6per idro6fenantreno

E!emplos de esteroides

i%. Te"penos. 'e encuentran en la mayora de los organismos, pero constituyen el grupo ms abundante de los aceites vegetales, de ec o son los responsables de los aromas y sabores especficos de las plantas, mientras mayor sea la cantidad de o$geno en la molcula, mayor ser su aroma. Estos compuestos, se forman a partir del isopreno (unidad de 8 tomos de carbono)9 pueden contener desde una asta oc o unidades.

Las unidades pueden arreglarse linealmente (como en el escualeno) o cclicamente (como en la limonina). (entro de los terpenos se clasifica a los carotenoides que son tetraterpenos muy importantes en los mamferos, especialmente el 6caroteno que es precursor de la vitamina & (446cis6retinal). :ambin las vitaminas liposolubles ( (colecalciferol) y ; son consideradas como terpenos.

&) Ca"&o-id"a!os Los idratos de carbono son una familia de sustancias ampliamente difundidas que se caracterizan por obedecer a la f%rmula emprica +n*1n)n +n(*1))n 0or tanto, estn constituidos por carbono, idr%geno y o$geno. Estas sustancias qumicamente son poli idro$ialde idos o poli idro$icetonas constituidas por una o ms unidades fundamentales (monosacridos). 'e an dividido en los siguientes grupos# mono y disacridos, oligosacridos, polisacridos y otros.

i. Es!"#c!#"a .#mica de $os monosac/"idos Los monosacridos son los azucares mas sencillos, pues no pueden descomponerse por idr%lisis para dar lugar a otros azucares mas simples. La estructura bsica de todos los monosacridos es una cadena de atomos de carbono no ramificada en la que todos ellos estn unidos por enlaces simples. <no de estos atomos de carbono esta unido a uno de o$igeno por un enlace doble formando un grupo carbonilo9 todos los dems estn unidos a grupos idro$ilo. 'i el grupo carbonilo se encuentra en un e$tremo de la cadena carbonada el monosacarido es un alde do y recibe el nombre de aldosa9 si el grupo carbonilo se encuentra en cualquier otra posici%n el monosacarido es una cetona y recibe el nombre de cetosa.

Los monosacridos naturales tienen entre 7 y 5 atomos de carbono, aunque los 2 y 5 son relativamente raros. 'eg.n tengan 7,=, 8, >, 2 u 5 carbonos se denominan respectivamente triosas, tetrosas, pentosas, e$osas, etc. &ldosas

El tomo central del gliceralde ido es %pticamente asimtrico y da lugar a dos is%meros, el ( y el L. La nomenclatura ( % L ace referencia a la configuraci%n absoluta seg.n la convenci%n de ?isc er, y o a las propiedades de rotaci%n de la luz de la sustancia. :odas las aldosas se consideran derivadas del gliceralde ido, asumiendo que se van insertando nuevos tomos de carbono entre las posiciones 4 y 1 de la cadena (contando desde el carbonilo). Este nuevo tomo insertado es asimtrico, por lo que se genera un nuevo centro %ptico con cada inserci%n. +ada uno de los compuestos generados recibe su nombre convencional. Las aldosas generadas a partir del D0 '$ice"a$de-ido se muestran a continuaci%n#

(ese cuenta que la configuraci%n del pen.ltimo carbono permanece inalterada respecto al ( gliceralde ido. El L6gliceralde ido genera la serie L de aldosas. +ada (6aldosa encuentra su enanti%mero (imagen especular) en la familia de las L6aldosas y viceversa. La configuraci%n de las L6aldosas se deduce trivialmente de la figura anterior.

+etosas (e la misma forma que las aldosas, las cetosas se pueden considerar derivadas de la di idro$icetona. 'in embargo, la di idro$icetona no presenta centro quiral, por lo que el n.mero de cetosas posibles se reduce a la mitad como se puede observar en la figura siguiente.

ii. E$ en$ace '$icosdico Los monosacridos capaces de formar anillos de piranosa o furanosa, en tanto que emiacetales intramoleculares pueden reaccionar con los alco oles para formar gluc%sidos liberndose en el proceso una molecula de agua. <n caso particular de esta reaccion se da cuando el grupo idro$ilo de la molecula de alco ol es aportado por un

segundo monosacarido. El compuesto resultante, un disacrido, estar formado por dos monosacridos unidos por un enlace glucosidico.

&si pues, el enlace glucosidico resulta de la formaci%n de un acetal (o cetal) entre el carbono carbonlico de un monosacarido y un grupo idro$ilo de otro monosacarido. Este segundo monosacarido posee un carbono carbonilico libre que a su vez puede raccionar con un grupo idro$ilo de un tercer monosacarido para formar otro enlace glucosidico, y asi sucesivamente. El enlace glucosidico puede ser de dos tipos, @ o A, seg.n sea @ o A la configuraci%n del monosacarido que aporta al enlace el atomo de carbono carbonilo. 0or otra parte, se distinguen enlaces glucosidicos monocarbonilicos, en los que solo esta implicado el carbono carbonilo de un monosacarido, y enlaces glucosidicos dicarbonilicos, en los que estn implicados los carbonos carbonilos de los dos monosacridos enlazados. B):&# Les de!o el linC de donde obtuve esta informaci%n, est muy bien, a pueden consultar las reacciones que se mencionan. ttp#DDEEE.bionova.org.esDbiocastDdocumentosDtemaF2.pdf iii. Disac/"idos1 ma$!osa2 saca"osa2 e!c.

El n.mero de unidades monosacaridicas que forman parte de un oligosacarido (cadenas peque"as de mon%meros unidos con enlaces glucosidicos) puede oscilar entre 1 y 4F. 'i estn formados solo por dos mon%meros se llaman disacridos. +uando dos monosacridos se unen mediante un enlace glucosidico monocarbonilico el disacrido resultante tendr poder reductor, ya que conserva un carbono carbonilico libre. 0or el contrario, si el enlace es dicarbonilico el disacrido resultante, al

tener sus dos carbonos carbonilicos implicados en el enlace, abr perdido su poder reductor. Los disacridos son los oligosacaridos mas abundantes e importantes biol%gicamente. & continuaci%n se muestra la composici%n de los disacridos mas importantes# 4) 1) 7) =) 8) >) /altosaG glucosa6@ (4H=)6 glucosa IsomaltosaG glucosa6@ (4H>)6glucosa +elobiosaG glucosa6A(4H=)6 glucosa LactosaG galactosa6A(4H=)6 glucosa :re alosaG glucosa6@(4H4)6 glucosa 'acarosaG fructuosa6A(1H4)6 glucosa /altosa La maltosa y la isomaltosa son dos de los productos de la idr%lisis incompleta del almidon y del gluc%geno (dos polisacridos de reserva) durante la digesti%n. +elobiosa Bo se encuentra libre en la naturaleza, se obtiene por idr%lisis de la celulosa (un polisacrido estructural). Lactosa 'e encuentra e$clusivamente en la lec e de los mamferos. :re alosa Es el constituyente principal del fluido circulante ( emolinfa) de los insectos. 'acarosa (az.car de mesa) Es el disacrido de especial importancia, se encuentra e$clusivamente en el mundo vegetal y es uno de los productos directos de la fotosntesis que estos realizan, constituyendo la principal forma de transporte de azucares desde las o!as acia otras partes de la planta.

La maltosa, isomaltosa, celobiosa y lactosa osn azucares reductores, mientras que la tre alosa y sacarosa son no reductores. i%. 3o$isac/"idos1 a$midn2 ce$#$osa2 f"#c!anos. Los polisacridos son carbo idratos formados por un numero elevado de monosacridos unidos entre s mediante enlaces glucosidicos. En el proceso de uni%n de B monosacridos para formar un polisacrido se liberan (B64) molculas de agua, una por cada enlace glucosidico. &unque el limite entre oligosacaridos y polisacridos se puede fi!ar arbitrariamente entre 4F unidades mosacaridicas constituyentes, lo cierto es que la mayora de los polisacridos naturales estn formados por centenares o miles de estas unidades monomericas. 'on macromolculas de elevado peso molecular y estructura comple!a. Las propiedades fsicas y qumicas de los polisacridos son en cierto modo contrarias a las de los monosacridos y oligosacaridos9 no cristalizan, no tienen sabor dulce, carecen de poder reductor9 y aunque son sustancias idrofilicas, son poco solubles en agua debido a su elevado peso molecular. Los distintos tipos de polisacridos difieren entre si en el tipo de unidades monosacaridicas que los forman, el tipo de enlace glucosidico (@ y A) que las une, y en el mayor o menor grado de ramificaci%n que presentan sus cadenas. 'e distinguen dos tipos principales# omopolisacaridos (formados por un solo tipo de monosacridos), y eteropolisacaridos (formados por dos o mas tipos de monosacridos). Los polisacridos que presentan enlaces glucosidicos @ tienen funci%n energtica (almidon, gluc%geno y de$tranos), mientras que los que presentan tipo A tienen funci%n estructural (celulosa, $ilanos y otros). &lmid%n Esta formado por molculas de @6(6glucosa unidos por enlaces glucosidicos @(4H=) y @(4H>).

En la molecula de almidon se distinguen dos tipos de polmeros# 4) &milosa# polmero no ramificado formado por largas cadenas de unidades de @6 (6glucosa. 1) &milopectina# 0olimero compuesto por uni%n de unidades de @ glucosa mediante enlaces enlaces 46=, pero ramificado con uniones 46> cada 1F a 18 restos de glucosa. Es la parte ramificada del almid%n.

+elulosa La celulosa es tambin un polmero de glucosa de caractersticas similares a la amilosa del almid%n (la fracci%n no ramificada). 'in embargo, la celulosa es radicalmente diferente de la amilosa en mucas de sus propiedades claves# J Es insoluble, retiene poco agua, so se gelatiniza. J ?orma fibrillas rectas, a diferencia de las espirales que forma la amilosa. J Bo se idroliza con la maltasa. J Bo es digestible por los mamferos.

:odas estas diferencias respecto de la amilosa se deben a un .nico cambio qumico# el an%mero de glucosa que constituye la celulosa est en posici%n beta, a diferencia de lo que ocurre con la amilosa.

Este cambio resulta en una estructura muc o ms compacta del polmero que le permite formar fibrillas estabilizadas por puentes de idr%geno adicionales. La fibrillas, adems pueden agruparse en fibras por enlaces electrostticos intercatenarios, como se muestra a continuaci%n#

?ructanos 'on carbo idratos que estn compuestos en su mayora por fructosa y en menor proporci%n por glucosa. 0oseen enlaces de tipo A fructosil6fructosa y pueden poseer estructuras lineales o ramificadas y diferentes grados de polimerizaci%n, dependiendo de donde fueron e$trados. 'on solubles en agua y son azucares no reductores. En la naturaleza se distinguen principalmente cinco clases estructurales de fructanos# inulina, levana, mezclas de fructanos ramificados, neoseries de inulina y neoseries de levana.

Estructura qumica de fructanos tipo inulina (nG78)

c. Amino/cidos

p"o!enas

i. Los amino/cidos +omo su nombre indica los aminocidos son compuestos que poseen un grupo amino +045,) y un grupo cido +ca"&o6$ico 0COO5) en su estructura. Los aminocidos son los precursores de los pptidos y las protenas, y en ellos el grupo amino y el grupo carbo$ilo, se encuentran unidos al mismo tomo de carbono, conocido como ca"&ono @ (@0amino/cidos). La estructura general de los @6 aminocidos (a e$cepci%n de la prolina, que es cclica) se muestra enseguida#

+omo se puede apreciar, el ca"&ono0@ (a e$cepci%n de la glicina) es un carbono quiral y como tal presenta dos enanti%meros (L6 y (6). Los 1F @6aminocidos presentes en las protenas son de la serie L6 y en su representaci%n de ?isc er poseen el grupo amino acia la izquierda. La diferencia entre los aminocidos viene dada por el resto 0R, o cadena lateral, unida al carbono6@. &tendiendo a la naturaleza del grupo 6K los aaLs pueden clasificarse en# M Beutros o apolares# 'on 5 los aminocidos que se clasifican como poseedores de cadenas laterales no polares. La a$anina2 %a$ina2 $e#cina e iso$e#cina , poseen cadenas laterales de idrocarburos alifticos. La me!ionina posee una cadena lateral de ter ti%lico (C0S0C). La prolina es el .nico aminocido cclico, pues el grupo 6K se cierra sobre el B del grupo @6amino (realmente es un amina secundaria). 0or su parte, la feni$a$anina y el !"ip!fano contienen grupos aromticos.

M 0olares con carga negativa# E$isten dos 6aminocidos cuyo resto polar posee carga negativa a p* fisiol%gico, debida a la presencia de un grupo carbo$ilo (6 +))*) , el /cido '$#!/mico y el /cido asp/"!ico.

M 0olares con carga positiva# :res son los 6aminocidos que poseen restos N K cargados positivamente a p* fisiol%gico. La $isina posee una cadena lateral de butilamonio, la a"'inina presenta un grupo 6K de guanidina y la -is!idina es portadora de un grupo 6K de imidazolio.

M 0olares sin carga# 'iete son los 6aminocidos cuyo resto 6K es polar pero sin carga. La '$icina posee la cadena ms simple, un tomo de idr%geno. La se"ina y la !"eonina son portadores de un grupo idro$ilo (6 O5). La aspa""a'ina y la '$#!amina, poseen cadenas laterales portadoras de un grupo amida, y por idr%lisis dan lugar, respectivamente, a aspartato y glutamato, dos aminocidos con carga negativa. La !i"osina posee un grupo fen%lico y la cis!ena debe su polaridad a la presencia de un grupo ti%lico (6'*).

Esta clasificaci%n se a realizado en base al grupo 6K, pero es importante indicar que a p* fisiol%gico (p* 2,7), el grupo 6amino se encuentra cargado positivamente y el grupo 6carbo$ilo lo est negativamente, por esta raz%n en las ?iguras estos grupos aparecen siempre cargados. (entro del con!unto de los aminocidos naturales, e$isten unos que pueden ser sintetizados por las clulas umanas a partir de otras sustancias, pero tambin ay aminocidos que debemos tomarlos en la dieta, ya que nuestras clulas no pueden sintetizarlos o, cuando menos, no en cantidad suficiente para satisfacer la demanda del organismo9 se conocen con el nombre de amino/cidos esencia$es y son valina, leucina, isoleucina, treonina, metionina, fenilalanina, tript%fano y lisina.

ii. 3"opiedades .#micas de $os dife"en!es !ipos de amino/cidos El p* del medio en el que se encuentre el aminocido es esencial para determinar sus propiedades cido6base, aspecto importante pues de ello dependen las propiedades qumicas y la funcionalidad biol%gica de los pptidos y protenas que forman. Las propiedades cido6base de un aminocido vienen determinadas por los grupos protonables que posea. <n aminocido puede actuar bien como cido o como base (sustancias anf!e"as), pudiendo tener asta tres grupos con carcter cido6base# el 6amino, el 6carbo$ilo y, en algunos casos, el resto 6K. Lo importante es que estos grupos poseen un carcter /cido0&ase d(&i$2 lo que ace que, dependiendo del p*, el correspondiente equilibrio pueda desplazarse en un sentido o en otro ( acia la forma protonada o acia la desprotonada. iii. E$ en$ace pep!dico Los aminocidos se encuentran unidos en los pptidos y las protenas mediante un en$ace amida +0CO0450)#

Este enlace se forma con con la uni%n del grupo carbo$lico de un aminoacido y el grupo amino de otro aminoacido (con perdida de una molecula de agua) y recibe el nombre de en$ace pep!dico. Entre los a"os 437F643=F, 0auling y +orey, mediante el estudio de Kayos O de cristales de aminocidos, dipptidos y triptidos, dilucidaron la estructura tridimensional del enlace peptdico (?igura =). &s, descubrieron que la uni%n +6B del enlace peptdico era ms corta que en la mayor parte de los dems enlaces +6B y llegaron a la conclusi%n de que el enlace deba tener alg.n carcter de doble enlace, por la aparici%n de dos formas resonantes#

Luego dedu!eron que los = tomos que rodeaban al enlace peptdico +6B (), + , +, *) estaban situados en el mismo plano, de tal manera que el o$geno del grupo carbonilo y el idr%geno del B6* estaran en posici%n trans. Esta ordenaci%n es rgida, y es el resultado de la estabilizaci%n por resonancia de las formas anteriormente citadas. 0artiendo de estos dos ec os, puede describirse el armaz%n de una cadena polipeptdica como constituido por una serie de planos, con posibilidad de giro en los +. (e esta forma podemos escribir la estructura de un pptido como una sucesi%n de planos en la que los grupos 6K se van alternando

i%. Sec#encia de amino/cidos de $as p"o!enas. La posici%n que ocupa cada aminocido dentro de la cadena polipeptdica, esto es la secuencia, constituye el primer nivel estructural de las protenas, su estructura primaria. La secuencia de un pptido tiene gran importancia porque entre otras cosas condiciona los siguientes niveles estructurales.

