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UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARAN UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARAN UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARAN UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARAN

SETOR DE CINCIAS BIOLGICAS SETOR DE CINCIAS BIOLGICAS SETOR DE CINCIAS BIOLGICAS SETOR DE CINCIAS BIOLGICAS
DEPARTAMENTO DE PATOLOGIA BSICA DEPARTAMENTO DE PATOLOGIA BSICA DEPARTAMENTO DE PATOLOGIA BSICA DEPARTAMENTO DE PATOLOGIA BSICA
CURSO DE MEDICINA CURSO DE MEDICINA CURSO DE MEDICINA CURSO DE MEDICINA





















(BP335)


MANUAL MANUAL MANUAL MANUAL TERICO TERICO TERICO TERICO- -- -PRTICO DE PROCEDIMENTOS PRTICO DE PROCEDIMENTOS PRTICO DE PROCEDIMENTOS PRTICO DE PROCEDIMENTOS
BSICOS EM MICROBIOLOGIA MDICA BSICOS EM MICROBIOLOGIA MDICA BSICOS EM MICROBIOLOGIA MDICA BSICOS EM MICROBIOLOGIA MDICA

3 EDIO




REALIZA REALIZA REALIZA REALIZAO OO O

Professor Professor Professor Professora aa a: :: : Dr Cristina Leise Bastos Monteiro (Coordenadora)
Professora Professora Professora Professora: :: : Dr Laura Lcia Cogo
Professora Professora Professora Professora: :: : Dr Izabel Galarda
Acadmico Acadmico Acadmico Acadmico: :: : Fernando Carlos Bortolozzi Filho

CURITIBA
2009
2
SUMRIO SUMRIO SUMRIO SUMRIO


A SEGURANA DOS ALUNOS NAS AULAS PRTICAS DE
BACTERIOLOGIA E MICOLOGIA............................................................................... 3
INTRODUO ............................................................................................................ 5
CAPTULO 1: CONTROLE DE MICRORGANISMOS............................................... 13
CAPTULO 2: TIPOS MORFOLGICOS DE BACTRIAS E
GRUPAMENTOS BACTERIANOS............................................................................ 29
CAPTULO 3: MORFOLOGIA COLONIAL................................................................ 35
CAPTULO 4: VERIFICAO DA PRESENA DE BACTRIAS
NO AR E SUA CONTAGEM ATRAVS DE CULTIVO.............................................. 37
CAPTULO 5: PREPARAES MICROSCPICAS................................................. 39
CAPTULO 6: MEIOS DE CULTURA........................................................................ 52
CAPTULO 7: ISOLAMENTO DE MICRORGANISMOS........................................... 55
CAPTULO 8: PROVAS BIOQUMICAS DIFERENCIAIS.......................................... 58
CAPTULO 9: MICROBIOTA NORMAL DO ORGANISMO HUMANO...................... 69
CAPTULO 10: DIAGNSTICO LABORATORIAL ATRAVS DO
ISOLAMENTO E CARACTERIZAO DE AGENTES ETIOLGICOS .................... 79
- PORES SUPERFICIAIS E PROFUNDAS.......................................................... 79
- OROFARINGE......................................................................................................... 88
- TRATO GNITO URINRIO................................................................................. 106
- INTESTINAIS ........................................................................................................ 113
- FEBRE TIFIDE E PARATIFIDE ....................................................................... 126
- TESTE DE SENSIBILIDADE AOS ANTIBITICOS .............................................. 131
CAPTULO 11: DOENAS SEXUALMENTE TRANSMISSVEIS. .......................... 136
CAPTULO 12: MICOBACTERIOSES..................................................................... 152
CAPTULO 13: LEPTOSPIROSE............................................................................ 170
CAPTULO 14: OS FUNGOS E AS MICOSES ....................................................... 178
CAPTULO 15: HERPES-VRUS............................................................................. 199

REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS......................................................................... 204
3
A SEGURANA DOS ALUNOS NAS AULAS PRTICAS DE A SEGURANA DOS ALUNOS NAS AULAS PRTICAS DE A SEGURANA DOS ALUNOS NAS AULAS PRTICAS DE A SEGURANA DOS ALUNOS NAS AULAS PRTICAS DE
BACTERIOLOGIA BACTERIOLOGIA BACTERIOLOGIA BACTERIOLOGIA E MICOLOGIA E MICOLOGIA E MICOLOGIA E MICOLOGIA


A segurana de todos depende dos cuidados individuais dos alunos e dos
professores.

Seguem-se as orientaes para os alunos executarem as tarefas dentro dos
parmetros de biosegurana mdica:

1. obrigatrio o uso de avental (ou jaleco, guarda-p, etc.) fechado na frente e de
mangas compridas, para proteger a roupa e a pele dos braos.
2. expressamente proibido comer, beber ou fumar dentro do laboratrio.
3. No usar anis e pulseiras.
4. Prender o cabelo comprido.
5. Lavar as mos antes e depois dos procedimentos. Aps a lavagem das mos
utilizar lcool 70% para otimizar a desinfeco.
6. Evitar o contato da pele e mucosas com materiais clnicos tais como sangue, pus,
escarro, fezes, urina, outras secrees e exsudatos. Tratar sempre todas as amostras
como potencialmente infectantes, sendo que os maiores perigos esto relacionados
com o vrus da hepatite B, HIV, bacilos da tuberculose e salmonelas.
Observao: cada mL de sangue pode conter 100 milhes de vrus de hepatite B e
uma s partcula provoca a hepatite. Caso ocorram respingos pelo material
contaminado sobre a pele, fazer imediatamente a antissepsia do local. O avental
respingado deve ser colocado em cartucho plstico para no contaminar outros
objetos.
7. No trabalhar nas proximidades de cadernos, mochilas e livros. As mochilas devem
ser colocadas no fundo dos laboratrios no incio das aulas prticas.
8. S utilizar pipeta quando esta tiver mecha de algodo no bocal. A mecha tem dois
objetivos: proteger o operador do risco de contaminao com material patolgico ou
culturas de microrganismos e preservar o material manipulado da contaminao pela
saliva do operador (aerossis).
9. Jamais colocar o tampo de algodo dos tubos ou frascos sobre a mesa. Durante os
procedimentos o tampo deve ser segurado com o dedo mnimo.
4
10. Jamais colocar a pipeta usada sobre a bancada ou mesa de trabalho. Ela deve ser
colocada em recipientes que contm desinfetantes (Lisoform, hipoclorito de sdio a
2%, etc.), bem como algodo para vidro (para no quebrar a ponta da pipeta)
disponvel em cada mesa.
11. Evitar a formao de aerossis, que so micropartculas que contm uma quantidade
extremamente pequena de lquido (gua, saliva, etc.) e algumas partculas infectantes
(vrus, esporos bacterianos, etc.). Estes aerossis podem cair sobre a mesa
contaminando-a, ou ainda ficarem suspensos no ar e serem inalados, promovendo um
possvel ciclo de infeco. Tais partculas podem se formar em procedimentos como
flambagem da ala metlica, flambagem de pinas, abertura brusca de tubos ou
frascos com tampa de presso, agitao de tubos com as mos, centrifugao de
tubos abertos, manipulao incorreta de seringas, homogeneizadores, etc.
12. Ao trmino do trabalho:
a) Desinfetar a bancada com um desinfetante disponvel (hipoclorito, lcool 70%,
clorexedine, lcool iodado, etc.).
b) Lavar as mos e antebraos com gua e sabonete lquido. Em seguida utilizar, de
preferncia, soluo degermante base de polivinilpirrolidona-iodo (PVPI) a 10%.
Enxugar com toalha descartvel. Em seguida aplicar lcool 70% nas mos para dar
continuidade desinfeco.
Observao: em caso de acidente, como de pipetas contaminadas, placas e frascos com
material patolgico ou cultura de microrganismos obrigatrio:
a) Derramar sobre o material quebrado um desinfetante (por exemplo lcool 70% ou
clorexedine).
b) Cobrir com toalha de papel.
c) Deixar em contato, no mnimo, por uma hora antes de remover o vidro com uma pina
e com a mo enluvada absorver o lquido com papel toalha, acondicionar em sacos
apropriados e a seguir autoclavar.


ESTE MANUAL NO TEM FINS LUCRATIVOS

USO PARA FINS ACADMICOS DENTRO DA UNIVERSIDADE
(Concentrado de obras que no esto disponveis nas bibliotecas da Universidade, por isso
esse texto disponibilizado aos alunos).
5
INTRODUO INTRODUO INTRODUO INTRODUO


Micrbio: termo usado em 1878 por Charles Emmanocl Sedillot (cirurgio francs).

Microbiologia: a cincia que estuda os microrganismos (seres pequenos, geralmente
microscpicos) e suas atividades. So os protozorios, fungos, algas, vrus e bactrias. Os
microrganismos constituem um grande grupo heterogneo, apresentando caractersticas
variadas, tendo, no entanto, em comum o fato de conservarem ao longo do curso de
evoluo biolgica, uma estrutura simples e indiferenciada, ou seja, possuem estrutura
primitiva no apresentando tecidos ou rgos especializados.
O estudo dos microrganismos compreende o conhecimento de suas formas,
estruturas, reproduo, metabolismo e identificao. Trata ainda da sua distribuio na
natureza e as relaes entre si e com os demais seres vivos. Estudam-se tambm as
transformaes fsicas e qumicas exercidas nos seus habitats, das quais resultam efeitos
prejudiciais ou proveitosos para outros seres vivos.
Em ltima anlise os fenmenos chamados doenas infecciosas, do ponto de vista
biolgico, so simplesmente interaes destrutivas entre vegetais e animais.
A microbiologia pode ser estudada como cincia autnoma, mas tambm como
instrumento de outras reas biolgicas. Foram os microrganismos que serviram, e servem
cada vez mais, de modelos para as cincias modernas como: bioqumica, gentica, biologia
molecular, engenharia gentica, etc. Para o estudo destas cincias preciso estar
familiarizado com os microrganismos. Os microrganismos possuem muitas caractersticas
que os tornam seres ideais para a investigao dos fenmenos biolgicos. Pode-se cultiv-
los facilmente em tubos (recipientes pequenos) o que requer menor espao para
manuteno do que plantas e animais. Crescem rapidamente e se reproduzem a um ritmo
extraordinariamente elevado. Algumas espcies bacterianas produzem cerca de 100
geraes num perodo de 24 horas. A cada 15 minutos surge uma nova gerao e de cada
clula resultam 2 clulas filhas em uma progresso geomtrica sendo que no final de 24
horas teremos milhes de descendentes, o que no acontece com animais e plantas.




6
reas de aplicao da microbiologia

O microbilogo, de uma maneira geral, pode se especializar no estudo de certos
microrganismos. Estritamente falando, bacteriologia o estudo das bactrias (muitas vezes
o termo usado como sinnimo de microbiologia), micologia estuda os fungos, virologia
estuda os vrus e ficologia estuda as algas.
freqente a especializao em algum aspecto da microbiologia: citologia
bacteriana, gentica bacteriana, fisiologia dos fungos, etc. Existem numerosas reas onde a
Microbiologia aplicada tem grande significado. Microbiologia mdica: os microrganismos
muito estudados so os que causam doenas em humanos e so chamados de
patognicos. Este ramo da microbiologia tambm estuda a preveno e controle de
doenas, imunizao, imunologia e os mtodos diagnsticos. O microbilogo tambm busca
estudar os microrganismos em ambientes particulares: solo, ar, gua, esgotos, etc.
A educao de um microbilogo abrange um conhecimento geral da maioria das
subdivises. Entretanto devido ao tremendo acmulo de informaes em cada
especializao, o microbilogo deve se limitar a um ou poucos ramos selecionados da
microbiologia.


Distribuio na natureza (habitat)

Os microrganismos so encontrados praticamente em todos os ambientes, desde o
solo e as massas de gua (mares, rios), ar, at as superfcies internas e externas de
humanos e outros animais, bem como de plantas. Aparecem em maior abundncia onde
encontram condies favorveis, como substncias nutritivas, umidade e temperatura
adequada ao seu desenvolvimento.
Os microrganismos, que so favorecidos pelas mesmas condies que a populao
humana, podem produzir modificaes devido ao seu metabolismo, o que os torna
patognicos para o homem. Felizmente a maioria incua e habita a superfcie do nosso
corpo, trato digestrio, boca, nariz, e outras cavidades naturais. Dispomos de meios para
resistir invaso daqueles que so potencialmente patognicos.




7
Posio entre os seres vivos

Aps a descoberta dos microrganismos, ficou claro que eles mostravam todas as
combinaes possveis das propriedades dos vegetais e animais, os dois reinos de seres
vivos admitidos na poca, aparecendo vrios absurdos como por exemplo, os fungos foram
classificados como vegetais porque eram imveis, quase no apresentando outras
propriedades dos mesmos sendo tambm que nenhum fungo possui clorofila.
Para evitar a distribuio arbitrria dos grupos intermedirios (entre plantas e
animais), o cientista alemo Ernest Haeckel, discpulo de Charles Darwin em 1866, props o
estabelecimento de um terceiro reino, para eliminar a confuso existente em relao
posio dos microrganismos e para lhes proporcionar uma posio no mundo vivente. Este
terceiro reino foi chamado Protista (da palavra grega que significa primitivo ou primeiro).
O Reino Protista compreendeu as algas, protozorios, fungos e bactrias. .Algumas
vezes os seres classificados em protistas eram denominados Protistas superiores e
Protistas inferiores fundamentando-se em sua estrutura celular. Os superiores possuem
clula eucaritica, como os protozorios, fungos e algas, com exceo das algas azul-
esverdeadas. Os protistas inferiores so procariticos: 'bactrias e algas azul-esverdeadas.
Desde o conceito original deste terceiro reino de seres vivos tm sido desenvolvidos
numerosos critrios para determinar mais adequadamente onde classificar estas microvidas.
Uma abordagem a respeito da classificao microbiana foi oferecida por Stanier e
Van Niel em 1941. Eles propuseram outra designao para outro reino chamado Monera,
que deveria conter algas azul-esverdeadas e as bactrias. As outras algas e protozorios
deveriam permanecer como pertencentes ao reino Protista. Os vrus, no entanto, ainda
permaneciam como um enigma.
Em 1969 foi proposto por Whittaker um outro sistema classificatrio de seres vivos,
compatvel com os recentes estudos ultraestruturais, bioqumicos, genticos e os principais
modos de nutrio: fotossntese, absoro e ingesto. Os cinco reinos de Whittaker so:
Plantae, Fungi, Animmalia, Protista e Monera. Os microrganismos so encontrados em trs
dos reinos:
Monera (bactrias e algas azuis esverdeadas);
Protistas (outras algas e protozorios);
Fungi (fungos: leveduras e bolores).



8
Classificao dos microrganismos

A classificao dos seres vivos serve a vrios propsitos, entre eles a de estabelecer
critrios necessrios para a identificao e acima de tudo, eliminar confuses. A
classificao dos microrganismos apresenta problemas peculiares podendo se basear em
muitas caractersticas. De uma maneira geral as classificaes podem ser: Naturais ou
Filogenticas e Artificiais ou Chaves.
Nas Chaves as caractersticas descritivas so organizadas de tal forma que um
organismo em estudo ser prontamente identificado. Os organismos agrupados numa chave
no precisam necessariamente apresentar relao filogentica; eles so listados juntos
porque apresentam algumas caractersticas em comum, facilmente identificveis. Ser
perfeitamente razovel, por exemplo, colocar numa chave um grupo de bactrias
formadoras de pigmento vermelho, tais como Serraria marcescens e as Sulfobactrias
prpuras. Todavia, este agrupamento ser de muita utilidade, pois um pesquisador com a
responsabilidade de identificar uma cultura com pigmento vermelho, imediatamente ter seu
trabalho reduzido a poucos tipos bacterianos.
Na classificao filogentica, agrupa-se tipos aparentados, isto , aqueles que tem
um ancestral em comum.
Durante os 100 anos da microbiologia como cincia, tm surgido muitas
classificaes. Infelizmente no existe um sistema classificatrio inteiramente aceitvel para
todos os microrganismos, principalmente para as bactrias. Dependendo da autoridade
consultada, so observadas vrias inconsistncias. De tempos em tempos so propostos
novos sistemas no aceitos em sua totalidade internacionalmente.


Classificao atual dos microrganismos

Uma classificao proposta atualmente poderia ser a seguinte:
1. Monera: clulas procariticas.
a) Bactrias
b) Cianobactrias
c) Arqueobactrias

2. Protistas: Deve-se utilizar a terminologia moderna e mais amplamente aceita. O
termo protista atualmente empregado apenas para microrganismos eucariticos.
9
a) Algas
b) Protozorios
c) Fungos

Elementos diferenciais entre as clulas

1. NCLEO Procariticos Eucariticos
Membrana Nuclear Ausente Presente
Cromossomos Um, circular Um ou mais, lineares
Aparelho mittico Ausente Presentes
Histonas Ausente Presentes
Genes Agrupados No agrupados

2. NATUREZA E
ESTRUTURA
CITOPLASMTICA
Procariticos Eucariticos
Correntes
citoplasmticas
Ausentes Presentes
Pinocitose Ausente Presentes
Mesossomos Presentes Ausentes
Ribossomos Dispersos no citoplasma
Dispostos em membranas,
retculos endoplasmticos
e cloroplastos
Mitocndrias Ausentes Presentes
Cloroplastos Ausentes Podem estar presentes
Complexo de Golgi Ausentes Presentes
Vacolos limitados por
membranas
Ausentes Presentes







10
3. ESTRUTURAS
CELULARES EXTERNAS
Procariticos Eucariticos
Membrana plasmtica
Possui parte da
maquinaria respiratria e
fotossntese
No desenvolve atividade
respiratria ou
fotossntese.
Parede celular de
Peptdeoglicano
Presente * Ausente
Organelas locomotoras Fibrilas simples
Multifibrilas com
microtbulos
Pseudpodos Ausentes Presente em alguns
* ausente em Mycoplasma sp.


4. RELAO GUANINA +
CITOSINA
Procariticos Eucariticos
Mols de Guanina e
Citosina
28 a 73 Cerca de 40


Bactrias

O termo bactria, derivado do grego "gotinhas" foi introduzido em 1828 pelo alemo C. G.
Ehrenberg como nome genrico de alguns tipos bacterianos caractersticos.
Bactrias so organismos microscpicos, unicelulares e procariticos.


Taxonomia bacteriana geral

Desde a primeira tentativa conhecida de classificao das bactrias, realizada por
Mller, em 1773, um grande esforo foi empregado na taxonomia bacteriana, mas at agora
nenhum dos numerosos esquemas propostos recebeu aprovao universal. H falta de
concordncia nas classificaes, mas havendo um interesse em evitar confuso
generalizada preciso aceitar e permitir a evoluo de algum plano razoavelmente
exeqvel acompanhando naturalmente o progresso dos novos conhecimentos. Uma das
classificaes foi proposta pela Sociedade Americana de Microbiologia atravs de seu
11
Bergey' s Manual of Detenninative Bacteriology ao longo de muitas edies. A 9 edio do
manual de Bergey tem como ttulo: "Bergey' s Manual of Systematic Bacteriology".
O manual de Bergey representa mais de 70 anos de evoluo, sendo mais aceito
que qualquer outro sistema. Devido s incertas relaes filogenticas das bactrias, o
manual admite que sua principal aplicao seja determinativa, isto , permitir aos
pesquisadores determinar se ce11o microrganismo corresponde a uma espcie descrita. A
1 edio data de 1923, j tendo alcanado a 9 edio. Em cada edio subseqente, tm
sido feito vrios avanos significativos, inclusive o acrscimo de novas espcies e excluindo
outras.
Atualmente um dos esquemas da classificao semi-oficial disponvel o que foi
publicado na 9 edio do Bergey's manual de 1984. amplamente utilizada como padro
de referncia na taxonomia bacteriana. Ele reconhece o reino Monera de Whittaker,
chamando-o, no entanto, de Procaryotae, em virtude da natureza procaritica de suas
clulas.
Novos conhecimentos causaro uma grande diferena nas futuras publicaes a
respeito da classificao microbiana. Nos ltimos anos o sistema gentico das bactrias foi
estudado ao nvel molecular a fim de determinar a homologia entre o DNA das clulas. O
parmetro empregado com mais freqncia a porcentagem de molculas de guanina mais
citosina no contedo total de DNA. A composio das bases do DNA uma caracterstica
constante de uma determinada espcie e expressa em porcentagem de guanina mais
citosina sobre o total de mols das bases. Se dois organismos tm propores muito
diferentes de bases, obviamente no so muito relacionados. Centenas de espcies tm
sido caracterizadas desta maneira modernamente.
Em 1980 o Comit Internacional sobre Sistemtica Bacteriolgica, publicou uma lista
de aproximadamente 2500 espcies, substituindo uma lista anterior de 30000. Desde 1 de
janeiro de 1980 apenas a nova lista de nomes considerada vlida. A substituio das
denominaes abandonadas, o acrscimo de novas ou quaisquer outras alteraes, exigem
publicaes no International Journal of Systematic Bacteriology.

Bactrias:
Uma chave classificatria para bactrias estabelece 4 grupos bacterianos, em funo do
metabolismo de movimentao e das caractersticas da parede celular.

12




Vrus: Complexo molecular vivo, possuindo DNA ou RNA.

*Os dados citados foram compilados de textos dados em aula.





13
CAPTULO 1 CAPTULO 1 CAPTULO 1 CAPTULO 1: :: : CONTROLE DOS MICRORGANISMOS


indispensvel o conhecimento do controle das populaes microbianas para todos
os profissionais da sade. A medicina progredia medida que surgiam novos
conhecimentos sobre o domnio dos microrganismos, reduzindo infeces e a transmisso
de doenas contagiosas, executando cirurgias asspticas, etc.
Os microbiologistas conseguiram estudar as espcies bacterianas, aps as
aplicaes artificiais de condies desfavorveis sua multiplicao. Atravs dos processos
de esterilizao dos objetos utilizados, meios de cultura estreis e tcnicas de assepsia,
obtiveram populaes bacterianas puras e, estas sim, puderam ser estudadas em todos os
detalhes: morfolgicos, estruturais, fisiolgicos, obter dados sobre seus fatores de virulncia
e outros.
O uso de materiais esterilizados condio indispensvel para o desempenho dos
trabalhos microbiolgicos.
Antes de iniciar o estudo dos mtodos de controle dos germes, importante
conceituar vrios deles, tais como: esterilizao, desinfeco (desinfetantes), anti-sepsia
(anti-spticos), assepsia, saneamento e sanitizao.
Esterilizao: deve resultar na destruio total de todas as formas de vida presentes
no material submetido ao processo em questo.
Desinfeco: o processo que remove a maioria dos microrganismos viveis,
reduzindo a bioburden (carga de organismos viveis). A desinfeco, na maior parte das
vezes, conseguida pelo uso de substncias qumicas chamadas desinfetantes, destinadas
a destruir os germes potencialmente patognicos, mas que so ineficientes contra a maioria
dos esporulados. O calor em temperaturas de 60 a 100
o
C tambm tem ao desinfetante,
pois no destri todos os esporos.
Anti-sepsia: o conjunto de meios usados para evitar a proliferao de germes,
inativando ou destrudo-os. O termo anti-sepsia geralmente usado referindo-se aos tecidos
vivos, como anti-sepsia da pele, anti-sepsia de feridas, etc., reservando-se o termo
desinfeco para objetos inanimados. A anti-sepsia obtida pela ao de substncias
qumicas chamadas anti-spticos.
Assepsia: conjunto de procedimentos que impede a penetrao de microrganismos
em local que no os contenha.
Saneamento: mantm a microbiota dentro dos valores populacionais previamente
estabelecidos por instituies de sade.
14
Sanitizao: usada em restaurantes e indstrias de alimentos, refere-se
eliminao dos microrganismos em utenslios e equipamentos para impedir a deteriorao
ou transmisso de infeces pelos produtos alimentares.


ESTERILIZAO

importante o conhecimento das diferentes tcnicas de esterilizao, para saber
qual delas aplica-se melhor, para casos especficos, e que cause dano mnimo ao material
envolvido.
Para pessoas da rea de sade, indispensvel tambm conhecer os efeitos que
alguns agentes esterilizantes (agentes qumicos, radiaes) exercem sobre o corpo
humano.
Os meios mais utilizados para esterilizao so os meios fsicos, tais como
temperaturas elevadas e as radiaes. Alm destes, possvel eliminar a microbiota
presente em um lquido ou gs, por processos mecnicos, como a filtrao.
Como agentes qumicos podem ser usados muitos compostos.
A escolha dos agentes e dos diferentes mtodos, depende do resultado que se
deseja e do material ou local em que o processo vai ser aplicado.
Segue-se o esquema e a descrio de alguns processos.

Esterilizao e Desinfeco por Meios Fsicos

Calor
- Calor Seco
Flambagem
Forno de Pasteur (estufa)
Incinerao

- Calor mido
Pasteurizao
Tyndallizao ou Tindalizao
gua Fervente
Autoclavao

15
Filtrao
- Velas
Chamberland porcelana porosa
Berkefeld infusrios

- Discos
Vidro
Amianto Seitz

- Membranas
Acetato de celulose: Millipore e HEPA
Nitrato de celulose

- Algodo para gases (ar)


Radiaes
- Ultravioleta (UV) NO IONIZANTES
- Gama () - IONIZANTES


Esterilizao e Desinfeco por Agentes Qumicos

Agentes Qumicos:
- Lquidos lcoois, detergentes, lcalis, glutaraldedo.
- Gasosos brometo de metila, xido de etileno, formaldedo.
- Slidos pastilhas de formalina.



Esterilizao e Desinfeco por Meios Fsicos

A ao letal do calor uma relao tempo-temperatura afetada por numerosos
fatores que devem ser levados em considerao, na seleo da intensidade trmica e na
durao da exposio, para reduzir a populao bacteriana ao nvel desejado.
16
CALOR SECO

a) Flambagem
a exposio do objeto chama de bico de Bunsen ou lamparina. Na tcnica
bacteriolgica utiliza-se a flambagem para esterilizar a ala de platina pelo
aquecimento at o rubro. As pinas, as pipetas, as bocas dos tubos e bales em que
se faz a semeadura so aquecidos na chama (chamuscadas) sem, no entanto, lev-
las ao rubro.

b) Ar Quente Forno de Pasteur
O Forno de Pasteur moderno uma estufa de forma retangular de paredes duplas,
isolada termicamente e aquecida por eletricidade. A temperatura desejada
regulada e mantida por um termostato. Em seu interior existem prateleiras mveis.
Na poro superior possui orifcios para ventilao e colocao de termmetro
graduado em 200
o
C.
Observao: o aparelho e seu funcionamento sero mostrados em aula.
A exposio ao ar quente constitui mtodo usado correntemente em bacteriologia,
para a esterilizao de materiais secos, tais como: tubos, ampolas, placa, provetas,
objetos metlicos, leo mineral, vaselina slida, parafina, talco, areia, etc. A vidraria
seca ser esterilizada no forno a 170 180
o
C por uma hora. O papel que protege o
material e os tampes de algodo adquire cor parda, porm no devem escurecer
demais ou tornarem-se quebradios. Deixar o forno esfriar espontaneamente.
A destruio dos microrganismos ocorre por desidratao e oxidao dos
constituintes celulares.
Limitaes: no se pode esterilizar a seco a vidraria fina como bales volumtricos e
pipetas graduadas de preciso, lquidos diversos, meios de cultura, borracha, etc.

c) Incinerao
O mtodo de incinerao, do ponto de vista microbiolgico, consiste em destruir os
microrganismos junto com os materiais orgnicos onde eles se localizam. So
materiais removidos dos curativos, peas anatmicas, animais de experincia
infectados e mortos, etc., (h os incineradores usados na queima de lixo no
hospitalar). Os incineradores que possuem uma s cmara de combusto so
ineficazes e inadequados. Isto porque os materiais no so destrudos por completo,
contaminando a atmosfera por microrganismos e substncias txicas. O incinerador
17
deve ter, alm da cmara de combusto principal, uma cmara de combusto
secundria. Ideal quando a 1
a
cmara est a 800
o
C e a segunda aquecida no
mnimo a 1000
o
C.
A incinerao tem-se tornado um problema social e poltico em muitas comunidades,
principalmente europias. Isto porque, a queima em altas temperaturas de matria
orgnica e plstico, gera substncias altamente txicas, tais como as dioxinas.
Incineradores, na verdade, so indstrias de ultragifte ultravenenos expresso
cunhada pela comunidade cientfica para designar dioxinas e furanos.
Observao: o criminoso Agente Laranja usado na Guerra do Vietn era rico em
dioxinas (Fonte: Proteo n
o
11 vol. 03).

CALOR MIDO


a) Pasteurizao
Ato de pasteurizar. Processo pelo qual um determinado material (o leite, por
exemplo), aquecido a uma temperatura no elevada (62,8
o
C por 30 minutos ou
71,7
o
C por 15 minutos) e a seguir submetido a resfriamento brusco (em torno de
4
o
C), obtendo-se assim a morte dos germes patognicos, no caso do leite:
Salmonella, brucelas, estreptococos, bacilos da tuberculose, mas no a eliminao
total dos germes contaminantes (bactrias esporuladas). um processo de
desinfeco.

b) Tyndallizao ou Tindalizao
uma esterilizao fracionada.
Tyndall, o idealizador do processo, verificou que o aquecimento descontnuo, ou
seja, aquecimento a 100
o
C, durante 1 hora, em 3 dias consecutivos, intercalados por
perodos de incubao em temperatura ambiente, conseguia esterilizar a soluo em
estudo.
Os esporos resistentes germinam durante o tempo de incubao e so destrudos
nas subseqentes exposies ao calor.
A temperatura de tindalizao varia de acordo com o material a esterilizar. Alguns
meios de cultura bacteriolgicos, solues de carboidratos, solues de vitaminas ou
enzimas, etc., sero aquecidas temperatura que no altere as suas propriedades.