La insulina bovina fue la primera protena que se secuenci% completamente por 'anger en 4387, lo que le vali% el premio Bobel. La determinaci%n de la secuencia de la insulina fue el resultado del traba!o de muc os cientficos durante 4F a"os, desde entonces se an secuenciado miles de protenas. La secuencia de una protena, si conocemos el gen del que proviene, puede obtenerse indirectamente, secuenciando dic o gen. 0ero tambin puede acerse la secuenciaci%n qumica directa. Los pasos a seguir son# (eterminaci%n de la composici%n del pptido por idr%lisis total y posterior anlisis cromatogrfico. (eterminaci%n de los e$tremos +6terminal y B6terminal ?ragmentaci%n por idr%lisis selectiva 'ecuenciaci%n# (egradaci%n de Edman La determinaci%n de la composici%n del pptido se realiza por -id"$isis !o!a$ presencia de *+l >B, calentando a 4FF P+ durante 4F61= , y en tubo al que se le a ec o el vaco. :ras el proceso se utiliza un sistema cromatogrfico que permita separar y determinar cuntos y cules son los aminocidos que forman la cadena. *ay distintos mtodos que permiten determinar el primer aminocido (Kesto 4!e"mina$) o el .ltimo (Kesto C0 !e"mina$) de una cadena polipeptdica. La determinaci%n del resto B6terminal, se puede realizar, entre otros mtodos, mediante la Degradacin de Edman: en este proceso el pptido reacciona con feni$ iso!iociana!o que se une selectivamente al primer aminocido. & continuaci%n se escinde con *? an idro el aminocido marcado, separndolo del resto selectivamente con un disolvente orgnico. :ras un tratamiento en medio cido el compuesto resultante se determina cromatogrficamente.

0or otro lado, la determinaci%n del resto +6 terminal, se puede realizar con Hidracina# este compuesto reacciona con todos los enlaces peptdicos del pptido, provocando la idr%lisis de los mismos y dando lugar a aminoacil6 idracinas con todos los aminocidos e$cepto con el .ltimo (+6 terminal), pudiendo separarse del resto fcilmente y determinarse con posterioridad su naturaleza.

La fragmentaci%n por idr%lisis parcial es necesaria porque por lo general no pueden secuenciarse pptidos con ms de 1F o 7F aminocidos. 'e realiza con reactivos selectivos, en la mayora de los casos se utilizan proteasas, enzimas que idrolizan determinados enlaces peptdicos. La !"ipsina idroliza por la derec a de &rg , Lys La .#imo!"ipsina idroliza por la derec a de 0 e, :rp, :yr La pepsina idroliza por la izquierda de 0 e, :rp, :yr La !e"mo$isina idroliza por la izquierda de Qal, Leu, Ile El &"om#"o de cian'eno +B"C4) idroliza por la derec a de la /et La sec#enciacin. Entre los distintos mtodos e$istentes, podemos citar la degradaci%n de Edman, cuyo fundamento emos visto en la determinaci%n del e$tremo B6terminal. La aplicaci%n continuada de varios ciclos de la degradaci%n de Edman me permite la secuenciaci%n de todo el pptido, siempre que este no tenga ms de 1F o 7F aminocidos. Bo obstante los act.ales requerimientos de secuenciaci%n de gran cantidad de pptidos en poco tiempo, an dado origen al desarrollo de nuevos mtodos de secuenciaci%n, desarrollados principalmente para afrontar proyectos como el del proteoma umano. Entre estos mtodos podemos citar el MALDI MS e$ ESI MS, ambos basados en la espectrometra de masas. d. 3"o!enas Las protenas son biomolculas formadas bsicamente por carbono, idr%geno, o$geno y nitr%geno. 0ueden adems contener azufre y en algunos tipos de protenas, f%sforo, ierro, magnesio y cobre entre otros elementos. 0ueden considerarse polmeros de unas peque"as molculas que reciben el nombre de aminocidos y seran, por tanto, los mon%meros unidad. Los aminocidos estn unidos mediante enlaces peptdicos. La uni%n de un ba!o n.mero de aminocidos da lugar a un pptido9 si el n.mero de aminocidos que forma la molcula no es mayor de 4F, se denomina oligopptido, si es superior a 4F se llama polipptido y si el n.mero es superior a 8F aminocidos se abla ya de protena. 0or tanto, las protenas son cadenas de aminocidos que se pliegan adquiriendo una estructura tridimensional que les permite llevar a cabo miles de funciones. Estn codificadas en el material gentico de cada organismo, donde se especifica su secuencia de aminocidos, y luego son sintetizadas por los ribosomas. :ienen diversas funciones# estructural, enzimtica, ormonal, defensiva, transporte, reserva, reguladoras, contracci%n muscular y funci%n omeosttica.

Estructura de las protenas :odas las protenas poseen una misma estructura qumica central, que consiste en una cadena lineal de aminocidos. Lo que ace distinta a una protena de otra es la secuencia de aminocidos de que est ec a, a tal secuencia se conoce como estructura primaria de la protena. La estructura primaria de una protena es determinante en la funci%n que cumplir despus, as las protenas estructurales (como aquellas que forman los tendones y cartlagos) poseen mayor cantidad de aminocidos rgidos y que establezcan enlaces qumicos fuertes unos con otros para dar dureza a la estructura que forman. 'in embargo, la secuencia lineal de aminocidos puede adoptar m.ltiples conformaciones en el espacio que se forma mediante el plegamiento del polmero lineal. :al plegamiento se desarrolla en parte espontneamente, por la repulsi%n de los aminocidos idr%fobos por el agua, la atracci%n de aminocidos cargados y la formaci%n de puentes disulfuro y tambin en parte es ayudado por otras protenas. As2 $a es!"#c!#"a p"ima"ia %iene de!e"minada po" $a sec#encia de amino/cidos en $a cadena p"o!eica2 es deci"2 e$ n7me"o de amino/cidos p"esen!es e$ o"den en .#e es!/n en$a8ados $a fo"ma en .#e se p$ie'a $a cadena se ana$i8a en !("minos de es!"#c!#"a sec#nda"ia. Adem/s $as p"o!enas adop!an dis!in!as posiciones en e$ espacio2 po" $o .#e se desc"i&e #na !e"ce"a es!"#c!#"a. La es!"#c!#"a !e"cia"ia2 po" !an!o2 es e$ modo en .#e $a cadena po$ipep!dica se p$ie'a en e$ espacio2 es deci"2 cmo se en"o$$a #na de!e"minada p"o!ena. &s mismo, las protenas no se componen, en su mayora, de una .nica cadena de aminocidos, sino que se suelen agrupar varias cadenas polipeptdicas (o mon%meros) para formar protenas multimricas mayores. & esto se llama es!"#c!#"a c#a!e"na"ia de $as p"o!enas2 a $a a'"#pacin de %a"ias cadenas de amino/cidos +o po$ip(p!idos) en comp$e9os mac"omo$ec#$a"es ma o"es. 0or tanto, podemos distinguir cuatro niveles de estructuraci%n en las protenas# M Estructura primaria M Estructura secundaria M Estructura terciaria M Estructura cuaternaria Los enlaces que determinan la estructura primaria son covalentes (enlace amida o enlace peptdicocovalente), mientras que la mayora de los enlaces que determinan la conformaci%n (estructuras secundaria y terciaria) y la asociaci%n (estructura cuaternaria y quinaria) son de tipo no covalente.

i. Es!"#c!#"as sec#nda"ias de $as p"o!enas La estructura secundaria de las protenas es el plegamiento que la cadena polipeptdica adopta gracias a la formaci%n de puentes de idr%geno entre los tomos que forman el enlace peptdico. Los puentes de idr%geno se establecen entre los grupos 6+)6 y 6B*6 del enlace peptdico (el primero como aceptor de *, y el segundo como donador de *). (e esta forma, la cadena polipeptdica es capaz de adoptar conformaciones de menor energa libre, y por tanto, ms estables .
4) *lice alfa

Esta estructura se mantiene gracias a los enlaces de idr%geno intracatenarios formados entre el grupo 6B* de un enlace peptdico y el grupo 6+G) del cuarto aminocido que le sigue. +uando la cadena polipeptdica se enrolla en espiral sobre s misma debido a los giros producidos en torno al carbono alfa de cada aminocido se adopta una conformaci%n denominada licea. Esta estructura es peri%dica y en ella cada enlace peptdico puede establecer dos puentes de idr%geno, un puente de idr%geno se forma entre el grupo 6B*6 del enlace peptdico del aminocido en posici%n n y el grupo 6+)6 del enlace peptdico del aminocido situado en posici%n n6=.

El otro puente de idr%geno se forma entre el grupo 6+)6 del enlace peptdico del && en posici%n n y el grupo 6B*6 del enlace peptdico del && situado en posici%n nR=. +ada vuelta de la lice tiene un paso de rosca de F,8= nm. Las cadenas laterales de los aminocidos se sit.an en la parte e$terna del elicoide, lo que evita problemas de impedimentos estricos. En consecuencia, esta estructura puede albergar a cualquier aminocido, a e$cepci%n de la prolina, cuyo +a no tiene libertad de giro, por estar integrado en un eterociclo. 0or este motivo, la prolina suele determinar una interrupci%n en la conformaci%n en lice. Los aminocidos muy polares (Lys, Slu) tambin desestabilizan la lice a porque los enlaces de idr%geno pierden importancia frente a las interacciones electrostticas de atracci%n o repulsi%n. 0or este motivo, la estructura en lice es la que predomina a valores de p* en los que los grupos ionizables no estn cargados.

1) *o!a Teta +uando la cadena principal de un polipptido se estira al m$imo que permiten sus enlaces covalentes se adopta una configuraci%n espacial denominada estructura , que suele representarse como una flec a. En esta estructura las cadenas laterales de los aminocidos se sit.an de forma alternante a la derec a y a la izquierda del esqueleto de la cadena polipeptdica. Las estructuras de distintas cadenas polipeptdicas o bien las estructuras de distintas zonas de una misma cadena polipeptdica pueden interaccionar entre s mediante puentes de idr%geno, dando lugar a estructuras laminares llamadas por su forma o!as plegadas u o!as . +uando las estructuras tienen el mismo sentido, la o!a resultante es paralela, y si las estructuras tienen sentidos opuestos, la o!a plegada resultante es antiparalela. 7) Siros Teta 'ecuencias de la cadena polipepetdica con estructura alfa o beta, a menudo estn conectadas entre s por medio de los llamados giros beta. 'on secuencias cortas, con una conformaci%n caracterstica que impone un brusco giro de 45F grados a la cadena principal de un polipeptido. &minocidos como &sn, Sly y 0ro (que se acomodan mal en estructuras de tipo o ) aparecen con frecuencia en este tipo de estructura. La conformaci%n de los giros est estabilizada generalmente por medio de un puente de idr%geno entre los residuos 4 y = del giro . =) *lice de colgeno Es una variedad particular de la estructura secundaria, caracterstica del colgeno. El colgeno es una importante protena fibrosa presente en tendones y te!ido conectivo con funci%n estructural ya que es particularmente rgida. 0resenta una secuencia tpica compuesta por la repetici%n peri%dica de grupos de tres aminocidos. El primer aminocido de cada grupo es Sly, y los otros dos son 0ro (o idro$iprolina) y un aminocido cualquiera# 6(S606O)6.

La frecuencia peri%dica de la 0rolina condiciona el enrollamiento peculiar del colgeno en forma de lice lev%gira. La glicina, sin cadena lateral, permite la apro$imaci%n entre distintas lices, de forma que tres lices lev%giras se asocian para formar un elicoide de$tr%giro. 8) Laminas beta o laminas plegadas 'on regiones de protenas que adoptan una estructura en zigzag y se asocian entre s estableciendo uniones mediante enlaces de idr%geno intercatenarios. :odos los enlaces peptdicos participan en estos enlaces cruzados, confiriendo as gran estabilidad a la estructura. La forma en beta es una conformaci%n simple formada por dos o ms cadenas polipeptdicas paralelas (que corren en el mismo sentido) o antparalelas (que corren en direcciones opuestas) y se adosan estrec amente por medio de puentes de idr%geno y diversos arreglos entre los radicales libres de los aminocidos. Esta conformaci%n tiene una estructura laminar y plegada, a la manera de un acorde%n. ii. Es!"#c!#"a !e"cia"ia2 dominios 'e llama estructura terciaria a la disposici%n tridimensional de todos los tomos que componen la protena, concepto equiparable al de conformaci%n absoluta en otras molculas. La estructura terciaria de una protena es la responsable directa de sus propiedades biol%gicas, ya que la disposici%n espacial de los distintos grupos funcionales determina su interacci%n con los diversos ligandos. 0ara las protenas que constan de una sola cadena polipeptdica (carecen de estructura cuaternaria), la estructura terciaria es la m$ima informaci%n estructural que se puede obtener. :ipos de estructura terciaria 'e distinguen dos tipos# 0rotenas con estructura terciaria de tipo fibroso en las que una de las dimensiones es muc o mayor que las otras dos. 'on e!emplos el colgeno, la queratina del cabello o la fibrona de la seda, En este caso, los elementos de estructura secundaria ( lices a u o!as b) pueden mantener su ordenamiento sin recurrir a grandes modificaciones, tan s%lo introduciendo ligeras torsiones longitudinales, como en las ebras de una cuerda.

0rotenas con estructura terciaria de tipo globular, ms frecuentes, en las que no e$iste una dimensi%n que predomine sobre las dems, y su forma es apro$imadamente esfrica. En este tipo de estructuras se suceden regiones con estructuras al azar, lice a o!a b, acodamientos y estructuras supersecundarias.

Las fuerzas que estabilizan la estructura terciaria de una protena se establecen entre las distintas cadenas laterales de los aminocidos que la componen. Los enlaces propios de la estructura terciaria pueden ser de dos tipos# covalentes y no covalentes. H Los enlaces covalentes pueden deberse a (4) la formaci%n de un puente disulfuro entre dos cadenas laterales de +ys, o a (1) la formaci%n de un enlace amida (6+)6B*6) entre las cadenas laterales de la Lys y un && dicarbo$lico (Slu o &sp). H Los enlaces no covalentes pueden ser de cuatro tipos# 4. fuerzas electrostticas entre cadenas laterales ionizadas, con cargas de signo opuesto 1. puentes de idr%geno, entre las cadenas laterales de && polares 7. interacciones idrof%bicas entre cadenas laterales apolares =. fuerzas de polaridad debidas a interacciones dipolo6dipolo +omo resultado de estas interacciones, en las protenas con estructura terciaria globular# H Las cadenas laterales con carcter apolar se orientan acia el interior de la molcula evitando las interacciones con el disolvente, y forman un n.cleo compacto con carcter idrof%bico. H Las cadenas laterales de los aminocidos polares se localizan en la superficie de la molcula, interaccionando con el agua y permitiendo que la protena permanezca en disoluci%n. H Bo todas estas interacciones contribuyen por igual al mantenimiento de la estructura terciaria. )bviamente, el enlace que aporta ms estabilidad es el de tipo covalente, y entre los no covalentes, las interacciones ms importantes son las de tipo idrof%bico, ya que e$igen una gran pro$imidad entre los grupo apolares de los &&. E$isten regiones diferenciadas dentro de la estructura terciaria de las protenas que act.an como unidades aut%nomas de plegamiento yDo desnaturalizaci%n de las protenas. Estas regiones constituyen un nivel estructural intermedio entre las estructuras secundaria y terciaria reciben el nombre de dominios. Los dominios se pliegan por separado a medida que se sintetiza la cadena polipeptdica. Es la asociaci%n de los distintos dominios la que origina la estructura terciaria.

iii. Es!"#c!#"a c#a!e"na"ia

comp$e9os m#$!ip"o!eicos.

+uando una protena consta de ms de una cadena polipeptdica, es decir, cuando se trata de una protena oligomrica, decimos que tiene estructura cuaternaria. La estructura cuaternaria debe considerar# El n.mero y la naturaleza de las distintas subunidades o mon%meros que integran el olig%mero y La forma en que se asocian en el espacio para dar lugar al olig%mero. La estructura cuaternaria deriva de la con!unci%n de varias cadenas peptdicas que, asociadas, conforman un multmero, que posee propiedades distintas a la de sus mon%meros componentes. (ic as subunidades se asocian entre s mediante interacciones no covalentes, como pueden ser puentes de idr%geno, interacciones idrof%bicas o puentes salinos. 0ara el caso de una protena constituida por dos mon%meros, un dmero, ste puede ser un omodmero, si los mon%meros constituyentes son iguales, o un eterodmero, si no lo son. En cuanto a uniones covalentes, tambin pueden e$istir uniones tipo puente disulfuro entre residuos de cistena situados en cadenas distintas. La figura siguiente corresponde a la emoglobina.

En protenas con estructura terciaria de tipo fibroso, la estructura cuaternaria resulta de la asociaci%n de varias ebras para formar una fibra o soga. La miosina o la tropomiosina constan de dos ebras con estructura de lice a enrolladas en una fibra lev%gira. La a6queratina del cabello y el fibrin%geno de la sangre presentan tres ebras en cada fibra lev%gira. El colgeno consta de tres ebras elicoidales lev%giras que forman una fibra de$tr%gira. La fibrona de la seda presenta varias ebras con estructura de o!a b orientadas de forma antiparalela. +uando varias protenas con estructura terciaria de tipo globular se asocian para formar una estructura de tipo cuaternario, los mon%meros pueden ser# E$actamente iguales, como en el caso de la fosfoglucoisomerasa o de la e$oquinasa. /uy parecidos, como en el caso de la lactato des idrogenasa. +on estructura distinta pero con una misma funci%n, como en el caso de la emoglobina. Estructural y funcionalmente distintos, que una vez asociados forman una unidad funcional,como en el caso de la aspartato transcarbamilasa, un enzima alostrico con seis subunidades con actividad cataltica y seis con actividad reguladora. La estructura cuaternaria modula la actividad biol%gica de la protena y la separaci%n de las subunidades a menudo conduce a la prdida de funcionalidad. Las fuerzas que mantienen unidas las distintas cadenas polipeptdicas son, en lneas generales, las mismas que estabilizan la estructura terciaria. Las ms abundantes son las interacciones dbiles ( idrof%bicas, polares, electrostticas y puentes de idr%geno), aunque en algunos casos, como en las inmunoglobulinas, la estructura cuaternaria se mantiene mediante puentes disulfuro. El ensambla!e de los mon%meros se realiza de forma espontnea, lo que indica que el olig%mero presenta un mnimo de energa libre con respecto a los mon%meros.

i%. M(!odos pa"a s# es!#dio El primer paso en el aislamiento de una protena es la rotura celular, para posteriormente poder e$traer la protena con un tamp%n adecuado. El mtodo de rotura a elegir depende de las caractersticas mecnicas del te!ido o clulas de donde se va a aislar la protena, as como de su localizaci%n. Entre los distintos mtodos ellos estn# Lisis celular (estrucci%n mecnica +ongelaci%n descongelaci%n :ras la rotura o bien, si se requiere, durante el proceso de rotura, se utilizan tampones de e$tracci%n para solubilizar las protenas. El resultado de todos estos tratamientos es un lisado u omogenado que contiene una mezcla de enzimas, membranas y clulas rotas. Esta preparaci%n se somete a centrifugaci%n (4F.FFF N 48.FFF rpm) para eliminar los restos celulares y separar, el sobrenadante, que contiene las protenas solubles, del precipitado que adems de restos celulares tambin contienen protenas asociadas a membranas y que para solubilizarlas requiere un tratamiento adicional con detergentes. En cualquier caso, la fase soluble (con o sin detergente) constituye el e$tracto crudo donde se encuentra la protena de inters ob!eto de la purificaci%n

1. 3#"ificacin 0ara purificar una protena es imprescindible tener un mtodo para detectar cuantitativamente su presencia. Es deseable que este mtodo sea especfico y fcil de llevar a cabo. En este sentido es muc o ms c%modo traba!ar con enzimas, pues se detectaran mediante su ensayo de actividad, en caso de purificar protenas no enzimticas, se requieren mtodos de selecci%n ms especficos. El mtodo empleado para la purificaci%n se basa en las siguientes propiedades de las protenas# :ama"o 'olubilidad +arga &dsorci%n &finidad

/todos de e$tracci%n

AQU ME FALTAN MUCHOS METODOS DE SEPARACION, PERO YA ME DA FLOJERILLA ESTAR PEGANDOLOS, LES PASO EL PDF

,. De!e"minacin de s# sec#encia de amino/cidos Los mtodos de secuenciaci%n tradicionales (basados en la degradaci%n de Edman) son demasiado lentos para abordar esta ingente tarea, la secuenciaci%n de los pptidos debe acerse por espectometra de masas. Baturalmente las tcnicas de purificaci%n y aislamiento de protenas son esenciales para abordar toda esta tarea.

(egradaci%n de Edman 0rimer paso# Kuptura e identificaci%n del aminocido B6terminal

'egundo paso# Kuptura e identificaci%n del segundo aminocido (nuevo e$tremo B6 terminal )

La degradaci%n de Edman permite la secuenciaci%n total de pptidos peque"os. Luego de treinta ciclos de degradaci%n el mtodo pierde precisi%n. Kuptura parcial de pptidos en cadenas ms cortas (menos de treinta residuos)# 4)-umica (poco selectiva)# idr%lisis con *+l diludo durante tiempos de reacci%n cortos. 1)Enzimtica (muy selectiva)# provocan la ruptura en puntos predecibles de la cadena. :KI0'IB&# rompe la cadena por los grupos carbo$ilo de los aminocidos bsicos# Lys, &rg -<I/):KI0'IB&# rompe la cadena por los grupos carbo$ilo de los aminocidos aromticos# 0 e, :yr, :rp E!emplo# determinaci%n de la estructura de la o$itocina bovina 4) idr%lisis parcial cida 1) secuenciaci%n 7) elucidaci%n

:. Iden!ificacin de p"o!enas sepa"adas po" e$ec!"ofo"esis +inm#node!eccin2 espec!"ome!"a de masas) Espectrofotometria de masas La espectrometra de masas permite calcular la masa del compuesto analizado con gran precisi%n. Esta tcnica se basa en que la desviaci%n que sufre una partcula cargada al atravesar un campo magntico depende bsicamente de su carga y masa. 'i ionizamos las molculas, la mayora con carga R4, y las sometemos a un barrido de campo magntico obtenemos un espectro de masas. Esta tcnica se utilizaba con molculas en fase gaseosa lo que impeda su aplicaci%n a molculas sensibles a la descomposici%n por calor o por los tratamientos tradicionales utilizados para pasar la muestra a fase gaseosa. En 4355 se desarrollaron dos tcnicas que permiten evitar este problema. La espectrometra de masas da muc a informaci%n sobre la masa molecular, la presencia de cofactores, etc. U adems puede utilizarse para secuenciar peque"as cadenas de polipptidos, mediante una tcnica conocida como tanden /', que bsicamente consiste en dos epectrometros de masas en serie. La protena ba!o estudio se trata con proteasas para obtener una mezcla de peque"os pptidos. En el primer espectr%metro la mezcla de pptidos se trata de forma que solo uno de los pptidos es seleccionado para su posterior anlisis. El pptido seleccionado se fragmenta en la cmara de colisi%n que se encuentra entre los dos espectr%metros donde una peque"a cantidad de gas noble (*e o &r) produce la fragmetaci%n del pptido preferentemente por los enlaces peptdicos, como la cmara est al vaco y no ay agua los productos son radicales. Los fragmentos son medidos en el segundo espectr%metro. En un especto tpico los picos mayoritarios corresponden a radicales que difieren en la masa de un aminocido particular. &s puede deducirse la secuencia. La .nica ambigVedad tiene lugar entre la leucina y la isoleucina que tienen la misma masa molecular. Este mtodo es rpido, requiere s%lo min.sculas cantidades de muestra que pueden ser e$tradas de una electroforesis bidimensional. Las grandes compa"as como +elera (particip% en el proyecto genoma umano) disponen de sistemas automatizados en que una gran cantidad de protenas se separan por electroforesis bidimensional o *0L+, cada punto puede ser luego secuenciado por un espectr%metro en tandem. Este

mtodo podra usarse tambin para la secuenciaci%n de (B&, pero los mtodos tradicionales son tan rpidos que no es rentable. Inmunodetecci%n
4. Determi !"i# $e %& e%tr&"t&r! tri$ime %i' !(

e. Bases ni!"o'enadas2 n#c$e!idos

/cidos n#c$eicos

Los cidos nucleicos (&(B, &KB) son macromolculas portadoras de informaci%n gentica, fundamentales para los seres vivos. Estn formados por# +, ), *, B, 0. 'on polinucle%tidos, es decir, largas cadenas de nucle%tidos. Los cidos nucleicos# estn consituidos por 7 unidades elementales# az.car ribosa (KB&) o deso$yribosa ((B&), fosfato y bases nitrogenadas. La uni%n del az.car y la base se denomina nucle%sido y la uni%n de fosfato, az.car y base se denomina nucle%tido. Los nucle%tidos que forman las cadenas se unen por enlaces fosfodiester. i. 3#"inas pi"imidinas

Las bases nitrogenadas se clasifican en funci%n de su estructura en purinas y pirimidinas. Las bases ms comunes en los cidos nucleicos son adenina, timina, citosina y guanina ((B&) y adenina, timina, citosina y uracilo (KB&). Bo obstante, es com.n encontrar otras en los cidos nucleicos, especialmente en el KB&(t).

PIRIMIDINAS

PURINAS

ii. 4#c$e!idos <n nucle%tido est formado por 7 componentes#

+uando se somete a los acidos nucleicos a idr%lisis en condiciones suaves liberan sus unidades monomericas constitutivas# los nucle%tidos. Los sillares estructurales de otras macromolculas, como los aminocidos o los monosacridos, no son susceptibles de descomponerse a su vez en unidades mas simples9 sin embargo los nucle%tidos, si pueden sufrir idr%lisis dando lugar a una mezcla de pentosas, acido fosf%rico y bases nitrogenadas.

Los nucle%tidos resultan de la uni%n mediante un enlace ester de la pentosa de un nucleosido (az.carRbase nitroenada) con una molecula de acido fosf%rico. Esta uni%n, en la que se libera una molecula de agua, puede producirse en cualquiera de los grupos idro$ilo libres de la pentosa, pero como regla general tiene lugar en el que ocupa la posici%n 8L9 es decir, los nucle%tidos son los 8L fosfatos de los correspondientes nucleosidos. &dems de los nucle%tidos monofosfato descritos, que son sillares estructurales de los acidos nucleicos, e$isten en la naturaleza nucle%tidos di y trifosfato, que resultan de la uni%n mediante enlace an idro de 4 o 1 moleculas de acido fosf%rico, adicionales a la que se encuentra unida al carbono 8L de la pentosa. 0or e!emplo# &:0 (adenosina trifosfato), &/0 (adenosina monofosfato), cuando el az.car es la ribosa y d&:0 (deso$iadenosina), dS:0 (deso$iguanosina), etc.

Los nucle%tidos pueden clasificarse en ribonucleotidos y deso$iribonucleotidos. &dems de ser los sillares de los acidos nucleicos, los nucle%tidos desempe"an en las clulas otras funciones no menos importantes. Los enlaces an idro que unen los enlaces fosfato adicionales de los nucle%tidos di y tri6fosfatos son ricos en energa9 necesitan un aporte energtico para formarse y liberan esta energa cuando se idrolizan. Esto les permite actuar como transportadores de energa. El &:0 actua universalmente en todas las clulas transportando energa.

iii. Es!"#c!#"a de$ D4A Los cidos nucleicos son polmeros de nucle%tidos. En ellos la uni%n entre la sucesivas unidades nucleotidicas se realiza mediante enlaces tipo ester6fosfato que resultan de la reacci%n entre el acido fosf%rico unido al carbono 8L de la pentosa de un nucle%tido y el idro$ilo del carbono 7L de la pentosa del otro nucle%tido. Este tipo de uni%n, en la que un grupo fosfato queda unido por dos enlaces ester a dos nucle%tidos sucesivos se conoce tambin como enlace fosfodiester. +uando dos nucle%tidos se unen mediante un puente fosfodiester el dinucle%tido que resulta conserva un grupo 8L fosfato libre en un e$tremo que puede reaccionar con el grupo idro$ilo 7L libre que puede reaccionar con el grupo 8L fosfato de otro nucle%tido. Esta circunstancia permite que mediente enlaces fosfodiester se puedan enlazar un numero elevado de nucle%tidos para formar largas cadenas lineales que siempre tendrn en un e$tremo un grupo 8L fosfato libre y en el otro un grupo idro$ilo 7L libre. (e manera anloga a lo establecido para otros tipos de biomoleculas, el compuesto formado por una cadena de asta 4F nucleotidos se denomina oligonucle%tido, mientras que si el numero de unidades nucleotidicas es superior a 4F se dice que es un polinucleotido.

(el mismo modo que se defini% la estructura primaria de las protenas como su secuencia de aminocidos, se puede describir la estructura primaria de los acidos nucleicos como su secuencia de nucle%tidos. &l igual que las cadena polipeptidicas poseen un esqueleto mon%tono a partir del cual se proyectan lateralmente los grupos K de los distintos aminocidos, los acidos nucleicos poseen un esqueleto de las mismas caractersticas formado por una sucesi%n alterna de pentosas y grupos fosfato, a partir del cual se proyectan lateralmente las distintas bases nitrogenadas. E$isten dos tipos principales de acidos nucleicos# el acido ribonucleoico (KB&) y acido deso$iribonucleico (&(B). Los dos tipos de acidos nucleicos estn presentes simultneamente en todas las clulas vivas.

AD4 6 Localizaci%n# En todas las clulas. En las eucari%ticas en el n.cleo. 6 +omposici%n# 0olinucle%tido 6 Estructura (oble cadena# dos cadenas, antiparalelas y complementarias9 unidas mediante enlaces de *idr%geno entre las bases nitrogenadas. 'iempre se unen & :, S +

(oble lice# La doble cadena se dispone en forma de doble lice. (escubierto por Watson y +racC en 4387. 6(eso$irribosa 6Tases &, S, +,: ?unciones biol%gicas Es portador de informaci%n gentica, que radica en la secuencia (orden) de las bases nitrogenadas. <n gen es un tramo de &(B con determinada informaci%n. El &(B tiene capacidad de autoduplicaci%n, es prcticamente la .nica molcula que puede fabricar una copia de s misma (con ayuda de enzimas). Es importante para la transmisi%n de la informaci%n gentica. El &(B dirige la sntesis de protenas# la informaci%n del &(B se utiliza para fabricar &KB y protenas. Es importante para la e$presi%n de la informaci%n gentica.