18
c) gua em Ebulio
Os materiais ou objetos contaminados no podem ser esterilizados com segurana
pela simples exposio gua em ebulio. Embora as clulas vegetativas das
bactrias possam ser destrudas em poucos minutos, alguns esporos resistiro
durante muitas horas. A imerso em gua fervente quando usada para esterilizao
de instrumentos cirrgicos, seringas de injeo, etc., oferece o risco de
contaminao por esporulados. S deve ser usada em circunstncias emergenciais.
Pela fervura do material mergulhado em gua ou exposto ao vapor em autoclave
com vlvula aberta (vapor fluente) s se consegue uma desinfeco e no
esterilizao.



d) Autoclave (temperatura superior a 100
o
C)
um mtodo em que se utiliza vapor dgua sob alta presso, de tal modo que o
meio mais prtico, rpido e barato de esterilizao. O aparelho que utiliza-se nesse
procedimento chama-se autoclave. H vrios modelos: horizontais, verticais,
aquecidas a gs ou eletricidade, ou ainda, alimentadas por vapor gerado em
caldeiras separadas.
Autoclave de Chamberland: caldeira de paredes resistentes, tampa com borracha
apertada por parafusos. Orifcios para o manmetro, vlvula de segurana e torneira.
Autoclave usa vapor dgua sob presso regulada. uma cmara de vapor saturado
equipada com dispositivos que permitem a manuteno do vapor em determinada
temperatura e presso por quaisquer perodos de tempo, dependendo da natureza
do material a esterilizar, do tipo do continente e de seus volumes. Por exemplo: tubos
de ensaio com meios lquidos podem ser esterilizados em 10 a 15 minutos a 121
o
C.
Os mesmos lquidos em bales de 10 litros requerem 1 hora ou mais sob a mesma
temperatura e presso. Materiais utilizados em Biologia Molecular necessitam de 40
minutos de autoclavao (para agir no DNA).
Modo de proceder: o material a esterilizar embrulhado em papel ou sacos plsticos
(como os de microondas) formando pacotes. Os pacotes so colocados dentro de
uma cesta metlica, esta repousa sobre um suporte, evitando o contato com gua do
fundo da autoclave. Iniciar o aquecimento com torneira aberta. Quando a gua
comear a ferver, h emisso de um jato intermitente de vapor e ar. Quando todo o
ar for expulso, comea a sair um jato contnuo de vapor, neste momento fecha-se a
19
torneira. Com a continuao do aquecimento, haver aumento de presso acusado
pelo manmetro. Ao ser atingida a temperatura desejada, 120
o
C por exemplo,
marca-se o tempo. Aps esse perodo desliga-se a corrente eltrica. Para abrir a
autoclave, espera-se at que o manmetro abaixe para zero. S ento se abre a
torneira. O material sai da autoclave impregnado de umidade. Deve-se coloc-lo na
estufa 60
o
C para a secagem. H autoclaves mais modernas em que o material j
sai seco, como a que existe no departamento de Bioqumica da UFPR.
Observao: a autoclave e seu funcionamento sero mostrados em seminrios,
acompanhando os processos de preparao de material para a esterilizao.

Desvantagens e Limitaes: alguns materiais no miscveis na gua, como gorduras,
leos, vaselina lquida e slida e parafina, que consequentemente no podem ser
autoclavados. Tais materiais no so atingidos pelo vapor, e os microrganismos
podero sobreviver. Algumas substncias so alteradas (metais que oxidam) ou
destrudas. O talco e a areia umedecidos so difceis de secar.

Vantagens:
1. Aquecimento rpido.
2. Grande poder de penetrao em material denso.
3. Maior condutibilidade.
4. No deixa resduos txicos.
5. Mais econmico.
6. Termocoagulao das protenas, catalisada pela gua. O calor mido desnatura
protenas, quebrando ligaes qumicas envolvidas na manuteno da
conformao espacial das protenas, causando sua coagulao.


Grau de Umidade (%) Temperatura de Coagulao da Ovoalbumina
50
25
18
06
00
56
80
90
145
170


20
Eficincia Comparativa do Calor Seco e do Calor mido como Esterilizantes

O calor mido tem um poder de penetrao superior.
A penetrao do calor seco menor, sendo necessrio, portanto, esterilizar o
equipamento e utenslios a temperaturas mais elevadas e por perodos mais longos.
Esta diferena de poder de penetrao do calor em estado seco ou mido
exemplificada pela verificao de que, em um fardo de flanela exposto ao calor seco a
150
o
C durante 4 horas, a temperatura atingida no centro sobre apenas a 83
o
C, ao passo
que, temperatura de 120
o
C em autoclave durante 1 hora e meia, a temperatura central
chega a 117
o
C.

Fardo de Flanela Temperatura Central
Calor Seco 150
o
C 4 horas 83
o
C
Calor mido 120
o
C 1 hora e meia 117
o
C

Microrganismo Calor mido 120
o
C Calor Seco 120
o
C
Clostridium botulinum 20 minutos 120 minutos
Bacillus anthracis 15 minutos 120 minutos (150
o
C)

Calor mido (tempo em minutos para vrias temperaturas)
Microrganismos 100
o
C 105
o
C 115
o
C 120
o
C
Bacillus subtilis
Clostridium botulinum
Bactrias do solo
Anaerbios putrefao
Bactrias termfilas
300
530

780



420

400
40


20
30
06
11


Testes para Controle de Eficincia da Autoclave

Em geral, necessrio fazer o controle de esterilidade enquanto a autoclave est em
operao, em vez de tentar reconhecer falhas, atravs do isolamento de microrganismos no
material processado.
21
Embora a temperatura e a presso sejam indicadas pelo termo-manmetro, todos os
laboratrios microbiolgicos fazem testes confirmatrios de esterilidade do material
processado.
Para tanto se pode recorrer a mtodos fsicos e biolgicos.
Nos mtodos fsicos usa-se:
1. Indicadores que tm por base a reao de um composto qumico quando
expostos a um parmetro necessrio esterilizao. Geralmente vm em forma
de fitas ou selos que mudam de cor na temperatura estabelecida.
2. Substncias qumicas em p (acondicionadas em ampolas de vidro) cujo ponto
de fuso conhecido. Aps a autoclavao, observar a substncia que deve
aparecer fundida.
Observao: para cada mtodo de esterilizao existem indicadores qumicos
especficos.
No mtodo biolgico usam-se esporos bacterianos altamente resistentes como os do
Bacillus stearothermophillus. Os esporos podem vir acondicionados em frascos com meio de
cultura ou impregnados em tiras de papel de filtro seco, numa concentrao de 10
6
esporos
em ambos os casos. Os esporos do Bacillus stearothermophillus morrem quando
submetidos a 121
o
C por 15 minutos.
Colocar os esporos na autoclave em pontos crticos, centro e fundo da cesta, pontos
em que a temperatura desejada obtida com maior dificuldade.
Aps a autoclavao, incubar a 55 a 57
o
C os esporos em caldo (ou no caso de usar
as tiras, transferi-las para um caldo) durante 24 a 48 horas. Caso haja turvao, indica que o
bacilo proliferou e que a autoclavao foi insatisfatria.
Os bioindicadores existem no comrcio sob o nome de Esporofars

, Steritest

e
outros.


FILTRAO

A filtrao o mtodo de escolha para esterilizar solues contendo substncias
termossensveis como o soro sanguneo, plasma, soluo de vitaminas, soluo de
enzimas, soluo de alguns carboidratos, fluidos para inoculao, colrios, etc.
Lquidos injetveis so primeiramente filtrados e depois autoclavados para evitar
pirognios. Estes so componentes termoestveis da degradao das bactrias.
22
As tcnicas de filtrao so tambm usadas para recuperar pequenas quantidades
de bactrias presentes em grandes volumes de lquido, como, por exemplo, gua. Nestes
casos, aps a filtrao, a membrana colocada em meio de cultura adequado, as bactrias
vo proliferar dando colnias que podem ser quantificadas, estudadas e identificadas.
A filtrao pode ser aplicada na descontaminao de gases como o ar. O exemplo
disto dado pelo uso de tampes de algodo que obturam a boca de tubos, bales vazios
ou contendo meio de cultura. O algodo suficientemente poroso para permitir a entrada de
ar e impedir a entrada de germes. Outro exemplo a filtrao do ar nas cmaras asspticas,
salas de cirurgia, etc.
Numerosos so os dispositivos e materiais usados na tcnica da filtrao, como por
exemplo:

a) VELAS - Chamberland: porcelana.
- Berkefeld: terra infusrios.
b) DISCOS - Vidro.
- Amianto.
c) MEMBRANAS - Acetato de celulose, tambm chamados de filtros
moleculares. Exemplo: Millipore. Atualmente so as mais usadas nas tcnicas de
filtrao. Elas apresentam a vantagem de poder ser autoclavadas. H as
descartveis. Podem filtrar diversos lquidos: gua, lcool, ter, toluol, xilol, metano,
etano, acetileno, parafina, naftalina, terpeno, etc., sem sofrer degradao.
Tamanho dos poros: 0,05 a 10 m (micrmetros).
Cada cm
2
contm milhes de poros, 80% da membrana espao aberto e 20% de
material slido, com isto o fluxo em torno de 40 vezes mais rpido que pelos
demais filtros.


Ultrafiltrao

Elford coldio membrana Gradocol (de nitrato de celulose).
Poros: 10 a 10.000 m (para determinar o tamanho do vrus).




23
Filtros HEPA (High Efficiency Particulate Air) de Acetato de Celulose

Utilizados para produo de fluxo de ar estril em cmaras bacteriolgicas
asspticas, salas de cirurgia, etc. H produo de fluxo de ar no turbulento ou laminar.
Eficincia = 99,97%


RADIAES NO IONIZANTES (U.V.)

As radiaes na forma de luz ultravioleta tm sua atividade melhor na faixa de 250-
260 m, comprimento de onda de absoro mxima pelas bases pricas e pirimdicas do
DNA, formando dmeros, inibindo a replicao do DNA.
comum seu emprego para esterilizao do ar em hospitais e tambm em
laboratrios de microbiologia, nas cmaras asspticas, onde as condies de assepsia
devem se manter rigorosamente controladas. Emprega-se esse tipo de radiao para
reduzir a populao microbiana da superfcie dos equipamentos ou do ar.
O seu poder de penetrao mnimo. Uma camada fina de vidro ou gua pode
impedir a ao da luz U.V. O uso de raios U.V., em medicina, limitado por danificar a
crnea e a pele.

Raios Gama e Raios X

Os raios gama so atualmente muito usados para esterilizar grandes quantidades de
itens de pequeno porte tais como agulhas, seringas, equipamentos endovenosos, cateteres
e luvas.
O material esterilizado j acondicionado na sua embalagem final. O processo
100% eficiente e ininterrupto. No uma tcnica aplicvel para uso descontnuo, pois no
possvel ligar ou desligar.
Os raios gama e os raios X criam radicais livres ativos (OH
-
e H
+
) pela hidrlise da
gua. Estes radicais altamente reativos quebram as ligaes covalentes do DNA, alterando
as estruturas do DNA e das protenas.
Vantagens - esterilizao fria (indstria alimentcia e farmacutica);
- alto poder de penetrao.
Desvantagens - alto custo;
- operadores altamente especializados;
24
- acarreta srios danos sade, tais como:
a) alteraes celulares (neoplasias malignas, como a
leucemia);
b) leses de gnadas (alteraes cromossmicas).


ESTERILIZAO E DESINFECO POR AGENTES QUMICOS


A esterilizao por produtos qumicos indicada apenas para os materiais que no
podem ser submetidos ao calor.
A escolha de um agente qumico depender da finalidade do uso. No existe uma
substncia ideal capaz de agir em todos os casos. Alguns so muito ativos, mas txicos
para os tecidos vivos, portanto usados apenas em objetos inanimados. Outros apresentam
instabilidade quando em soluo. Alguns so rapidamente inativados em contato com
matria orgnica.
A maioria dos agentes qumicos age como desinfetante ou anti-sptico, somente
alguns so capazes de esterilizar, embora se saiba que os produtos qumicos podem agir
como bacteriostticos ou esterilizantes dependendo da concentrao e do tempo de ao.
cido fnico em soluo de 0,2% age como bacteriosttico e a 5% esterilizante.
Alguns produtos qumicos so mais utilizados que outros devido a vrios fatores:
facilidade de obteno, menor custo, maior estabilidade quando em soluo e seu poder
germicida.
Assim temos:
Produto Qumico
Deve ter
- Atividade antimicrobiana de largo espectro.
- Estabilidade e homogeneidade quando em soluo.
- Inocuidade para o homem.
- Boa solubilidade.
Deve no ser
- Corrosivo.
- Irritante.
Deve
- No deixar resduos.
25
- No alterar materiais como borracha, plstico, etc.

Na aplicao de qualquer agente qumico necessrio observar-se as seguintes
variveis:
a) Concentrao;
b) Tempo;
c) Temperatura;
d) pH;
e) Limpeza.


AGENTES QUMICOS

Agentes qumicos so comumente empregados para a esterilizao ou desinfeco
de equipamentos:
Lquidos: cidos e lcalis fortes, glutaraldedo, compostos fenlicos, lcoois e
compostos quaternrios de amnio.
Gasosos: oznio, brometo de metila, -propionalactona, xido de etileno, xido
de propileno e formaldedo.
Slidos: pastilhas de formalina.


xido de Etileno

um gs incolor, no corrosivo e que se liquefaz a 10,9
o
C, sendo o lquido bastante
solvel em gs e solventes orgnicos.
Concentraes acima de 100 mg/L so txicas ao ser humano, causando irritaes
dos olhos e pulmes; nuseas, edema pulmonar e danos pele.
O gs altamente inflamvel e explosivo, no se podendo trabalhar em
temperaturas elevadas, no mximo 60
o
C.
Aplicaes industriais so baseadas no uso de misturas contendo 10% de xido de
etileno e 90% de CO
2
ou 50% de xido de etileno e 50% de formato de metila.
O gs tem elevado poder de penetrao em material orgnico, incluindo plsticos,
borrachas, madeira, papel, tecidos (l), couro, produtos desidratados, equipamentos de
26
anestesia e seringas sem danific-los, o que recomenda muito o seu emprego. Pode ainda
ser utilizado em metais, vidros e materiais eltricos.
O uso de xido de etileno requer equipamentos adequados de alto custo. O aparelho
esterilizador a ETO formado de um conjunto de trs unidades:
- Uma autoclave (cmara grande) tendo o gs ETO e vapor dgua.
- Um painel de controle onde est conectado o cilindro de mistura de gases.
- Uma cmara secadora onde o material, aps a esterilizao, obrigatoriamente
submetido aerao, que consiste na circulao de ar filtrado. O ar passando
pelos materiais faz a remoo dos resduos de gs retido nos mesmo.
Tendo condies adequadas de temperatura, presso de vapor dgua, tempo e
concentrao do gs, o ETO muito eficiente.

Condies:
Temperatura entre 49 e 60
o
C;
Tempo de exposio de 2 a 12 horas;
Concentrao do gs 450 mg/L;
Umidade de 20 a 40%.

xido de Etileno
Vantagens Desvantagens
a) Bactericida, viricida, esporicida;
b) Temperatura baixa 47-60
o
C;
c) Grande variedade de materiais;
d) Equipamento anestesia, seringa.
a) Alto custo;
b) Txico;
c) Inflamvel.


O xido de etileno atua como alquilante, inativando as enzimas e outras protenas
que tm tomos de H lbeis, como em grupos sulfidrila. O anel da molcula do xido de
etileno se rompe para formar CH
2
CH
2
O que se insere entre tomos de enxofre e
hidrognio do grupo sulfidrila:


H
2
C H
2
C + R.SH R.SCH
2
.CH
2
.OH
O (enzima ativa) (enzima inativa)

27
Formaldedo

O formaldedo, de estrutura simples (HCOH), estvel em altas concentraes e
temperaturas elevadas, mas extremamente txico, seus vapores so irritantes s
mucosas. Em temperatura ambiente o formaldedo polimeriza-se, formando uma substncia
slida, incolor paraformaldedo que libera formaldedo pelo aquecimento.
Formalina a soluo aquosa de formaldedo (37 a 40%), forma em que
comercializado.
O formaldedo utilizado na forma gasosa para esterilizar reas fechadas, como
quartos de doentes contagiosos, aps a desocupao. A umidade e temperatura tm grande
influncia sobre sua ao antimicrobiana, temperatura ideal de 22
o
C e umidade de 60

a
80%.
Tem a desvantagem do baixo poder de penetrao.
A sua ao com os grupos amino, hidroxila, carboxila e sulfidrila, introduzindo um
radical (CH
2
), alterando a estrutura das protenas e cidos nuclicos.


Glutaraldedo

Age de modo semelhante ao formaldedo, mas menos txico e dez vezes mais
eficiente. Age lentamente porm efetivamente. Usado na desinfeco de endoscpios e
equipamentos de terapia respiratria.


Outras substncias de interesse na prtica mdica

lcoois: os mais usados so o lcool etlico e o isoproplico. O lcool etlico muito
usado na degermao da pele e desinfeco de superfcies, algumas vezes em combinao
com iodo. Requer presena de gua (lcool a 70%) para sua atividade mxima. O lcool
desestrutura os lipdios da membrana celular e desnatura as protenas bacterianas.

cidos e lcalis: a variao acentuada de pH pode resultar em cessao do
metabolismo e morte do microrganismo. A ao dos cidos depende do seu grau de
ionizao: da concentrao hidrogeninica no caso dos cidos minerais ou da natureza de
suas molculas no caso dos cidos orgnicos. A ao dos lcalis depende do seu grau de
28
dissociao, da concentrao de ons hidroxila e do on metlico do lcali. O hidrxido de
clcio um deles. de alto poder desinfetante, usado em quartos de doentes, excretas,
vages, etc.

Oxidantes: inativam as clulas oxidando os grupos sulfidrila livres. So: perxido de
hidrognio, iodo, cloro e compostos que liberam lentamente o cloro (cal clorada).
O iodo anti-sptico muito utilizado nas prticas mdicas. de efeito imediato.
encontrado em duas formas: Tintura de Iodo e iodforos. Os iodforos so complexos de
iodo com detergentes ou outras molculas carreadoras. Os iodforos liberam iodo
lentamente, no irritam a pele, no tem odor irritante e no tingem os tecidos. O iodo reage
especificamente com resduos de tirosina das protenas e inativa as enzimas que contm
pontes de dissulfeto.

Detergentes: so agentes surfactantes ativos e podem ser aninicos ou catinicos.
a) Detergentes aninicos tm hidrocarboneto de cadeia longa de carga eltrica
negativa, por exemplo: os sabes e produtos sintticos semelhantes aos sabes. Os
produtos sintticos so mais solveis e mais baratos que os sabes convencionais.
b) Detergentes catinicos de carga eltrica positiva. Os mais usados so os
detergentes de compostos quaternrios de amnio. Estes compostos tm amplo
espectro bactericida e bacteriosttico mesmo em altas diluies contra bactrias
Gram positivas e Gram negativas.
Os detergentes agem sobre os lipdeos da membrana celular alterando sua funo ou
desintegrando-a. tambm desnaturam as protenas. Os compostos quaternrios de amnio
so muito solveis em gua, so pouco txicos e no corrosivos, como o cloreto de
benzalcnio, muito utilizado na anti-sepsia da pele.

Metais Pesados: os mais usados so mercrio e prata. Ambos possuem boa atividade
antimicrobiana. O mercrio quando combinado a outras substncias, apresenta-se menos
txico ao organismo humano que o prprio metal. Por exemplo: mercrio cromo, Mertiolato.
A prata combinada com protenas antissptico de mucosas do nariz e garganta: Argirol,
Protargol. Estes metais agem inativando as enzimas bacterianas atravs do grupo sulfidrila.
29
CAPTULO 2 CAPTULO 2 CAPTULO 2 CAPTULO 2: : : : TIPOS MORFOLGICOS DE BACTRIAS E
GRUPAMENTOS BACTERIANOS


Objetivos

a. Observar e comparar a morfologia das diversas bactrias em lminas focalizadas.
b. Identificar nas preparaes microscpicas focalizadas a forma da clula e o grupamento.
c. Verificar se nos grupamentos h ou no arranjos sempre com o mesmo nmero de
clulas.
d. Observar estruturas bacterianas no interior das clulas (esporos, granulaes).


Tipos Morfolgicos

Embora existam milhares de espcies bacterianas, as suas clulas podem agrupar-
se em trs tipos morfolgicos fundamentais:
a) Arredondada;
b) Alongada;
c) Ondulada.

COCOS

Forma arredondada (perfeitamente esfricas, elpticas, em chama de vela e
riniformes. * VER PRANCHAS DE MORFOLOGIA NAS AULAS PRTICAS




Esfrico: Completamente arredondado.
Exemplo: Staphylococcus aureus.

Coco-oval (alongado)
Exemplo: Streptococcus pyogenes.

30


Pneumococo (em forma de gota, chama de
vela)
Exemplo: Streptococcus pneumoniae.
Fonte:
Fernando Bortolozzi

Gonococo e Meningococo: Forma
riniforme (em forma de feijo ou rim)
Exemplos: Neisseria gonorrhoeae (G)
Neisseria meningitidis (M).


BACILOS

Forma alongada ou cilndrica. Bastonetes. (variaes: quanto ao comprimento,
espessura e forma das extremidades).
Obs: Os bacilos eram tambm denominados bastonetes at alguns anos atrs. No entanto,
a denominao bastonete de uso mais aconselhvel para os neutrfilos imaturos que
saem da medula ssea mielide e vo para a corrente sangunea suprir necessidades
fisiolgicas durante uma infeco (desvio esquerda, como ser visto nas aulas de
Patologia Mdica Molecular BP337). Portanto para bactrias alongadas, prefere-se o
termo BACILO.

VARIAES BACILARES:

Finos e curtos: tm extremidades arredondadas.
Exemplo: Salmonella, Shigella, Proteus, Pseudomonas, Mycobacterium.


Finos e longos (forma filamentosa). Parece um fio de cabelo.
Exemplo: Leptotrix buccalis, Lactobacillus sp.


Curtos, espessos e extremidades rombadas.
Exemplo: Bacillus.

Finas longas e extremidades agudas.
31
Exemplo: Fusobacterium nucleatum.
Curta e arredondada (cocobacilo).
Exemplo: Brucella, Haemophilus sp.

* VER PRANCHAS DE MORFOLOGIA NAS AULAS PRTICAS

Nos bacilos, sempre o comprimento predomina sobre a espessura no mnimo uma
vez e meia, ao contrrio dos cocos, nos quais essas dimenses permanecem quase iguais.


FORMAS ONDULADAS

Forma ondulada, espiralada ou helicoidal.
Compreende:
a) Espirilos
b) Espiroquetas
c) Vibries


a) Espirilo: possui corpo rgido, movendo-se custa de flagelos.
Exemplo: Spirillum




b) Espiroqueta: corpo flexvel e mvel com o auxlio de filamentos axiais presentes sob a
camada externa.
Exemplo: Treponema pallidum


32
c) Vibrio: em forma de vrgula, apenas um seguimento de espiral.
Exemplo: Vibrio cholerae Imagens: Tortora, 2005




Outros: Entre espirilos e espiroquetas aparecem diferenas notveis de comprimento,
espessura, nmero e amplitude de espiras.



Algumas possuem pequeno nmero de espiras, abertas e irregulares.
Exemplo: Borrelia.




Outras tm espiras numerosas, regulares e apertadas semelhana de dentes de serra.

Treponema pallidum

Leptospira interrogans


33
GRUPAMENTOS BACTERIANOS


Ao lado da forma da clula, importante o conhecimento das diferentes disposies
que as bactrias apresentam, chamadas de grupamentos, pelos quais podem-se
diferenciar gneros bacterianos.
Estas associaes so explicadas por peculiaridades dos processos de
multiplicao.
Podem ocorrer os seguintes arranjos:
Imagens: Fernando Bortolozzi e Tortora, 2005 h
NOMENCLATURA DO
GRUPAMENTO
FORMATO EXEMPLOS
Diplococos (dois a dois)



1

2
1. Neisseria gonorrhoeae
Neisseria meningitis
(GONOCOCO e MENINGOCOCO)

2. Streptococcus pneumoniae
(PNEUMOCOCO)
Estreptococos (cadeias)


Streptococcus pyogenes
Estafilococos (irregular ou
cacho de uva)



Staphylococcus aureus
Ttrades (cocos de 4 em 4
elementos, simetricamente)


Micrococcus
Sarcina (8 elementos,
formando cubos
simetricamente)


Sarcina (no visvel no plano do MO)

Quanto s clulas alongadas, os grupamentos no apresentam tanta importncia:
1. Diplobacilos (dois a dois):
2. Estreptobacilos (em cadeia): Imagens: Tortora, 2005
(Geralmente esporulam)
34
3. Alguns bacilos podem agrupar-se em paliada, quando o movimento ps-
divisional de deslizamento:
Mycobacterium tuberculosis (PALIADA)

4. Globias: bacililos agrupados em formas concntricas que se assemelham a um
globo.
Mycobacterium leprae (GLOBIA)
Imagens: Fernando Bortolozzi
5. Um outro movimento ps-divisional em dobra, onde as clulas formam ngulo
semelhana de letras e o conjunto lembra letras chinesas:

Corynebacterium diphteriae

6. As formas onduladas apresentam-se individuais, no formando grupamentos.
Observao: em uma preparao microscpica, observar a morfologia celular e o
grupamento predominante.

Formas de Involuo e Pleomrficas

Pleomrficas: so bactrias sem parede e justamente por isso no tm forma definida
ORIGINALMENTE (no se enquadram em cocos, bacilos, espirilos etc., uma vez que nunca
tiveram forma definida). Independe das condies do meio. Exemplos: Haemophilus,
Mycoplasma, Proteus, Chlamydia e o bacilo diftrico.

Involutivas: Bactrias em degenerao, aberrantes ou intumescidas. Quando em meio
inadequado (pH, O
2
, toxinas, composio do meio, produtos txicos vindos do prprio
metabolismo bacteriano, etc.), esses microrganismos perdem sua forma original. Um dia
foram cocos, bacilos, etc. As clulas deste tipo mostram aspectos de intumescimento,
aberrantes e em degenerao, como por exemplo, a Yersinia pestis.
35
CAPTULO 3 CAPTULO 3 CAPTULO 3 CAPTULO 3: : : : MORFOLOGIA COLONIAL

Objetivos

1. Identificar as principais caractersticas culturais de bactrias;
2. Avaliar a importncia destes dados na sistemtica bacteriana, facilitando a
caracterizao e a identificao das bactrias.

Introduo

Fornecendo as mesmas condies de cultivo relacionadas composio do meio de
cultura, atmosfera, temperatura, pH, etc, as bactrias apresentam uma notvel constncia
de caracteres.
Podem-se considerar as seguintes caractersticas coloniais pela variao de:
tamanho, cor, forma, tipos de bordas, elevao, superfcie, consistncia, transparncia,
brilho, cromognese (pigmento solvel ou no).

Definio

Colnia o crescimento dos microrganismos em meio slido. Em condies ideais, a
colnia representa a descendncia de uma nica clula.

Caractersticas das Colnias

Tamanho: puntiformes (menores que 0.5mm) at alguns centmetros de
dimetro.
Cor: amarelo ouro, amarela citrina, amarela clara, vermelha, rosada, branca,
castanha, alaranjada, etc., com pigmento difusvel ou no.
Forma:
Circular Irregular Rizide ou arborescente




36
Bordas:

Lisa Denteadas


Lobadas Onduladas

Elevao:

Convexa alta Convexa baixa


Acuminada Espraiada


Centro-saliente Umbilicada


Centro-deprimida Papiliforme

Superfcie:

Lisa, rugosa, pregueada, raiada


Com crculos concntricos
Consistncia:
Cremosa, viscosa, granulosa, seca
Transparncia:
Opaca, translcida, transparente
Brilho:
Fosca, brilhante
37
CAPTULO 4 CAPTULO 4 CAPTULO 4 CAPTULO 4: : : : VERIFICAO DA PRESENA DE
BACTRIAS NO AR E SUA CONTAGEM ATRAVS DE
CULTIVO

Observao

A partir deste captulo as aulas prticas sero participativas ou demonstrativas
dependendo da disponibilidade de material para sua execuo (meios de cultura, material
patolgico, soros aglutinantes, placas, pipetas, etc.)

Objetivos

1) Avaliar o ambiente quanto presena e nmero de bactrias viveis no
exigentes, aerbias e mesfilas, para justificar a necessidade de assepsia nos
trabalhos bacteriolgicos.
2) Preveno de contaminao em salas de curativos, cirurgias, etc..
3) Estudar as diferentes caractersticas coloniais.

Contagem

Meio de cultivo: gar simples (ASI) distribudo em placas de Petri de 10 cm de
dimetro.