El &(B puede sufrir cambios en su secuencia de bases (alteraciones en la informaci%n gentica, mutaciones). &lgunas mutaciones pueden tener un papel importante en la evoluci%n. s# es!"#c!#"a

i%. Dife"en!es !ipos de R4As

6 Localizaci%n# En todas las clulas. En clulas eucari%ticas, tanto en el n.cleo como en el citoplasma. &bunda especialmente en los ribosomas. 6 +omposici%n# 0olinucle%tido 6 Estructura# En general, es de cadena sencilla (no doble), aunque se pueden formar bucles por apareamiento de bases. 6 :ipos de &KB y funciones biol%gicas E$isten varios tipos de &KB# &KBm, &KBr, &KBt,X :odos intervienen en la sntesis de protenas. &KBm (&KB mensa!ero). 'e forma a partir de un tramo de &(B, copiando la informaci%n de ste. Qa a los ribosomas, donde la informaci%n de ste. Qa a los ribosomas, donde la informaci%n se utilizar para fabricar una determinada protena. El c%digo gentico es la correspondencia entre los tripletes de nucle%tidos del &KBm y los aminocidos de la protena especificada por l. &KBr (&KB ribos%mico). <nido a protenas, forma los ribosomas, fbricas de ribosomas. &KBt (&KB de transferencia) Lleva especficamente los aminocidos al ribosoma y los coloca en posici%n adecuada. &l encadenarse los a, se formar la protena. +ada &KBt lleva un solo a. %. M(!odos pa"a s# es!#dio 4. 'eparaci%n de los diferentes tipos de cidos nucleicos Electroforesis Es un mtodo analtico N semipreparativo, en el que se separan biomolculas, en dependencia entre otros factores de su carga y ba!o la acci%n de un campo elctrico. 'e fundamenta en la migraci%n de solutos i%nicos ba!o la influencia de un campo elctrico9 Estas partculas migran acia el ctodo o nodo (electrodos 6 y R), en dependencia de una combinaci%n de su carga, peso molecular y estructura tridimensional. Es de destacar que a escala analtica, los mtodos electroforticos son de alta sensibilidad, poder de resoluci%n y versatilidad, y sirven como mtodo de separaci%n de mezclas comple!as de cidos nucleicos, protenas y otras biomolculas, donde aportan un potente criterio de pureza. 'e pueden conocer tambin mediante estas tcnicas, las caractersticas cido6bsicas de las protenas presentes en un e$tracto crudo, lo que da la informaci%n necesaria si se pretende realizar una separaci%n cromatogrfica basada en diferencias de carga. Es .til adems para determinar otros

parmetros como peso molecular, punto isoelctrico y n.mero de cadenas polipeptdicas de las protenas. La mayora de las biomacromolculas (protenas, cidos nucleicos y polisacridos) poseen determinada carga elctrica con grupos ani%nicos y cati%nicos capaces de disociarse. La carga neta de la partcula est dada por el p* del medio y puede ser modificada por la interacci%n con peque"as molculas de iones u otras macromolculas. (e lo anterior se deduce que el p* influye sobre la velocidad de migraci%n de las molculas.1 En el punto isoelctrico de la biomolcula, p* al cual su carga neta es F, esta no migra. 0or deba!o del punto isoelctrico tiene carga neta positiva y migra acia el ctodo, y por encima del punto isoelctrico tienen carga neta negativa y migra acia el nodo. /todos electroforticos zonales 'on .tiles para lograr la separaci%n de componentes de mezclas comple!as. 'e aplican peque"as cantidades de la disoluci%n de biomoleculas (acidos nucleicos, protenas, etc) a un soporte s%lido, que se impregna con una soluci%n de tamp%n. Los soportes son en general polmeros y forman un gel poroso que restringe el movimiento de las molculas a travs del medio durante la electroforesis y disminuyen los flu!os de convecci%n del solvente. +omo soportes an sido utilizados papel (celulosa), almid%n, poliacrilamida, agarosa, acetato de celulosa, etctera. Este mtodo tiene gran poder resolutivo porque se aplica una cantidad peque"a de protena a una zona estrec a, mientras que la longitud del trayecto es muc o mayor que la zona de aplicaci%n. El equipamiento requerido es simple (fuente de poder y cubeta vertical u orizontal donde se coloca el soporte y 1 electrodos). Estos geles se colocan en la cubeta de electroforesis, sumergidos en un tamp%n de p* alrededor de 5. (e esta forma, las molculas de (B& o KB& sometidas a electroforesis se desplazarn al polo positivo ya que a p* superiores a 8 poseen carga negativa. Los geles se comportan como un tamiz molecular y permiten separar molculas cargadas en funci%n de su tama"o y forma. &s, molculas de (B& de diferente tama"o, van a emigrar de forma distinta en un gel de electroforesis. La distancia recorrida por cada fragmento de (B& va a ser inversamente proporcional al logaritmo de su peso molecular. Es importante la utilizaci%n de marcadores de tama"o conocido porque nos permitirn calcular los pesos moleculares de las muestras de (B& problema. En el caso de los geles de agarosa, se le a"ade &"om#"o de e!idio, sustancia que se intercala entre las bases del (B& y es fluorescente cuando se ilumina con luz ultravioleta. :ras la electroforesis, se visualiza el gel con una lmpara de luz <Q, y se vern las bandas correspondientes a las muestras de (B& aplicado y los marcadores de peso molecular.

). P&ri*i"!"i# La e$tracci%n y purificaci%n de cidos nucleicos constituye la primara etapa de la mayora de los estudios de biologa molecular y de todas las tcnicas de recombinaci%n de &(B. En este caso, los mtodos de e$tracci%n permiten obtener cidos nucleicos purificados a partir de diversas fuentes para despus realizar anlisis especficos de modificaciones genticas mediante la reacci%n en cadena de la polimerasa (0+K). La calidad y la pureza de los cidos nucleicos son dos de los elementos ms importantes en ese tipo de anlisis. 'i se desea obtener cidos nucleicos muy purificados, que no contengan contaminantes in ibidores, es preciso aplicar mtodos de e$tracci%n adecuados.
(ada la gran variedad de mtodos de e$tracci%n y purificaci%n de cidos nucleicos e$istentes, la elecci%n de la tcnica ms adecuada suele efectuarse conforme a los criterios siguientes# cido nucleico diana9 organismo fuente9 material inicial (te!ido, o!a, semilla, material transformado, etc.)9 resultados deseados (rendimiento, pureza, tiempo que requiere la purificaci%n)9 uso posterior (0+K, clonaci%n, etiquetado, transferencia, K:60+K, sntesis de &(Bc, etc.). /todos de e$tracci%n 0ara e$traer los cidos nucleicos del material biol%gico es preciso provocar una lisis celular, inactivar las nucleasas celulares y separar los cidos nucleicos de los restos de clulas. El procedimiento de lisis id%neo suele consistir en un equilibrio de tcnicas y a de ser suficientemente fuerte para romper el material inicial comple!o (un te!ido, por e!emplo), pero suficientemente suave para preservar el cido nucleico diana. Entre los procedimientos usuales de lisis figuran los siguientes# rotura mecnica (trituraci%n, lisis ipot%nica, etc.)9 tratamiento qumico (detergentes, agentes caotr%picos, reducci%n con tioles, etc.)9 digesti%n enzimtica (0roteinasa ;, etc.). Es posible romper la membrana celular e inactivar las nucleasas intracelulares al mismo tiempo. 0or e!emplo, una misma soluci%n puede contener detergentes que solubilicen las membranas celulares y sales caotr%picas fuertes que inactiven las enzimas intracelulares. :ras la lisis celular y la inactivaci%n de las nucleasas, los restos de clulas se eliminan fcilmente por filtraci%n o precipitaci%n. /etodos de purificaci%n Los mtodos empleados para purificar los cidos nucleicos de e$tractos celulares suelen ser combinaciones de dos o ms tcnicas de las siguientes# e$tracci%nDprecipitaci%n9 cromatografa9 centrifugaci%n9 separaci%n por afinidad.

E6!"accin;p"ecipi!acin
& menudo se efect.a una e$tracci%n con disolventes para eliminar los contaminantes de los cidos nucleicos. 0or e!emplo, suele emplearse una combinaci%n de fenol y cloroformo con ob!eto de eliminar las protenas. 0ara concentrar los cidos nucleicos suele realizarse una precipitaci%n con isopropanol o etanol. 'i la cantidad de cido nucleico diana es escasa, puede a"adirse a la mezcla un portador inerte (como el gluc%geno) para favorecer la precipitaci%n.

:ambin puede realizarse una precipitaci%n selectiva con concentraciones salinas elevadas (precipitaci%n salina) o una precipitaci%n de las protenas mediante cambios del p*.

C"oma!o'"afa
0ueden emplearse diversas tcnicas cromatogrficas de separaci%n# permeaci%n sobre gel, intercambio i%nico, adsorci%n selectiva o uni%n por afinidad. La permeaci%n sobre gel aprovec a las propiedades de las partculas porosas del gel para tamizar molculas. 'e emplea una matriz con poros de tama"o definido, que de!an pasar las molculas ms peque"as por difusi%n, pero no las ms grandes, que quedan eluidas en el volumen vaco. &s pues, las molculas quedan eluidas por orden de tama"o decreciente. La cromatogrfica de intercambio i%nico es otra tcnica, que se basa en la interacci%n electrosttica de la molcula diana con un grupo funcional de la matriz en columna. Los cidos nucleicos (polianiones lineales con fuerte carga negativa) pueden eluirse de las columnas de intercambio i%nico con simples :ampones salinos. En la cromatografa de adsorci%n, los cidos nucleicos se fi!an selectivamente en slice o vidrio, en presencia de determinadas sales (por e!emplo, sales caotr%picas), mientras que otras molculas biol%gicas no se fi!an. & continuaci%n, los cidos nucleicos pueden eluirse con agua o un tamp%n iposalino y se obtiene una muestra que puede emplearse directamente en las aplicaciones posteriores.

Cen!"if#'acin
La centrifugaci%n selectiva constituye un mtodo de purificaci%n eficaz. &s, por e!emplo, la ultracentrifugaci%n en gradientes autogenerados de +s+l con fuerzas g elevadas se lleva empleando muc o tiempo para purificar plsmidos. La centrifugaci%n suele asociarse a otros mtodos, como la cromatografa de columna centrifugada, en cuyo caso se combina la permeaci%n sobre gel y la centrifugaci%n para separar el &(B o &KB de contaminantes ms peque"os (sales, nucle%tidos, etc.), intercambiar tampones o seleccionar seg.n el tama"o. &lgunos procedimientos combinan la adsorci%n selectiva en matriz cromatogrfica (vase el apartado anterior Y+romatografaZ) y la eluci%n por centrifugaci%n para purificar de forma selectiva un tipo de cido nucleico.

Sepa"acin po" afinidad

En los .ltimos a"os, cada vez son ms los mtodos de purificaci%n que combinan la inmovilizaci%n por afinidad de cidos nucleicos y la separaci%n magntica. 0or e!emplo, los &KBm poli & R pueden unirse a partculas magnticas revestidas de estreptavidina mediante oligo d: marcados con biotina, y el comple!o de partculas puede eliminarse de la soluci%n (y de los contaminantes libres) con un imn. Esta tcnica en fase s%lida simplifica la purificaci%n de los cidos nucleicos, pues permite sustituir las etapas de centrifugaci%n, e$tracci%n orgnica y separaci%n de fases por una operaci%n de separaci%n magntica, .nica y rpida.

:. Sec#enciacin La estrategia bsica de la secuenciaci%n de cidos nucleicos es idntica a la que se utiliza en la secuenciaci%n de protenas. ,sta involucra# 4.6 La degradaci%n especfica y el fraccionamiento de los polinucle%tidos de inters a fragmentos suficientemente peque"os para ser secuenciados. 1.6 La secuenciaci%n de los fragmentos peque"os. 7.6 El ordenamiento de los fragmentos a travs de la repetici%n de los pasos anteriores, usando un procedimiento de degradaci%n que produce una serie de fragmentos de polinucle%tidos que traslapan el punto de corte en la primera serie.

En 4322, se reportaron dos protocolos para la secuenciaci%n de &(B. El primer mtodo fue el de /a$am y Silbert. +on este mtodo, al igual que con el de 'anger, se obtiene una autoradiografa en donde puede leerse una secuencia. 'in embargo, se determina la secuencia de una molcula de &(B utilizando qumicos que cortan en posiciones especficas fragmentos marcados en sus e$tremos 8[. El segundo mtodo es el de 'anger. ,ste utiliza un templado de &(B de cadena sencilla para sintetizar la ebra complementaria, la cual se termina en posiciones especficas. En los dos casos, la secuencia de la molcula se determina por diferencias en los tama"os de los fragmentos generados. E$ m(!odo de de'"adacin .#mica +Ma6am and Gi$&e"!2 1<==). En este mtodo, un fragmento de &(B de cadena doble o sencilla se marca en los e$tremos 8[ o 7[ de una o ambas ebras con 710. (espus, la muestra de &(B se divide en cuatro alcuotas y se fragmenta en cuatro reacciones qumicas distintas. 0osteriormente, los fragmentos de &(B generados pueden ser separados por electroforesis en cuatro carriles distintos con base en su tama"o. +onociendo el nucle%tido en el que se realizaron los cortes, se puede inferir la secuencia de la molcula original (figura =). Las reacciones qumicas que se utilizan para fragmentar la molcula de &(B son las siguientes# 4. +orte de las purinas. Las purinas adenina y guanina se metilan con dimetil sulfato ((/'). (espus, la reacci%n es tratada en condiciones alcalinas9 la molcula de &(B se fragmenta en las purinas metiladas. +omo resultado, se obtiene una serie de bandas oscuras que corresponden a las guaninas (las cuales se metilan 8 veces ms rpido), y bandas claras que corresponden a las adeninas. 0ara interpretar fcilmente el patr%n de bandas generadas, se puede comparar contra un tratamiento que favorezca el corte de las adeninas. 1. +orte de adeninas. Esta reacci%n es una variaci%n de la anterior. Las purinas metiladas se tratan inicialmente con un cido diluido. Esto favorece el corte de las adeninas metiladas. (espus de un tratamiento alcalino las guaninas tambin son cortadas. Este tratamiento genera una serie de bandas oscuras y claras que tambin corresponden a las adeninas, y las guaninas, respectivamente. 7. +orte de pirimidinas. Esta reacci%n utiliza el reactivo idracina, que corta las bases citosina y timina. 0osteriormente, se trata con piperidina para completar la reacci%n. =. +orte de citosina. La presencia de Ba+l 1/ in ibe la reacci%n de idracina con tiamina, y el tratamiento posterior con piperidina, produce solamente fragmentos que terminan en citosina. (esde que se reporto este mtodo, no se an encontrado reactivos qumicos especficos que corten las bases & o :, por lo que se utiliza la estrategia de corte descrita en la figura =. Esta estrategia permite distinguir entre los nucle%tidos que se encuentran al final de cada corte y deducir la secuencia de &(B.

*oy en da, el mtodo ms usado para la secuenciaci%n de cidos nucleicos es el mtodo de 'anger. 'in embargo, es !usto decir que el mtodo de /a$am6Silbert es el ms adecuado para determinar la secuencia de fragmentos cortos de &(B, debido a que puede determinar la secuencia desde la primera base. En cambio, el mtodo de 'anger s%lo permite la lectura a partir de la base 4F61F (:a ara et al., 433F). E$ m(!odo en8im/!ico +San'e" et al.2 1<==). El mtodo de secuenciaci%n enzimtico sali% casi al mismo tiempo que el de /a$am y Silbert, pero a sido ms utilizado. Esto se debe, en gran parte, a que se an realizado grandes avances en la automatizaci%n de esta tcnica, lo cual se discutir ms adelante. El mtodo de 'anger se basa en el uso de la &(B polimerasa para sintetizar cadenas de &(B con una terminaci%n especfica. +on este mtodo se generan fragmentos de &(B de todos los tama"os posibles que se puedan distinguir entre s, por el tipo de marca!e que llevan o por la incorporaci%n de un terminador especfico. Las enzims del tipo de la &(B polimerasa requieren de un templado de &(B de cadena sencilla, y realizan la sntesis de la ebra complementaria e$tendindola a partir de un iniciador en direcci%n 8L a 7L. Entre los componentes de la reacci%n se incluyen nucle%tidos que no tienen un grupo idro$ilo en su e$tremo 7L (ddB:0), para poder obtener una terminaci%n especifica en las cadenas.

<na vez que el ddB:0 se incorpora como el residuo terminal, evita que la cadena de &(B sintetizada contin.e e$tendindose. La incorporaci%n de los ddB:0s es al azar, de tal forma que se obtienen fragmentos de todos los tama"os posibles que terminan en un residuo especifico. En el mtodo de 'anger (4322), la estrategia es acer cuatro reacciones diferentes de sntesis de &(B, utilizando un ddB:0 distinto en cada tubo. +on la mezcla del nucle%tido normal (dB:0) y su terminador (ddB:0), se pueden generar fragmentos complementarios de diferentes tama"os que terminan en el mismo nucle%tido. (espus, estos fragmentos se pueden separar en un gel de electroforesis con cuatro carriles distintos, para determinar la secuencia del templado

Sec#enciacin de AR4 0aralelo al desarrollo de los mtodos de secuenciaci%n de &(B, tambin se reportaron avances en la secuenciaci%n de &KB. (esde que *olley secuenci% un t&KB para &lanina en 43>8, se an desarrollado mtodos de secuenciaci%n de &KB similares a los utilizados para secuenciar &(B (TlacCburn y Sait, 433>). Tsicamente, los mtodos de secuenciaci%n de &KB se dividen en 1 categoras. >.,.1 M(!odos indi"ec!os En este caso, el &KB se convierte primero a c&(B con la enzima transcriptasa reversa y luego se usa el fragmento obtenido como templado para la reacci%n de secuenciaci%n. En realidad, este mtodo determina la secuencia de una molcula de

&(B a partir de la cual se infiere la secuencia de la molcula de &KB. Este mtodo indirecto es uno de los ms comunes para la secuenciaci%n de &KB porque tiene todas las venta!as de la secuenciaci%n de &(B. M(!odos di"ec!os Estos mtodos se utilizan para secuenciar la molcula de &KB cuando es complicado utilizar el mtodo indirecto (Igloi, 4335). Esto suele suceder con &KBs muy peque"os, o con estructuras secundarias e$tensas (ribosomales, transferencia). :odas estas tcnicas requieren de que el &KB este en forma pura. a) /todo enzimtico66 En los primeros reportes se e$periment% con una forma enzimtica para secuenciar &KB directamente. En este caso, los autores TroEnlee y +artErig t (4322) reportaron los resultados de la secuenciaci%n de una molcula de m&KB de casi 1FF pb. <tilizaron un iniciador marcado con 710 y la transcriptasa reversa. <sando reacciones similares a las del mtodo de 'anger, los autores generaron fragmentos de c&(B con una terminaci%n especfica dada por ddB:0s. (espus, resolvieron el orden de los fragmentos de &(B generados en un gel de acrilamida. 'e a visto que la concentraci%n del &KB templado influye muc o en la resoluci%n del gel. Los autores +arpenter y 'imon (433F) reportaron que cuanto mayor era la cantidad de &KB viral usado como templado, menor era la resoluci%n obtenida en el gel de acrilamida debido a que las bandas eran anc as, complicando la interpretaci%n del orden. Ellos obtuvieron la me!or resoluci%n utilizando F.= \g (F.28 pmol) de &KB como templado. En una reacci%n de secuenciaci%n de r&KB, TaCin y )fengand (4331) obtuvieron la me!or resoluci%n empleando 4F veces menos &KB, es decir, solamente F.47 pmol. & pesar de que se generan fragmentos de &(B, el mtodo enzimtico es un mtodo directo porque el templado es una molcula de &KB. La marca se puede incorporar a los fragmentos de &(B de maneras alternativas a la usada por TroEnlee y +artErig t en 4322. El uso de ddB:0s marcados tiene la venta!a de que los fragmentos que sufren una terminaci%n prematura no se detectan ni interfieren con la interpretaci%n de la secuencia. La terminaci%n prematura suele ser un problema ms com.n en la secuenciaci%n de &KB por la formaci%n de estructuras secundarias que interfieren con la actividad de la transcriptasa reversa. &dems, la sntesis de fragmentos de &(B a 72 ]+ carece de las venta!as de las altas temperaturas que se pueden usar con otras enzimas (polimerasa Taq). b) /todo qumico66 En 4322 se present% un mtodo de ruptura qumica del &KB similar al de /a$am y Silbert ((onis6;eller et al., 4322). La molcula de &KB (en este caso &KB ribosomal) se marca con una molcula de 710 en un e$tremo. (espus se utilizaron nucleasas para acer digestiones de la molcula de &KB marcado en distintos lugares. La KB&sa :4 corta las guaninas, la KB&sa <1 corta las adeninas y una idr%lisis alcalina rompe todos los enlaces fosfodister ((onis6;eller et al., 4322). 'e utiliza un gel de acrilamida para separar los fragmentos de estos tres tipos de ruptura, lo que permite determinar el orden de las guaninas, adeninas y pirimidinas de una molcula de &KB ribosomal.

& diferencia del mtodo enzimtico, en el que se puede usar un iniciador marcado para generar los fragmentos que sern secuenciados, el mtodo qumico requiere que la molcula de &KB sea marcada directamente. Esto se puede acer introduciendo una marca de 710 en el e$tremo 8L de la molcula con una cinasa :=, o en el e$tremo 7L con una ligasa := (TlacCburn and Sait, 433>). >. Iden!ificacin de sec#encias po" -i&"idacin Entre otras cosas el conocimiento de la secuencia de los genomas o los genes de los organismos tambin a permitido desarrollar nuevos mtodos de secuenciaci%n. +omo reportan IsaCsson y Landegren (4333) uno de estos es la secuenciaci%n por ibridizaci%n. <na forma en la cual puede funcionar este mtodo es utilizando ^microarrays_. Estos son soportes peque"os en los cuales se imobilian peque"os fragmentos de &(B en un orden conocido. (espus se pasa la muestra de &(B (con secuencia desconocida) y se cuantifica el grado de ibridizaci%n, y por consecuencia el grado de identidad con las secuencias fi!as en el soporte (+antor y 'mit , 4333). Esto parece funcionar especialmente bien en la identificaci%n de 'B0s. Wang et al. (4335) reportaron que es posible identificar el genotipo de un individuo analizando 8FF 'B0s a la vez en un e$perimento de ibridizaci%n con un ^microarray_ de oligonucleotidos. <na posibilidad para la secuenciaci%n de acidos nucleicos a futuro, que discuten los autores +antor y 'mit (4333) es el acer ibridizaci%n contra oligonucleotidos que formen palabras de tal forma que se pueda ir determinando la secuencia sobrelapando los fragmentos (de >65 nucle%tidos) con los cuales brida el fragmento secuenciado.

, METABOLISMO
!. F& $!me t'% $e (! !""i# e +im,ti"! i. C' "e-t'% *& $!me t!(e% $e e +im'('./! 'on catalizadores, capaces de acelerar las reacciones qumicas en ambos sentidos, sin consumirse en ella, ni formar parte de los productos. La diferencia fundamental es que tienen gran especificidad de reacci%n o sea por el sustrato sobre el cual act.an. +iertas ez requieren de ciertos compuestos orgnicos, termoestables para poder cumplir con su funci%n cataltica, estas molculas se denominan coenzimas, generalmente tiene ba!o peso molecular y suelen ser claves en el mecanismo cataltico. La apoenzima unida a la coenzima constituye la oloenzima. Estas molculas termoestables generalmente son vitaminas o metales.

La funci%n principal de las enzimas es actuar como catalizadores de las reacciones de los seres vivos9 como tales catalizadores tienen ciertas caractersticas que vamos a estudiar a continuaci%n. :odas las reacciones qumicas tienen lugar porque cierta fracci%n de la poblaci%n de molculas reactantes poseen la suficiente energa como para alcanzar un estado activado, llamado estado de transicin, en el que es muy elevada la probabilidad de que se rompan o se establezcan enlaces para formar los productos. Este estado de transici%n reside en la cima de la barrera energtica que separa los reactantes de los productos, como muestra la ?igura 4. En ella se observa el diagrama de energa para una reacci%n qumica, no catalizada y catalizada, donde la energa libre de activacin es la cantidad de energa necesaria para llevar todas las molculas de un mol de sustancia, a una temperatura determinada, al estado de transici%n. E$isten dos mtodos generales mediante los cuales puede acelerarse la velocidad de una reacci%n qumica. <no de ellos es la elevaci%n de la temperatura (ya que provoca un incremento en la velocidad de las molculas)9 el otro consiste en utilizar un ca!a$i8ado". El catalizador se combina con los reactantes de modo transitorio activndolos, produciendo un estado de transici%n de menor energa que en la reacci%n no catalizada. <na vez formados los productos el catalizador queda libre, y puede ser de nuevo utilizado. Las enzimas disminuyen la energa de activaci%n, de tal forma que aumentan la velocidad de la reacci%n catalizada, sin afectar a las funciones termodinmicas ni a las constantes de equilibrio. 'u alto poder cataltico se debe en parte a su alta especificidad por los sustratos, la cul puede ser absoluta para un .nico sustrato o relativa, cuando permite la reacci%n de compuestos diferentes pero con una estructura similar. &dems de la especificidad y la alta eficiencia, otras dos caractersticas que diferencian a las enzimas de los catalizadores qumicos, son que las enzimas pueden saturarse por sustrato y tienen capacidad para regular su actividad. /uc as enzimas an sido designadas a"adiendo el sufi!o -asa al nombre del sustrato, es decir, la molcula sobre la cul e!erce su actividad cataltica. 0or e!emplo la ureasa cataliza la idr%lisis de la urea, y la arginasa cataliza la idr%lisis de la arginina. )tras enzimas an recibido su nombre en funci%n del tipo de reacci%n que catalizan9 as la Sliceralde do676fosfato6deshidrogenasa cataliza la des idrogenaci%n (o$idaci%n) del Sliceralde do676fosfato a 76fosfoglicerato. Incluso algunas se conocen de ace muc o tiempo y mantienen su nombre, sin dar informaci%n alguna del sustrato o la reacci%n que catalizan (tripsina). Bo obstante, e$iste una c$asificacin sis!em/!ica de $as en8imas que las divide en > grandes grupos, cada uno de los cuales se divide a su vez en subclases# 1: Oxido-reductasas (reacciones de o$ido6reducci%n) 2: Transferasas (transfieren grupos funcionales) 3: Hidrolasas (reacciones de idr%lisis), : !iasas (reacciones de adici%n a los dobles enlaces) ": #so$erasas (reacciones de isomerizaci%n) %: !igasas (formaci%n de enlaces con consumo de &:0).

& cada enzima se le asigna un n.mero con cuatro dgitos. Los tres primeros indican la clase, subclase y sub6subclase, respectivamente, y el .ltimo es un n.mero de orden. La :abla 1 muestra la clasificaci%n internacional de las enzimas en los seis grupos antes citados.

&s, por e!emplo, la enzima alco ol des idrogenasa (E+,4.4.4.4), es una oxidoreductasa (1.), que cataliza la o$idaci%n de etanol (4. 1.) a acetalde do, utilizando B&(R (4.4.1.) como aceptor de electrones y por lo tanto pertenece al grupo 4, se designa como E+ 4.4.4.4. Cofac!o"es en8im/!icos La actividad de algunas enzimas depende solamente de su estructura como protena, mientras que otras necesitan, adems, uno o ms componentes no proteicos, llamados cofac!o"es. El cofactor puede ser un ion $et&lico o bien una molcula orgnica, llamada coen'i$a, aunque algunos enzimas necesitan de ambos. El cofactor puede estar fuertemente unido a la protena (suele ser el i%n metlico, aunque puede igualmente ser un coenzima) y recibe entonces el nombre de grupo prosttico, o dbilmente unido, por lo que en realidad act.a como un sustrato especfico de la enzima (co-sustrato9 suele ser una molcula orgnica, coenzima). El comple!o enzima6cofactor catalticamente activo recibe el nombre de holoen'i$a. +uando se separa el cofactor, la protena restante, que por s misma es inactiva catalticamente, se designa con el nombre de a(oen'i$a.

En las enzimas el cofactor puede actuar como centro cataltico primario, grupo puente para reunir el sustrato y la enzima % agente estabilizante de la actividad enzimtica (conformaci%n). La :abla 7 muestra una relaci%n de iones me!/$icos que act.an como cofactores de enzimas.

0or su parte, cada uno de los coen8imas catalogados suele contener en su estructura, alguna vita$ina (sustancias orgnicas que, en cantidades mnimas, son vitales para el funcionamiento de todas las clulas, y deben figurar en la dieta de algunas especies) o molcula derivada de ella. Los coenzimas act.an por lo general como transportadores intermedios de tomos especficos o de electrones.

La :abla = muestra algunos de los coenzimas ms abituales en la catlisis enzimtica.

Entre las distintas cofactores enzimticos, el B&( RDB&(* (nicotinamida adenindinucle%tido) y el ?&(D?&(*1 (falvin adenin dinucle%tido), en sus forma o$idadaDreducida, constituyen coenzimas esenciales en el metabolismo, como aceptores, transportadores y donadores electr%nicos. La siguiente figura muestra el par redo$ B&(RDB&(*. Mode$os de ac!#acin de $as en8imas 0ara e$plicar la actividad cataltica de las enzimas, se a propuesto un mecanismo general, en dos etapas#

En la primera etapa, la enzima (E) se une a la molcula de sustrato ('), para formar el comple!o enzima6sustrato (E'). En una segunda etapa, el comple!o se fragmenta dando lugar al producto (0) y a la enzima (E), que vuelve a estar disponible para reaccionar con otra molcula de sustrato. 0or lo general, la molcula de enzima es muc o mayor que la del sustrato por lo que s%lo una peque"a parte de la enzima est implicada en la formaci%n del comple!o9 esta regi%n que interacciona con el sustrato y en la que tiene lugar la reacci%n, se denomina si!io ac!i%o de la enzima. El sitio activo es un dominio tridimensional de la enzima con una distribuci%n de los grupos .nica para posibilitar la uni%n a su sustrato especfico. (ic os grupos del enzima no tienen por qu ser necesariamente consecutivos en la secuencia de la protena y reciben el nombre de cen!"os ca!a$!icos. El mode$o ms conocido sobre el mecanismo de reacci%n de las enzimas es el de *isc-e", quien propuso que la molcula de sustrato se adapta al centro activo de la enzima del mismo modo que lo ara una llave al enca!ar en una cerradura, es decir, que tienen una relaci%n estructural complementaria (?igura 1).

)tra ip%tesis ms aceptada actualmente es la del en'i$a flexible o de a)uste inducido (mode$o de ?os-$and), que sugiere que el sitio activo no necesita ser una cavidad geomtricamente rgida y pree$istente, sino que dic o sitio activo debe tener una disposici%n espacial, precisa y especfica, de ciertos grupos de la enzima que al interaccionar con el sustrato se adaptan y a!ustan a su estructura (?igura 7).

Independientemente del modelo, una vez formado el comple!o enzima sustrato, mediante un mecanismo de distorsi%n, se activan los enlaces que ay que romper y se apro$iman los grupos que ay que enlazar, favoreciendo la formaci%n del producto resultante de la reacci%n catalizada y quedando la enzima libre para comenzar de nuevo el proceso cataltico.

ii Pri "i-i'% $e "i 0ti"! e +im,ti"!