Tcnica

1. Expor contaminao, pelo ar, as placas abertas em diversos locais da sala de
aula por 30 minutos (por exemplo);
2. Fechar e incubar a 36
o
C durante 48h;
3. Contar as colnias desenvolvidas;
4. Calcular a quantidade de bactrias por m
2
de acordo com os seguintes dados:



38
a. rea da placa de 10 cm de dimetro = 0,007854 m
2
.
b. Tempo de exposio: 30 minutos.
Exemplo: 10 UFC 0,007854 m
2

x 1 m
2

x = 1.273 UFC/m
2

em uma hora: 1.273 0,5 hora
x 1 hora
x = 2.546 UFC/m
2
/h

UFC = Unidades Formadoras de Colnia





















39
CAPTULO 5 CAPTULO 5 CAPTULO 5 CAPTULO 5: : : : PREPARAES MICROSCPICAS

Objetivos

Familiarizar o aluno com as tcnicas de preparaes microscpicas, visando
observao dos microrganismos. Pelas caractersticas vistas, iniciar a identificao das
bactrias.

Introduo

Existem muitos tipos de preparaes microscpicas, variando com a necessidade de
obter dados como: mobilidade, estruturas celulares, propriedades tintoriais, etc,...
A bacterioscopia pode ser feita com o objetivo de observar bactrias:
1. Vivas: pelos exames a fresco.
2. Mortas: em preparaes coradas.

Preparaes a Fresco

Campo Claro
- Entre lmina e lamnula.
- Gota pendente.
Campo Escuro
- Entre lmina e lamnula.
Servem para observar a mobilidade e/ou presena de bactrias.

Preparaes Coradas

Colorao Negativa usando contraste.
Colorao Simples um corante.
Colorao Composta ou Diferencial dois ou mais corantes diferentes.
A colorao negativa e a colorao simples so usadas para observar a presena de
bactrias e sua morfologia.
A colorao composta usada para evidenciar estruturas celulares e as
propriedades tintoriais.
40
Preparaes a Fresco

Nas preparaes a fresco os materiais lquidos como urina, exsudatos, LCR, meios
de cultivo lquidos, podem ser examinados tais como se apresentam ou centrifugados e
examinando-se o sedimento.
Quando se tem material espesso (patolgico ou de cultivo), deve-se dilu-lo em soro
fisiolgico estril.
Podem-se examinar as bactrias ao natural, com pouca luminosidade, mas como as
suas clulas tm um ndice de refrao prximo ao da gua, algumas vezes torna-se difcil
observ-las. Nesses casos recorre-se aos corantes vitais, atxicos (para no prejudicar a
mobilidade). Os mais usados so: azul de metileno, vermelho neutro, azul de Nilo, entre
outros, em soluo aquosa a 1%.






Tcnica de preparao
entre lmina e lamnula
1) Sobre uma lmina colocar uma ou duas gotas do
lquido a examinar;
2) Cobrir com lamnula.
Observar ao microscpio com quantidade reduzida de
luz e objetiva de pequeno aumento (10x) para uma viso
panormica. Em seguida passar para 40x aumentando
convenientemente a intensidade da luz.
Observao: para evitar a dessecao do material, pode-se
cercar as gotas com Vaspar (mistura de vaselina e parafina).
A lamnula colocada ficar aderida ao Vaspar, fechando a
preparao. Na falta de Vaspar pode-se utilizar vaselina
slida ou lanolina.





Tcnica de preparao em
gota pendente
Usa-se para esta tcnica a lmina escavada de Koch (lmina
com 3 mm de espessura com concavidade central).
1. Untar as bordas da concavidade com Vaspar.
2. Sobre uma lamnula colocar uma pequena quantidade do
lquido a ser examinado.
3. Inverter a lmina escavada sobre a lamnula e pression-la
levemente para aderir ao Vaspar.
4. Voltar rapidamente a lmina sua posio normal.

41
VISTA DE CIMA CORTE TRANSVERSAL
(APS A MONTAGEM)

Lmina Vaspar Lmina Lamnula Vaspar







Gota Pendente
Escavao (concavidade)


Preparao a fresco em campo escuro

Serve para a mesma finalidade que as tcnicas precedentes, mas especialmente
usada para observar bactrias muito delgadas, que so invisveis em campo claro. Utilizada
para observar a presena de espiroquetas em materiais como serosidade de cancro sifiltico
(Treponema pallidum) ou urina suspeita de conter Leptospira (urina recm emitida e
centrifugada, utilizar o sedimento).
O campo escuro ao microscpio obtido usando-se um condensador especial (como
o cardiide) que impede a penetrao de raios diretos de luz sobre o material examinado.
As bactrias so iluminadas lateralmente, contrastando com o fundo escuro.
A tcnica de montagem da preparao a mesma que entre lmina e lamnula.


Preparaes Microscpicas Coradas

So as mais usadas em bacteriologia, onde as bactrias esto mortas e
artificialmente coradas. Este tipo de preparao, que compreende a colorao de Gram,
muito importante na identificao presuntiva de microrganismos. A morfologia da clula, sua
disposio e propriedades tintoriais so freqentemente suficientes para definir o gnero.
Etapas das preparaes coradas:
1) Esfregao
2) Fixao (a quente ou a frio)
3) Colorao
42
1. Esfregao: consiste em depositar o material a examinar no centro de uma lmina
e espalh-lo numa espessura apropriada. Deixar secar espontaneamente ou
numa estufa a 37
o
C. Se o material a examinar pela bacterioscopia for muito
espesso (patolgico ou cultivo), deve ser diludo em salina ou gua estril. Se for
material lquido e pobre em microrganismos, deve ser centrifugado (urina, por
exemplo); derrama-se o sobrenadante e examina-se o sedimento.

2. Fixao: tem por objetivo fixar o material lmina para que no se desprenda
durante os procedimentos ulteriores. A fixao pode ser feita a quente ou a frio.
Em ambos os casos h coagulao de clula bacteriana que a faz aderir
lmina.
A Quente
Pode ser feita serrando com a lmina a chama da lmpada
ou bico de Bunsen, duas a trs vezes, com a face que contm
o material voltada para cima, para no ter contato direto com a
chama.
Derrama-se lcool sobre a preparao e inflama-se.
Observao: a exposio excessiva ao calor deforma a morfologia da bactria e
com aquecimento insuficiente haver desprendimento do material.

A Frio
Para no alterar muito a morfologia bacteriana ou quando h
interesse de observar o aspecto citolgico do material, como
exsudatos, sangue, lquor, etc., usa-se fixao a frio, cobrindo
o esfregao com substncias qumicas:
- Mistura de lcool e acetona.
- Formol.
- Soluo de cloreto de mercrio, etc.


3. Colorao propriamente dita: seguir as instrues do mtodo de colorao a
ser usado. Nos casos em que se queira observar apenas a presena de bactrias
ou conhecer a sua morfologia ou grupamento, recorre-se COLORAO
SIMPLES, onde se usa um corante qualquer: azul de metileno, fucsina, violeta de
genciana, etc.
43
Colorao Simples

Tcnica

1. Cobrir o esfregao com o corante e deixar agir um minuto;
2. Lavar com gua;
3. Secar.
Examinar no MO com a objetiva de 100x em imerso.


Colorao Composta ou Diferencial

Nestas coloraes participam fundamentalmente quatro componentes, cuja natureza
qumica varia com o mtodo escolhido.

1. Corante principal: o primeiro a ser empregado determinando a caracterstica
tintorial (como por exemplo, violeta de genciana na colorao Gram).
2. Mordente: a substncia que refora a ao do corante principal (iodo no
Gram).
3. Diferenciador: o elemento que descora seletivamente as bactrias (lcool no
Gram).
4. Corante secundrio ou de fundo: o que cora os elementos descorados pelo
diferenciador (fucsina no Gram). O corante de fundo tem que ter cor contrastante
com o corante principal.
A colorao diferencial universalmente aceita, e usada em todos os laboratrios
de bacteriologia, a colorao de Gram, que separa as bactrias em dois
grandes grupos:
1) Gram positivas.
2) Gram negativa.

A propriedade tintorial revelada pelo Gram est relacionada composio
qumica da parede celular bacteriana.



44
COLORAO DE GRAM

Tcnica
1. Cobrir o esfregao com Violeta de Genciana e deixar agir. (1 minuto)
2. Derramar o corante e cobrir com lugol. (1 minuto)
3. Lavar com gua.
4. Descorar pelo lcool (tempo crtico) - (15 segundos)
5. Lavar com gua.
6. Cobrir com fucsina de Ziehl diluda 1:10. (30 segundos)
7. Lavar com gua.
8. Secar.

Observao: existem diversas modificaes do mtodo de Gram. Alguns laboratrios
substituem a Violeta de Genciana (penta e hexametil pararosanilina) por Cristal Violeta
(hexametilpararosanilina) que tem poder corante superior.
As bactrias submetidas ao mtodo de Gram comportam-se da seguinte maneira:

(Fonte: Tortora, 2005)
Etapa Gram POSITIVA Gram NEGATIVA
At a 3
a
etapa
Aps a 5
a
etapa
Aps a 7
a
etapa
Violeta
Violeta
Violeta
Violeta
Incolor
Vermelha

45
GRAM GRAM +
Microscopia: Rosa Microscopia: Roxo
Possui uma parede celular mais diversificada,
sem lipoteicoato
Possui filamentos de teicoato, ligados
muranato
1-2 camadas de peptidoglicano (5-10%)
(+ FINAS)
15 a 20 camadas de peptidoglicano (90%)
(+ ESPESSAS)
Mais lipdeo (20%) e muitos aa Tem pouco lipdeo (2%) e poucos aa
Possui uma 2 membrana ancorada s
camadas de peptidoglicano (chamada
membrana externa) externa parede celular
Tem adjacente membrana plasmtica uma
parede celular
Formam ESFEROPLASTOS: quando a
bactria perde a parece celular. Quando restam
partes da PC, em local e condies adequadas,
essa PC pode ser refazer.
Formam PROTOPLASTOS: a membrana de
uma bactria gram +. Se perd-la, no
consegue refaz-la. Porm sobrevive s com o
protoplasto.
Mais polissacardeos e presena de lipdeo A
formando os lipopolissacardeos (LPS***)
Menos polissacardeos



CORRELAES CLNICAS: Fonte: Robbins, 2005

*** LPS: so pirognios exgenos (geram calor) No organismo humano, podem ser
produtores de febre. Quando os macrfagos fagocitam os produtos bacterianos, produzem
altas concentraes de fator de necrose tumoral. O TNF estimula a produo de Interleucina
1 (IL-1) por outros macrfagos e alguns leuccitos. Esses mediadores estimulam a
expresso de receptores no endotlio para que os neutrfilos migrem, via rolamento, para o
tecido conjuntivo em combate s bactrias patognicas. Alm disso, a IL-1 e o TNF
estimulam a produo de PGE-2 (prostaglandina E2) no hipotlamo, que controla a
temperatura corporal via AMPc. Com o aumento da temperatura corporal, protenas do
choque trmico so expressar e ativam a resposta e a atividade linfocitria. Ou seja, a
elevao da temperatura corporal melhora a resposta imune do indivduo frente a bactrias
patognicas. Outros efeitos do TNF e da IL-1 (quando elevados) so a sonolncia e a
inapetncia, o que explica porque o paciente geralmente fica acamado durante uma
infeco. Detalhes sero vistos na disciplina de Patologia Mdica Molecular (BP337).

* Espao periplsmico: o espao entre as camadas de peptidoglicano. um importante
local de produo de enzimas, entre elas a -LACTAMASE. Uma enzima muito importante,
pois ela influencia na teraputica antibitica. -lactmicos so uma classe de antibiticos,
diga-se de passagem, os antibiticos mais utilizados no tratamento de infeces (leia-se
penicilinas, cefalosporinas, carbapenmicos, etc). Esses antibiticos so assim chamados
porque em sua composio tm um anel beta-lactmico. Essas bactrias que produzem -
46
lactamases, so capazes de destruir esse anel dos antibiticos por hidrlise, deixando o
mecanismo de ao antimicrobiano inativo. Ou seja, UM IMPORTANTE MECANISMO DE
RESISTNCIA AOS ANTIBITICOS! As principais bactrias que a produzem so os
estafilococos (Staphylococcus aureus principalmente), Haemophilus influenzae, Moraxella e
a maioria dos BGNs intestinais como a Escherichia coli. Estreptococos geralmente no so
capazes de produzir -lactamases. No entanto, em uma infeco tipo tonsilite por
Streptococcus pyogenes (Estreptococo beta hemoltico do grupo A de Lancefield produtor
de estreptolisina), por exemplo: esta bactria no produz -lactamases, mas algumas
bactrias da microbiota residente as produzem. Essas enzimas degradam o frmaco que iria
matar a bactria causadora da infeco e o medicamento acaba falhando. Por isso, muitas
vezes, mesmo para infeces estreptocccicas, deve ser prescrever um antibitico JUNTO
COM UM INIBIDOR DAS BETA LACTAMASES. At porque clinicamente no se sabe se
trata-se de uma infeco por estafilococos, estreptococos, Haemophilus, Moraxella, etc.
Prescreve-se um antibitico -lactmico com um inibidor de -lactamases que faz inibio
enzimtica e deixa essas penicilinases sem atividade cataltica. Ex: Clavulanato, Sulbactam,
etc. Eles inibem as -lactamases e deixam o antibitico agir (penicilina). Alm disso, muitas
vezes, a prpria bactria causadora da infeco pode ser produtora dessas enzimas.

Medicamentos com inibidores de -lactamases:
Amoxicilina + Clavulanato de Potssio (Clavulin). Antibitico de primeira escolha para
infeces de vias areas superiores. O clavulanato inibe as -lactamases e a amoxicilina,
uma vez que no ser destruda pela ao dessas enzimas, dar cabo das bactrias. H
vrios esquemas de posologia que sero vistos nas disciplinas clnicas.
Amoxicilina + Sulbactam (Trifamox IBL)

Mecanismo de ao dos -lactmicos: Inibio da sntese de peptideoglicano. Existem
enzimas responsveis pela sntese de peptideoglicano, as PBP (Penicillium Binding
Proteins), so transpeptidases e carboxipeptidases, protenas fixadoras de penicilina. O
mecanismo simples, esses antibiticos inibem essas enzimas (que geralmente se
localizam na superfcie externa da MP), deixando a parede celular frouxa. Mas, alm disso,
esses antimicrobianos fazem a inativao dos inibidores das enzimas autolticas na PC.


Exemplos de bactrias Gram positivas e Gram negativas mais comuns:
Cocos Gram positivos Staphylococcus, Micrococcus, Streptococcus, Enterococcus,
Sarcina
Cocos Gram negativos Neisseria (gonorrhoeae e meningitidis), Moraxella, Veillonella
Bacilos Gram positivos Bacillus, Lactobacillus, Clostridium, Corynebacterium, Listeria
Bacilos Gram negativos Enterobacteriaceae (Salmonella, Shigella, Escherichia coli,
Proteus, etc), Bordetella, Brucella, Pseudomonas, Alcaligenes

O comportamento tintorial frente ao Gram est relacionado intimamente a outras
propriedades das bactrias. De tal modo que, ao verificarmos a Gram positividade ou Gram
negatividade, teremos informaes referentes natureza qumica da parede celular e do
seu comportamento frente aos agentes antimicrobianos (antibiticos, corantes, etc.).
47
COLORAO DE ZIEHL-NEELSEN: A Evidenciao de Bacilos lcool-cido
Resistentes (BAARs)


Certas bactrias, como o bacilo da tuberculose e da hansenase, dificilmente tomam
as cores da anilina, mas uma vez coradas por tcnicas apropriadas fixam fortemente o
corante, a ponto de resistir ao de descorantes como o lcool e cidos minerais fortes e
diludos. Da o uso corrente do mtodo de Ziehl-Neelsen ou de suas numerosas
modificaes para identificao das bactrias, que assim se comportam e por isso so
chamadas Bacilos lcool-cido Resistentes (BAAR).
Para vencer a resistncia colorao, aumenta-se a concentrao do cido fnico
(mordente) da soluo corante, prolonga-se a exposio ao corante (5 a 10 minutos) e
aplica-se o calor (aquecimento) durante o tempo de colorao.
No descoramento so usados o lcool e solues de cidos minerais, tais como o
cido ntrico, sulfrico ou clordrico.
O fenmeno de cido-lcool resistncia atribudo presena de um alto teor de
lipdeos, sobretudo na parede celular, que se ope penetrao do corante.

Composio dos Reativos Usados no Ziehl-Neelsen

Fucsina fenicada
Fucsina bsica 0,3 g
lcool 95
o
10 mL
Fenol fundido 5 mL
gua destilada 95 mL
Observao: em outras coloraes usa-se o fenol aproximadamente em
quantidade 5 vezes maior.

Diferenciador
lcool etlico 95
o
99 mL
cido clordrico 1 mL

Corante de fundo
Soluo de azul de metileno.

48
Tcnica

1. Fixar o esfregao pelo calor.
2. Cobrir com fucsina de Ziehl e aquecer at o desprendimento de vapores, a partir
deste momento, contar 5 minutos. No ferver nem deixar secar. Quando cessar a
emisso de vapores, aquecer a lmina novamente.
3. Lavar com gua.
4. Descorar com lcool cido, at no sair mais o corante.
5. Lavar com gua.
6. Corar com azul de metileno, 1 minuto.
7. Lavar, secar.
Os bacilos lcool-cido resistentes aparecem em cor vermelha, cor da fucsina, e
os outros elementos coram-se em azul, cor do azul de metileno (no caso do
escarro: cocos, outros bacilos, leuccitos, clulas epiteliais, filamentos de muco,
etc.).


COLORAES DE ESPIROQUETAS


Os espiroquetas so microrganismos muito delgados (a maioria tem cerca de 0,2 m
de espessura), helicoidais, de corpo flexuoso e deformvel durante o movimento. A maior
parte cora-se com dificuldade, devido natureza lipdica das estruturas mais superficiais:
so microrganismos delicados que perdem a morfologia se forem fixados pelo calor numa
preparao microscpica. Por estas razes, para observ-los, as tcnicas mais comuns so
as seguintes:
1. Exame a fresco em campo escuro.
2. Colorao negativa com tinta-da-China (mtodo de Burri).
3. Mtodos de impregnao pela prata: Fontana-Tribondeau, Morosov, etc.
4. Mtodo de Giemsa.




49
Colorao Negativa (Mtodo de Burri)


So preparaes com tinta-da-China (Nanquim) ou Nigrosina. Usada para
evidenciar: espiroquetas, bacilo diftrico, associao fuso-espiralar ou cpsulas bacterianas.
Uma das maneiras de preparar a lmina para colorao negativa segue esta tcnica:
1. Colocar o material a examinar sobre a lmina;
2. Gotejar tinta-da-China;
3. Usando outra lmina (no esborcinada), reunir os dois materiais e inclinando-a
num ngulo de 40
o
, estender sobre a primeira lmina, maneira de esfregaos
de sangue.
4. Deixar secar.
Examinar em imerso.
Os elementos (bactrias) aparecero como se apresentam em natureza, isto ,
hialinas, incolores, contrastando com o fundo escuro formado pela tinta-da-China.
um mtodo que deforma em menor grau a clula bacteriana, uma vez que no
usa fixao pelo calor, corantes, diferenciadores, etc., que possam desidrat-la
ou deform-la.

Fontana-Tribondeau (Impregnao pela Prata)

Mtodo tradicional para a identificao de espiroquetas como o Treponema palidum.

Composio dos reativos no mtodo de Fontana:
Fixador (Lquido de Ruge) cido actico 1 mL
Formalina 2 mL
gua destilada 100 mL
Mordente Tanino 5g
gua fenicada a 1% 100 mL
Soluo impregnadora Nitrato de prata amoniacal




50
Processo

1. Secar o esfregao ao ar.
2. Cobrir com lquido de Ruge e deixar agir por 1 minuto.
3. Lavar com gua.
4. Cobrir com soluo de tanino fenicado, aquecendo a lmina at a emisso de
vapores, durante 1 minuto.
5. Lavar com gua.
6. Cobrir com soluo de nitrato de prata e aquecer at a emisso de vapores
durante minuto.
7. Lavar e secar ao ar.
As bactrias aparecem de cor marrom e o fundo da lmina amarelo.


COLORAO DE GRANULAES METACROMTICAS

As granulaes metacromticas so as que tratadas por certos corantes, apresentam
o fenmeno de metacromasia, isto , tomam uma cor diferente da do corante.
So tambm chamadas de granulaes de volutina ou de Babes-Ernst; so
encontradas em determinadas bactrias como: Spirillum volutans, bacilo diftrico, difteride
e lactobacilo. Para evidenci-las, usam-se mtodos de colorao especiais. Exemplo:
mtodo de Neisser, mtodo de Albert Laybourn, os quais empregam corantes
metacromticos.

Mtodo de Albert Laybourn

Reativos da Colorao de Laybourn
Soluo de Laybourn Azul de toluidina
Verde malaquita
cido actico glacial
lcool a 95%
gua destilada
Mordente Lugol forte

51
Tcnica

1. Fixar o esfregao pelo calor.
2. Corar com soluo de Laybourn por 3 a 5 minutos.
3. Derramar o corante e cobrir com lugol por 1 minuto.
4. Lavar com gua.
5. Secar.
Examinar em imerso.
As bactrias aparecem coradas de verde-claro e as granulaes ficam escuras
(quase negras).
Observao: o corante metacromtico, neste mtodo, o azul de toluidina.
52
CAPTULO 6 CAPTULO 6 CAPTULO 6 CAPTULO 6: : : : MEIOS DE CULTURA

O conjunto de substncias nutritivas em que se cultivam os microrganismos em
laboratrio chama-se meio de cultura. A composio varia ao infinito. Os meios de cultura
microbiolgicos consistem em uma mistura de substncias nutrientes mais ou menos
complexa, dependendo das exigncias nutritivas da espcie em estudo. As exigncias so
decorrentes do maior ou menor poder de sntese da espcie. Alguns meios compem-se
apenas de solues de sais inorgnicos, outros se preparam com ingredientes complexos
como extratos de tecidos ou rgos de animais. Outros consistem em tecidos vivos (cultivo
de tecidos) usados para Rickettsia e vrus.
Os meios de cultura podem ser divididos em diversos grupos de acordo com a
procedncia, consistncia, composio e finalidade.

QUANTO PROCEDNCIA
Naturais So usadas substncias assim como elas se apresentam na natureza ou
apenas com pequenas modificaes, como coco.
Exemplos: suco de tomate, batata, leite.
Artificiais So preparados no laboratrio, pela mistura de diversas substncias.
Exemplos: caldo simples, gua peptonada.


QUANTO CONSISTNCIA
Slidos
Semi-slidos
Xaroposos
Lquidos

A solidificao geralmente feita acrescentando o gar aos meios lquidos.
Aumentando ou diminudo a porcentagem do gar, obtemos a variao da consistncia de
acordo com a necessidade.
O gar extrado de algas marinhas (gnero Gelidium uma delas) de natureza
qumica polissacardica (D-galactose e L-galactose).
um solidificante ideal porque:
53
1. No metabolizado pelas bactrias de interesse mdico (apenas algumas
espcies marinhas o digerem).
2. Uma vez na consistncia de gel, s se liquefaz temperatura de 100
o
C (prprio
at para o cultivo de termfilas = 65
o
C a 70
o
C).
3. uma vez liquefeito, vai solidificar apenas ao redor de 45
o
C, fato que se aproveita
para cultivar bactrias incorporadas ao meio de cultura a esta temperatura. Em
seguida deixa-se solidificar (semeadura de Pour-Plate).
Outras substncias usadas para solidificar os meios de cultura so:
a) Gelatina.
b) Slica-gel.
a) A gelatina obtida a partir de ossena, uma protena rica em aminocidos.
Apresenta a desvantagem de ser hidrolisada por algumas bactrias, com o
que perde sua qualidade de gel. Tambm porque temperatura de 36
o
C
(temperatura prpria para o cultivo da maioria das bactrias de interesse
mdico) ela apresenta-se lquida.
b) A slica-gel obtida pela ao de HCl sobre silicato de sdio, formando cido
silcico. Tem a vantagem de apresentar composio qumica definida, no
possuir nenhum elemento nutritivo, ideal para solidificar os meios sintticos.

QUANTO COMPOSIO
Simples So destinados ao cultivo de germes pouco exigentes ou servem de base
para outros meios.
Exemplos: soluo aquosa de sais minerais, caldo simples, gua peptonada,
gelose simples.
Enriquecidos So meios adicionados de substncias altamente nutritivas, como protenas
termocoagulveis (sangue, plasma sanguneo, lquido de ascite),
aminocidos, extratos de rgos de mamferos, protena da soja, etc.
Exemplos: gar sangue e gar soro. Usados no cultivo de bactrias
exigentes.





54
QUANTO FINALIDADE
Seletivos A adio de certas substncias qumicas, ao meio de cultura, inibe
o crescimento de algumas bactrias, possibilitando o
desenvolvimento de outras. O cristal violeta na concentrao de
1:20.000, inibe a proliferao de germes Gram positivos, sem
afetar os Gram negativos. A penicilina e outros antibiticos so
usados com a mesma finalidade. Os meios seletivos so slidos.
Diferenciais So aqueles que permitem a diferenciao dos germes que neles
crescem, pela mudana da cor das colnias ou do meio de cultura,
pela reao com produtos do metabolismo.
Seletivos-Diferenciais So os que simultaneamente selecionam e diferenciam as
espcies. Exemplo: meio de Teague, MacConckey, Chapmann e
SS.
De Enriquecimento So os meios lquidos ou xaroposos que favorecem a proliferao
dos germes, facilitando o seu posterior isolamento em meio slido.
So usados quando as bactrias que se deseja isolar, estejam em
quantidade muito pequena ou quando a microbiota de
acompanhamento seja muito rica. Neste ltimo caso, costuma-se
adicionar substncias impedientes ao meio, de modo que na
cultura prevalecer o germe que se deseja isolar.
Meios Sintticos So meios de composio qumica bem definida, constitudos de
soluo de sais minerais ou orgnicos, aminocidos, hidratos de
carbono e vitaminas.

Sobre a composio, preparo e ajuste de pH de meios de cultura, consultar
Diagnstico Microbiolgico (6
a
edio) 2001, de Konemann e colaboradores.
55
CAPTULO 7 CAPTULO 7 CAPTULO 7 CAPTULO 7: : : : ISOLAMENTO DE MICRORGANISMOS

Tcnicas asspticas de semeaduras para o isolamento e estudo das bactrias.

Objetivos

1. Treinar o aluno na manipulao dos meios de cultura, em condies de assepsia.
2. Executar semeaduras em meios slidos e lquidos.
3. Semear o material em estudo (patolgico ou no) para obter o isolamento da
bactria em cultura pura, cujas propriedades serviro para caracterizao e
posterior identificao.

Introduo

Em microbiologia nada pode ser feito antes de isolar a bactria em cultura pura, ou
seja, a cultura deve ser de uma nica espcie. S ento que se pode caracteriz-la.
O cultivo de bactrias requer tcnicas asspticas adequadas, para evitar
contaminaes. Para isso devem ser observados os seguintes cuidados:
Os tubos e placas estreis ou com material em estudo somente devem ser
abertos prximos a uma chama onde se forma uma rea estril (ou se usar
cmara assptica).
Os procedimentos devem ser feitos de preferncia por trs da chama.
As alas ou agulhas devem ser flambadas imediatamente antes e aps o uso
(aps o uso, evitar o aquecimento brusco para evitar os aerossis). As alas
devem ser levadas ao rubro em posio vertical em relao chama de gs ou
lmpada de lcool.
As bocas de tubos, frascos, pipetas, etc., so flambadas ligeiramente antes e
aps a transferncia de material.
Nunca abrir os tubos ou frascos na posio vertical. Para semeadura em meios
lquidos, inclinar o tubo em um ngulo de aproximadamente 40
o
. O tubo com
meio slido, deixar na horizontal.


56
Isolamento em Placas

O isolamento em placas o mais usado para obter cultura pura de amostras que
contenham populao mista. Com semeadura por esgotamento (para descarregar a ala),
fazem-se estrias superficiais de lado a lado da placa.



Cuidados
1. Ocupar toda a superfcie do meio de cultura;
2. No passar 2 vezes no mesmo local (salvo em semeaduras que
sero explicadas a seguir);
3. As estrias no devem ser muito prximas nem muito distantes
uma da outra (o objetivo conseguir colnias isoladas).

Uma das maneiras corretas de semear Maneiras incorretas de semear
Crescimento confluente






Colnias isoladas
Desperdcio de meio de cultura sem
conseguir culturas isoladas




Estrias muito apertadas que resultam em
crescimento confluente.

Quando se tem material muito rico em bactrias (verificar pela bacterioscopia), pode-
se fazer estrias em quadrantes, flambando a ala na ltima estria do quadrante
anteriormente semeado.
Esgotamento


Ponto de recarregamento





Na semeadura por estrias haver crescimento confluente na rea de esgotamento e
nas primeiras estrias. Em seguida aparece um grande nmero de colnias isoladas, muito
57
prximas umas das outras e de tamanho pequeno. S no final haver espaamento maior
entre as colnias e estas tero o tamanho caracterstico da espcie.
Inicialmente o crescimento exponencial em relao ao tempo. Logo aps,
entretanto, a ordem de crescimento se torna muito complexa, devido proximidade das
clulas acumuladas. Esta proximidade cria uma situao que pode ser chamada
aglomerao fisiolgica na qual as clulas competem entre si pelos nutrientes disponveis
e afetam-se mutuamente pelo acmulo de produtos residuais.
O crescimento em colnias afetado no s pelas interaes celulares dentro de
cada colnia, mas tambm por interaes entre colnias vizinhas, conforme explicado
anteriormente.
Para a prxima etapa de identificao, vai se preferir as colnias bem separadas,
presumindo-se que so formadas por descendentes de uma nica clula, portanto
constituindo cultura pura.
Existem diversas maneiras de fazer estrias, dependendo da preferncia ou
habilidade do laboratorista. O importante que no final se consiga colnias isoladas.
Observao: cultura pura a condio indispensvel para caracterizao e
identificao de bactrias.