En condiciones fisiol%gicas las reacciones sin catalizar tienden a ser lentas (estabilidad de biomolculas) /uc as reacciones bioqumicas suponen situaciones poco probables <na enzima soluciona estos problemas proporcionando un ambiente tridimensional favorable a la reacci%n (sitio activo) Las enzimas alteran las velocidades de reacci%n pero no los equilibrios

Las velocidades de reacci%n y los equilibrios tienen definiciones termodinmicas precisas

Las interacciones dbiles entre enzima y sustrato son %ptimas en el estado de transici%n

En el estado de transici%n las interacciones entre la enzima y el sustrato son %ptimas

La energa de fi!aci%n entre enzima y sustrato proporciona especificidad de reacci%n y catlisis

La velocidad de una reacci%n catalizada por un enzima depende de 4. la concentraci%n de molculas de sustrato `'a 1. la temperatura 7. la presencia de in ibidores =. p* del medio, que afecta a la conformaci%n (estructura espacial) de la molcula enzimtica Los principios generales de las reacciones qumicas se aplican tambin a las reacciones enzimticas. En una reacci%n qumica que tiene lugar sin variaci%n del volumen del sistema, la %e$ocidad de "eaccin (v) es igual a la variaci%n de la concentraci%n de los productos por unidad de tiempo (?igura 48). &s, en la reacci%n sacarosa R agua glucosa R fructosa La velocidad de idr%lisis de la sacarosa es, en todo momento, proporcional a la concentraci%n de sacarosa. (ic o matemticamente,

(onde `'a es la concentraci%n de sacarosa a cada tiempo (t) y C es la constante de proporcionalidad. 'e dice que sta es una "eaccin de p"ime" o"den, ya que la velocidad de formaci%n de los productos es directamente proporcional a la concentraci%n del sustrato (?igura 48). <na "eaccin de se'#ndo o"den es aquella en la que la velocidad de formaci%n del producto depende directamente de la concentraci%n de dos sustratos (como en una reacci%n de condensaci%n) o bien del cuadrado de la concentraci%n de un .nico sustrato (como en una reacci%n de dimerizaci%n) (?igura 48)# v G C `'4a `'1a % v G C `'a1 En una "eaccin de o"den ce"o, la velocidad de formaci%n del producto es independiente de la concentraci%n de sustrato (?igura 48)# v G CF La cin(!ica en8im/!ica estudia la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas. Estos estudios proporcionan informaci%n directa acerca del mecanismo de la reacci%n cataltica y de la especifidad de la enzima. La velocidad de una reacci%n catalizada por una enzima puede medirse con relativa facilidad, ya que en muc os casos no es necesario purificar o aislar la enzima. La medida se realiza siempre en las condiciones p!imas de p*, temperatura, presencia de cofactores, etc, y se utilizan concentraciones saturantes de sustrato. En estas condiciones, la velocidad de reacci%n

observada es la velocidad m$ima (Qma$). La velocidad puede determinarse bien midiendo la aparici%n de los productos o la desaparici%n de los reactivos (?igura 4>). &l seguir la velocidad de aparici%n de producto (o de desaparici%n del sustrato) en funci%n del tiempo se obtiene la llamada c#"%a de a%ance de $a "eaccin , o simplemente, la cintica de la reacci%n. & medida que la reacci%n transcurre, la velocidad de acumulaci%n del producto va disminuyendo porque se va consumiendo el sustrato de la reacci%n. 0ara evitar esta complicaci%n se procede a medir la %e$ocidad inicia$ de la reacci%n (vF). La velocidad inicial de la reacci%n es igual a la pendiente de la curva de avance a tiempo cero (?igura 4>). (e esta forma, la medida de vF se realiza antes de que se consuma el 4Fb del total del sustrato, de forma que pueda considerarse la `'a como esencialmente constante a lo largo del e$perimento. &dems, en estas condiciones no es necesario considerar la reacci%n inversa, ya que la cantidad de producto formada es tan peque"a que la reacci%n inversa apenas ocurre. (e esta forma se simplifican enormemente las ecuaciones de velocidad. Los estudios sistemticos del efecto de la concentraci%n del sustrato sobre la actividad enzimtica comenzaron a realizarse a finales del siglo OIO. Ua en 4551 se introdu!o el concepto del comple!o enzima6sustrato como intermediario del proceso de catlisis enzimtica. En 4347, Leonor /ic aelis y /aud /enten desarrollaron esta teora y propusieron una ec#acin de %e$ocidad .#e "i'e $a accin en8im/!ica . 0ara estudiar la cintica enzimtica se mide el efecto de la concentraci%n inicial de sustrato sobre la velocidad inicial de la reacci%n, manteniendo la cantidad de enzima constante. 0ara cada una de las curvas de avance de reacci%n as obtenidas se calcula la vF (la pendiente de la curva de avance a tiempo cero). 0osteriormente, se representa la velocidad inicial frente a la concentraci%n inicial de sustrato ( %@ f"en!e a ASB@). 'e observa que c#ando ASB@ es pe.#eCa , la velocidad inicial es directamente proporcional a la concentraci%n de sustrato, y por tanto, la reacci%n es de primer orden con respecto al sustrato(?igura 4>). A a$!as ASB@, el enzima se encuentra saturada por el sustrato, es decir, todos los centros activos estn ocupados, y un incremento en `'aF no se traduce en un incremento de la velocidad(?igura 4>). En este punto, la reacci%n es de orden cero con respecto al sustrato, y la velocidad es m$ima (Qma$). La relaci%n entre la velocidad inicial (vF) y la concentraci%n de sustrato (`'a) est descrita por el mode$o cin(!ico de Mic-ae$is0Men!en. 0ropusieron que las reacciones catalizadas enzimticamente ocurren en dos e!apas (?igura 42). En la primera etapa se forma el comple!o enzima6sustrato y en la segunda, el comple!o se convierte en producto, liberando el enzima libre#

iii. In-i&icin en8im/!ica <na enzima no tiene por qu actuar siempre a la misma velocidad. 'u actividad est modulada por cambios en el p5 o en la !empe"a!#"a. 'u velocidad depende de las concen!"aciones de s#s s#s!"a!os y de sus cofac!o"es. La p"esencia de $os p"od#c!os finales tambin puede acer que la reacci%n sea ms lenta, o incluso invertir su sentido. +iertas molculas pueden in ibir la acci%n cataltica de una enzima# son los in-i&ido"es. 'e pueden distinguir varios tipos de in ibidores, en funci%n de su forma de actuaci%n# J In-i&ido"es compe!i!i%os# son molculas con una estructura similar a la del sustrato que se unen al centro activo de la enzima e impiden que sta act.e sobre el sustrato (?igura 4F). J In-i&ido"es no compe!i!i%os # se unen a la enzima por un lugar distinto del centro activo y esta uni%n provoca un cambio de conformaci%n que modifica el centro activo de forma que el sustrato ya no puede unirse (?igura 4F). J In-i&ido"es incompe!i!i%os . se unen al comple!o enzima6sustrato e impiden que se complete la reacci%n (?igura 4F). *ay enzimas que pueden adoptar 1 conformaciones interconvertibles llamadas K (rela!ada) y : (tensa). K es la forma ms activa (?igura 44). Las formas K y : se encuentran en equilibrio K :. +iertas sustancias tienden a estabilizar la forma K. 'on los llamados mod#$ado"es posi!i%os . El propio sustrato es a menudo un modulador positivo. Las molculas que favorecen la forma K pero que act.an sobre una regi%n de la enzima distinta del centro activo son los ac!i%ado"es a$os!("icos. Las sustancias que favorecen la forma : y disminuyen la actividad enzimtica son los mod#$ado"es ne'a!i%os . 'i estos moduladores act.an en lugares distintos del centro activo se llaman in-i&ido"es a$os!("icos (?igura 44). )tras enzimas pasan de una forma menos activa a otra ms activa #ni(ndose co%a$en!emen!e a #n '"#po .#mico de peque"o tama"o como el 0i o el &/0 (?igura 41). :ambin se da el caso inverso, en el que una enzima muy activa se desactiva al liberar alg.n grupo qumico. En las enzimas de las vas degradativas del metabolismo (catabolismo), la forma fosforilada es ms activa que la no fosforilada, mientras que en las vas biosintticas (anabolismo) ocurre lo contrario. &lgunas enzimas no se sintetizan como tales, sino como protenas precursoras sin actividad enzimtica. Estas protenas se llaman p"oen8imas o 8im'enos. 0ara activarse, los zim%genos sufren un ataque idroltico que origina la liberaci%n de uno o varios pptidos (?igura 47). El resto de la molcula proteica adopta la conformaci%n y las propiedades de la enzima activa.

&lgunas enzimas tienen distinta estructura molecular aunque su funci%n biol%gica sea la misma. 'on las llamadas iso8imas o isoen8imas. Estas diferencias de estructura se traducen en ligeros cambios en sus propiedades, de forma que cada isozima se adapta perfectamente a la funci%n que debe realizar. i%. Mecanismos de $a accin en8im/!ica +e9emp$os) 4. 0roteasas Las peptidasas (antes conocidas como proteasas) son enzimas que rompen los enlaces peptdicos de las protenas. <san una molcula de agua para acerlo y por lo tanto se clasifican como idrolasas. 'e encuentra naturalmente en organismos vivos, donde se usan para la digesti%n molecular y la reducci%n de protenas no deseadas. Las peptidasas pueden romper ya sea enlaces peptdicos especficos (*rotelisis li$itada), dependiendo en la secuencia de aminocidos de la protena, o pueden reducir un pptido completo a aminocidos. ((rotelisis ili$itada) +omo las peptidasas son en s mismas pptidos, es natural preguntarse si las peptidasas se pueden degradar. Es un ec o conocido que muc as peptidasas se desdoblan a s mismas. Esto puede ser un mtodo importante de regulaci%n de la actividad de las peptidasas. 1. &n idrasas carb%nicas La an idrasa carb%nica (&+, carbonato de idratasa# E.+. =.1.4.4) es una enzima que pertenece a una familia de metaloenzimas (enzimas que contienen uno o ms tomos metlicos como componente funcional de la enzima) y que catalizan la conversi%n rpida de di%$ido de carbono y agua a bicarbonato y protones, una reacci%n que ocurre ms lenta en ausencia del catalizador.4 La an idrasa carb%nica incrementa significativamente la tasa de reacci%n, donde las tpicas tasas catalticas de las diferentes formas de esta enzima tienen valores que alternan entre 4F = y 4F> reacciones por segundo.1 El centro activo de la mayora de las an idrasas carb%nicas contiene un ion de zinc (cn). 7. Endonucleasas de restricci%n 'on enzimas que pueden cortar el &(B y que tienen la venta!a de que lo cortan en sitios concretos. ?ueron descubiertas en bacterias, y son enzimas que estas bacterias usan para destruir &(B que ingresa a ellas, por e!emplo &(B de virus bacteri%fagos. +on las enzimas, la bacteria puede degradar este &(B forneo sin degradar su propio &(B. La venta!a de estas enzimas es que reconocen un sitio para cortar, pueden ser un dise"o de =, >, 5 bases, pero tienen que estar organizadas con una secuencia e$acta y no otra. Estas enzimas de restricci%n, entonces permiten cortar el &(B en sitios especdficos. &lgunas de ellas cortan de!ando e$tremos co esivos que se pueden pegar nada ms que por complementariedad de bases. Esto quiere decir que un e$tremo que gener%

una enzima y otro que gener% la misma enzima aunque provengan de molculas de &(B diferentes, se pueden unir y generar lo que se llam% inicialmente un &(B recombinante. &. In!"od#ccin a$ me!a&o$ismo i. 3ano"ama de$ me!a&o$ismo El me!a&o$ismo comprende una serie de transformaciones qumicas y procesos energticos que ocurren en el ser vivo. 0ara que sucedan cada una de esas transformaciones se necesitan enzimas que originen sustancias que sean a su vez productos de otras reacciones. El con!unto de reacciones qumicas y enzimticas se denomina "#!a o %a me!a&$ica. El metabolismo se divide en# e El ca!a&o$ismo es el metabolismo de degradaci%n de sustancias con liberaci%n de energa. e El ana&o$ismo es el metabolismo de construcci%n de sustancias comple!as con necesidad de energa en el proceso. En las "#!as me!a&$icas se necesitan numerosas y especficas molculas que van conformando los pasos y productos intermedios de las rutas. 0ero, adems, son necesarios varios tipos de molculas indispensables para su desarrollo final# 4. me!a&o$i!os (molculas que ingresan en la ruta para su degradaci%n o para participar en la sntesis de otras sustancias ms comple!as), 1. n#c$e!idos (molculas que permiten la o$idaci%n y reducci%n de los metabolitos), 7. mo$(c#$as ene"'(!icas (&:0 y S:0 o la +oenzima & que, al

almacenar o desprender fosfato de sus molculas, liberan o almacenan energa). =. mo$(c#$as am&ien!a$es (o$geno, agua, di%$ido de carbono, etc. que se encuentran al comienzo o final de alg.n proceso metab%lico). +ada clula desarrolla miles de reacciones qumicas que pueden ser e6e"'nicas (con liberaci%n de energa) o ende"'nicas (con consumo de energa). Las reacciones qumicas dentro de una clula estn regidas por las mismas leyes termodinmicas. Las reacciones, termodinmicamente pueden ser# fS g F.........+erca del equilibrio. :ienen dos sentidos. fS hh F.........&le!ada del equilibrio.'%lo tiene un sentido. SG Energia libre Las reacciones cercanas al equilibrio se caracterizan porque# H Las enzimas que catalizan tienen su actividad muy grande y la actividad del enzima no es un factor limitante del enzima. H 'on reacciones fcilmente reversibles y dependen de la relaci%n de sustratos y productos. La direccionalidad va a venir dada en cambios de sustrato y producto. El flu!o de la va va a venir determinado por las concentraciones de sustrato y producto. Las reacciones cercanas al equilibrio# H Los enzimas tienen muy poca actividad pero son sensiblesa procesos de variaci%n de su actividad. H 'on poco sensibles a la variaci%n de concentraci%n de sustrato y producto y s%lo tienen una direcci%n en la va metab%lica. Las reaccionen le!anas del equilibrio son las que mayormente regulan la va metab%lica. Las reacciones cercanas al equilibrio, pocas veces regulan el flu!o de la va metab%lica. EL CATABOLISMO El ca!a&o$ismo comprende el metabolismo de degradaci%n o$idativa de las molculas orgnicas, cuya finalidad es la obtenci%n de energa necesaria para que la clula pueda desarrollar sus funciones vitales. (ebe

e$istir una .ltima molcula que capte los electrones o los idr%genos desprendidos en las reacciones de o$idaci%n. 'i el aceptor de electrones es el o$geno molecular la ruta o el catabolismo es ae"&ico y si es otra molcula es ca!a&o$ismo anae"&ico. El ca!a&o$ismo ae"o&io est formado por varias rutas metab%licas que conducen finalmente a la obtenci%n de molculas de &:0. Estas molculas de &:0 ms tarde sern imprescindibles para dar energa en las rutas anab%licas. La energa que no se usa se disipar en forma de calor.

E$ ca!a&o$ismo anae"&ico +uando el catabolismo se realiza en condiciones anae"&icas, es decir cuando el .ltimo aceptor de idr%genos o electrones no es e$ o6'eno, sino una molcula orgnica sencilla, las rutas de degradaci%n de la glucosa se llaman fe"men!aciones. En un mismo organismo pluricelular pueden darse rutas aer%bicas o anaer%bicas, seg.n las condiciones ambientales de la clula. 0or e!emplo, la clula muscular puede funcionar con o$geno asta que ste llega con dificultad al te!ido. :raba!a entonces en condiciones anaerobias produciendo cido lctico. EL A4ABOLISMO

La construcci%n de biomolculas propias e$clusivas s%lo pueden llevarla a cabo los seres vivos a base de capturar determinadas sustancias del medio en que viven (a#!!"ofos). En muc os seres vivos la nutrici%n solo puede realizarse mediante la ingesti%n de otros seres vivos (-e!e"!"ofos). Buestra vida en el planeta tierra depende de la funci%n de unos seres vivos muy especiales, que son capaces de fabricar su propia materia a partir de la luz. 'e trata de plantas verdes y algas que realizan la fo!osn!esis. Los organismos fotosintticos utilizan la luz del sol y transforman su energa luminosa en energa para formar gl.cidos y otras molculas orgnicas. Estas molculas orgnicas forman sus te!idos que sirven de alimento a los seres vivos no fotosintetizadores. El ana&o$ismo o &iosn!esis es una de las dos partes del metabolismo, encargada de la sntesis o bioformaci%n de molculas orgnicas (biomolculas) ms comple!as a partir de otras ms sencillas o de los nutrientes, con requerimiento de energa, al contrario que el catabolismo. El anabolismo es el responsable de# J La formaci%n de los componentes celulares y te!idos corporales y por tanto del crecimiento. J El almacenamiento de energa mediante enlaces qumicos en molculas orgnicas.