Identificao de Bactrias

Objetivos

1. Familiarizar o aluno com a seqncia de etapas para conseguir caracterizar e
identificar a bactria para fins de diagnstico.
2. Conhecer os princpios das provas bioqumicas diferenciais utilizadas na
caracterizao.
3. Executar tcnicas e interpretar resultados.

A identificao fundamenta-se na observao de um complexo conjunto de
caracteres. necessria a anlise de todos os aspectos: morfologia celular, morfologia
colonial, atividades fisiolgicas relacionadas com os diversos metabolismos de carboidratos,
protenas, etc. (so as provas bioqumicas) e estrutura antignica (reao antgeno-
anticorpo). A investigao de somente um tipo dessas caractersticas raramente suficiente
para identificar a espcie.
58
CAPTULO 8 CAPTULO 8 CAPTULO 8 CAPTULO 8: : : : PROVAS BIOQUMICAS DIFERENCIAIS

Atravs das provas bioqumicas verificam-se as transformaes que ocorrem num
substrato conhecido, pela ao das enzimas bacterianas. Cada microrganismo possui um
sistema enzimtico especfico. Com auxlio de indicadores observa-se se o substrato foi
degradado, de que maneira ou se no o foi.
As provas bioqumicas baseiam-se no metabolismo de:
1) Carboidratos (fermentao de glicose, lactose, etc.).
2) Nitrogenados proticos (indol).
3) Nitrogenados no proticos (urease).
Entre outras.
Para realizar as provas bioqumicas usam-se meios de cultura contendo meio
nutritivo bsico, acrescido do substrato a ser ensaiado. Mesmo que a bactria no utilize o
substrato testado, ela crescer a custa do meio bsico.
Os sistemas de provas bioqumicas tornaram-se cada vez mais sofisticados na
atualidade.
A quantidade de provas depende da espcie a caracterizar. Algumas so
caracterizadas com menos de 10 provas, outras exigem dezenas delas.
As provas bioqumicas que vo ser executadas em sala de aula prtica so: provas
de fermentao da glicose, lactose, sacarose e manitol; prova do indol, citratase, gs
sulfdrico (H
2
S), urease, vermelho de metila, Voges-Proskauer, gelatinase, nitratase e
mobilidade.

Provas de Fermentao
Fermentao da Glicose
Fermentao da Lactose
Fermentao da Sacarose
Fermentao do Manitol


A aparncia dos 4 tubos igual, levam a identificao das letras, G, L, S e M,
respectivamente.

Cada um destes substratos misturado a meio nutritivo bsico, de acordo com a
seguinte frmula:
59
Caldo simples 1000 mL
Soluo de carboidrato a 10% 100 mL
Vermelho de fenol (indicador de pH) 2 mg
Dentro do tubo com meio de cultura h um tubo pequeno, de boca para baixo
(tubinho de Durham) que vai servir para captar os gases que se formam na decomposio
do carboidrato, em casos que a bactria elaborar a enzima formiase e que vai desdobrar o
cido frmico (metanico) em H
2
e CO
2
.

O FORMIASE
H C H
2
+ CO
2

OH

Os seguintes casos podem ser observados:
1) Cor vermelha (inicial) = reao negativa.
2) Cor amarela = reao positiva.
3) Cor amarela com gs = reao positiva com gs.
A notao usada para reaes:
Reao negativa = - ou 0 (zero).
Reao positiva = + ou A (cido).
Reao positiva com gs = + ou AG (cido e gs).

PROVA DO INDOL (Derivados Proticos)


Meio de cultivo:
gua peptonada de frmula:
Peptona (triptofano) 10g
gua 1000 mL
O triptofano quando metabolizado por desamimao pela enzima triptofanase, libera
indol livre (benzil pirrol), cido pirvico e NH
3
.
Uma das tcnicas de verificar a presena do indol extra-lo da fase aquosa por
meio de ter e evidenci-lo por meio do reativo de Ehrlich.

TRIPTOFANASE
TRIPTOFANO INDOL + NH
4
+
+



60
Tcnica

1) Agitar a cultura com ter (na proporo de 3:1).
2) Deixar em repouso para estratificar as camadas.
3) Pelas paredes do tubo inclinado, gotejar o reativo de Ehrlich at formar camada
visvel.

Resultado

Cor vermelha imediata: prova + POSITIVO
Cor amarela: prova - NEGATIVO
O princpio ativo do reativo de Ehrlich : paradimetilaminobenzaldeido.


PROVA DA CITRATASE (Bactrias que usam Citrato como fonte de Carbono)

O meio de cultura usado o de Kirsh-Koser, cuja frmula :
Fosfato de sdio amoniacal
Fosfato monopotssico
Sulfato de magnsio
Citrato de sdio
gua

Nota-se, pela composio, que a nica fonte de C o citrato. Os outros componentes
so sais inorgnicos. S vai proliferar a bactria que produzir a enzima citratase, que
degrada o citrato, liberando o C.

Resultado

Turbidez: prova positiva
Limpidez: prova negativa




61
PROVA DO GS SULFDRICO H
2
S

O meio de cultivo para esta prova contm composto sulfurado (cistena, metionina ou
tiossulfato) e um indicador de reao (sal de metal pesado: ferro, chumbo, etc.).
O substrato sulfurado vai ser hidrolisado pela enzima dessulfidrilase, liberando S na
forma de H
2
S. A seqncia de etapas que conduzem produo e deteco do H
2
S a
seguinte:
1. Liberao do S a partir do composto sulfurado;
2. Acoplamento do S (S
-2
) com o on H (H
+
) para formar H
2
S;
3. Deteco do H
2
S pelos sais de metais pesados na forma de sulfeto do metal
pesado que preto.
Prova positiva = meio de cultivo enegrecido.

PROVA DA UREASE

O meio de cultura contm, alm da uria, um indicador de pH, azul de bromotimol. A
urease uma enzima que desdobra a uria com liberao de amnia e dixido de carbono.
A uria uma diamida do cido carbnico cuja frmula :
Uria

A urease hidrolisa a uria de acordo com a reao:


A amnia reage em soluo para formar carbonato de amnio, resultando a
alcalinizao do meio observada pelo indicador de pH.
Prova positiva = cor azul intensa.
O gnero Proteus hidrolisa rapidamente a uria de 1 a 2h ou at 24h.
O gnero Klebsiella urease tardia, pode demorar de 3 a 4 dias para positivar.



62
PROVA DE VM (VERMELHO DE METILA) E VP (VOGES-PROSKAUER)

Ambas so realizadas no meio de Clark-Lubs, cujo substrato a testar a glicose.
Por estas provas evidenciamos duas maneiras de decomposio da glicose:
1) A partir do cido pirvico h formao de cidos orgnicos fortes (cido actico,
cido lctico, cido frmico) provocando uma queda acentuada do pH do meio
(<4,5).
2) cido pirvico decomposto em acetil-metil-carbinol ou acetona e pequena
quantidade de cidos orgnicos fortes. A acetona neutra e os cidos formados
no baixam muito o pH, ficando em torno de 6 a 6,5.
A acidez forte do primeiro caso verificada pela prova de VM.
A presena de acetil-metil-carbinol detectada pela prova de VP.

Glicose cido frmico H
2
+ CO
2



Succinato Acetil-CoA Acetato




Lactato acetil-metil-carbinol


Muitas bactrias (incluindo todas as enterobactrias) produzem a fermentao cida
mista, com produo de diferentes quantidades e tipos de cido de acordo com a
composio enzimtica da bactria. Exemplo: Escherichia coli produz grandes quantidades
de cidos. Enterobacter produz grande quantidade de acetona e pequena quantidade de
cidos.

Tcnica de VM

No meio cultivado Clark-Lubs colocar 5 gotas do vermelho de metila.
Interpretao: colorao vermelha = positiva;
colorao amarela = negativa.
Observao: o vermelho de metila um indicador de pH com a zona de viragem
entre 6 e 4,4 (6 amarelo; 4,4 vermelho).

PIRUVATO
63
Tcnica de VP

Ao Clark-Lubs juntar o reativo de Barrit:
d) Alfa-naftol a 5% em lcool absoluto.
e) Soluo aquosa de KOH a 40%.
Colocar 6 gotas de alfa-naftol e 4 gotas de KOH. Agitar para expor o meio de cultura
ao contato com o O
2
do ar.
Observao: o alfa-naftol catalisador.
A reao se processa assim:

acetona + O
2
+ KOH + alfa-naftol diacetila + O
2
+ KOH
complexo colorido vermelho

A reao lenta, de algumas horas. acelerada pelo catalisador alfa-naftol que se
acrescenta reao, dando resultado em 10 minutos.
Resultado: Colorao vermelha = prova positiva.

PROVA DA GELATINASE

O meio de cultura usado acrescido de gelatina. Algumas bactrias decompem a
gelatina, que perde a qualidade de gel.
Aps o cultivo, ao tirar da estufa a 37
o
C o meio de cultivo apresenta-se lquido. Para
saber se a gelatina foi hidrolisada, coloca-se o tubo na geladeira por alguns minutos. Se o
meio solidificou porque a gelatina est intacta. Se permanecer lquido sinal de
degradao da gelatina.
Resultado: Meio liquefeito = prova positiva;
Meio solidificado = prova negativa.


PROVA DA NITRATASE OU REDUO DO NITRATO (NO
3
-
)

O termo reduo de nitratos inclui todos os processos pelos quais o nitrato
desaparece do meio de cultura, pela ao das enzimas bacterianas, aparecendo o
nitrognio sob forma menos oxidada.
64
Na maioria das espcies essa reduo no prossegue alm do estgio de nitritos:

NO
3
+ 2e

+ 2H NO
2
+ H
2
O

s vezes, no entanto, a reduo progride at a formao de amnia e nitrognio
molecular. Os nitratos so aceptores de H.

NO
3
NO
2
NO NH
3
N



Reativos usados: reativo de Griess-Ilosva A e B.
f) A soluo de cido sulfanlico.
g) B soluo de alfa-naftil-amina.
Observao: o reativo de Griess-Ilosva s produz colorao vermelha em presena
de nitritos.

Tcnica

1) Colocar no meio cultivado 5 gotas da soluo A;
2) Colocar 5 gotas da soluo B.
Observao: no agitar, a cor fugaz.

Resultados

1) Cor vermelha = prova positiva. A cor vermelha produzida pelo diaznio
vermelho: p-sulfobenzeno-azo-alfa-naftilamina;
2) Cor inalterada = prova positiva ou negativa. Neste caso faz-se a contra prova que
consiste em colocar uma pitada de Zn metlico em p. Agitar. O p de Zn reduz
rapidamente o NO
3
a NO
2
. Se aps o Zn aparecer colorao vermelha, a prova
da nitratase negativa.

RESUMO
Cor vermelha Prova positiva 1
a
etapa
Incolor Prova positiva ou negativa
65
Cor vermelha Prova negativa 2
a
etapa (aps o Zn)
Incolor Prova positiva


PROVA DA MOBILIDADE

A mobilidade bacteriana, alm de preparaes a fresco, pode ser observada atravs
de cultivo.
Meio de cultura: gelose semi-slida distribuda em tubo (coluna alta).
Semeadura: picada superficial (cerca de 1mm).
Resultado: as bactrias mveis do crescimento difuso para dentro do meio de
cultura. As imveis tero crescimento confinado ao ponto de inoculao.

Esquema da Prova da Mobilidade (Vista Lateral)






Prova positiva






Prova negativa

Na pgina 66, consta uma tabela parcial, simplificada, com algumas provas
bioqumicas e respectivos resultados para bacilos Gram negativos.
66

67
Estas so algumas das provas feitas com o substrato colocado separadamente em
tubos de cultivo individuais. Existem, no entanto, meios que so compostos por diversos
substratos num nico tubo:
1) gar ferro Kligler (KIA) = glicose, lactose, H
2
S.
2) gar trplice acar (TSI) = glicose, sacarose, lactose e H
2
S.
3) Baracchini = glicose, lactose, sacarose, uria e H
2
S.
4) Rugai modificado (IAL) = indol, sacarose, fenilalanina, glicose, H
2
S, uria, lisina,
motilidade.
Detalhes de composio e interpretao dos resultados do meio Baracchini sero
dados no diagnstico das infeces intestinais.
Alm das provas bioqumicas, descritas acima, existem inmeras outras e a escolha
vai depender do microrganismo a identificar e da disponibilidade de meios de cultura no
laboratrio. Tambm sero levados em considerao os seus custos e a complexidade dos
testes.
Observao: existem disponveis no comrcio os chamados Sistemas Compactos de
identificao de bactrias. As vantagens destes sistemas so:
1. Longo prazo de validez dos meios de cultura, at um ano, o que no ocorre com
os meios convencionais.
2. Precisam de pouco espao para armazenamento e incubao.
3. Caractersticas de crescimento facilmente observadas.
4. Com o registro dos resultados e programas de computao, a identificao torna-
se fcil e precisa.
Entre as desvantagens podem-se citar os custos elevados quando forem
necessrias dez ou mais provas diferenciais.
Alm disso, alguns microbiologistas empregam um nmero mnimo de provas na
identificao de certas bactrias que apresentam aspectos coloniais e bacterioscpicos
altamente caractersticos, j no isolamento primrio. Por exemplo: alguns bacilos Gram
negativos fermentadores de lactose podem ser identificados com poucas provas
bioqumicas, como a Escherichia coli.
Ademais, uma identificao correta no depende, algumas vezes, apenas das provas
bioqumicas diferenciais (como nos Sistemas Compactos). Estas devem somar-se s
caractersticas das colnias, quanto ao tamanho, cor, textura, formato, reao hemoltica,
etc., propriedade tintorial pelo Gram, morfologia da clula bacteriana e grupamento e s
reaes sorolgicas, para a identificao final confivel, como por exemplo, na identificao
da Salmonella.
68
Aparelhos automatizados. Os laboratrios de grande porte onde, por exemplo, so
feitos, em mdia, 150 culturas de urina por dia, tm o seu trabalho facilitado pelos aparelhos
automatizados. Estes podem revelar, em algumas horas (6 12h), o biotipo da bactria
isolada e o antibiograma, saindo o resultado no impresso computadorizado.
Longe de desaprovar os progressos da tecnologia moderna, que prtica e
indispensvel atualmente, e no fazendo apologia das tcnicas convencionais, precisamos
admitir que os futuros bacteriologistas no tenham a satisfao de conhecer o mago da
bactria, as caractersticas de seus componentes celulares, variando com as condies que
se lhe oferece. As suas mutaes, as surpresas com o surgimento de resistncia a um
antibitico. Conhecero apenas os biotipos das bactrias, fornecidas pelos clculos
eletrnicos e impressos computadorizados.
Fleming, ao observar a ao inibidora de um fungo contaminante sobre os
estafilococos em isolamento numa singela placa de Petri, descobriu a penicilina que
revolucionou a medicina. No a teria descoberto, talvez, se estivesse usando os mtodos
sofisticados e apenas apertando os botes de um computador.




















69
CAPTULO 9 CAPTULO 9 CAPTULO 9 CAPTULO 9: : : : MICROBIOTA NORMAL DO ORGANISMO
HUMANO

Objetivos

1. Demonstrar a presena de bactrias de diversas espcies, existentes sobre a
pele e na fossa nasal;
2. Alertar para a necessidade dos cuidados higinicos para evitar a propagao de
bactrias, principalmente em ambientes hospitalares;
3. Atentar para os dados do exame laboratorial bacteriolgico, em cujo resultado
possa constar a presena de microbiota normal, para no incorrer em erros de
interpretao.

Introduo
O termo microbiota normal refere-se aos microrganismos presentes regularmente
em determinados locais do corpo. Se removidos, prontamente se recompe. a tambm
chamada microbiota residente. De 10 a 20% das pessoas normais da comunidade extra-
hospitalar, so portadoras de Staphylococcus aureus, em concentrao elevada, na
nasofaringe. Esse estado de portador assintomtico que pode ser persistente, intermitente
ou transitrio, pode alcanar 60 a 90% das pessoas em atividades hospitalares. Os surtos
ocasionais devidos ao Staphylococcus aureus, principalmente em enfermarias re recm
natos, podem ser rastreados e relacionados com a pele e fossas nasais das pessoas que
trabalham nestes locais.
H tambm a microbiota transitria, que pode ser constituda por microrganismos
no patognicos (de baixo potencial patognico) ou alto potencial patognico e que habitam
a pele e mucosas por horas, dias ou semanas.
A microbiota residente benfica quando evita a colonizao pelas patognicas, por
diversos mecanismos: competio por substncias nutritivas, inibio por produtos
metablicos txicos, competio por receptores das clulas do hospedeiro, etc.
A microbiota normal tambm pode provocar doenas nos seguintes casos:
1. Quando deslocada do seu ambiente para outros rgos ou tecidos. Exemplo:
Streptococcus do grupo viridans incuo na orofaringe, causa endocardite quando
se instala no corao.
2. Provocando enfermidades em pessoas debilitadas ou imunodeprimidas.
70
A PELE

A pele possui uma microbiota residente bem definida. Porm, pela sua exposio ao
meio ambiente, tem facilidade de apresentar a microbiota transitria. O microrganismo
predominante o Staphylococcus epidermidis, com cerca de 10
3
a 10
4
/cm
2
de pele. A
maioria est localizada no extrato crneo, outros habitam folculos pilosos e atuam como
reservatrio para restabelecimento aps a lavagem.



TRATO RESPIRATRIO

Grande nmero de bactrias coloniza as fossas nasais, garganta e boca. Mas os
brnquios inferiores e os alvolos contm poucos ou nenhuns microrganismos.



OROFARINGE

Cerca de 50% da microbiota da garganta constituda por ESTREPTOCOCOS:
Streptococcus do grupo viridans (Streptococcus salivarius, Streptococcus sanguis,
Streptococcus mitis, Streptococcus mutans) e o Streptococcus pyogenes, Neisseria sp.
no patognica ou patognica, Haemophilus influenzae, Staphylococcus epidermidis,
Staphylococcus aureus, fusobactrias, lactobacilos, formas onduladas, etc.
MICROBIOTA NORMAL DA PELE
Staphylococcus epidermidis
Corynebacterium sp.
Pseudomonas aeruginosa
Micrococcus
Streptococcus do grupo viridans
Enterococcus
Staphylococcus aureus
Mycobacterium no patognico" (em regies ricas
em secrees sebceas)

71
A cavidade bucal apresenta uma das mais concentradas e variadas populaes
microbianas (29 espcies) e cuja localizao principal est no dorso da lngua, sulco
gengival e placa dentria. A contagem bacteriana em material da lngua apresenta nmeros
que variam de 43 milhes a 5,5 bilhes por ml de saliva. Do sulco gengival e da placa a
quantidade pelo menos 100 vezes maior, aproximadamente 200 bilhes por grama. Os
estreptococos constituem o grupo mais numeroso, a metade das viveis. (Microbiologia
Oral, Burnet, Sherp, Schuster 4
a
edio).

MUCOSA NASAL

A mucosa nasal habitada por estreptococos e estafilococos, destes o mais
importante o Staphylococcus aureus. O Staphylococcus aureus pode ser disseminado
causando doenas em hospitais: em enfermarias de recm-nascidos, de queimados, de
imunodeprimidos e dos submetidos cirurgia.




TRATO GASTROINTESTINAL (TGI)

No estmago existem poucos microrganismos devido ao baixo pH. Em situaes
patognicas se encontra o Helicobacter pylori. O intestino delgado alberga pequeno nmero
de estreptococos, lactobacilos e Candida albicans. O clon possui grande quantidade de
bactrias, cerca de 10
11
/g, aproximadamente 20% das fezes constitudo por bactrias, com
predominncia de anaerbios. As bactrias mais numerosas so: Bacteroides fragilis,
coliformes, estreptococos, lactobacilos, clostrdeos, Pseudomonas, etc.

MICROBIOTA NORMAL DA MUCOSA NASAL
Staphylococcus epidermidis
Staphylococcus aureus
Streptococcus pneumoniae
Streptococcus do grupo viridans
Neisseria sp.
Haemophilus sp.

72
TRATO GNITO-URINRIO (TGU)


Microbiota vaginal: lactobacilos e menos freqentemente Escherichia coli,
Enterobacter, Streptococcus agalactiae.
Bexiga: a urina na bexiga estril em pessoas ss, mas ao passar pela poro final
da uretra, pode se contaminar com Staphylococcus epidermidis, coliformes, difterides e
estreptococos no hemolticos.
* Staphylococcus saprophyticus faz infeco em TGU inferior em mulheres jovens.
A rea em torno da uretra masculina e feminina pode apresentar Mycobacterium
smegmatis (BAAR).
A candidase torna-se uma das doenas que mais acomente mulheres em idade frtil
no mundo atual. A vagina uma regio favorvel ao crescimento de microrganismos, como
a Candida albicans, o Thichomonas vaginalis e os bacilos de Doderlin (gram positivos).

PRTICA

Evidenciao da presena de bactrias na pele e mucosa nasal.
O meio de cultura, usado para o isolamento primrio em nossa aula prtica, ser o
gar-sangue em placas de Petri.

1
o
dia

Para coletar o material da pele do queixo, da testa, aba do nariz e fossa nasal. Usar
swab ou zaragatoa, atritando a rea em estudo (individualmente em cada rea). Em seguida
deslizar o swab em estrias na superfcie do meio de cultura, ocupando toda a rea da placa.

Mos

Com um pincel, dividir o fundo da placa em 4 partes. Marcar as partes com letras
para identificar a rea semeada:
S = sujo.
L = lavado.
E = escovado.
D = com degermante.
73
1. Com o dedo indicador (sem lavar) fazer estrias diretamente sobre o meio na parte
S.
2. Em seguida, lavar as mos com sabo normalmente. No enxugar. Com o
mesmo dedo fazer estrias na parte L.
3. Ensaboar as mos e escovar os dedos. Enxaguar. No enxugar e passar na
parte E.
4. A seguir passar um anti-sptico disponvel. Enxaguar. Fazer estrias sobre a parte
D.
Colocar as placas semeadas na estufa a 37
o
C.

Representao esquemtica da lavagem das mos






Lavagem com gua e sabo






Escovao
Degermante e gua
Recolonizao






Recolonizao (aps horas)




2
o
dia

1. Retirar as placas da estufa e observar o crescimento. Verificar a quantidade de
colnias em cada rea. Anotar.
2. Estudar as caractersticas das colnias. Anotar.
3. Fazer bacterioscopia pelo mtodo de Gram dos diferentes tipos de colnias.
Anotar. Na placa semeada com os dedos notar onde houver maior crescimento
de bactrias. Justificar.
4. Comparar com o resultado dos colegas e fazer um levantamento da bactria
predominante.
74
5. Se houver crescimento de colnias com caractersticas de estafilococos, ou seja:
de 1 a 3 mm de dimetro, brancas ou amarelas, opacas, brilhantes, convexas
altas, circulares, bordas lisas e superfcie lisa, prosseguir com a caracterizao
utilizando as provas de Identificao Presuntiva dos estafilococos de interesse
clnico.

3 33 3
o oo o
dia dia dia dia: : : : Identificao Presuntiva de Estafilococos da Pele e Mucosa Nasal

Sabemos que microscopia ptica simples, na maioria das vezes no conseguimos
fazer o diagnstico da espcie da bactria. No mximo determina-se o gnero e muitas
vezes apenas o tipo bacteriano (ex: BGN). No caso dos estafilococos, microscopia ptica
damos o diagnstico de Staphylococcus sp apenas.
A partir disso as provas bioqumicas devem ser aplicadas para diferenciar a espcie
em questo. Para ter certeza de que estamos trabalhando com uma colnia de estafilococos
da placa de gar (sem fazer microscopia) faremos a prova da catalase.


1 PROVA: CATALASE

Os estafilococos tm a capacidade de degradar perxido de hidrognio, pois eles
produzem a enzima catalase.

H
2
O
2
H
2
O + O
2
(via catalase processo enzimtico)

A prova simples: em uma lmina, pingamos gua oxigenada a 3% (que contm
H
2
O
2
e gua comum) em cima da colnia que foi coletada. Se borbulhar (liberar O
2
)
porque a colnia produz catalase, enzima que estreptococo NO produz.
Fonte: Google
75
Esta prova diferencia os estafilococos de outros cocos Gram positivos, como os
estreptococos.

CATALASE + ESTAFILO
CATALASE ESTREPTO ou outro tipo de coco.


2 PROVA: PLASMOCOAGULASE

Usaremos agora s as colnias CATALASE +, para seguirmos na identificao de
estafilococos. Em tubo de ensaio com plasma de coelho, mergulharemos as colnias das
amostras. Se ocorrer um precipitado "coagulado", dizemos que a prova coagulase
positiva. Mas por que isso acontece?

O Staphylococcus aureus produz uma enzima chamada coagulase. Ele converte o
fibrinognio em fibrina no final da cascata da coagulao, a fim de fazer uma cpsula fibrosa
em torno das colnias no nosso organismo (ele usa fibrinognio do plasma). Digamos que
seria uma colnia encapsulada, que estaria mais protegida contra as defesas do nosso
corpo e os antibiticos. Esses so os chamados abscessos. So galerias de bactrias e
exsudato, colees de infeco e inflamao aguda, geralmente no tecido subcutneo.

Fonte: Google

Dentre o grupo dos estafilococos de interesse mdico, quem a produz coagulase
somente o S. aureus. Por isso precisamos saber se nossa colnia em questo produz
fibrina. Como no plasma de coelho tambm h fibrinognio, a reao que ocorrer a
mesma. Portanto, basta semear a colnia no plasma de coelho e encubar 37C. Depois de
24h veremos se h precipitado ou no.
76
CORRELAES CLNICAS:

Quando se evidencia a presena de um abscesso em um paciente, que bactria
sempre devemos incluir no grupo de agentes etiolgicos suspeitos?


Procedimentos

Num tubo estril colocar:
0,5 mL de plasma sanguneo diludo a 1:5.
Coletar a colnia em estudo e emulsionar no plasma.
Incubar em estufa a 37
o
C.
Observar a formao de cogulo de meia em meia hora durante as primeiras 4 horas.
Se no houver formao de cogulo, deixar na estufa at 24h para fazer a leitura.
Observao: algumas tcnicas recomendam usar o plasma sem diluio. Neste caso o
cogulo formado mais consistente.

Resultados

PLASMOCOAGULASE + Staphylococcus aureus (DIAGNSTICO DEFINITIVO)
PLASMOCOAGULASE ENPC (Estafilococos no produtores de coagulase)


3 PROVA: NOVOBIOCINA

um antibitico. Ele vai testar a sensibilidade dos ENPC para fazer a diferenciao
via halo de inibio. Semeia-se a colnia de ENPC em uma nova placa de gar sangue e
coloca-se um disco de novobiocina no centro. Incuba-se. Se houver um halo de inibio
(menor que 14mm), dizemos que a bactria sensvel novobiocina. Se no houver, ela
resistente. Atualmente so conhecidas outras espcies de ENPC que tambm so
resistentes novobiocina, mas no de interesse mdico to importante.

Resultados

RESISTENTE: Staphylococcus saprophyticus
SENSVEL: Staphylococcus epidermidis
H bactrias que produzem
enzimas semelhantes coagulase
e que tambm podem ser agentes
etiolgicos de ABSCESSOS
ABSCESSOS NO SO
EXCLUSIVOS DE S. aureus
77
Fonte: Google



RESUMO:
Catalase + estafilo Plasmocoagulase + Staphylococcus aureus
Plasmocoagulase ENPC Novobiocina S S. epidermidis
R S. saprophyticus
Catalase estrepto ou outro coco



PROVA DO MANITOL (ALTERNATIVA)

Semear o estafilococo em tubo (caldo) ou placa (gar) com manitol e indicador de pH
vermelho de fenol. Colocar na estufa a 36
o
C. Aps 24h fazer a leitura. A decomposio do
manitol acidifica o meio de cultura, produzindo a mudana da cor do indicador de vermelho
para amarelo.
Cultura amarela = positiva.
Cultura vermelha = negativa.




78
Para diferenciar as trs principais espcies, pode se utilizar o seguinte esquema:
DIFERENCIAO DAS TRS ESPCIES DE Staphylococcus
Coagulase Manitol Novobiocina
Staphylococcus aureus
Staphylococcus epidermidis
Staphylococcus saprophyticus
+
-
-
+
-
- (v)
Sensvel
Sensvel
Resistente
v = 11 a 89% positivos.


GAR SANGUE

Meio diferencial e no selietivo (muito enriquecido, uma vez que possui protenas e
outros substratos provenientes do sangue). A bactria que crescer pode apresentar
hemlise do sangue ou no. No caso de hemlise total, vai haver destruio dos glbulos
vermelhos aparecendo um halo claro ao redor das colnias.
Composio do ASA: gelose simples acrescida de 5 a 10% de sangue desfibrinado
de carneiro.


MEIO DE MANITOL-HIPERTNICO (CHAPMAN)


Extrato de carne 1 g
Peptona 10 g
NaCl 75 g
Manitol 10 g
gar 15 g
Vermelho de fenol 0,025 g
gua 1000 mL

um meio seletivo e diferencial.
Seletivo: pela concentrao de 7,5% de NaCl permitindo o crescimento de poucas
bactrias, entre elas o estafilococo (os meios comuns contm em geral 0,5% de NaCl).
79
CAPTULO 10 CAPTULO 10 CAPTULO 10 CAPTULO 10: :: : DIAGNSTICO LABORATORIAL ATRAVS
DO ISOLAMENTO E CARACTERIZAO DOS AGENTES
ETIOLGICOS DAS INFECES

Neste captulo abordaremos os possveis tipos de microrganismos que podem ser
agentes etiolgicos das mais diversas infeces. Para isto, dividiremos o contedo
didaticamente de acordo com os locais de acometimento mais comuns no ser humano.


PORES SUPERFICIAIS E PROFUNDAS
Estafilococos, Estreptococos e Pseudomonas sp.

Objetivos

1) Familiarizar o aluno com as tcnicas da coleta adequada do material patolgico,
a fim de evitar contaminantes, facilitando o isolamento do agente efetivo da
infeco.
2) No futuro, como clnico solicitante do exame laboratorial, dever orientar o
paciente quanto maneira correta de coletar a amostra, de conserv-la e
transport-la ao laboratrio de anlises.
O mdico deve dominar os conhecimentos que lhe permitam escolher e indicar a
realizao de exames complementares especficos, relativos hiptese
diagnstica formulada a partir de dados epidemiolgicos, clnicos e laboratoriais
inespecficos. Cabe-lhe tambm orientar a colheita dos materiais adequados para
o exame e saber interpretar com rigor e segurana os resultados fornecidos pelo
laboratrio. (Dr. Paulo Kiyoshi e Dr. Luis Parellada Ruiz, Doenas
Transmissveis, captulo 10 pg. 115).
3) Acompanhar a seqncia dos exames laboratoriais bacteriolgicos necessrios
na identificao do agente para fins de diagnstico e tratamento.




80
Introduo

Algumas doenas bacterianas podem ser diagnosticadas presuntivamente, lanando
mo de dados epidemiolgicos e clnicos (como sinais e sintomas tpicos ou
patognomnicos) que podem por si s, algumas vezes, fazer o diagnstico sem necessitar
do exame microbiolgico. Exemplos disso so: o ttano, a difteria, a coqueluche, a amidalite
purulenta bacteriana, escarlatina e furunculose. No entanto, existe um nmero grande de
doenas que necessitam exames laboratoriais para confirmar a suspeita clnica.
As infeces so causadas por diversas bactrias. As mais comuns so
estafilococos e estreptococos, bactrias cuja ao promove a formao de exsudato ou
derrame inflamatrio que contm grandes quantidades de componentes celulares do
hospedeiro. Esse exsudato descrito como purulento. No processo patolgico
desenvolvido, identificado como infeco bacteriana piognica, o tipo celular
predominante de clulas NEUTRFILO (devido liberao de quimiocinas, IL-1 e TNF
pelos macrfagos, ativando as integrinas dos neutrfilos circulantes, caractersticas da
inflamao aguda). Alm do Staphylococcus aureus e do Streptococcus pyogenes, as outras
bactrias mais freqentemente encontradas nas infeces so: Enterococcus sp.,
Pseudomonas e Enterobactrias (Escherichia coli, Enterobacter, Proteus).
Como j referido acima, o quadro clnico de determinadas infeces, como as
piodermites causadas por estafilococos, no necessitam habitualmente de confirmao por
exames laboratoriais. O exame laboratorial, no entanto, indispensvel quando houver
necessidade da avaliao da resistncia do estafilococo aos antimicrobianos.
Fonte: Robbins, 2005
81
CORRELAES CLNICAS:

H dois tipos de secrees patolgicas: o exsudato e o transudato. Pus sinnimo de
exsudato purulento. Ambos so secrees liberadas como resposta pelo nosso organismo.

Exsudato: cor opaca, muitas protenas, muitos leuccitos, muita desidrogenase ltica (LDH,
uma enzima que converte o lactato em piruvato e vice versa, alm de ser uma enzima
gluconeognica). Uma caracterstica muito importante a presena de POUCA GLICOSE.
Uma vez que h presena de bactrias, a glicose estar diminuda. Ela o principal
carboidrato utilizado no metabolismo bacteriano, e uma das enzimas que participa desse
processo a LDH. Os leuccitos presentes esto promovendo uma resposta imunolgica
imediata frente aos microrganismos. O principal deles nesse caso o neutrfilo, que a
primeira linha de defesa do organismo e vem da fase de rolamento sobre o endotlio capilar,
como ser detalhado na disciplina de Patologia Mdica Molecular (BP337).
Para caracterizar um exsudato tem que haver mais de 3g/dL de protena, mais de 10
3

leuccitos/L, mais de 200UI de LDH e menos de 45mg/dL de glicose.

Transudato: geralmente so lquidos cavitrios (pleural, peritoneal, pericrdico, asctico,
lquor), de caracterstica transparente, poucas protenas, poucas clulas, pouca LDH e
TAXAS NORMAIS DE GLICOSE. Isso se deve ausncia de bactrias nesse lquido.
Ocorre em abdome asctico (hepatopata), derrame pericrdico, pleural, edema agudo de
pulmo e por a vai. Eles vm geralmente devido a uma obstruo no fluxo venoso.

Quando h um lquido suspeito, vindo de uma cirurgia, de uma puno pleural, de cavidades
diversas, para caracterizar se o lquido um exsudato ou um transudato o exame que feito
no Brasil a CULTURA (nos mais diferentes meios slidos e lquidos), para pesquisar se h
presena de microrganismos. Os exames bioqumicos como glicose e LDH so utilizados
em secrees mais nobres, como o lquor (para caracterizar uma meningite, por exemplo).
Alm da microbiologia, os lquidos de cavidades devem ser encaminhados Anatomia
Patolgica para averiguar a presena de clulas neoplsicas por exame de citologia
onctica (o lquido pode ter se acumulado devido a uma metstase).


Coleta do material

A coleta correta do material a etapa mais importante para o estudo do agente
etiolgico e deve ser precedida dos seguintes cuidados:
a) Uma quantidade insuficiente de material dificulta os procedimentos laboratoriais,
prejudicando a identificao.
b) O isolamento de contaminante pode levar a uma terapia incorreta, ou mesmo
prejudicial, porque ele pode apresentar um padro diferente de sensibilidade aos
antimicrobianos do que o agente efetivo da infeco.
c) A coleta deve ser feita antes da antibioticoterapia.
Nas infeces, a coleta varia com a forma clnica e a localizao do processo, que
pode ser superficial ou profundo.
82
Em localizao profunda esto a osteomielite, meningite, sinusite, promiosite,
infeces nas articulaes e outras colees fechadas de pus.
Nestes recorre-se puno aspirativa do exsudato purulento com seringa e agulha
estreis. O local da puno deve ser rigorosamente descontaminado com sabo cirrgico ou
outro anti-sptico adequado.
Nas endocardites e septicemia coleta-se o sangue para hemocultura.


Leses superficiais

As infeces de pele geralmente causadas pelos estafilococos so: a foliculite, a
furunculose e o impetigo. A foliculite uma pstula mais superficial (em cabea de prego),
de caracterstica purulenta, que acomete o folculo piloso. A furunculose uma infeco
mais profunda na derme, envolvendo o folculo piloso, que muitas vezes adquire a
caracterstica nodular com muita hiperemia ativa (pstula interna). O estafilococo
estabelece-se em um folculo piloso, produzindo necrose tecidual com acmulo de clulas
inflamatrias. A bactria elabora a enzima coagulase que forma cogulo (fibrina) em torno
da leso e dentro dos linfticos, resultando numa parede que delimita o processo. No centro
da leso ocorre liquefao do tecido necrtico e o abscesso aponta na direo de menor
resistncia. A parede de fibrina evita a propagao dos estafilococos e no deve ser
rompida por manipulao ou trauma, sob o risco de disseminar a infeco (por analogia,
evitar espremer espinha).
Se por um lado a parede de fibrina evita a disseminao do estafilococo, por outro
lado dificulta o acesso de antibiticos e elementos sanguneos de defesa.
Observao: uma vez drenado o pus, a leso cicatriza rapidamente.

Coleta em leses superficiais

Nas formas superficiais, tais como furnculo (ou outras piodermites: impetigo, ectima,
etc.) segue-se o seguinte esquema, observando rigorosa assepsia:
1) Descontaminar a superfcie do abscesso com o auxlio de uma gaze estril,
embebida em anti-sptico ou salina estril.
2) Secar com gaze estril.
3) Com um objeto perfurocortante (agulha, lanceta, etc., estreis) levantar a afastar
a pelcula ou crosta superficial.
83
4) Coletar o material purulento da profundidade da leso com swab (ou aspirar com
seringa) tendo o cuidado de no tocar as bordas da pele adjacente.
Observao: em caso de leses abertas, remover a secreo superficial com gaze
estril com salina, para eliminar os contaminantes.

Exame laboratorial

O material enviado ao laboratrio ser submetido aos seguintes procedimentos:
1) Bacterioscopia.
2) Cultivo.
3) Identificao.
4) Teste de Sensibilidade aos Antibiticos (TSA).
Observao: o mdico deve comunicar ao laboratrio atravs da requisio dos
exames, se suspeita de microrganismos menos freqentes, que exijam tcnicas prprias de
microscopia e cultivo.

Bacterioscopia

Rotineiramente a bacterioscopia feita pelo mtodo de Gram (triagem), revelando a
presena, o tipo morfolgico e propriedade tintorial da bactria.


Cultivo

Na nossa aula prtica o cultivo feito em dois meios e visando apenas as bactrias
aerbias e anaerbias facultativas.
1) gar-sangue.
2) Teague (EMB) ou MacConkey.
Onde vamos cercar as possibilidades de isolar estafilococo, estreptococo e qualquer
bacilo Gram negativo pouco exigente (Pseudomonas, enterobactrias) ou exigente como o
Haemophilus.
No gar-sangue: Vo crescer estafilococos, estreptococos e bacilos (exigentes e
no exigentes).
No Teague/MacConkey: Vo crescer bacilos Gram negativos (BGN) pouco
exigentes.
84
Procedimentos
Meios de cultivo
Dia
Teague ou MacConkey gar-sangue
1
o
dia
Semear por estrias na superfcie do
meio.
Semear por estrias na superfcie do meio.
2
o
dia
1. Fazer Gram
2. Repicar para gelose inclinada,
em tubos separados as L+ e L-
3. Incubar a 35
o
C 1
o
C.
1. Fazer Gram.
2. Fazer catalase.
a) Se a catalase por positiva, repicar para
tubo contendo plasma de coelho. Incubar
a 35
o
C 1
o
C.
b) Se a catalase for negativa, proceder a
identificao para estreptococos, segundo
o tipo de hemlise observada.
3
o
dia
Semear em diversos meios para
provas bioqumicas.
a) Interpretar a coagulase. Se negativa,
prosseguir a identificao de outras
espcies de estafilococos.
b) Realizar provas de identificao para
estreptococos.
4
o
dia
Interpretar as provas bioqumicas e
consultar tabelas para identificao
do bacilo Gram negativo (BGN).
Interpretar provas adicionais para ENPC.


Pseudomonas sp. (Bacilo Piocinico)

freqente o encontro de Pseudomonas sp. em infeces. Cerca de 70% destas
so produzidas por Pseudomonas aeruginosa. As espcies (mais de 100) so diferenciadas
por provas bioqumicas (pois um bacilo gram negativo que no se diferencia dos demais
BGNs microscopia simples).
A caracterstica marcante da Pseudomonas aeruginosa (88% delas) a produo de
pigmento azul-esverdeado, chamado piocianina, deixando os meios de cultura claros e o
pus com esta colorao. A cultura geralmente apresenta odor perfumado de essncia barata
de uva (trimetilamina). Em geral, o odor do material infectado muito ftido e ruim.
85
A Pseudomonas aeruginosa ubiquitria: cresce em solo, gua, vegetais e,
obviamente, em tecidos orgnicos. O homem alberga na pele, garganta (5% de pessoas
normais) e fezes. Ela to pouco exigente que cresce at em gua mineral.
uma bactria oportunista, podendo causar vrias doenas. So freqentes as
infeces em queimaduras e feridas cirrgicas. Faz uma leso em pele chamada de ectima
gangrenosa (de odor muito ftido). Aps procedimentos com cateteres urinrios, punes
lombares, cirurgias oculares, cardacas, etc. Pode causar infeces graves, especialmente e
em pessoas hospitalizadas, onde a mortalidade pode chegar a 50%. Imunocomprometidos
tambm so alvos preferenciais.
Entre os fatores de virulncia destaca-se a toxina A, que bloqueia a sntese protica
das clulas do hospedeiro ( semelhana da exotoxina do bacilo diftrico).
Nas infeces por Pseudomonas, o clnico sempre pede antibiograma, visto que ela
apresenta resistncia a muitos antibiticos, tais como: vrios -lactmicos, cloranfenicol e
tetraciclinas.
sensvel apenas polimixina, gentamicina, amicacina e algumas penicilinas semi-
sintticas (carbenicilina). Com exceo da polimixina, a bactria pode adquirir resistncia
aos antimicrobianos citados por mutao ou aquisio de plasmdios de resistncia.

CORRELAES CLNICAS:

Na clnica mdica de rotina, um agente que sempre deve ser considerado em
infeces intestinais e do trato gnito urinrio feminino, alm de feridas cirrgicas.
A droga de escolha mais adequada o ciprofloxacino, uma fluoroquinolona de 2
gerao. Este frmaco citado muitas vezes como quinolona anti-pseudomonas pelos livros
de clnica mdica como Harrison, Tratado de Medicina Interna 2006, bem como nas
publicaes mais atuais. Pode ser utilizado, inclusive, em pneumonias causadas por
Pseudomonas aeruginosa (ps confirmao bioqumica), de acordo com os critrios
adotados pelas disciplinas clnicas de Pneumologia e Otorrinolaringologia do ciclo
profissionalizante do curso de Medicina desta instituio.
* Ciprofloxacino NUNCA deve ser empregado como medicamento de primeira escolha
(terapia emprica) para pneumonias, uma vez que uma droga pouco eficaz contra germes
gram positivos como pneumococo (o agente etiolgico mais comum das pneumonias
bacterianas). Fluoroquinolonas de 3 gerao em diante (levofloxacino, moxifloxacino e
gemifloxacino) so drogas mais apropriadas para infeces bacterianas pulmonares.


Identificao dos Bacilos No Fermentadores BF

Pacientes imunodeprimidos so muito suscetveis infeco por este grupo de
bactrias. O isolamento de bacilo no fermentador de stios anatmicos originalmente
estreis forte indicador de ser este o responsvel pela infeco.
86
Nos casos de locais no estreis, como secreo de ferida cirrgica, pode ser
apenas contaminante e no o causador da infeco.
Os BF podem ser isolados de infeces urinrias, secrees de ferimentos e
hemoculturas.
Entre as bactrias no fermentadoras mais freqentemente isoladas das infeces
esto:
Pseudomonas aeruginosa 70-75%
Acinetobacter baumanii 25%
Outras Pseudomonas 5%

As Pseudomonas utilizam os carboidratos por via oxidativa. Para verificar este tipo
de metabolismo usa-se meios de cultura especiais. Hugh e Leifson foram os primeiros a
idealizar um meio de cultivo que chamaram de Oxidao-Fermentao (O-F).
O meio de O-F de Hugh e Leifson contm 0,2% de peptona para 1% do carboidrato
testado, diferente da relao 2:1 dos meios usuais para fermentao.
A acidez produzida pelas bactrias oxidativas muito pequena e no deve ser
neutralizada pelos produtos de decomposio da peptona, razo da proporo 0,2% da
peptona para 1% do carboidrato.
A prova realizada em dois tubos para cada acar: um com leo mineral e outro
sem leo na superfcie.
Os bacilos oxidativos produzem cido somente no meio exposto ao ar.
Os bacilos fermentadores produzem cido em ambos os tubos.
Os bacilos no sacarolticos no produzem alterao em nenhum dos tubos.

Exemplo: Pseudomonas = metabolismo oxidativo
Alcalgenes = no sacaroltico

Para maiores detalhes da identificao dos bacilos oxidativos consultar: Diagnstico Microbiolgico, de Konemann
e colaboradores.


Meios de cultura usados nesta aula prtica

gar sangue: Ver pgina 78


87
Teague (EMB / HHT / TEA)

Tambm chamado de Holt-Harris-Teague (HHT) ou gar eosina-azul de metileno =
EMB (Eosin Methilene Blue). Alguns autores descrevem pequenas diferenas entre a
composio do EMB e do TEA. No entanto, a finalidade desses meios no laboratrio a
mesma.

Composio:
gar simples 100 mL
Lactose 10 mL
Soluo de eosina 2% 2 mL
Soluo de azul de metileno 0,5% 2 mL

um meio seletivo-diferencial para Bacilos Gram negativos (BGN) no exigentes.

Seletivo: pelos corantes que inibem o crescimento da maior parte das bactrias
Gram positivas.

Diferencial: pela decomposio ou no da lactose evidenciada pela cor das colnias
(os corantes funcionam como identificadores de pH).


LACTOSE POSITIVA (L+)

Os fermentadores de Lactose.
Colnias:
1) Cor vermelha opaca;
2) Cor vermelha com ponto central preto;
3) Secas com brilho metlico.
Observao: podem crescer colnias intermedirias destes tipos.

LACTOSE NEGATIVA (L-)

Os no fermentadores de Lactose.
Colnias:
Vermelhas claras transparentes.
88
Observao: embora existam muitos meios de cultura seletivos e diferenciais para
enterobactrias e mesmo havendo diferenas quanto capacidade de inibio de bactrias
indesejveis, os bacteriologistas do preferncia queles que lhes oferecem dados mais
visveis. Por exemplo, o brilho metlico das colnias no Teague, ajuda na identificao da
Escherichia coli, apesar de no lhe ser especfico.


OROFARINGE
Estreptococos, Haemophilus, Moraxella e Corynebacterium

A microbiota da orofaringe constituda principalmente por ESTREPTOCOCOS
(50% da populao total bacteriana). Exemplos so os estreptococos do grupo viridante
(Streptococcus salivarius, Streptococcus sanguis, Streptococcus mitis), Streptococcus
pneumoniae (PNEUMOCOCO), Streptococcus pyogenes, Neisseria sp., Haemophilus sp.,
Staphylococcus epidermidis, bacilos pseudodiftricos (Corynebacterium
pseudodiphetheriticum ou Corynebacterium hofmanni) e outros.
Com isto chamando-se a ateno para dificuldade de isolamento do agente real da
infeco da orofaringe como, por exemplo, pelo estreptococo e bacilo diftrico.


Faringite Estreptocccica

Quase 70% das dores de garganta agudas so causadas por vrus. A dor devido
infeco demasiada da mucosa ou da prpria resposta inflamatria do organismo. Os
principais vrus que podem causar faringites so os adenovrus (tipos 3, 4, 7, 14 e 21),
rinovrus, coronavrus, influenza, parainfluenza, citomagalovrus (CMV), Esptain-Barr (EBV),
Herpes vrus tipo 1 e coxsackie A.
As infeces virais sero vistas mais adiante. Neste captulo, abordaremos as
faringoamigdalites (faringites e tonsilites so os termos mais apropriados pela nmina
anatmica atual) bacterianas.
A infeco mais freqente do trato respiratrio superior manifesta-se sob a forma de
faringite e tonsilite (amigdalite) causada por Streptococcus pyogenes (ESTREPTOCOCO
BETA HEMOLTICO DO GRUPO A DE LANCEFIELD) = angina estreptoccica (90%).
uma infeco que requer ateno especial, visto que, alm de disseminar-se a outros locais
causando sinusite, otite, mastoidite e vias areas inferiores provocando broncopneumonias,
89
pneumonias e empiema (pus no espao pleural). Ainda podem ocorrer seqelas graves ps-
estreptoccicas como Febre Reumtica e Glomerulonefrite Aguda (GNA).
As caractersticas clnicas so semelhantes ao Haemophilus e Moraxella. Nas
tonsilas palatinas existem as criptas amigdalianas, que so invaginaes da mucosa,
aumentando a superfcie da tonsila, promovendo uma maior exposio de eptopos aos
ndulos linfticos confuentes que existem subjacentes mucosa. Nessas criptas no h
drenagem de ductos das glndulas salivares menores, portanto ali o acmulo de material
facilitado. Durante uma tonsilite, alm da presena de febre na maioria dos casos, acumula-
se exsudato purulento nessas regies, dando o aspecto de placas amarelo-esbranquiadas
sobre as tonsilas. Essas placas so facilmente removidas com swab e esse o material que
se utiliza para fazer semeadura em gar sangue.


Fonte: Rubin, 2006
90
CORRELAES CLNICAS:

Streptococcus pyogenes, um mal que deve ser cortado pela raiz

Na parte externa da parede celular de algumas cepas da espcie do estreptococo
beta hemoltico, h uma protena chamada de protena M (uma protena que inclusive,
degrada o fator C3b e no deixa a cascata do sistema complemento agir). O sistema
imunolgico acaba por dar cabo da bactria produzindo anticorpos contra essa protena.
Porm, essa protena muito parecida com protenas do organismo humano, que esto
principalmente na membrana basal do glomrulo renal, nas vlvulas cardacas, etc. Uma
vez desenvolvidos anticorpos pelos linfcitos B contra essas protenas dos estreptococos, o
organismo entra em uma operao de auto-ataque, destruindo nossas prprias clulas e
membranas (complexos imunes), causando cardiopatia reumtica e glomerulonefrite ps-
estreptocccica, por exemplo. Muitas vezes o paciente necessita de prtese valvar
(tamanho o estrago) nos casos de valvulopatia severa e transplante renal nos casos mais
exacerbados de glomerulonefrite no tratada. Os aspectos morfolgicos destas leses sero
abordados com detalhes na disciplina de Anatomia Patolgica (MP313).
A esse fenmeno ps-estreptocccico d-se o nome de febre reumtica (cepas que
produzem estreptolisina O). Por isso importante sempre tratar as faringoamigdalites com
antibiticos mesmo dos casos mais brandos e silenciosos, antes do desenvolvimento destes
anticorpos. At porque nunca se sabe ao certo qual a espcie de bactria envolvida na
infeco, quanto mais a cepa (se resistente ou no). Enfim, as manifestaes ps
estreptocccicas de uma infeco mal tratada fazem parte de uma doena reumtica,
imunolgica, que ataca, depois de um tempo, tecidos sadios com complexos imunes (reao
de hipersensibilidade tipo III). Esse assunto ser abordado com detalhes em seminrios
promovidos pela disciplina de Imunologia Mdica (BP336).
Alm disso, o Streptococcus pyogenes tem uma enzima chamada peptidase do C5a,
que degrada o C5a, impedindo uma via do sistema complemento, e por conseqncia a
quimiotaxia de neutrfilos. Tambm produz hialuronidase, uma enzima que destri o
hialuronato do tecido conjuntivo e contribui para uma permeabilidade mais fcil nos tecidos
sadios. Para diagnstico de febre reumtica, usam-se os critrios de Jones, como visto nas
aulas tericas desta disciplina.
Para a terapia antimicrobiana, o antibitico de escolha a amoxicilina. Pode ser
administrada sozinha ou associada a um bloqueador de -lactamases, uma vez que vrias
espcies da microbiota normal produzem tais enzimas. Alm disso, o quadro clnico se
assemelha a infeces por Haemophilus influenzae e Moraxella catarrhalis, microrganismos
potencialmente produtores dessas pelicilinases.


Streptococcus pyogenes e as infeces hospitalares

Alm de ser um potente causador de infeces do trato respiratrio, o estreptococo
beta hemoltico ainda pode desencadear infeces hospitalares severas, de difcil controle
que muitas vezes levam o paciente inevitavelmente ao bito.
Um exemplo disso a Fasciite Necrotizante. Uma doena maligna que pode
ocorrer em feridas cirrgicas. conhecida como doena da bactria carnvora, pois o
paciente relata muitas vezes que sente que est sendo comido vivo. E o quadro clnico
comprova isso, com muitas reas infectadas, necroses extensas, tecidos putrefados e
exsudato intenso. A taxa de letalidade relativamente alta, uma vez que a carga bacteriana
j est to elevada que os antibiticos, mesmo os de maior eficcia, no conseguem
eliminar a infeco. Alm disso, os tecidos necrosados produzem muitas toxinas pelo
91
metabolismo desorganizado, e quando esse material atinge o sangue pode gerar estragos
bem maiores.



Os microrganismos mais comuns comumente encontrados nessas infeces so os
vrus respiratrios. Entre as bactrias, o grande destaque o S. pyogenes. Outros
estreptococos que podem fazer faringite, menos comumente so o S. anginosus e o S.
dysagalactiae. O Haemophilus influenzae quase que exclusivamente peditrico.
Coco-bacilo gram negativo, Haemophilus significa Gosta de sangue e o nome
influenzae foi dado porque originalmente se pensava que causasse gripe, mas agora se
sabe que um invasor secundrio do trato respiratrio, em especial o inferior. H seis
sorotipos (a-f), distinguveis sorologicamente pela cpsula polissacardica, ou por PCR.
O meio de cultura mais adequado o gar chocolate em microaerofilia (alta
sensibilidade). No entanto, o meio especfico para o hemfilos o gar Mueller-Hinton (alta
especifidade). O meio de Hitchens-Pike tambm pode ser utilizado.

CORRELAES CLNICAS:

As cepas no encapsuladas do Haemophilus influenzae geralmente fazem parte da
microbiota normal da orofaringe. O tipo b (encapsulado) muito menos comum em
microbiota normal e o principal sorogrupo causador de infeces. Acomete muito as
crianas, principalmente lactentes e pr-escolares. Crianas at 2-3 anos de idade no so
capazes de fabricar tais anticorpos, pois essa resposta depende de alguns linfcitos T que o
timo ainda no foi capaz de fabricar. O H. influenzae um potente causador de pneumonias
(2 agente mais comum), sinusites, otites, artrite sptica, bronquites, meningite (em casos
mais severos quando h bacteremia), alm de ser o principal agente etiolgico da epiglotite.
Faringites ocorrem em crianas com menos de 5 anos. No trato respiratrio superior em
adultos causa sinusites e otites (cepas no-b). H vacina eficaz, ministrada obrigatoriamente
pelo calendrio de vacianao brasileiro em trs doses, aos 2, 4 e 6 meses de idade.
Sempre suspeitar de infeco por H. influenzae em crianas com sinais clnicos. 15 a
20% das cepas patognicas do Haemophilus influenzae produzem -lactamases, portanto a
terapia sem bloqueador dessas enzimas pode ser ineficaz.



A Moraxella catarrhalis (originalmente denominada Branhamella catarrhalis) hoje
considerada uma causa crescente de faringites e pneumonias, sobretudo em pacientes com
carcinoma de pulmo ou doena pulmonar de base. No se sabe ao certo o porqu, mas
epidemiologicamente, os pacientes mais acometidos por essa espcie so usurios crnicos
de lcool. So diplococos gram negativos (s vezes chamadas de cocos ovais), oxidase
positiva e catalase positiva. Apresentam bom crescimento em gar sangue e gar chocolate.
H um meio com alta especificidade, o gar DNase (azul de toluidina).
92
Outros tipos de Faringites


Angina de Vicent (Angina de Plaut-Vincent)

Outra infeco na forma de tonsilite lcero-membranosa a chamada Angina de
Plaut-Vincent. causada pela associao fusoespirilar (Treponema vincentii e
Fusobacterium nucleatum).
O quadro clnico, diferente das demais bactrias, sugere muito a origem etiolgica da
infeco. As tonsilas palatinas e os pilares farngeos adquirem lceras em forma de
verdadeiros buracos.

Difteria Farngea

A difteria que se caracteriza por inflamao da garganta (angina diftrica) onde as
tonsilas palatinas, os pilares anteriores e a vula se recobrem com exsudato
pseudomembranoso. uma infeco muito grave, mais comum entre o primeiro e o stimo
ano de vida, causada por cepas do Corynebacterium diphteriae (tambm chamado de bacilo
diftrico ou bacilo de Klebs-Loeffler). Esta bactria produz uma endotoxina (responsvel
pelos fenmenos locais da doena) e uma exotoxina (extracelular) que se introduzir na
corrente circulatria provocando febre (baixa), pulso rpido, palidez e adinamia (falta de
disposio). Pode causar obstruo respiratria fatal (crupe), quando atinge a traquia
(tosse estridante), com roquido e voz velada.
A principal diferena para uma faringoamigdalite comum o aspecto de falsa
membrana que recobre as tonsilas, diferente das infeces estreptocccicas onde h placas
purulentas nas criptas. Essa pseudomembrana no facilmente removida com swab. O
diagnstico confirmado pelo exame bacterioscpico direto e pela cultura dos exsudatos
farngeos, ou at mesmo um fragmento da pseudomembrana.
Alm da faringe, o bacilo diftrico pode colonizar a laringe, as fossas nasais, ouvidos
e, ocasionalmente, o trato genital e a pele.





93
Identificao Presuntiva dos Estreptococos


Classificao

A classificao para um estudo preliminar dos estreptococos baseia-se no
crescimento (comportamento) em placa gar-sangue, onde se diferenciam em quatro tipos,
segundo a hemlise que produzem. a classificao de Schottmller-Brown. Ou seja, pelo
PADRO DE HEMLISE EM GAR SANGUE.