Las clulas obtienen la energa del medio ambiente mediante tres tipos distintos de fuente de energa que son# J La luz solar, mediante la fotosntesis en las plantas. J )tros compuestos orgnicos como ocurre en los organismos eter%trofos. J +ompuestos inorgnicos como las bacterias quimiolitotr%ficas que pueden ser aut%trofas o eter%trofas. El anabolismo se puede clasificar acadmicamente seg.n las biomolculas que se sinteticen en# J Keplicaci%n o duplicaci%n de &(B. J 'ntesis de &KB. J 'ntesis de protenas.

J 'ntesis de gl.cidos. J 'ntesis de lpidos. ii. Ca"ac!e"s!icas de $as %as me!a&$icas Las rutas metab%licas son una serie de reacciones catalizadas enzimticamente. En una ruta, un precursor se convierte en un producto a travs de una serie de intermediarios# los metabolitos. En ellas# 6Las reacciones bioqumicas son muc as, pero las reaccione importantes son relativamente pocas 6Las rutas metab%licas centrales son pocas y son similares en todas las formas vivas 6Las molculas importantes del metabolismo no son mas de 4FF 6:odas las rutas se regulan de forma similar.

Las rutas metab%licas comparten varias caractersticas comunes, por e!emplo, la mayora requiere de &:0 como fuente fundamental de energa. las sustancias intermedias producidas en las rutas metab%licas generalmente no se almacenan en cambio, se producen los intermedios de otras sustancias en el momento en que es necesario. En las diferentes partes de la clula ocurren diferentes reacciones metab%licas, por e!emplo, la degradaci%n de la glucosa ocurre en el citoplasma, y la o$idaci%n de los cidos grasos ocurre en las mitocondrias9 as, las sustancias comunes a ms de una ruta se deben transportar de un organelo a otro. ?inalmente, cada ruta metab%lica esta regulada por muc os mecanismos diferentes9 las enzimas alostricas y la ormonas son generalmente los agentes qumicos que regulan a estas.

Las rutas metab%licas pueden ser convergentes, divergentes o cclicas

Kegulaci%n de las rutas metab%licas 'irve para# -ue la velocidad de la va est adaptada a las necesidades de la clula -ue las vas de sntesis y degradaci%n no est activas a la vez. Las rutas catab%licas y anab%licas no son inversas las unas de las otras. &mbas rutas tienen a menudo localizaci%n diferente en las clulas. 'e d a tres niveles# 4. 0or los en'i$as alost+ricos, capaces de cambiar la actividad cataltica en respuesta a moduladores estimuladores o in ibidores. 1. /ediante regulacin hor$onal. 7. 0or regulacin de la concentracin de un enzima en la clula (regulaci%n gentica)

iii. T"ansfo"maciones de ene"'a en e$ me!a&o$ismo1 p"incipios !e"modin/micos :raba!o y energa biol%gicos JLos seres vivos captan EBEKSi& de diversas fuentes J<tilizan la energa para desarrollar :K&T&j) TI)LkSI+) JLos organismos realizan gran cantidad de transformaciones de energa J+onvierten la energa qumica (&:0) de los combustibles en# +alor, energa mecnica, energa elctrica, otras fuentes de energa qumica

0rincipios bsicos de la bioenergtica Tioenergtica# Kama de la bioqumica que estudia la transferencia y utilizaci%n de energa en los sistemas biol%gicos. +omprende el estudio cuantitativo de los cambios de energa de las reacciones bioqumicas. &plica los principios bsicos de la termodinmica a los sistemas biol%gicos. 'istema# se denomina sistema termodinmico a aquella parte del universo que se est observando. El entorno es el resto del universo. El sistema y su entorno constituyen el universo. Las clulas vivas y los organismos son sistemas abiertos que intercambian materia y energa con el entorno

Estado de un sistema: forma de comportarse el sistema en un instante dado. Cuando se produce una variacin en el estado de un sistema se dice !ue este "a sufrido una transformacin un proceso en el !ue e#iste un estado inicial $ un estado final. El incremento %& es la diferencia entre el valor de una varia'le en el estado inicial $ en el estado final.

(unciones de estado: a!uellas funciones termodin)micas cu$o valor depende slo del estado del sistema. Si en un sistema se produce una transformacin la variacin de las funciones de estado depende *nicamente del estado inicial $ del estado final $ no del camino por el !ue se reali+a la transformacin. ,ol*men , Presin P Entalp-a . Ener/-a li're 0 etc. 4er principio# +onservacion de la energa 12a ener/-a ni se crea ni se destru$e solo se transforma de una forma a otra3 E4: los animales convierten la E5 !u-mica %A6P& en 7 calor %mantenimiento 65& 76ra'a4o %E5 mec)nica E5 el8ctrica otras formas de E5 !u-mica& En todas estas conversiones de E5 esta no se crea ni se destru$e. . 9 EN6A2P:A %contenido calrico del sistema& %;<mol& . 9 calor !ue se li'era o se a'sor'e durante una reaccin . %7&.... E=>6ERMICA %li'era calor& . %?& .... END>6ERMICA %a'sor'e calor& 1do principio# &naliza la direcci%n de los procesos favorables o espontaneos @en todo proceso el desorden total del universo aumenta1 S 9 entrop-a %medida cuantitativa del desorden& %;<mol A& % Ssistema ? Sentorno & B C 9 proceso espont)neo Entrop-a9 la ener/-a de un sistema !ue no puede utili+arse para reali+ar un tra'a4o *til Ener/-a li'reo o ener/-a de 0i''s %0&: 2a ener/-a li're %0& es la parte de ener/-a de un sistema capa+ de "acer tra'a4o 'iol/ico. 2as reacciones espont)neas van en la direccin de m)s 'a4a ener/-a li're 0 %7& E=ER0DNICA favora'le o espont)nea 0 %?& ENDER0DNICA no espont)nea. 09C e!uili'rio

c. Das me!a&$icas p"incipa$es i. De'"adacin de a87ca"es $pidos Me!a&o$ismo de ca"&o-id"a!os +C5Os) Los carbo idratos de la racion proporcionan mas del 8Fb de la energia necesaria para el traba!o metabolico, el crecimiento, la reparacion, la secrecion, la absorcion, la e$crecion y el traba!o mecanico. El metabolismo de +*)s incluye las reacciones que e$perimentan los +*)s de origenes alimentarios o los formados a partir de compuestos diferentes a los +*)s. La o$idacion de este tipo de gl.cidos proporciona energia, se almacenan como glucogeno, sirven para la sintesis de aminoacidos no esenciales y ante el e$ceso de +*)s se favorece la sintesis de acidos grasos. G$#c$isis +Da de Em&den0Me e"-of) La glucolisis es un proceso comun a todas las celulas, es la principal via metabolica de utilizacion de e$osas, principalmente glucosa pero tambien directamente de la fructosa y de la galactosa. El con!unto de las reacciones permiten o$idar parcialmente la glucosa para formar piruvato con el ob!eto de liberar energia para sintetizar &:0. Esta via se desarrolla totalmente en el citoplasma celular en condiciones anaerobicas o aerobicas. 0ueden considerarse dos fases dentro de esta via. 4) La primera parte o fase preparativa, la glucosa es activada y para ello se emplean dos &:0. Los enzimas e$ocinasa y glucosinasa son responsables de la conversion de glucosa a glucosa >60. La e$ocinasa se encuentra en todos los te!idos, tiene una gran afinidad por la glucosa y otras e$osas, puede llevar a cabo la reaccion aun a ba!as concentraciones del enzima y es in ibido por la glucosa >60. El enzima glucocinasa se localiza en el igado y en las celulas A del pancreas, tiene una ba!a afinidad por la glucosa, por ello es efectiva cuando la glucosa se encuentra a elevadas concentraciones, no es in ibido por el producto y esta ausente o sus concentraciones son muy ba!as en los rumiantes. La formacion de fructosa 4, >6bi fosfato se lleva a cabo por la fosfofructocinasa.

Este enzima esta presente solo en la glucolisis, asi, constituye un sitio de control. La adrenalina, el glucagon, aumento en los acidos grasos libres, el citrato, y el &:0 in iben su actividad. 1) En la segunda parte de la glucolisis o fase productora de energia, se lleva a cabo la generacion de &:0. El balance general de las reacciones de la glucolisis es el siguiente#

En condiciones anaerobias se produciran y en condiciones aerobias se generaran que entraran al +iclo de ;rebs (ciclo del acido ctrico).

EO:K&# G$#c$isis La gluc%lisis es la va metab%lica encargada de o$idar la glucosa y as obtener energa para la clula. La gluc%lisis se realiza en todas las clulas del organismo, especficamente se produce en el citosol celular9 la ruta metab%lica inicia con ^glucosa > fosfato_ y termina con dos molculas de piruvato. G$#c$isis anae"&ica La gluc%lisis anaer%bica generalmente sucede en las clulas musculares, particularmente del m.sculo esqueltico que se contrae vigorosamente9 el piruvato formado en la gluc%lisis, al no poder o$idarse ms por falta de o$geno, se reduce a lactato. G$#co'en$isis La glucogen%lisis se activa en el gado en respuesta a una demanda de glucosa en la sangre9 e$isten tres activadores ormonales importantes de la glucogen%lisis# el glucag%n, la epinefrina (adrenalina) y el cortisol. La ruta metab%lica consiste en romper molculas de gluc%geno mediante fosfor%lisis para producir ^glucosa 4 fosfato_ que despus se convertir en ^glucosa > fosfato_. G$#coneo'(nesis La gluconeognesis es la sntesis de glucosa a partir de otras molculas como ciertos aminocidos, lactato, piruvato, glicerol y cualquiera de los intermediarios del ciclo de ;rebs como fuentes de carbono para la va metab%lica. Seneralmente la gluconeognesis tiene lugar durante la recuperaci%n del e!ercicio muscular. Cic$o de$ /cido !"ica"&o6$ico El ciclo del cido tricarbo$lico se lleva a cabo dentro de las mitocondrias y a travs de ste se completa la gluc%lisis aer%bica, al descomponer el piruvato en energa (&:0)9

asimismo participa en la o$idaci%n de cidos grasos y algunos aminocidos, liberando energa en forma utilizable (&:0). E$ ace!i$ CoA El acetil +o& puede

formarse a partir de carbo idratos, grasas y protenas9 es el punto de comienzo para la sntesis de grasa, esteroides y cuerpos cet%nicos. 'u o$idaci%n dentro del ciclo del cido tricarbo$lico proporciona energa para el organismo. El acetil +o& se localiza en la matriz mitocondrial.

Me!a&o$ismo de $pidos Los acidos grasos (&S) son los componentes principales de los lipidos comple!os (triacilgliceroles, fosfolipidos). Los triacilgliceroles son la forma mas importante de almacenamiento de energia en los animales. Este tipo de almacenamiento presenta sus venta!as, al o$idarse el + de los &S producen mas &:0 que cualquier otra forma de +, ademas, los lipidos estan menos idratados que los polisacaridos, por lo que ocupan menos espacio. Los &S se incorporan a las membranas celulares. El principal organo de interconversion y metabolismo de lipidos es el igado. Biosn!esis de /cidos '"asos El igado, el te!ido adiposo y la glandula mamaria son los sitios mas importantes de biosintesis de &S. La actividad del te!ido adiposo predomina en el rumiante. Los principales sustratos para la sintesis de &S son el acetil6+o& y el B&(0*, estos se generan en la glucolisis, el ciclo de las pentosas y el ciclo de ;rebs. El enzima citrato sintasa convierte al acetil +o& y al )&& en citrato y de esta manera logra cruzar la membrana mitocondrial para salir al citoplasma9 el citrato es retransformado en acetil +o& y )&& en el citosol por el enzima &:06citrato liasa. El o$alato se convierte en malato para regresar a la mitocondria e incorporarse al ciclo de ;rebs. El enzima malica descarbo$ila al malato en piruvato que puede ser transportado a la mitocondria. Este enzima en el citosol genera B&(0*, necesario para la sintesis de &S. Los enzimas para la sintesis de &S estan organizados en un comple!o multienzimatico en los animales. El comple!o es llamado acido graso sintasa que ademas incluye la proteina transportadora de acilos (0:& o &+0). 'olo ay una reaccion en la sintesis de &S que no ocurre en el comple!o, esta es la formacion de malonil6+o& a partir de acetil6+o& la cual es catalizada por la acetil6+o& carbo$ilasa. El comple!o acido grasa sintasa cataliza# la union entre el acetil6+o& y malonil6+o&, una reaccion de condensacion, reacciones de reduccion, de continuacion, de elongacion, desaturacion. La sintesis de &S produce principalmente acido palmitico, que sera el sustrato para producir una variedad de &S. En los rumiantes, el acetato es la fuente mas importante para la sintesis de &S. Los enzimas &:0citrato liasa y malica no funcionan. 0or esta razon los rumiantes recurren al ciclo de las pentosas, a la o$idacion de isocitrato a @6cetoglutarato en el citosol y la desviacion isocitrato6o$aloacetato en la mitocondria, para conseguir equivalentes reductores (B&0(*). La primera reaccion limitante de la sintesis de &S es la sintesis de malonil6+o&. El enzima acetil6+o& carbo$ilasa es estimulado por elevadas concentraciones de citrato y altas concentraciones de &:0. 0or el contrario es controlada por mecanismos de fosforilacion y desfosforilacion. El enzima fosforilado es menos activo. La insulina promueve la desfosforilacion y el glucagon la fosforilacion.

O6idacin de $os /cidos '"asos +uando el aporte de energia de la dieta es insuficiente, el animal responde con la senal ormonal, que se transmite al te!ido adiposo por medio de la liberacion de adrenalina, glucagon u otras ormonas. Estas se unen a la membrana de la celula adiposa y estimulan la sintesis del quien activara a una proteina quinasa que fosforila y activa a la triglicerido lipasa. Los trigliceridos se idrolizan a digliceridos, liberando un acido graso del carbono 4 o 7 del glicerol. Los digliceridos y los monogliceridos son idrolizados rapidamente para producir acidos grasos y glicerol. El acido graso no esterificado sale a la sangre y se une a la albumina para ser transportado a otros te!idos, y el glicerol sera utilizado por el igado para la produccion de glucosa. Los &S se o$idan en el carbono A, de a i el nombre de A6o$idacion y se degradan a acido acetico y un acido graso con dos carbonos menos#

La A6o$idacion inicia con una reaccion de des idrogenacion (acil6+o& des idrogenasa), utilizando a ?&( como coenzima. El producto de esta reaccion es un enoil6+o& y . El enoil6+oa es idratado por la enoil6+o& idrasa, se produce un idro$iacil6+o&. El grupo idro$ilo de este compuesto es o$idado por y la idro$iacil6 +o& des idrogenasa, se produce A6cetoacil6+o& y B&(*. El ultimo paso es catalizado por una tiolasa, produciendo acetil6+o& y un acil6+o&, con dos carbonos menos que el sustrato inicial. Estos pasos se repiten asta que en la ultima secuencia de reacciones el butiril6+o& es degradado a dos acetil6+o&. En los rumiantes, la o$idacion de &S de cadena impar puede representar tanto como el 18b de sus requerimientos de energia. La o$idacion de un &S de 42 carbonos daria por resultado 2 acetil6+o& y un propionil6+o&. El propionil6+o& es tambien un producto de la degradacion de valina e isoleucina. El propionil6+o& es convertido en succinil6 +o& y sera utilizado en el ciclo de ;rebs. ii. E$ cic$o de$ /cido c!"ico E$ cic$o de ?"e&s +cic$o de$ /cido !"ica"&o6$ico o de$ /cido c!"ico) La glucolisis y el ciclo de ;rebs son consideradas las vias metabolicas e!e, participan en la degradacion de casi todos los componentes que la celula es capaz de degradar y proveen el poder reductor y los materiales de construccion, ademas del &:0, para todas las secuencias biosinteticas de la celula energia para otras actividades. El proceso general es el de metabolismo respiratorio aerobico. En estas condiciones, el es el ultimo aceptor de energia, los atomos de + de la glucosa (u otro sustrato) se o$idan por completo a y , la energia se conserva, la produccion de &:0 es 1F veces mas importante en comparacion de las condiciones anaerobicas.