1) Tipo (alfa) produz em torno das colnias um halo verde de hemlise
parcial (transformao da hemoglobina em substncia semelhante biliverdina).
Produzida por estreptococos conhecidos como do grupo viridans.
2) Tipo (beta) produz um halo de hemlise total.
3) Tipo
1
(alfa-primo) intermedirio entre os precedentes, de difcil observao.
4) Tipo (gama) ou inerte que no altera o sangue (espcies no hemolticas).

Fonte: Prof Alessandra Daur
Ao isolar cocos Gram positivos da leso, deve-se fazer a prova da catalase (que
deve ser negativa) para o incio da caracterizao do estreptococo.



94
Prova de Optoquina

Aplica-se para as colnias alfa hemolticas. Se sensvel, o diagnstico de
Streptococcus pneumoniae (pneumococo). Se resistente, devem-se fazer todos os testes
para gama hemlise.
Semear a bactria em gar-sangue e colocar um disco de optoquina. Incubar 24h em
tenso de CO
2
. A bactria sensvel se apresentar um halo de inibio 14 mm.
Fonte: Prof
a
Alessandra Daur



Prova de Bacitracina

Ela diferencia as colnias beta hemolticas em grupo A e B de Lancefield. Se for
sensvel, o diagnstico de Streptococcus pyogenes. Se for resistente, h necessidade de
se fazer a prova de Camp Test.
Semear a bactria em gar-sangue e colocar o disco de bacitracina (0,04 g).
Incubar 24h a 35
o
C. A presena de halo de inibio de qualquer tamanho, indica
sensibilidade. (para auxlio no diagnstico dos estreptococos -hemoltico pode se utilizar
disco de Sulfametoxazol-trimetropim).
Fonte: Prof Alessandra Daur


95
Prova de Camp-Test (C-T)

Em linha, uma amostra semeada de Staphylococcus aureus tambm beta hemoltico.
Semear linhas perpendiculares linha de S. aureus, porm sem contato fsico de uma linha
com a outra. Se ocorrer hemlise intensificada em forma de flecha (hemlise intensificada),
diagnostica-se Streptococcus agalactiae.
A atividade hemoltica do estafilococo intensificada pelo fator extracelular do
estreptococo do grupo B, denominado fator Camp. A zona de intensificao da lise assume
forma semelhante ponta de flecha, na interseco das duas estrias.
Fonte: Google

Prova de tolerncia ao sal (MTS)

Para Gama hemlise fazer prova de tolerncia ao sal.
Se positivo Enterococcus sp.
Se negativa, fazer a prova da Bile-escurina.

Semear a bactria em caldo MTS (NaCl 6,5%). Incubar 24h a 35
o
C. a turvao do
meio e/ou a viragem do indicador de pH para amarelo indica positividade prova (tolerncia
do microrganismo alta concentrao de NaCl 6,5%).


Prova de Bile-esculina (Besc)

Cultivar a bactria na superfcie do gar e incubar 24h a 35
o
C. Microrganismos Besc
positivos crescem em presena de 40% de bile e hidrolisam a esculina, formando um
precipitado negro em 2/3 ou mais do gar inoculado.

96
Bile esculina + Estreptococos do grupo D
Bile esculina - Estreptococos do grupo Viridans


CLASSIFICAO DE LANCEFIELD (Muito importante)

A classificao de Lancefield baseada nas caractersticas antignicas de um
polissacardeo, carboidrato C, localizado na parede celular. Nesta classificao os
estreptococos so designados pelas letras maisculas do alfabeto: de A a V.

O Streptococcus pyogenes do grupo A. Produz hemlise.
O Streptococcus agalactiae do grupo B. Produz hemlise.


Pesquisa do estreptococo

Cuidados na Coleta

1. Cuidar para que as paredes laterais da boca, lngua e gengivas no sejam
tocadas, com isto evitando a contaminao pela microbiota normal. Por exemplo,
pelos estreptococos enverdescentes e ENPC. Em culturas da orofaringe o
resultado positivo para estas bactrias no deve ser valorizado. Neste sentido, foi
dada nfase especial no captulo que trata da microbiota normal do corpo
humano, para no haver dificuldade na interpretao do exame bacteriolgico
enviado pelo laboratrio.
2. Coletar as amostras antes da antibioticoterapia, evitando os resultados falso-
negativos.
3. Caso haja demora entre a coleta do material e o seu processamento no
laboratrio, indicada a utilizao de um meio de cultura de transporte, como por
exemplo, o meio de Stuart.
4. Para facilitar o isolamento de Streptococcus pyogenes, usar meio de
enriquecimento, como por exemplo, o meio de Hitchens-Pike.
(A descrio destes dois meios encontra-se no final deste captulo).


97
Coleta do material da garganta

Orientar o paciente a abrir a boca e falar um aaaa demorado que abre a garganta e
ergue a vula. Pressionar para imobilizar a lngua com um abaixador de lngua e com auxlio
de um swab (zaragatoa), deslizar em movimentos suaves na faringe posterior, tonsilas ou
fossa tonsilar, tocando os pontos de pus ou placas (alguns recomendam remov-las e
coletar material que estava por baixo delas).
Na falta destas leses, passar o swab nas partes hiperemiadas.


Exames

Do material obtido procede-se ao exame:
1) Bacterioscpico (pelo Gram);
2) Cultivo em meios enriquecidos como gar-sangue. O estreptococo no cresce
em meios simples.


Bacterioscopia

Na bacterioscopia pelo Gram, observar a morfologia celular, grupamento tpico e a
Gram positividade.


Cultivo

1
o
dia

O cultivo feito em gar-sangue semeando com o swab numa pequena rea da
placa (1/5). Em seguida, com o auxlio de ala metlica, tocar a rea semeada com swab e
puxar vrias estrias. Desta maneira consegue-se melhor isolamento.
Semeadura com swab



Stabs

98
Ainda com a ala, fazer cortes curtos e profundos, os stabs, num ngulo
aproximado de 40
o
para introduzir os estreptococos abaixo da superfcie do meio de cultura
e evidenciar a hemlise pela estreptolisina O que oxignio instvel. Nos cortes cria-se
atmosfera de relativa anaerobiose.


Observaes a respeito da hemlise

O estreptococo produz duas hemolisinas:
1) Estreptolisina O = oxignio sensvel;
2) Estreptolisina S = oxignio estvel.
Cerca de 2% do Streptococcus pyogenes produz apenas a estreptolisina O. Para
surpreender estas linhagens fazem-se os stabs para obter hemlise em anaerobiose, pois
em aerobiose no produzem hemlise, perdendo-se um diagnstico importante para
Streptococcus pyogenes.


2
o
dia

No segundo dia, observar o crescimento no gar-sangue. O estreptococo cresce
dando colnias pequenas, puntiformes, delimitadas, bordas lisas. Observar a hemlise:
Fazer Gram das colnias hemolticas.
Semear a colnia hemoltica para o teste da Bacitracina.
Tcnica e recomendaes:
1. Testar apenas amostras hemolticas, visto que, alguns estreptococos alfa-
hemolticos so tambm sensveis a 0,04 g.
2. Se o laboratrio usar apenas o teste da Bacitracina para identificar o
Streptococcus pyogenes, isto deve constar no laudo enviado ao mdico:
Streptococcus beta-hemoltico do grupo A, pelo teste da bacitracina.
Portanto, a sensibilidade Bacitracina no um diagnstico definitivo do
Streptococcus pyogenes. Teste definitivo a aglutinao com o soro
especfico anticarboidrato C, numa reao Ag-Ac.



99
3
o
dia

Observar a sensibilidade Bacitracina. Qualquer halo de inibio d positividade.
Cerca de 85% de Streptococcus pyogenes so sensveis a 0,04 g de bacitracina.

Microbiologia Trabulsi 2
a
edio. Pg. 115. Dr. Luiz Rachid Trabulsi, Prof. Titular
de Microbiologia da Escola Paulista de Medicina So Paulo.
de importncia fundamental que tanto o bacteriologista como o clnico
compreenda o pouco valor da identificao dos estreptococos, somente pela atividade
hemoltica. Est bem demonstrado que os estreptococos beta-hemolticos (alm do Grupo
A) podem ser isolados, com freqncia, da garganta, particularmente os dos grupos C, B e
G. Conforme sabido, as infeces por estes estreptococos no so seguidas de febre
reumtica e glomerulonefrite, no requerendo assim os cuidados teraputicos exigidos pelas
infeces provocadas pelo Streptococcus pyogenes.
Outro aspecto importante do diagnstico, refere-se ao fato de que 10 a 20% dos
indivduos normais podem albergar Streptococcus pyogenes na garganta. Por esta razo, o
isolamento de uma amostra de Streptococcus pyogenes de um paciente com faringite, poder
ser mera coincidncia. A responsabilidade do germe pelo processo infeccioso ter que ser
determinada tendo-se em conta as manifestaes clnicas do paciente e de maneira mais
segura, pela pesquisa de anticorpos sricos 2 a 3 semanas aps o incio da doena.
Observao: outros patgenos sero pesquisados, quando requisitado por mdico,
por exemplo: Neisseria gonorrhoeae, em faringites em pacientes que praticam sexo oral
sem preservativo, Haemophilus influenzae em laringites, etc.


Angina de Plaut-Vincent

Esta angina pode ser diagnosticada com segurana pelo exame bacterioscpico.
O exame bacterioscpico feito pelo mtodo de Gram ou Giemsa, revelando a
presena de bacilos fusiformes e espiroquetas (associao fusoespirilar) que so o
Fusobacterium nucleatum (fusiformes) e o Treponema vincentii, ambos Gram negativos.
Fusiforme: 4 a 8 m de comprimento.
Treponema: 10 a 20 m de comprimento.
O cultivo, se necessrio, feito em anaerobiose.

100
Difteria

Coleta do material

No caso da difteria da orofaringe, de acordo com o Manual de Procedimentos
Bsicos, recomenda-se coletar o material com quatro swabs: dois da garganta (G1 e G2) e
dois da regio nasofaringea (N1 e N2).
Dois swabs, N1 e G1, so utilizados para exame bacterioscpico e outros dois
destinados ao cultivo.


Bacterioscopia

Os esfregaos so corados pelo Gram e Laybourn (bacilo verde claro).
Gram: o bacilo diftrico aparece Gram positivo com extremidades dilatadas.
Laybourn: revela as granulaes metacromticas (azuis) no interiordo bacilo.
O bacilo diftrico tem tendncia ao pleomorfismo apresentando formas em clava,
piriforme, fusiforme e em halter. Os agrupamentos dos bacilos so peculiares, seja
formando paliada ou formando ngulos V, L, Y, que em conjunto tem aparncia de letras
chinesas.
A morfologia tpica observada melhor quando se usa a colorao negativa com
tinta-da-china.
A bacterioscopia tem pequeno valor diagnstico, sendo apenas um teste
presuntivo. Visto que os bacilos pseudodiftricos (Corynebacterium hofmanii, tambm
chamado Corynebacterium pseudodiphtheriticum) que fazem parte da microbiota normal da
orofaringe, tm a mesma morfologia e a mesma propriedade tintorial.
No diagnstico da difteria, o exame bacterioscpico de esfregaos corados pelo
Gram ou por outros processos como os usados para granulaes metacromticas, no tm
valor diagnstico. O bacilo diftrico tem as mesmas caractersticas que as outras
corinebactrias que fazem parte da microbiota normal da garganta. Provavelmente as
manifestaes clnicas apresentadas pelo paciente so mais teis para o diagnstico
etiolgico do que um exame bacterioscpico. Infelizmente este conceito no
suficientemente difundido e por esta razo freqente em nosso meio, o mdico solicitar
uma bacterioscopia de secreo de garganta, quando suspeita de difteria. (Microbiologia
Trabulsi. Dr. Luiz Rachid Trabulsi, 2
a
edio, pg. 129)
101
O tratamento com antitoxina (soro antidiftrico) deve ser uma deciso clnica, to
logo se suspeite de difteria com base nos sintomas apresentados.
O diagnstico laboratorial completo ter valor retrospectivo na confirmao do
diagnstico clnico e como ponto de partida s medidas profilticas, a fim de evitar a
propagao da difteria aos familiares e comunidade (escola).


Cultivo

O cultivo feito em meio de Loeffler (soro sanguneo coagulado).
Neste meio o bacilo diftrico apresenta colnias aps um perodo curto de
incubao, 8 a 10h. Outras bactrias como estafilococos, estreptococos, neisserias, cuja
fase-lag mais demorada, no crescem com igual rapidez.
Do cultivo feita nova bacterioscopia. Caso sejam encontrados caracteres morfo-
tintoriais do bacilo diftrico ser, mesmo assim, um teste positivo de probabilidade.
Para as provas seguintes: bioqumicas e de virulncia, recomenda-se reisolamento
em placas.
O diagnstico de certeza dado somente pelas provas da produo de toxina pelo
bacilo diftrico.
Observao: o bacilo diftrico somente produz toxina quando lisogenizado por
bacterifagos contendo o gene TOX. O vrus integra o seu DNA ao cromossomo bacteriano
e a toxina sintetizada. O Corynebacterium diphtheriae que no lisogenizado no produz
toxina e no patognico, no mximo produz manifestaes clnicas discretas e localizadas.
O teste de certeza pode ser realizado de duas maneiras:
1) In vitro.
2) In vivo.


In vitro

Teste in vitro pode ser feito por imunodifuso radial = IDR (como recomendado pelo
prof. Dr. Luiz Carlos Duarte Formiga Diviso Nacional de Laboratrios de Sade Pblica e
utilizado no Lacen).


102
Tcnica

Em placas contendo meio de cultura acrescido de soro antidiftrico, semear a
bactria suspeita isolada em forma de spots de aproximadamente 4mm de dimetro.
Incubar.
Se o bacilo produzir a toxina, ela se difundir no meio e reagir com o soro
antidiftrico. Haver reao AgAc, que se manifesta como precipitao em torno da
colnia. Outro mtodo o teste de Elek, fundamentando-se no mesmo princpio.

Tcnica

Numa placa com meio transparente colocar uma tira de papel de filtro impregnada
com soro antidiftrico. Semear o bacilo suspeito perpendicularmente ao papel. Se houver
produo de toxina, aps 48h desenvolve-se uma linha branca de precipitao na bissetriz
do ngulo entre a tira e semeadura.

Teste de IDR (hemodifuso radial Ag-Ac) Teste de Elek (tem anti-soro)












In vivo

O teste de virulncia in vivo feito em cobaia inoculando o bacilo suspeito e
observando a ao da toxina. Esses testes no so usados por questes bioticas.

Resumo dos testes

Segundo Otto Bier:
1) Diagnstico de possibilidade - pelo exame bacterioscpico;
2) Diagnstico de probabilidade - cultura em meios adequados;
3) Diagnstico de certeza - mais demorado, porm o nico seguro, que
determina a virulncia (testes in vivo e in vitro).
103
104
Meios de Cultura

Meio de Stuart

utilizado para transportar amostras para culturas de cocos Gram positivos e bacilos
Gram negativos, mantendo as bactrias viveis por 24h (tempo de segurana) ou 48h, at
que sejam semeadas em meios especficos para crescimento.
O meio de Stuart pode ser lquido ou semi-slido.
Frmula do meio de Stuart (semi-slido)
Cloreto de sdio 3 g
Cloreto de potssio 0,2 g
Fosfato dissdico 1,15 g
Fosfato monossdico 0,2 g
Tioglicolato de sdio 1 g
Cloreto de clcio 1% aquoso 10 g
Cloreto de magnsio 10% aquoso 10 g
gar 4 g
gua destilada 1 L
uma soluo tampo, no contendo carboidratos, peptonas ou outras substncias
nutritivas de crescimento. O meio apenas preserva a viabilidade das bactrias durante o
transporte, sem multiplicao significativa dos microrganismos. O tioglicolato de sdio
funciona como agente redutor, para melhorar o isolamento dos anaerbios e a pequena
quantidade de gar fornece consistncia semi-slida, evitando oxigenao e o
extravasamento durante o transporte.

Meio de Hitchens-Pike

Meio de enriquecimento para estreptococos consistncia xaroposa.
Frmula
Infuso de corao bovino 1 L
Peptona 10 g
NaCl 5 g
gar 1 g
Soluo aquosa de azida sdica, NaN (1:1.000) 40 mL
Soluo aquosa de cristal violeta (1:25.000) 12,5 mL
105
O cristal violeta impede o crescimento dos outros cocos Gram positivos e a azida
sdica inibe a microbiota Gram negativa.
O crescimento de estreptococos no meio Hitchens-Pike, tem semelhana com
estalactites, formando filamentos que pendem da superfcie do meio.


CLASSIFICAO DAS PRINCIPAIS ESPCIES DE ESTREPTOCOCOS
PATOGNICAS PARA O SER HUMANO
GRUPO
PRINCIPAIS
ESPCIES
PADRO DE
HEMLISE
HABITAT
PRINCIPAIS
DOENAS
A S. pyogenes Beta
Orofaringe
Pele
Faringites,
tonsilites,
piodermites,
escarlatina.
B S. agalactiae
Beta
(Alfa, Gama)
Nasofaringe
TGU
Sepse neonatal,
meningites,
infeco puerperal,
ITU, etc.
C
S. anginosus
S. dysgalactiae
Beta
(Alfa, Gama)
Nasofaringe
Pele
TGU e TGI
Infeces de pele,
endocardites,
faringites
G
S. canis
S. anginosus
S. dysgalactiae
Beta
(Alfa, Gama)
Nasofaringe
Pele
TGU e TGI
Infeces de pele,
endocardites,
faringites
Enterococos:
E. faecalis
E. faecium
Gama
(Alfa, Beta)
TGU e TGI
ITU, peritonite,
endocardite
D
No
enterococos:
S. bovis
Beta
(Alfa, Gama)
TGI
ITU
Endocardite
F S. anginosus
Beta
(Alfa, Gama)
Orofaringe,
TGU e TGI
Sinusite
Meningite
H S. sanguis
Alfa
(Beta, Gama)
Orofaringe e
TGI
Abscesso cerebral,
pneumonias
K S. salivaris
Gama
(Alfa)
Orofaringe Endocardite
Grupo Viridans:
S. mitis
S. mutans
Alfa Orofaringe Endocartite, crie
NO GRUPAVEIS
Outros:
S. pneumoniae
Alfa
Boca,
faringe e
traquia
Pneumonia, otite
mdia, sinusite,
endocardite.
ESTREPTOCOCOS
ANAERBIOS
Vrios,
inclundo o
Peptostreptococo
Gama
(Beta, Alfa)
Orofaringe,
TGU e TGI
Sinusite,
pneumonia,
abscesso
pulmonar e
cerebral
106
TRATO GNITO URINRIO (TGU)


Os agentes etiolgicos mais freqentes das infeces do aparelho urinrio so:
1) Enterobactrias: Escherichia coli (90% dos casos)
Klebsiella
Proteus
2) Pseudomonas aeruginosa
3) Enterococcus
4) Staphylococcus aureus
5) Staphylococcus saprophyticus (este considerado atualmente o principal agente
de infeco urinria em mulheres jovens).
O material para o diagnstico laboratorial a urina.
Amostras de urina so submetidas cultura, quando existe suspeita de infeco do
trato urinrio, para controle de tratamento ou em pacientes assintomticos com alto risco de
infeco.

Coleta de urina

De preferncia coletar a primeira urina da manh, em frasco estril, tampa de rosca e
boca larga. Outras amostras tambm podem ser obtidas, desde que o paciente retenha a
urina no mnimo por 2 a 3 horas antes da coleta.
Aps a higienizao da regio genital, desprezar o 1
o
jato e coletar o jato mdio da
urina. O restante da mico no deve ser utilizado.
Em crianas com fraldas ou em pacientes que no tm controle de mico, devem-
se usar coletores prprios de urina, fornecidos pelo Laboratrio de Anlises Clnicas. Pode
ser adquirido em farmcias.
1) Fazer anti-sepsia rigorosa do perneo, coxas, ndegas e abdmen.
2) Enxugar com gaze estril.
3) Aplicar o coletor autocolante.
4) A seguir observar se h quantidade suficiente de urina para o exame. Caso no
houver mico em uma hora, trocar o coletor por um novo, fazendo uma nova
assepsia.


107
UROCULTURA

um exame QUANTITATIVO. Para evitar a multiplicao das bactrias na urina
coletada, o exame laboratorial deve ser feito o mais rapidamente possvel (dentro de uma
hora aps a coleta), caso contrrio, pode se manter o material temperatura de geladeira,
no mais que cinco horas.

Diagnstico bacteriolgico

Uma vez no laboratrio o exame segue as seguintes etapas:
1) Bacterioscopia (Gram) do sedimento.
2) Cultivo da urina.
3) Contagem de colnias (bactrias ou contagem de UFC = unidades formadoras de
colnias).
4) Antibiograma.

Descrio dos procedimentos

1
o
dia

1) Centrifugar a urina em um tubo coberto com cpsula de papel alumnio.
2) Derramar o sobrenadante e do sedimento, fazer colorao de Gram para
observar a presena ou ausncia de leuccitos e bactrias.

Cultivo da urina homogeneizada

Mergulhar uma ala de platina na urina e semear por estriais superficiais em placa de
Teague e gar sangue.
Incubar a 37
o
C.




108
Contagem bacteriana (contagem de colnias) UFC

A tcnica de contagem em placa baseada no princpio de que cada clula
bacteriana quando cultivada em meio slido ao se multiplicar forma uma massa
macroscpica que a colnia. Somente serve para contagem de viveis. A contagem pode
ser feita das seguintes maneiras:
1. Com ala calibrada.
2. Por diluies.
3. Lmino-cultivo.


Contagem com ala ( a mais utilizada)

Para a contagem semiquantitativa usa-se ala metlica calibrada de 0,01 ou
0,001mL.
1) Imergir a ala, de forma vertical, em urina homogeneizada e semear uma nica
estria central em placa de Teague e gar-sangue.
2) Em seguida, estria-se perpendicularmente primeira linha semeada, a fim de
espalhar ao mximo o material.

Esquema da Contagem Bacteriana Com Ala




1. Esgotamento
(Inoculao primria)

2. Estriamento

2
o
dia

Do Teague (EMB). Observar as caractersticas coloniais.
1. Se for um bacilo L+, realizar o teste IMVIC. IMVIC uma srie bioqumica
simplificada para caracterizar as bactrias do grupo coliforme.
I = Indol V = Voges-Proskauer
M = Vermelho de Metila C = Citratase
2. Se for um bacilo L-, fazer a srie completa de provas bioqumicas.

109
I M V C
Escherichia coli + + - -
Enterobacter - - + + mvel
Klebsiella - - + + (urease tardia) imvel
Citrobacter + + - +

Do crescimento em gar sangue fazer Gram. Se houver crescimento de estafilococos
ou estreptococos, caracteriz-los como nos captulos precedentes.

Contagem das colnias

Contagem de colnias (UFC) por ala calibrada.
O nmero de colnias multiplicado por 100 se a ala utilizada for de 0,01 e por
1.000 se a ala utilizada for de 0,001.
Exemplo: colnias contadas = 40.
1) Ala 0,01 40 x 100 = 4.000 col/mL urina;
2) Ala 0,001 40 x 1.000 = 40.000 col/mL urina.
O resultado dado pelo laboratrio usando potenciao, para evitar os nmeros com
muitos zeros. Exemplos:
90.000 = 9x10
4
col/mL ou UFC/mL
9.000 = 9x10
3
col/mL ou UFC/mL
100 = 10
2
col/mL ou UFC/mL
45.000 = 4,5x10
4
col/mL ou UFC/mL
100.000 = 10
5
col/mL ou UFC/mL
Mais de 100.000 = superior a 10
5
col/mL ou UFC/mL

3
o
dia

Leitura do IMVIC e das provas bioqumicas do BGN, se lactose negativa (L-).
Leitura das caractersticas do estafilococo e estreptococo.
O Esquema de Urocultura est apresentado na pgina 110.
110
111
Interpretao dos resultados das anlises de urina relacionados com sintomatologia
clnica

Contagem
bacteriana
Leuccitos Sintomas Como reportar o
resultado
Comentrios
A A No houve
crescimento de MO.
No existe infeco urinria.
P A No houve
crescimento de MO.
Piria assptica causada por
desidratao / inflamao.


Sem
crescimento
P P No houve
crescimento de MO.
Provvel uretrite ou paciente
sob uso de antibiticos.
A A Identificao do MO. Provvel contaminao ou
colonizao.
P A Identificao do MO. Bacteriria assintomtica.
Tratamento prvio com
antibiticos.



< 10
5

UFC/mL
P P Identificao do MO
e antibiograma.
Bacteriria sintomtica.
A A Identificao do MO
e antibiograma. *
Bacteriria assintomtica
(gravidez ou paciente idoso).
Contaminao (crescimento de
vrias espcies de MO).
A P Identificao do MO
e antibiograma. *
Cistite, pielonefrite.
Bacteriria sem piria.
P A Identificao do MO
e antibiograma. *
Bacteriria assintomtica
(gravidez ou paciente idoso).




> 10
5

UFC/mL
P P Identificao do MO
e antibiograma. *
Cistite, pielonefrite.




112
Legenda: Sintomatologia P = presena de disria e/ou freqncia urinria
A = ausncia de disria e/ou freqncia urinria
Leuccitos A = < 10/campo
P = 10/campo
MO = microrganismo
* = se houver crescimento de mais de uma espcie de MO, considerar a
predominante.
113
INTESTINAIS

Diversos so os agentes que podem causar doenas diarricas e entre eles as
bactrias.
As fezes devem ser coletadas no incio da diarria, para a pesquisa do patgeno.
As diarrias agudas podem ser divididas em dois grupos:
1) Sanguinolenta.
2) Diarria no sanguinolenta.
A diarria sanguinolenta causada por bactrias invasivas e produtoras de
citotoxinas que invadem ou destroem as clulas epiteliais do intestino. As evacuaes so
sanguinolentas e pouco volumosas. Ao exame microscpico observa-se a presena de
muitos leuccitos.
A diarria no sanguinolenta causada por bactrias produtoras de enterotoxinas.
Estas bactrias aderem mucosa intestinal sem interferir na integridade das clulas
epiteliais. As fezes ficam liquefeitas, de volume grande e evacuaes freqentes. H
ausncia de leuccitos no exame microscpico das fezes.
As bactrias enteropatognicas pesquisadas de rotina em coprocultura so:
Salmonella, Shigella e Escherichia coli invasora e Escherichia coli enteropatognica
clssica. Outras bactrias como a Yersinia enterocolitica, vibries (Vibrio cholerae, Vibrio
parahemolyticus e Campylobacter jejuni), Clostridium (Clostridium difficile e Clostridium
perfringens) e Staphylococcus aureus so pesquisados somente em situaes especiais e
quando solicitado pelo mdico.


Cultura de Fezes

1
o
dia

1) Semear uma alada de fezes ou swab anal, por estrias superficiais, em meio de
Teague ou SS.
2) Semear 3 a 4 aladas das fezes em um caldo de enriquecimento (caldo GN,
tetrationato ou selenito)
3) Incubar o Teague e SS (gar Salmonella-Shigella) a 35
o
C 1
o
C por 24 horas e
caldo de enriquecimento a 35
o
C 1
o
C, sendo que o perodo de incubao varia
de acordo com o caldo utilizado, sendo respectivamente:
114
GN 4 a 6 horas
Selenito 8 a 12 horas
Tetrationato 12 a 24 horas
O enriquecimento necessrio para recuperao e isolamento da Shigella e
Salmonella, pois quando estas bactrias esto presentes em pequena
quantidade podem ser prejudicadas pela competio com a microbiota intestinal.
4) Repicar do caldo de enriquecimento para uma placa de SS ou XLD (Xilose,
Lisina, Desoxicolato).




2
o
dia

1) Observar o crescimento nas placas de Teague. Repicar as colnias suspeitas do
Teague e SS para os tubos contendo EPM e MILI, conforme esquema abaixo. A
inoculao em EPM feita com agulha por picada profunda e, sem recarregar a
agulha, fazer estriais superficiais na parte inclinada do meio. O meio de MILI deve
ser semeado fazendo-se uma picada central prxima ao fundo do tubo.

Esquema da Inoculao Com Agulha Por Picada Profunda
Vista Lateral Vista Anterior








EPM








EPM



115
3
o
dia

1) Realizar a leitura do EPM/MILI.
2) Se houver suspeita de algum patgeno significativo, realizar provas bioqumicas
complementares (se necessrio) e soroaglutinao especfica.
3) Do SS, que veio do enriquecimento, semear as colnias claras no Baracchini.

EPM Cor original: verde





Verde acastanhado LTD positivo

Bolhas de ar gs positivo
6

Amarelo glicose positivo

Azulado uria positiva

Preto H
2
S positivo






MILI Cor original: roxa


Formao de anel vermelho ao adicionar o
reativo de Kovacs indol positivo

Formao de anel amarelo ao adicionar o
reativo de Kovacs indol negativo

Turvao ao redor da linha de inoculao -
motilidade positiva

Amarelo lisina negativa
Qualquer cor diferente do amarelo -
lisina positiva
116
Enteropatgenos

O fluxograma de triagem para enteropatgenos em Coprocultura aps o cultivo em
MILI e EPM encontra-se demosntrado na pgina 123.


Teste de Identificao Sorolgica

O teste feito por aglutinao rpida em lmina, misturando 1 gota do anti-soro e 1
gota da suspenso bacteriana a identificar.
A Salmonella possui antgenos somticos O e antgenos flagelares H. Os antgenos
flagelares podem pertencer a fase 1 ou fase 2 (Salmonelas difsicas).
Uma primeira orientao obtida com misturas de soros O (polivalentes O) e soros
H (polivalentes H), antes de utilizar os soros monoespecficos.


Tcnica

1. Sobre uma lmina colocar uma gota de soro polivalente O e 1 gota de suspenso
bacteriana a identificar.
2. Misturar com ala at ficar com aparncia homognea.
3. Com movimentos basculantes contnuos, promover maior contato entre o soro e
as bactrias. Caso haja especificidade, ocorre reao Ag-Ac que se manifesta
pelo fenmeno da aglutinao.
Em seguida repetir a mesma tcnica usando o soro polivalente H.

Ambas as aglutinaes, O e H, tm que dar positivas. A aglutinao H forma flocos
grandes e frouxos; a aglutinao O forma grumos midos e compactos.
Em seguida fazer aglutinao com soros monoespecficos: somticos e flagelares.
Iniciar com soros correspondentes s salmonelas que mais comumente se isolam na
regio. No nosso meio, a mais freqente a Salmonella typhimurium. Caso haja aglutinao
com todos os soros que correspondem frmula antignica de Salmonella typhimurium, fica
comprovada a sua identificao.

117
Observao: a identificao sorolgica de todas as salmonelas (mais de 2200
sorotipos) s pode ser feita em Laboratrios de Referncia. Os laboratrios clnicos dispem
apenas dos soros das salmonelas mais freqentemente isoladas.
Grupo Sorotipo Antgeno O Fase 1 Fase 2
A S. paratyphi A 1, 2, 12 a -
B S. paratyphi B
S. schwarzerngrund
S. salinatis
S. saint-paul
S. reading
S. kaapstad
S. chester
S. derby
S. agona
S. california
S. typhimurium
S. agama
S. bredeney
1, 4, 5, 12
1, 4, 12, 27
4, 12
1, 4, 5, 12
1, 4, 5, 12
4, 12
1, 4, 5, 12
1, 4, 5, 12
1, 4, 12
4, 12
1, 4, 5, 12
4, 12
1, 4, 12, 27
b
d
d, e, h
e, h
e, h
e, h
e, h
f, g
f, g, s
g, m, t
i
i
l, v
1, 2
1, 7
d, e, n, z
15

1, 2
1, 5
1, 7
e, n, x
1, 2
-
-
1, 2
1, 6
1, 7
C
1
S. oslo
S. paratyphi C
S. cholerae-suis
S. birkenhead
S. livingstone
S. norvich
S. montevideo
S. oranienburg
S. thompson
S. infantis
S. inganda
S. tennessee
S. decatur
6, 7
6, 7 (Vi)
6, 7
6, 7
6, 7
6, 7
6, 7
6, 7
6, 7
6, 7
6, 7
6, 7
6, 7
a
c
c
c
d
e, h
g, m, p, s
m, t
k
r
z
10

z
29

c
1, 5
1, 5
1, 5
1, 6
1, w
1, 6
-
-
1, 5
1, 5
1, 5
1, 5
1, 5
C
2
S. belem
S. muechen
S. newport
S. tokodari
S. bonariensis
S. lichtfield
6, 8
6, 8
6, 8
6, 8
6, 8
6, 8
c
d
e, h
i
i
l, v
e, n, x
1, 2
1, 2
1, 5
e, n, x
1, 2
C
3
S. haardt
S. kentucky
8
8, 20
k
l
1, 5
z
6

C
4
S. eimsbuettel 6, 7, 14 d 1, w
D S. sendai
S. typhi
S. enteritidis
S. dublin
S. panama
S. gallinarum
1, 9, 12
9, 12 (Vi)
1, 9, 12
1, 9, 12 (Vi)
1, 9, 12
1, 9, 12
a
d
g, m
g, p
l, v
-
1, 5
-
1, 7
-
1, 5
-
E S. butantan
S. anatum
S. maleagridis
S. nchanga
3, 10
3, 10
3, 10
3, 10
b
e, h
e, h
l, w
1, 5
1, 6
1, w
1, 2

118
Shigella

Possui 4 espcies, cada espcie com diversos sorotipos. As espcies:
Shigella dysenteriae
Shigella flexneri
Shigella boydii
Shigella sonnei
A Shigella imvel. caracterizada somente pelo antgeno O ( desprovida de
antgenos H e K).

Tcnica

O teste de aglutinao segue a tcnica anterior.

Escherichia coli

A principal bactria da microbiota intestinal a Escherichia coli. H 167 sorogrupos e
desde 60 existem em humanos: 25 microbiota normal; 35 patognicas. As no patognicas
podem causar infeco urinria e meningite.

As Escherichia coli patognicas so distribudas em 5 sorogrupos:
EPEC enteropatognica clssica
ETEC toxignica
EIEC invasiva
EHEC hemorrgica
EAEC aderente

EPEC no produz nenhuma toxina, mas destri microvilosidades (adeso-aplainamento) por
fmbrias formadoras de feixes, intimina e seu receptor, uma protena translocase.

ETEC possui fatores de colonizao (adesinas fimbriais) ligam a bactria a stios
esfecificos na superfcie celular dos entercitos. Produzem poderosas enterotoxinas
codificadas por plasmdeos LT (termolbil) ou ST (termoestvel). LT atua na adenilato
ciclase e a ST na guanilato ciclase (aumenta assim aproduo de fluidos e causa diarria).

119
EHEC - Hemorrgica. Produz uma toxina verotoxina (que idntica toxina Shigalike da
Shigella). Ela se fixa na mucosa do intestino grosso pelo processo de adeso aplainamento,
igual EPEC. A verotoxina atinge as clulas epiteliais e causa diarria. Duas conseqncias
so: a colite hemorrgica e a sndrome hemoltica urmica.

EIEC se liga especificamente mucosa do intestino grosso utiliza genes associados a
plasmdeos, penetram nas clulas do epitlio intestinal por endocitose. No interior das
clulas, lisam o vacolo endoctico, multiplicam-se e disseminam-se para as clulas
adjacentes, provocando destruio tecidual, inflamao, necrose e ulcerao. Isso faz
aparecer sangue e muco nas fezes.

EAEC liga-se s clulas na cultura de tecido. Faz que nem tijolo empilhado. Atuam no
intestino delgado e fazem diarria persistente, principalmente em crianas. Tem muitas
fmbrias que foram transcritas a partir de genes plasmidianos. Produz toxinas termolbeis.

* Testes especficos so necessrios para identificar cepas de E. coli patognicas
Por fazer parte da microbiota normal intestinal, a bioqumica e a sorologia se fazem
necessrias. PCR pode ser utilizada, mas uma tcnica muito cara (diagnstico molecular).

* E. coli possui os antgenos O, K e H a partir deles fazemos a diferenciao das cepas de
E. coli para fazer a diferenciao de qualquer cepa de Escherichia coli, utilizamos a
sorologia por meio desses trs antgenos.

Sorogrupos de Escherichia coli associados a infeces humanas

Infeco Sorogrupo O Observaes
26, 55, 86, 111, 114, 119,
125, 126, 128, 142, 158
EPEC (associados somente
com diarria infantil)
28, 29, 112, 124, 136,
143, 144, 152, 164, 167
EIEC (associados com
disenteria bacilar)
6, 8, 15, 20, 25, 63,
78, 115, 128, 148
ETEC



Intestinal
26, 157 EHEC (associados com a
colite hemorrgica)
120
Urinria 1, 2, 4, 6, 7, 8, 9,
11, 22, 25, 62, 75
Meningite do recm-nascido 1, 6, 7, 16, 18, 83
Bacteremia 1, 2, 4, 6, 7, 8, 9,
11, 18, 22, 25, 76

Membros da microbiota
normal dos intestinos

A Escherichia coli possui antgenos O, K e H, existem 171 antgenos O, 100
antgenos K e 57 antgenos H. A frmula antignica da Escherichia coli representada por
nmeros arbicos colocados aps as letras. Exemplo: O26:K60:H11.
Aglutinao: as tcnicas de aglutinao so feitas como nas anteriormente citadas,
geralmente aglutinando-se com o soro anti-O.
Aps a concluso dos testes, o laboratrio envia ao mdico o resultado.
Exemplos conforme o resultado obtido:
1. Coprocultura positiva para Salmonella sp. Ou citar o sorotipo quando efetuadas
as tipagens sorolgicas completas.
2. Coprocultura positiva para Shigella flexnerii.
3. Coprocultura positiva para Escherichia coli enteropatognica clssica.
4. Coprocultura negativa para bactrias enteropatognicas (citar as bactrias
pesquisadas)
Observao final: as provas bioqumicas so insuficientes para a identificao das
enterobactrias patognicas. A identificao s completa aps os testes sorolgicos.


Meios de cultura usados nesta prtica

Meio SS

Seletivo diferencial. SS iniciais de Salmonella e Shigella.
Frmula:
Lactose: diferencial;
Vermelho neutro: indicador de pH;
Verde brilhante: seletivo, inibe a maior parte das bactrias Gram positivas;
Sais biliares: favorecem a Salmonella, inibem coliformes e Gram positivas;
Hipossulfito de sdio: inibe outros Gram negativos;
121
Cloreto frrico;
gar simples.

O meio SS muito seletivo, a ponto de no ser aconselhado por microbiologistas de
renome. formulado para prejudicar a maior parte das Gram negativas, inclusive os
coliformes, pelas altas concentraes de sais biliares (8,5 g/L os outros meios tm 1,5 g/L)
e altas concentraes de citrato de sdio.

MEIO DE
CULTURA
FINALIDADE DO MEIO
ASPECTO DAS COLNIAS
SUSPEITAS
PROCEDIMENTO
DE
IDENTIFICAO
MC
Isolamento de entero-
bactrias.
Inibe CGPs.

Crescem BGNs
somente
Lactose negativa (transparente ou
sem cor): suspeita de Salmonella
spp., Shigella spp. e algumas E. coli
invasoras.
Lactose positiva (co de rosa):
suspeita de E. coli
Rugai e
sorotipagem
EBM
TEA
HHT
Isolamento de entero-
bactrias.
Inibe CGPs.
Crescem BGNs
somente
Transparentes ou roxo claro: suspeita
de Salmonella spp.
Roxo escuro com brilho metlico:
suspeita de E. coli
Rugai e
sorotipagem
HE
Seletivo para
Salmonella e Shigella.
Contm indicador da
produo de H
2
S (cido
sulfdrico)
Azul ou verde azulado: suspeita de
Salmonella spp. (com ou sem centro
negro), Shigella spp.
Amarela: suspeita de E. coli
Rugai e
sorotipagem
SS
Seletivo para
Salmonella spp. Pode
inibir Shigella spp.
Contm indicador da
produo de H
2
S
Incolor (com ou sem centro negro):
suspeita de Salmonella spp.
Incolor: suspeita de Shigella spp.
Colnias negras: suspeita de
Salmonella spp.
Colnias cor de rosa: suspeita de E.
coli
Rugai e
sorotipagem
VB
Seletivo para
Salmonella spp.
Vermelha, rosa forte ou translcida
circundadas de vermelho: suspeita de
Salmonella spp.
Amarela: suspeita de Klebsiella spp.
Rugai e
sorotipagem
Fonte: Opustil et al, 2002
122
EPM (Escola Paulista de Medicina)

Este meio trata-se de uma modificao do meio de Rugai e Arajo pela retirada da
sacarose e da prova do indol.
Neste tubo pode ser lido:
Desaminao do Ltriptofano.
Fermentao da glicose.
Produo de gs pela fermentao da glicose.
Produo de H
2
S.
Hidrlise da uria pela enzima urease.


MILI (Motilidade, Indol e Lisina)

um meio semi-slido onde pode ser lido:
Motilidade.
Descarboxilao da lisina.
Produo de indol a partir de triptofano.


GN Broth (Bacilo Gram Negativo Caldo)

Triptose 20g
Dextrose 1g
D-manitol 2g
Citrato de sdio 5g
Desoxicolato de Na 0,5g
Fosfato de potssio 4g
Fosfato monopotssico 1,5g
NaCl 5g
P/ 1000mL de H
2
O.
123


124
MEIO BARACCHINI

Este meio permite observar a decomposio de trs acares: glicose, lactose e
sacarose, alm da produo ou no de urease, H
2
S, gs e indol. um meio que promove
sete provas bioqumicas em uma s.
1) Extrato de carne
2) Triptose
3) NaCl
4) Tiossulfato de Sdio
5) Sulfato Ferroso
6) Glicose, Lactose e Sacarose
7) Uria
8) Vermelho de Fenol
9) Azul de Timol
Composio deste meio de
cultura
10) gar

importante estabelecer a proporo de glicose de 1:10 em relao a cada um dos
demais carboidratos. O meio slido distribudo para apresentar uma base em coluna alta
de aproximadamente 3cm de altura e o pice inclinado do mesmo comprimento que a base,
em forma de bisel. As bactrias inoculadas no fundo vo ter uma relativa anaerobiose.

ASPECTO DIAGNSTICO
1. Base amarela, sem gs, com
enegrecimento e com o pice vermelho.
Salmonella typhi
2. Base amarela, com gs, com
enegrecimento e com o pice vermelho.
Salmonella arizona, Salmonella sp.
Citrobacter sp.
3. Base amarela, sem gs e pice vermelho. Shigella sp.
4. Base violeta, com ou sem enegrecimento
e com o pice violeta.
Proteus sp.
5. Base amarela, com gs, com ou sem
enegrecimento e com o pice amarelo.
Escherichia sp., Klebsiella sp.,
Enterobacter sp.
6. Base e pice vermelhos. Pseudomonas aeruginosa
7. Base amarela, sem gs, pice amarelo ou
amarelo avermelhado.
Bactrias Gram Positivas
125
Resultados

Relacionados apenas com a decomposio de acares (no considerando a urase
e o H
2
S), temos trs resultados:

CASO 1 CASO 2 CASO 3
Base alcalina
pice alcalino
No fermentadora
Base cida
pice cido
Fermentadora de
lactose e sacarose
Inicial
pice e base cidos
No fermenta
lactose
Fermenta glicose
Posterior
Base cida
(amarela)
pice vermelho

CASO 1: Quando a bactria incapaz de fermentar qualquer acar testado. A base e o
pice conservam a cor vermelha inicial (pH alcalino).

CASO 2: Quando a bactria fermentadora de glicose e sacarose ou lactose. H produo
de cidos. A base e pice apresentam cor amarela (pH abaixo de 6,0).

CASO 3: Ilustra o metabolismo inicial e a transformao posterior definitiva.

Inicial: A base e o pice aparecem amarelos indicando acidificao (fermentao de
glicose).

Posterior: A superfcie do bisel gradualmente volve ao pH alcalino (meio vermelho inicial),
ao transformarem aminas a partir da descarboxilao oxidativa do O
2
do ar (no fundo do
tubo, onde no existe o O
2
, a decomposio dos peptdeos quase nula). A bactria no
fermentadora de lactose e fermentadora de glicose. A glicose em pequenas quantidades
nesse meio (1:10) em relao aos outros carboidratos, produz pequenas quantidades de
cidos, os quais so facilmente neutralizados pelas aminas alcalinas. Devido maior
proporo, a lactose ou a sacarose, se fermentadas, produziriam pequenas quantidades de
cidos, e que as aminas formadas no conseguiriam neutralizar.




126
FEBRE TIFIDE E PARATIFIDE


A febre entrica adquirida atravs da ingesto de gua ou alimentos contaminados
com material fecal. No prazo de 10 ou 14 dias aps a ingesto dos bacilos aparece febre,
que aumenta gradualmente, com queixas inespecficas de cefalia, mialgias, mal-estar e
anorexia. Estes sintomas persistem por uma semana ou mais e so seguidos de sintomas
gastro-intestinais.

Agente etiolgico:
Febre Tifide Salmonella typhi
Febre Paratifide Salmonella paratyphi A, Salmonella schottmuelleri (antiga
Salmonella paratyphi B) e Salmonella hirschfeldii.

O diagnstico laboratorial feito por duas provas:
1) Hemocultura diagnstico direto;
2) Reao de soro-aglutinao Reao de Widal (diagnstico indireto).

Perodos da doena e as porcentagens de positividade

Primeira semana = hemocultura (80 a 100% de positivo), Widal (10%).
Segunda semana = hemocultura (75%), Widal (75%).
Terceira semana = Reao de Widal (100%), hemocultura (40%).

CORRELAES CLNICAS:

Como quase sempre o paciente chega ao servio de sade logo na primeira semana, quase
sempre o exame a ser feito a hemocultura. No entanto, pode haver casos isolados e ser
a anamnese que nos guiar a qual exame dever ser feito. H quanto tempo o(a) senhor(a)
est com essa febre?

NA PRIMEIRA SEMANA: FAZER HEMOCULTURA
NA SEGUNDA SEMANA: INDIFERENTE
NA TERCEIRA SEMANA: FAZER WIDAL




127







Incubao








Invaso
ativa e
Bacteremia








ACME
Fonte: Rubin, 2006


Observao: como nem sempre o paciente sabe especificar o incio da doena, alguns
clnicos recomendam realizar ambas as provas simultaneamente, independente do perodo
da infeco, para obter maior probabilidade diagnstica.
128
Quarta semana (fase de convalescena) = realiza-se a Coprocultura-Teste de
libertao. A coprocultura no tem por objetivo o diagnstico da doena e sim para confirmar
o estado de portador, em virtude da infeco crnica da vescula biliar em alguns pacientes.
O portador elimina a Salmonella atravs das fezes podendo propagar a doena. Para
comprovar que o paciente no alberga a Salmonella preciso fazer trs coproculturas de
trs evacuaes consecutivas. As trs devem ser negativas.
Muitos livros de microbiologia citam o caso de uma cozinheira americana que
trabalhou para oito famlias durante oito anos e foi a fonte de contaminao de sete
epidemias de Febre Tifide com mais de duzentos casos. Foi por isso chamada de Mary
Typhoid.


Hemocultura

o cultivo do sangue do paciente em meios adequados. No caso da Salmonella
pode se usar o caldo bileado.
O sangue obtido por puno da veia usando seringa e agulha. Extrado o sangue,
trocar a agulha e inocular no frasco com meio de cultivo, perfurando a tampa de borracha (o
diafragma de borracha, como nos frascos de penicilina).
Pode-se usar tambm um sistema fechado, que consiste num frasco com meio de
cultura e vcuo. Puncionar a veia com a agulha do prprio sistema e o sangue aspirado
diretamente para o frasco.
Em ambos os casos, o local da puno deve ser rigorosamente descontaminado.
Recomenda-se fazer:
1) Lavagem com sabo medicinal.
2) Enxaguar com gua estril.
3) Aplicar lcool iodado a 1%.
4) Passar lcool 70% para retirar o iodo.
Aps a anti-sepsia no palpar a veia com os dedos.


Perodo da coleta

Recomenda-se a coleta de sangue imediatamente antes do pico febril, porque o
perodo de maior concentrao de bactrias circulantes. Mas como o pico febril geralmente
129
no pode ser previsto, aconselhada a coleta de duas amostras com uma hora de
diferena.
Normalmente recomenda-se colher 2 amostras em crianas, 3 em adultos que no
estejam em tratamento e 4 a 6 amostras, na vigncia do tratamento com antibiticos.
Nos casos de estado febril agudo em que haja a necessidade de terapia imediata,
realizam-se duas coletas, uma em cada brao.


Volume do sangue a cultivar

Para hemocultura de adultos, retira-se 10 mL de sangue, visto que o nmero de
bactrias circulantes pequeno, de 10 a 20 bactrias por mL. Em crianas de at um ano,
colher de 1 a 5 mL.
Proporo: semear em meios de cultura guardando a proporo de 1 para 10, a
diluio necessria para preservar, in vitro, um microrganismo da ao bactericida do
sangue.


Uso de antibiticos

Se o paciente estiver usando antibiticos, o fato deve constar na requisio do
exame dando o nome do medicamento. Se for penicilina, neutraliza-se a sua ao,
acrescentando penicilinase ao meio de cultura (50 u%). Se forem sulfamdicos, acrescenta-
se cido p-amino-benzico (5 mg%).
Alguns meios para hemocultura disponveis no comrcio contm anticoagulante
polianetol-sulfonato de sdio (PSS) que, alm de evitar a coagulao do sangue, inibe a
ao do complemento, lisozima, fagocitose e inativa aminoglicosidios.
Observao: quando h suspeita de que a septicemia causada por Neisseria
gonorrhoeae, Neisseria meningitidis e Gardnerella vaginalis no se deve usar este
anticoagulante, porque ele inibe o crescimento destes agentes.

Cultivo

Os frascos com o sangue devem ser incubados a 37
o
C e observados durante vrios
dias (para Listeria, at 30 dias). Devido ao pequeno nmero de microrganismos, o
130
crescimento lento. O crescimento percebido pela turvao do meio. Nesta ocasio, tirar
uma pequena poro da cultura e fazer:
Bacterioscopia pelo Gram.
Isolamento em placas para caracterizao.
O resultado de Gram enviado ao clnico para orientao preliminar. Por exemplo:
Hemocultura positiva para bacilos Gram negativos aps cinco dias de incubao.
Caracterizao bioqumica em andamento.
Um vez identificada a bactria, manda-se o resultado definitivo ao mdico.


Reao de Widal

A Reao de Widal uma soro-aglutinao e pesquisa anticorpos anti-salmonela, no
sangue do paciente, dirigida contra os antgenos O e antgenos H.
Para que a Reao de Widal tenha valor diagnstico necessrio titular os
anticorpos presentes, visto que eles existem em pequenas quantidades em sangue de
pessoas normais.
Para detalhes tcnicos e interpretao de resultados da Reao de Widal, consultar
Microbiologia e Imunologia de Otto Bier, pg. 635 a 642, edio 1990.
131
TESTE DE SENSIBILIDADE AOS ANTIBITICOS (TSA)


So testes utilizados para observar a resistncia ou sensibilidade aos
antimicrobianos de bactrias isoladas de amostras clnicas representativas de um processo
infeccioso, cuja sensibilidade no previsvel.

1) Por diluio do antibitico
2) Por difuso do antibitico

Diluio

O teste da diluio em caldo empregado para determinao da Concentrao
Inibitria Mnima (CIM) que dada pela quantidade da droga no tubo onde no houver mais
crescimento (a quantidade expressa em mcg/mL).
Exemplo:

30 mcg/mL 15 mcg/mL 7,5 mcg/mL 3,75 mcg/mL 1,88 mcg/mL 0,94 mcg/mL








Nos tubos so colocadas quantidades conhecidas e decrescentes do antimicrobiano
e quantidades fixas de bactrias em todos os tubos. Portanto temos:
a) Quantidades variveis do antimicrobiano;
b) Quantidades constantes de bactrias.
Aps incubao, observar os tubos com crescimento revelado pela turbidez. No
exemplo acima houve crescimento nos trs tubos da direita. J o tubo com 7,5 mcg no
apresentou turbidez. O CIM deste antibitico = 7,5 mcg/mL.
Este mtodo, fornecendo dados quantitativos, sempre usado em situaes onde o
mtodo de difuso fornece dados inseguros. Tambm quando os pacientes no respondem
132
a uma teraputica aparentemente adequada ou ento que apresentam recidivas no curso do
tratamento.


Difuso

O segundo mtodo, o Teste de Sensibilidade aos Antibiticos (TSA) ou antibiograma,
baseia-se na capacidade, apresentada pelo antibitico, de se difundir no meio de cultura
slido.
As tcnicas variam, podendo-se usar: comprimidos, escavaes nas quais se coloca
o antibitico, mas a mais usada em Laboratrios de Anlises Clnicas a tcnica de difuso
do disco (confete) de papel de filtro, embebido em antibitico. o mtodo de Kirby-Bauer
que prtico, seguro, barato e de fcil execuo. H vantagem tambm na apresentao do
resultado em trs nveis: sensvel, intermedirio (ou pouco sensvel) e resistente, o que
permite correlao com os dados de CIM e os nveis antimicrobianos a nvel de sangue e
urina, com a dosagem habitual do antibitico prescrito.
O mtodo de Kirby-Bauer foi padronizado para patgenos de crescimento rpido,
como enterobactrias, Staphylococcus aureus e Pseudomonas. Para outros microrganismos
ainda so feitas investigaes para efeito de padronizao.
A padronizao requer os seguintes cuidados relacionados aos meios de cultura:
1) pH 7,3 a 7,4.
2) Espessura uniforme de 4 mm com superfcie perfeitamente plana.
3) As placas no devem ter umidade excessiva na superfcie do meio e na tampa.
4) O meio deve ser recente (no ressecado).


Cuidados com o inculo

A suspenso bacteriana deve ter turvao idntica ao tubo n
o
5 do padro de sulfato
de brio (escala de Mac Farland 0,5 mL de BaCl 1% + 99,5 mL de H
2
SO
4
a 1%). A
variao da concentrao do inculo pode resultar em erros superiores a 50%.




133
Cuidados com os discos de papel de filtro

1) Devem ser conservados a 4
o
C (ou menos), em frascos originais.
2) Antes de usar, retirar da geladeira ou freezer e usar somente quando os frascos
atingiram a temperatura ambiente, para evitar gotas de condensao.


1
o
dia

Semeadura em placa

1) Mergulhar um swab estril no inculo a testar. Retirar o excesso do lquido
pressionando-o contra a parede interna do tubo.
2) Deslizar o swab sobre a superfcie em todas as direes (semeadura em massa),
observando que no fique nem uma rea sem semear.


Aplicao dos discos

1) Com cuidados de assepsia, os discos podem ser aplicados manualmente (com
auxlio de pina estril) ou por dispositivos mecnicos simples ou mltiplos. Os
discos podem ser individuais ou polidiscos. Os polidiscos so usados em
laboratrios de rotina grande.





Ligaes inertes



Discos impregnados

A placa de dimetro grande, de 15 cm aproximadamente.
134
H economia de tempo e trabalho visto que se coloca o polidisco de uma s vez.
No exemplo acima o polidisco tem 13 antibiticos.
No caso dos discos individuais deve se respeitar o espaamento entre eles de 3
cm e 2 cm entre o disco e a borda da placa. No centro da placa colocar os
antibiticos com menor poder de difuso: polimixina, bacitracina e vancomicina.
Usar um antibitico de cada grupo. So recomendados meios de cultura
especiais para antibiticos pouco solveis em gua.
2) Aps colocar o disco, fazer uma presso leve com a pina para deix-lo aderido
superfcie do meio.
3) Inverter a placa e incubar a 37
o
C.


2
o
dia

1) Observar o crescimento que deve ser semiconfluente. Colnias isoladas, muito
separadas, indicam quantidade insuficiente de bactrias.
2) Medir com rgua milimetrada o dimetro da zona de inibio de crescimento ao
redor do disco (inclusive o disco).
3) Crescimento de colnias isoladas dentro do halo indica presena de mutantes
resistentes ou contaminantes (cultura mista).

Observar a variao, na Tabela de Agentes Antimicrobianos Sugeridos para Uso
Rotineiro em Antibiograma e Tabela de Interpretao de Dimetro dos Halos de
Inibio, do halo de inibio em relao ao antimicrobiano e a bactria testada (as tabelas
esto nas pginas seguintes).










135
Interpretao do Dimetro dos Halos de Inibio
Antimicrobiano Potncia do
disco
Dimetro do halo de inibio (mm)
Resistente Intermedirio Sensvel
Amicacina 30 mcg 14 15 16 17
Ampicilina
(...) Gram-negativos entricos
(...) Estafilococos
(...) Haemophilus sp.
(...) Enterococo
(...) Estreptococo (S. bovis)
(...) Listeria monocytogenes

10 mcg
10 mcg
10 mcg
10 mcg
10 mcg
10 mcg

11
28
19
16
21
19

12 13
-
-
-
22 29
-

14
29
30
19
30
20
Carbecilina
(...) Pseudomonas
(...) Gram-negativos entricos
100 mcg
13
17

14 16
18 22

17
23
Cefotaxima
Cefoxitina
Ceftazidima
Ceftriaxona
Cefalotina
Cloranfenicol
Clindamicina ou Lincomicina
Eritromicina
Fosfomicina
Gentamicina
Imipenem
Metilmicina
30 mcg
30 mcg
30 mcg
30 mcg
30 mcg
30 mcg
2 mcg
15 mcg
50 mcg
10 mcg
10 mcg
30 mcg
14
14
14
13
14
12
14
13
13
12
13
12
15 22
15 17
15 17
14 20
15 17
13 17
15 20
14 22
14 22
13 14
14 15
13 14
23
18
18
21
18
18
21
23
17
15
16
15
Oxacilina
(...) Estafilococos
(...) Pneumococos quando
sensveis penicilina G

1 mcg
1 mcg

10
19


11 12
-


13
20

Penicilina G
(...) Estafilococos
(...) N. gonorrhoae
(...) Enterococos (E. faecalis)
(...) L. monocytogenes
(...) S. bovis

10 unidades
10 unidades
10 unidades
10 unidades
10 unidades

28
19
14
19
19

-
-
-
-
20 27

29
20
15
20
28
Rifampicina
Tetraciclina
Tobramicina
Trimetoprim / sulfametoxazol
Vancomicina
30 mcg
30 mcg
10 mcg
1,25/23,75 mcg
30 mcg
16
14
12
10
9
17 19
15 18
13 14
11 15
10 11
20
19
15
20
28
Antimicrobianos especficos
para infeces urinrias






cido pipemdico
cido nalidixo
Nitrofurantona
Norfloxacina
Sulmamdicos
20 mcg
30 mcg
300 mcg
10 mcg
250 a 300 mcg
13
13
14
12
12
14 18
14 18
15 16
13 16
13 16
19
19
17
17
17
Drogas para Germes Urinrios

136
CAPTULO 11 CAPTULO 11 CAPTULO 11 CAPTULO 11: :: : DOENAS SEXUALMENTE TRASMISSVEIS


PRINCIPAIS AGENTES ETIOLGICOS:

Cancro mole/cancride Haemophilus ducreyi
Gonorria Neisseria gonorrhoeae
Linfogranuloma venreo (LGV) Clamydia trachomatis
Sfilis Treponema pallidum

Outras: Gardnerella vaginallis, Mycoplasma hominis, Ureoplasma urealyticum,
Calymmatobacterium granulomatis, Candida albicans, Herpes vrus e o protozorio flagelado
Trichomonas vaginalis, o qual vocs vero com detalhes na Parasitologia Mdica (BP331).