En este ciclo se pueden mencionar dos procesos separados pero relacionados# 4) El metabolismo o$idativo, ay remocion de electrones de sustancias organicas y transferencia a coenzimas. 1) *ay reo$idacion de las coenzimas a traves de la transferencia de electrones al acompa"ada directamente de la generacion de &:0. En anaerobiosis, la glucolisis es la fase inicial del catabolismo de la glucosa. Los otros componentes del metabolismo de respiracion son el ciclo de ;rebs (continuacion de la o$idacion del piruvato), la cadena de transporte de electrones y la fosforilacion o$idativa de &(0 a &:0 a traves de un gradiente de protones generado en el transporte de electrones. El proceso completo genera de 7> a 75 moleculas de &:0Dmol de glucosa, en cada vuelta del ciclo de ;rebs entran dos moles de acetil +o& y se liberan 1 carbonos () lo que regenera la molecula de o$aloacetato ()&&). La serie de eventos de la descarbo$ilacion o$idativa del piruvato para producir acetil +o& es catalizada por el comple!o de la piruvato des idrogenasa (localizado en la mitocondria).

El primer paso del ciclo de ;rebs es catalizado por el enzima citrato sintasa. El resumen del proceso es#

El ciclo de ;rebs es sensible a la disponibilidad de su sustrato (acetil6+o&), a los niveles acumulados de sus productos finales, B&(* y &:0, asi como a las relaciones B&(*Dy &:0D&(0. )tros reguladores son la relacion acetil6+o&D+o& libre, acetil6 +o&Dsuccinil6+o& y citratoDo$aloacetato. 4 B&(* en la mitocondia produce 7 &:0 $ 7 en el ciclo G 3 &:0 4 ?&(*1 en la l l 1 &:0 $ 4 en el ciclo G 1 &:0 4 S:0 es anlogo a 4 &:0 $ 4 en el ciclo G 4 &:0 TOTAL por cada vuelta del ciclo 1, AT3

d. *osfo"i$acin o6ida!i%a La fosforilaci%n o$idativa se define como la formaci%n de &:0 generada por la transferencia de electrones. :odas las rutas catab%licas, en los organismos aerobios, convergen para permitir elcflu!o de electrones asta el o$geno, produciendo energa para la generaci%n de &:0 constituyendo la etapa final del catabolismo de todas las biomolculas. i. T"anspo"!e "espi"a!o"io de e$ec!"ones p"o!ones

& travs de las distintas rutas catab%licas analizadas asta este punto, se a ido produciendo una liberaci%n de energa neta, en forma de &:0, y un segundo tipo de energa denominado poder reductor, en forma de coenzimas reducidos. Los principales coenzimas, que an participado en reacciones de %$ido6reducci%n tanto en el citoplasma como en la mitocondria, son B&(* y ?&(*19 los cuales iniciarn a ora, una ruta metab%lica, la cadena de transporte electr%nico o cadena respiratoria, que permitir, por un lado, la recuperaci%n de los coenzimas en su forma o$idada, y por otro, que los electrones sean conducidos a travs de una serie de etapas sucesivas asta el )1, para formar agua. En este proceso de transferencia electr%nica es donde se producir un fuerte desprendimiento energtico aprovec ado para la formaci%n de enlaces de alta energa en forma de &:0. REACCIO4ES DE EFIDO0REDUCCIE4 & la ora de analizar la cadena de transporte electr%nico es importante realizar una breve consideraci%n de las reacciones de %$ido6reducci%n. Estas reacciones tienen lugar cuando ay una transferencia de electrones desde un dador, denominado reductor asta un aceptor que se denomina o$idante. Los elementos que participan en estas reacciones pueden encontrarse en dos formas# o$idada y reducida formando un par redo$ con!ugado.

&unque la mayor parte del estudio de las reacciones de este tipo tienen como elementos participantes a iones metlicos, las molculas orgnicas tambin pueden e$perimentar prdida o ganancia de electrones, interviniendo como otro sustrato ms en las reacciones de %$idoN reducci%n. (e las molculas orgnicas ms abituales se an citado ya los coenzimas B&(R y ?&(. En la mayora de las reacciones analizadas en las rutas metab%licas descritas, la transferencia es de electrones !unto con idrogeniones, o lo que es lo mismo tomos de idr%geno, ya que#

(esarrollndose de forma genrica la siguiente reacci%n#

&s una de las reacciones que transcurren en el ciclo del cido ctrico#

& las pare!as /alatoD)$alacetato, y B&(RD B&(* R *R se les denomina pares redo$, y la capacidad que tiene cada uno de estos pares para captar o ceder electrones viene e$presado por el potencial de %$ido6reducci%n, o abreviadamente por potencial redo$. CADE4A DE TRA4S3ORTE ELECTRE4ICO (e forma sinttica, en la cadena de transporte electr%nico se produce la o$idaci%n de los coenzimas reducidos, por el fuerte potencial redo$ del )1D*1), y la reducci%n del o$geno para formar agua.

&l ser la diferencia de potencial entre estos pares tan grande, la variaci%n de energa libre es tambin muy alta (fSo[ G N81,> ;calDmol), lo que ace de esta reacci%n un proceso fuertemente e$oerg%nico. Esta diferencia de potencial constituye la fuerza directriz para el desarrollo de la cadena de transporte electr%nica y de la fosforilaci%n o$idativa. 0ara lograr el m$imo aprovec amiento energtico, el proceso de %$ido6reducci%n no se desarrolla en una .nica reacci%n como la representada superiormente, sino que se desarrolla en una secuencia de varias reacciones. Este procedimiento permite distribuir el fuerte desprendimiento instantneo de energa en cuantos menores, proporcionando una rentabilidad muc o mayor en forma de energa metab%lica.

ELE/EB:)' (E L& +&(EB& KE'0IK&:)KI&

Esta ruta metab%lica est formada por tres grandes comple!os enzimticos, denominados B&(*reductasa, citocromo reductasa y citocromo o$idasa, conectados entre s por dos transportadores m%viles de electrones que son la ubiquinona y el citocromo c. Los grupos transportadores de electrones en las protenas enzimticas son grupos prostticos como las flavinas, comple!os de ierro6azufre, grupos emo e iones cobre. La incorporaci%n de los electrones procedentes de la coenzima ?&(*1 se lleva a cabo mediante un comple!o distinto de los anteriores que es la succinato6reductasa. & diferencia de los tres comple!os anteriores, que canalizan la energa desprendida en la reacci%n redo$ e$oerg%nica en bombear protones de la matriz a la cara citoplasmtico de la membrana, este .ltimo comple!o no es capaz de realizarlo. Estos comple!os estn formados por pares redo$ con potenciales sucesivamente crecientes, que establecen un flu!o direccional de electrones y un desprendimiento secuencial de energa. Reacciones de$ !"anspo"!e e$ec!"nico Las reacciones que tienen lugar a nivel de la B&(*6reductasa o comple!o I son una serie de reacciones redo$, en las que intervienen un coenzima flavnico (?/B o flavina mononucle%tido), y un centro ferrosulfurado en el que el tomo de ierro es el que realiza el intercambio electr%nico para cederlos al coenzima -. El flu!o de dos electrones desde el B&(* asta el coenzima - o ubiquinona, da lugar al bombeo de cuatro *R a travs de la membrana mitocondrial interna, desde la matriz acia su cara citoplasmtica.

El comple!o II o succinato6reductasa se encuentra a nivel de la membrana, y uno de sus componentes es una enzima del ciclo del cido ctrico, la succinato des idrogenasa, que cataliza la reacci%n de succinato a fumarato. <no de los productos de la reacci%n, el coenzima reducido ?&(*1 no abandona el comple!o, transfiriendo los electrones en el interior del mismo a un centro ?e6', para posteriormente ser cedidos al coenzima -. Esta es la .nica enzima del ciclo del cido ctrico que no se encuentra libre en la soluci%n de la matriz mitocondrial, sino que est fuertemente unida a la membrana mitocondrial interna. 0or otro lado, algunas de las enzimas mitocondriales que utilizan ?&( (acil6+o& des idrogenasa, primer enzima de la A6o$idaci%n), no introducen sus electrones a la cadena de transporte electr%nico a travs del comple!o II, sino mediante una flavoprotena transportadora de electrones (E:?06 ubiquinona reductasa) que reduce directamente la ubiquinona o coenzima -. El potencial de transferencia electr%nica es menor en este comple!o que en el anterior, y el desprendimiento energtico no es suficiente para el bombeo de idrogeniones, lo que se traducir en un menor rendimiento de &:0, comparado con el obtenido cuando los electrones penetran en la cadena utilizando el comple!o I. La segunda bomba de idrogeniones, se sit.a en el comple!o III o citocromo6reductasa , que se caracteriza principalmente por disponer de grupos prostticos emo, similares a los de la emoglobina, con un tomo de ?e que se alterna entre su estado reducido o ferroso (?e1R) y el estado o$idado o frrico (?e7R). & travs de la siguiente secuencia de reacciones los electrones son transferidos asta el citocromo c, este flu!o genera un potencial suficiente para bombear 1 *R acia el lado citoplasmtico. La diferencia de potencial de transferencia es menor que en el comple!o I y por lo tanto la capacidad de mover los idrogeniones tambin es menor.

& travs del .ltimo comple!o, la citocromo6o$idasa acepta cuatro electrones del citocromo c, uno cada vez, a travs de dos grupos emo que utilizan tomos de cobre y los transfiere a una sola molcula de )1 formando dos molculas de *1). 'e estima que el 3F b del consumo total de o$geno de las clulas es realizado por la citocromo6o$idasa. El o$geno molecular es un aceptor de electrones con un fuerte carcter o$idante, una alta tendencia a captar electrones, pero reacciona muy lentamente a menos que sea activado catalticamente. Esta activaci%n es realizada por este comple!o, el cual tambin funciona como una bomba de protones, realizando un movimiento neto de = *R acia el espacio intermembranoso. &l final de todo este proceso (desde la glucolisis asta la cadena de transporte) se producen en total 7F moleculas de &:0. ACO3LAMIE4TO *OS*ORILACIE40OFIDACIE4 &unque an e$istido teoras m.ltiples que intentaban !ustificar la cone$i%n entre estas dos funciones, ninguna se sostena con los necesarios datos e$perimentales. El planteamiento de la ip%tesis quimiosm%tica o de /itc ell (0eter /itc ell, 43>4) permiti% la teorizaci%n y posterior corroboraci%n del mecanismo de dic o acoplamiento. El transporte de electrones y la sntesis de &:0 estaban acoplados a travs de un gradiente de protones, o idrogeniones, entre ambas caras de la membrana interna. El bombeo de protones, desarrollado por los diferentes comple!os de la cadena de transporte electr%nico, genera un aumento de concentraci%n de *R en la cara citoplasmtica, y un gradiente elctrico debido a la carga positiva movilizada por los protones acia el e$terior de la membrana. Estos gradientes establecen una fuerza protomotriz (movedora de protones) que empu!a a los idrogeniones acia el interior, y utilizando esta fuerza, el comple!o enzimtico &:0 sintasa (tambin denominada &:0asa mitocondrial o *R6&:0asa) formara enlaces de alta energa en forma de molculas de &:0. REGULACIE4 DE LA *OS*ORILACIE4 OFIDATIDA La velocidad con que se desarrolla la fosforilaci%n o$idativa est marcada por las necesidades energticas de la clula. 0ara que el proceso se realice de forma correcta se requiere un aporte de sustratos como B&(* (o ?&(*1), )1, &(0 y 0i siendo el ms importante el &(0. La concentraci%n intracelular de este metabolito es una

medida de las necesidades de energa metab%lica, y, por lo tanto, va a fi!ar la velocidad a la que a de desarrollarse la fosforilaci%n o$idativa. Esta regulaci%n por &(0 se denomina control respiratorio, ya que el consumo de )1 por parte de la mitocondria, es dependiente de la cantidad de &(0 presente. 'eg.n la actividad celular desarrollada, se producir un consumo mayor o menor de &:0, generndose cantidades variables de &(0. <na concentraci%n elevada de &(0 causar un incremento en la velocidad de la respiraci%n celular o fosforilaci%n o$idativa, intentando de manera continua reequilibrar la relaci%n &:0D&(0, o e$presado ba!o otros trminos, la sntesis de &:0 se realiza seg.n va siendo requerido por las necesidades celulares. :odas las rutas catab%licas estudiadas tienen una regulaci%n acoplada a la fosforilaci%n o$idativa, que se realiza a travs de la carga energtica9 de tal manera, que ay un engrana!e correcto y equilibrado entre todos los procesos productores de energa con el consumo de la misma. ii. Sn!esis de AT3 La &:0 sintasa es un comple!o enzimtico de gran tama"o, observable a microscopa electr%nica. Est formada por dos subunidades ?F , una porci%n idrof%bica que atraviesa la integridad de la membrana mitocondrial interna, formada por cuatro cadenas polipeptdicas y que funcionalmente constituye el conducto de protones. La otra subunidad ?4 protruye en el lado interno de la membrana, y est formada por cinco clases de cadenas polipeptdicas ,@7, A7, m, n y o. 'u papel funcional es catalizar la formaci%n de un enlace de alta energa, sintetizando &:0. El cuello intermedio que une ambas subunidades est formado a su vez por varias protenas reguladoras. El sistema mediante el cual funciona este comple!o, a permitido observar que el &:0 se forma rpidamente, a.n en ausencia de gradiente a travs de la misma, pero la carencia de fuerza protomotriz no permite la separaci%n del &:0 formado, que permanece unido a la sintasa. '%lo el flu!o de protones, la estimaci%n es de forma apro$imada de tres *R, origina la liberaci%n de un &:0. +ada par de electrones proveniente del B&(*, genera un flu!o neto de protones a travs del comple!o I, III y IQ de =, 1 y = protones respectivamente, lo que se traducir en la sntesis de 7 &:0s, la entrada de electrones a travs del ?&(*1 genera un flu!o de protones a travs del comple!o III y IQ de 1 y = respectivamente, que permitir la formaci%n de 1 &:0s.

e. F't'%/ te%i% i. A1%'r"i# $e (&+ ii. Tr! %-'rte *'t'%i t0ti"' $e e(e"tr' e% 2 -r't' e% iii. S/ te%i% $e ATP 3*'t'*'%*'ri(!"i# 4 i5. E( "i"(' $e C!(5i 5. F't'%/ te%i% C6, C4 2 CAM *. I tr'$&""i# !( met!1'(i%m' 1i'%i t0ti"' i. Met!1'(i%m' $e( itr#.e ' ii. P! 'r!m! $e (!% %/ te%i% $e !mi ',"i$'% iii. S/ te%i% $e ,"i$'% .r!%'% 2 ter-e '% .. I te.r!"i# met!1#(i"! i. 7/!% 2 re$e% met!1#(i"!%8 %& $i5er%i$!$

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