Atualmente o nmero de doenas transmitidas pelo contato sexual aumentou (ver
tabela). H as que so causadas por vrus: Herpes, hepatites, AIDS. Infeces por
bactrias: Salmonella, Shigella, Campylobacter. A Entamoeba histolytica, Giardia e
Enterobius so transmitidos aps o contato bucolingual-anal.
O aumento das DST foi devido a mudanas do comportamento sexual, ligado a
diversos fatores, entre os quais:
Maior liberdade sexual.
Incio precoce da atividade sexual.
Multiplicidade de parceiros.
Maior expresso social feminina



Doenas infecciosas e infestaes transmitidas por contato sexual
Tipo de Agente Agente Especfico Doena ou Sndrome
Vrus
Citomegalovrus
Vrus da hepatite A
Vrus da hepatite B
Vrus do herpes simples tipo 2
Vrus da imunodeficincia
humana
Vrus do molusco contagioso
Vrus do papiloma genital
Citomegalovirose
Hepatite A
Hepatite B
Herpes simples genital
AIDS

Molusco contagioso
Condiloma acuminado
137
Bactrias
Calymmatobacterium
granulomatis
Campylobacter sp.
Chlamydia trachomatis





Gardnerella vaginalis
Hemophilus ducreyi
Mycoplasma hominis

Neisseria gonorrhoeae
Salmonella sp.
Shigella sp.
Treponema pallidum
Ureaplasma urealyticum
Granuloma inguinal ou donovanose

Enterite e enterocolite
Uretrite, epidimite, proctite e
linfogranuloma venreo (no sexo
masculino). Cervicite, endometrite,
salpingite, bartolinite, sndrome uretral,
proctite, peri-hepatite e linfogranuloma
venreo (no sexo feminino)
Vaginite
Cancro mole ou cancride
Salpingite, febre ps-abortamento,
febre puerperal e pielonefrite
Gonorria (uretrite e outras sndromes)
Salmonelose
Shigelose
Sfilis
Uretrite, uretroprostatite e
corioamnionite
Fungo Candida albicans Vulvovaginite e balanopostite
Protozorios
Entamoeba histolytica
Giardia lamblia
Trichomonas vaginalis
Amebase intestinal
Giardase
Vulvovaginite e uretrite
Helmintos Enterobius vermicularis Enterobase
Artrpodes
Phthirus pubis
Sarcoptes scabiei
Ptirase ou pediculose pubiana
Escabiose


SFILIS

Sfilis ou lues causada por Treponema pallidum, geralmente, transmitida
sexualmente ou em relaes muito ntimas. Mais raramente pode ser adquirida por
transfuso de sangue, acidentes de laboratrio ou por via placentria.
O treponema penetra atravs de mucosas ntegras ou em efraes da pele. A
umidade favorece a instalao.
A sfilis uma doena de evoluo lenta e pode ser dividida em quatro fases:

Fase da Doena Caracterizao
1 Sfilis Primria Cancro duro
2 Sfilis Secundria Rosolas
3 Sfilis Latente Sem sintomas ou sinais
4 Sfilis Terciria Sfilis cardiovascular ou neurossfilis (demncia)
138
1. Sfilis Primria

Aparece de 2 a 6 semanas aps o contgio e se manifesta com o aparecimento de
uma leso chamada cancro duro ou protosifiloma. uma leso de 1 a 2 cm de dimetro,
geralmente circular e nica, bordas endurecidas (da o nome) e elevadas, indolor e de fundo
liso com cor avermelhada. Cobre-se facilmente com secreo purulenta devido infeco
por contaminantes. As localizaes mais freqentes so: pnis, vulva, parede vaginal, canal
endocervical e em menor freqncia no nus, reto e na cavidade oral (faringe e tonsilas). O
cancro duro cura espontaneamente ao fim de 1 a 3 meses.

Fonte: Netter, 2006 Fonte: Rubin, 2006

2. Sfilis Secundria

O Treponema pallidum dissemina-se a partir da leso inicial e pode acometer vrios
rgos e tecidos. Na pele aparecem manchas eritematosas chamadas rosolas sifilticas
(principalmente no tronco). Na mucosa bucal a leso tem semelhana com a afta e rica em
treponemas. Podem aparecer leses nas amgdalas, mucosa retal, vulva, prepcio e reao
139
ganglionar. Alm destas leses, pode haver envolvimento de rgos internos (nefrite,
hepatite, meningite, etc.).
Em pacientes no tratados, as leses e os sintomas desaparecem aps 1 a 3 meses.

Fonte: Mims, 2005

3. Sfilis Latente

Segue-se a sfilis latente que assintomtica, apenas revelada em provas
sorolgicas. Esta fase pode durar de 1 a 30 anos.

4. Sfilis Terciria

quando o carter de infeco j neurolgico e cardiovascular. Pode ocorrer
aortite sifiltica, que um tipo de endarterite obliterante dos vasa vasorum (os microvasos
que nutrem os leiomicitos da tnica mdia dos grandes vasos, como foi visto em Histologia
I), pode ocorrer um aneurisma sifiltico e outras leses que sero discutidas na disciplina de
Anatomia Patolgica (MP313). Alm disso, pode ocorrer neurossfilis lesando meninges,
crtex cerebral, medula e pares cranianos, e a sfilis terciria benigna (surgimento de uma
goma em qualquer rgo).

5. Sfilis congnita

quando a sfilis transmitida intra utero, da me infectada para o feto, com
disseminao nos tecidos fetais, havendo proliferao e posterior resposta inflamatria.
Pode se apresentar de maneira assintomtica, ou sintomas inespecficos como rinite. Em
alguns casos d-se origem trade de Hutchinson, que um diagnstico patognomnico da
sfilis congnita.

140
Trade de Hutchinson
- queratite parenquimatosa com conseqente cegueira
- hipocusia (surdez) vestibular (labirntica)
- dentes ebtalhados semi lunarmente (o destista pode fazer o diagnstico)

Resumo:

Fonte: Rubin, 2006 Fonte: Robbins, 2005


Diagnstico Laboratorial

O diagnstico laboratorial depende da fase da doena:

Sfilis Primria Diagnstico direto bacterioscopia para revelar
a presena do agente causador.

Sfilis
Secundria
Latente
Terciria
Diagnstico indireto pela pesquisa de
anticorpos no sangue do paciente, atravs de
provas sorolgicas.

Observao: em certas ocasies, os clnicos requisitam bacterioscopia de leses
secundrias de sfilis, principalmente de mucosas e em material ganglionar. Como tambm
alguns solicitam exame sorolgico em sfilis primria, visto que esta fase pode durar at 3
meses e j aps a segunda semana comeam a surgir anticorpos especficos.
141
Coleta do material para bacterioscopia

1. Limpar a superfcie da leso com gaze embebida em soluo salina estril, para
remover os contaminantes.
2. Secar com gaze estril.
3. Fazer presso leve na base endurecida e coletar a serosidade que poreja da
leso, utilizando ala metlica, tubo capilar ou fazendo um imprint com a prpria
lmina.
A bacterioscopia pode ser feita por diversos mtodos:

a. Campo escuro (95% de positividade);
b. Colorao negativa;
c. Fontana-Tribondeau;
d. Imunofluorescncia direta.


Campo escuro

o mtodo de escolha, de grande sensibilidade e uma positividade ao redor de 95%.

Tcnica

Imediatamente aps coletar a serosidade, cobrir com lamnula e observar. Os
treponemas medem de 6 a 10 m de comprimento e 0,2 m de espessura, apresentam
espiras apertadas, regulares e numerosas (de 10 a 14). Em campo escuro aparecem
apresentando grande mobilidade. Deve-se ter o cuidado de no confundir com outro
espiroqueta, o Treponema refringens, habitante freqente da genitlia. Encontrado em
leses sifilticas secundariamente infectadas e tambm em leses genitais no luticas.
Com experincia percebem-se logo as diferenas: o Treponema refringens mais
refringente (da o nome), mais calibroso, tem espiras mais abertas e menos numerosas. Em
leses bucais, as formas espiraladas, como o Treponema microdentium, de morfologia
muito semelhante ao Treponema pallidum pode ocasionar resultados falso-positivos. O uso
de drogas antitreponmicas locais ou sistmicas ou o material coletado em leses antigas,
podem dar resultados falso-negativos.


142
Tcnica de Fontana-Tribondeau

Apesar de menos sensvel e mais trabalhoso que a pesquisa direta em campo
escuro, o mtodo de Fontana usado principalmente em laboratrios clnicos de pequeno
porte que no dispem de microscpios de campo escuro.
Observao: no se usa o Gram para evidenciar o Treponema pallidum por trs
motivos:
1. Cora-se mal pelos corantes de anilina, devido a composio em lipdios.
2. Mesmo se corasse, no seria observado, pois seu calibre de 0,2 m, limite de
visibilidade em MO.
3. muito frgil e no suportaria a fixao pelo calor usado no Gram.

Imunofluorescncia Direta

Na imunofluorescncia direta so usados anticorpos especficos conjugados com
fluorescena. H formao de reao Ag-Ac, Ag (bactria) com anticorpo correspondente e o
Treponema aparece fluorescente, quando observado ao microscpio de luz ultravileta.

Reaes Sorolgicas

A partir da fase secundria da sfilis, so feitos exames sorolgicos. O material o
sangue do paciente.
Aps a assepsia do local, coletar o sangue e deixar coagular. O soro sobrenadante
submetido a diversos exames, visando encontrar anticorpos contra o treponema. O
sorodiagnstico feito por dois tipos de reao:
1. Reaes com antgenos no-treponmicos;
2. Reaes com antgenos treponmicos.
1. O antgeno no treponmico a cardiolipina extrada de corao bovino. usado
nas reaes de floculao: Kahn, Kline, VDRL e outras. usado tambm em
reao de Wassermann, por Fixao de Complemento.
Observao: os clnicos costumam solicitar a pesquisa de anticorpos sifilticos
atravs de: Soro Lues. Neste caso o laboratrio clnico s far: Kahn, Kline e
VDRL. Caso haja interesse em outros mtodos, deve constar na requisio.
2. O antgeno treponmico usado em vrias reaes, entre elas:
TPI: Treponema pallidum Immobilization;
143
FTA: Fluorescent Treponema Antibody.
FTA-ABS: Fluorescent Treponema Antibody Absorved Test
Fonte: Mims, 2005

O TPI muito especfico, apresentando reao cruzada apenas com o
Treponema pertenue (bouba) e Treponema carateum (pinta). Mas no muito
utilizado em laboratrios clnicos por ser caro e de difcil execuo. H
necessidade de manter o Treponema pallidum suficientemente patognico em
inoculao em coelhos, que devem ser mantidos no biotrio em temperaturas
prximas de 18
o
C.
Atualmente cada vez mais usado em laboratrios clnicos o FTA-ABS, que de
fcil execuo e de grande sensibilidade e especificidade, uma vez que o soro
suspeito absorvido com antgenos de treponemas no patognicos (Treponema
de Reiter). O Treponema pallidum e o Treponema reiterii tm antgenos em
comum e geram a formao de anticorpos comuns. Mas cada um deles tem
antgenos prprios. Absorvidos os anticorpos comuns, ficam somente aqueles do
Treponema pallidum.
O FTA-ABS consiste em dois sistemas Ag-Ac.

Treponema pallidum
x
Anticorpo
Anticorpo (gamaglobulina)
x
Soro antiglobulina humana
(conjugado com fluorescena)



144
Tcnica

1. Sobre uma lmina preparada com Treponema pallidum fixado colocado o
soro suspeito absorvido.
2. Colocar o complexo soro antigamaglobulina humana + fluorescena. Caso
haja anticorpos anti-sifilticos, a antigamaglobulina reagir com ele. Levada
ao microscpio de luz U.V. aparecero os treponemas fluorescentes em caso
positivo.
Observao: o treponema pallidum no se cultiva em meios bacteriolgicos
artificiais e nem em cultura de clulas.

Soro suspeito com Ac



Treponema pallidum



Antigamablobulina com fluorescena






GONORRIA


Gonorria ou blenorragia causada pela Neisseria gonorrhoeae. A Neisseria um
diplococo Gram negativo justaposto pela face plana ou cncava em forma de gro de caf
ou dois rins justapostos. Fica alojado dentro de neutrfilos em secreo (ela consegue
entrar no PMN graas protena Rmp).
de transmisso pela relao sexual. Acontece com maior freqncia nos
adolescentes e adultos jovens. A gonorria normalmente sintomtica em homens e
geralmente assintomtica em mulheres. As infeces do trato genital, anal, do reto e da
faringe atuam como fontes na propagao do gonococo. A manifestao na orofaringe
aparece em indivduos que praticam sexo oral sem preservativo.
Os recm nascidos podem ser contaminados durante o parto ao atravessarem o
canal vaginal, e apresentar infeco ocular gonoccica, chamada oftalmia do neonato.
145
Transmisso
No-sexual
a) Oftalmia neonatal
b) Vulvovaginite em
crianas



Gonococo
mucosas






Homens (uretrite)
a) Cistite
b) Pielite
c) Proctite
d) Orquite
e) Epididimite
Transmisso
Sexual


Mulheres (cervicite)
a) Salpingite: podendo
esterilizar
b) Metrite: podendo
disseminar, causando
peritonite ou proctite

Quadro clnico

As manifestaes ocorrem aps 2 a 5 dias do contgio. Nos homens aparece fluxo
mucoporulento uretral abundante. Nas mulheres somente 10 a 20% apresentam quadro
clnico agudo, podendo aparecer vulvovaginite com secreo purulenta e abundante.
Geralmente os casos so de endocervicite. Se a gonorria no for tratada nas 2 semanas
iniciais, haver propagao da infeco em 50% dos casos masculinos, para glndulas
anexas causando epididimite, orquite, e a mais freqente a prostatite. Em mulheres a
propagao resultar em metrite e salpingite.
Podem ocorrer manifestaes extragenitais como anorretite, artrite, meningite e
endocardite.
Fonte: Netter, 2006
146
Diagnstico laboratorial: Bacterioscopia e Cultura

Coleta do material

Em homens:
O melhor material a secreo uretral.
A coleta deve ser feita pela manh, antes da primeira mico:
1. Limpar a secreo externa com gaze estril embebida em salina.
2. Enxugar.
3. Introduzir um swab fino, 2 cm no canal uretral aps a fossa navicular e absorver a
secreo.
Observao: pode-se coletar outros materiais como: urina (1
o
jato miccional),
esperma e lquido prosttico.
Em mulheres:
Dar preferncia secreo do canal endocervical.
1. Aps introduzir o especulo, limpar com gaze estril a secreo da vagina e do
colo do tero.
2. Introduzir o swab no canal endocervical e absorver a secreo.
3. Retirar o swab com cuidado para no contaminar com bactrias da vagina.

Bacterioscopia pelo Gram

Tem valor diagnstico somente em uretrites gonoccicas masculinas e nas
vulvovaginites agudas. Em todos os outros casos necessrio fazer a cultura de bactrias.
Na bacterioscopia aparecero os gonococos na forma de diplococos Gram
negativos, intra e extracelulares.
Fonte: Tortora, 2005
147
Cultivo

O cultivo feito de preferncia no meio de cultura de Thayer-Martin Modificado
(TMM), que um gar chocolate acrescido de antibiticos: vancomicina, colistina, nistatina e
trimetoprim. Pode ser utilizado o gar chocolate tambm.

Tcnica (recomendada pelo Ministrio da Sade/PN-DST-AIDS) e seguida pelo Lacen:

1. Estriar o meio em forma de Z rolando o swab suavemente sobre a superfcie.
2. Com ala de platina fazer estrias em sentido transversal ao Z.
3. Colocar uma tampa para baixo em uma lata que possa ser fechada
hermeticamente (lata de biscoitos).
4. No fundo da lata colocar uma mexa de algodo embebido em gua para
preservar a umidade deste ambiente.
5. No fundo da lata ou sobre a placa, colocar uma vela e acend-la.
6. Fechar a tampa e segurar.
7. A vela apaga quando o O
2
fica exaurido, deixando uma atmosfera de
aproximadamente 5 a 10% de CO
2
, prpria para a proliferao do gonococo.
8. Incubar com a lata em estufa a 35
o
C durante 48h.
O TMM especfico para cultura de gonococo. Aps a incubao examinar as
colnias: gonococo cresce dando colnias brilhantes, mucides e acinzentadas de tamanho
varivel.
Fazer bacterioscopia pelo Gram: aps a cultura aparecero as formas de autlise: os
gonococos vo aparecer em formas atpicas como cocos intumescidos com fraco contorno e
palidamente coradas. A seguir realizar provas bioqumicas.


Liberao de Laudo

Negativo: no foram encontrados diplococos Gram negativos no exame
bacterioscpico. Cultura: no houve crescimento de Neisseria gonorrhoeae em meio de
Thayer-Martin aps 48h de incubao.
Positivo: presena de numerosos (ou vrios, ou alguns, ou raros) diplococos Gram
negativos intra e/ou extracelulares. Polimorfonucleares acima de 30 por campo; ou de 20 a
25 p/c; 5 a 10 p/c; abaixo de 5 p/c. Cultura: positiva para Neisseria gonorrhoeae.
148
URETRITES NO GONOCCICAS

As uretrites no gonoccicas so causadas por Chlamydia trachomatis, Gardnerella
vaginalis, Ureaplasma urealiticum, outras bactrias, protozorios e vrus.
No ser humano a uretrite por Chlamydia a infeco mais comum.

LGV (Linfogranuloma Venreo)

Agente etiolgico: Clamydia trachomatis

Ocorre mais em homens. Infeco sistmica acometendo tecido linftico. Primeiro
forma-se uma ulcerao local formada por uma ppula ulcerada no local da inoculao.
Pode haver febre, cefalia e mialgia. A Clamydia se oculta, mas forma infeces em
linfonodos inguinais, causando edema. A partir da circulao linftica, ela pode se
disseminar para outros rgos. Pode fazer hepatite, proctite (inflamao no nus),
pneumonite, meningoencafalite, etc. Por via inguinal pode causar uretrite, epididimite,
ccervicite (do crvix na mulher), bartolinite (uma inflamao nas glndulas de Barthollini, que
fazem lubrificao na vagina), salpingite (salpingite de tubas UTERINAS, no tubas
auditivas, salpingus vem de tuba) 15-20% dos pacientes que tem gonorria, tm a
Clamydia tambm. a maior causa de uretrite no gonocccica.

Lembrando que clamdias so intracelulares obrigatrias, portanto, temos que coletar
a clula, no s a secreo. Tanto que se acreditava que as clamdias eram, na verdade,
vrus. Para cultiv-las precisamos utilizar meios de cultura que tenham clulas eucariticas.
As leses iniciais so mais freqentes em sulco blano prepucial e face interna dos
pequenos lbios. Faz adenopatia inguinal unilateral. Abscessos (pontos de flutuao)
fistulizam e disseminam para o resto do organismo via linftica. H material purulento
espesso.

No confundir com Dovanose (granuloma inguinal) causada pelo Calymmatobacterium
granulomatis

149

Fonte: Netter, 2006 Fonte: Mims, 2005


H 3 fases:

Primria: Ppulas nos rgos genitais
Secundria: Manifestaes sistmicas
Terciria: Fibrose, drenagem linftica inapropriada.

Alguns pesquisadores (Belle Grayston, 1986) afirmam que no sexo masculino, a
uretrite por Chlamydia e 2,5 vezes mais freqente do que a uretrite gonoccica. Outros
dados mais recentes apresentam a Chlamydia como responsvel por 50% das uretrites.
Nos homens a uretrite por clamdia apresenta quadro clnico semelhante uretrite
gonoccica, embora a secreo uretral seja mais moderada ou escassa e menos purulenta,
sendo mais aquosa ou mucide.
O perodo de incubao de duas a trs semanas, enquanto o do gonococo de 2 a
7 dias.
As complicaes podem aparecer em tempo varivel, podendo ser graves. A mais
importante no homem quando acomete a prstata e s vezes as vesculas seminais,
levando infertilidade.
Nas mulheres pode infectar tero, trompa e ovrios.
As clamdias so organismos cocides, imveis, sendo parasitas intracelulares
obrigatrios. Duplicam-se no citoplasma das clulas do hospedeiro, formando incluses
caractersticas. Estas incluses podem ser observadas ao microscpio, utilizando colorao
de Giemsa ou usando anticorpos especficos conjugados com fluorescena.
Devido o seu parasitismo obrigatrio, no possvel cultiv-la em meios artificiais.
S se cultivam em sistemas vivos: saco vitelino de ovos embrionados, cultura de tecidos,
mas as mais usadas so as clulas Hela e clulas McCoy.
150
CANCRO MOLE (CANCRIDE)

Agente etiolgico: Haemophilus ducreyi
Meio de cultura: gar chocolate em microaerofilia, para a cultura feito o esfregao das
clulas e/ou aspirado de linfonodos (onde o Haemophilus pode se alojar).

Manifestam-se como lceras genitais DOLOROSAS. (o cancro da sfilis NO doloroso)

Fonte: Netter, 2006 Fonte: Google Imagens


VAGINOSE BACTERIANA

Esta doena, tambm conhecida como vaginite anaerbia, ainda no foi claramente
definida. A sintomatologia tpica queixa de mau odor, muitas vezes associado ao aumento
do fluido vaginal, freqentemente mais notado aps a menstruao ou coito.
s vezes a paciente pode se queixar de prurido vulvar ou erupo perivulvar. O pH
vaginal geralmente maior que 4,5. O principal agente etiolgico envolvido a Gardnerella
vaginalis. Uma das caractersticas marcantes da secreo de vaginose bacteriana
microscopia ptica a presena de clue cells (clulas epiteliais da vagina cobertas de
bactrias).
Clue-cells Fonte: Google Imagens
151
Exame laboratorial

A microscopia do exsudato vaginal pelo Gram, mostra clulas-chave (clulas
epiteliais cobertas por um grande nmero de cocobacilos Gram-variveis) com pequeno
nmero de leuccitos polimorfonucleares e nmero diminudo de lactobacilos.
A cultura no muito utilizada.

Patogenicidade

A patogenicidade da Gardnerella vaginalis ainda no foi estabelecida. considerada
por alguns pesquisadores como resultado do desequilbrio entre a microbiota vaginal
normal, com a relao sinrgica entre o nmero aumentado de Gardnerella e anaerbios.
O microrganismo raramente encontrado em homens.


CANDIDASE

A infeco por Candida albicans a infeco fngica mais comum na prtica genito-
urinria.
A candidase pode ser transmitida ou exacerbada pela relao sexual, mas a maioria
das infeces (particularmente em mulheres) resultam de auto-inoculao do reto.
Os sintomas podem ser causados por hipersensibilidade ou infeco. No primeiro
caso as manifestaes microbiolgicas so negativas.
Na prtica mdica a doena pode se manifestar com sintomas em apenas um dos
parceiros, mas essencial examinar e tratar o parceiro assintomtico para reduzir a chance
de reinfeco.
Mais detalhes: ver pginas 189 a 192.


Exame laboratorial

O exame laboratorial feito pela demonstrao do agente causador por microscopia
pelo Gram ou Preparao a Fresco.
A cultura pode ser feita no Meio de Sabouraud.
152
CAPTULO 12 CAPTULO 12 CAPTULO 12 CAPTULO 12: : : : MICOBACTERIOSES

Micobactrias so assim classificadas por terem sua parede celular diferente das
demais bactrias. So bacilos retos ou um pouco curvados, imveis e dispostos na forma de
paliada ou de globias. Sua classificao de bacilo pela forma e micobactria pela
bioqumica da parede. O micolato o principal componente da parede celular, a qual
denominada de "cerosa" pelo Robbins. Esse nion quem d a esses microrganismos a
caracterstica de Bacilos lcool-cido Resistentes (BAAR). Ou seja, no se coram
facilmente pelo Gram, uma vez que eles retm os corantes quando tratados com lcool e
cido, tornandos-os fracamente positivos neste mtodo.

Principais espcies de interesse mdico:
Mycobacterium tuberculosis e Mycobacterium leprae

Outras espcies: Mycobacterium bovis, Mycobacterium avium, etc.




TUBERCULOSE (TB)

A tuberculose uma doena extremamente contagiosa. Causa grande mortalidade
no mundo inteiro, como trs milhes por ano. Registram-se atualmente cerca de 5 milhes
de casos, sendo que este nmero tem crescido. A tuberculose um grave problema de
153
sade pblica, visto que cada tuberculoso pode disseminar o bacilo no convvio familiar e
social.
Apesar de se conhecer o agente causador, a maneira de transmisso e o tratamento
adequado, a tuberculose um problema preocupante.
A tuberculose humana causada tambm pelo Mycobacterium bovis e outras
espcies (ver tabela).

Espcies de micobactrias de maior significado clnico
Espcie Grupos de Runyon Significado clnico
M. ulcerans
M. tuberculosis
M. bovis
Sempre patognicas
M. marinum
M. kansasii
I (fotocromgenas) Geralmente patognicas
M. scrofulaceum
M. xenopi
II (escotocromgenas) Geralmente patognicas
M. avium
M. intracellulare
III (no-cromgenas) Geralmente patognicas
M. fortuitum
M. smegmatis
IV (rpidos crescedores) Geralmente no-patognicas

Transmisso: doena inflamatria infecciosa, de carter contagioso, que evolui por surtos,
sendo o acometimento pulmonar a maior causa de morbidade e mortalidade .
Contgio: aquisio de bacilos atravs do contato direto com os portadores da doena
(perdigotos), atravs do uso de utenslios contaminados (fmites), tambm atravs de
permanncia contnua e prolongada em meio ambiente contaminado. Aerossis
respiratrios so a principal forma de disseminao, pois ela uma bactria aerbia e tem
tropismo por alvolos. Desta forma, as pessoas cujo escarro possui BAARs visveis
microscopia so consideradas portadoras da micobactria.
Fatores predisponentes: doenas ou condies debilitantes. Essas pessoas so
enquadradas dentro de grupos de risco: marginalizados, txico-dependentes, idosos, HIV+,
transplantados, portadores de IRC, cncer, etilistas, diabticos, portadores de neoplasias,
grupos socialmente desfavorecidos, desnutridos e emigrantes. H a TB gastrointestinal
(Mycobacterium bovis), a aquisio do bacilo se faz pela ingesto de leite no-pasteurizado.
154
Fisiopatologia:

Inalao do BAAR via aerossis alvolo
Primeiras semanas: a infeco primria ocorre no pulmo (lembre-se de que o hospedeiro
ainda no tem resistncia).
As micobactrias so fagocitadas pelos macrfagos alveolares.

Fonte: Fernando Bortolozzi Fonte: Netter, 2005 (Fisiologia)
Macrfago alveolar
Dentro dos macrfagos, os BAAR tm dois destinos:
1) Serem mortos e eliminados.
2) Continuarem resistentes e fazerem lise dos macrfagos. Os macrfagos liberam
quimiocinas e fazem quimiotaxia de neutrfilos e moncitos circulantes (circulo vicioso).

O Mycobacterium tuberculosis possui uma cpsula de composio lipoprotica que
interfere na fuso deste microrganismo com os fagolisossomos dos macrfagos alveolares.
Isso possibilita a sobrevida dos BAAR no interior destas clulas, se no houver o correto
direcionamento da ao enzimtica dos macrfagos pelas linfocinas.

As quimiciocinas se ligam na -hlice dos receptores transmembrnicos dos
moncitos e neutrfilos. Isso ativa a cascata das integrinas e provocam alteraes no
citoesqueleto, promovendo a migrao destas clulas para os tecidos.
155
H Reao de Hipersensibilidade tipo IV (Tardia) macrfagos cercam o bacilo e
formam o ganuloma (um tipo de inflamao crnica). A Imunologia Mdica (BP336)
explicar os mecanismos imunolgicos da hipersensibilidade e a Patologia Mdica
Molecular (BP337) mostra os mecanismos deste tipo de inflamao crnica.

Tentemos entender: de um lado os macrfagos ativados esto tentando conter a infeco e
do outro eles provocam dano tecidual nos rgos infectados (liberam EROs).
EROs uma sigla que quer dizer espcies reativas de oxignio. So radicais livres.
Geralmente so produzidos dentro de fagcitos como neutrfilos e macrfagos. Essas
clulas os produzem no intuito de dar cabo das bactrias patognicas.

Nos pulmes, esse processo leva a cavitaes e a disseminao de bactrias.
Posteriormente h fibrose extensa e isso pode ser demonstrado em radiografias do trax.
(Aspecto radiogrfico tpico da tuberculose, o pulmo "em cavernas" na radiografia que ser
visto nas aulas de propedutica).
O Mycobacterium tuberculosis promove a formao de um granuloma "imunolgico"
(o termo imunolgico utilizado pela presena de linfcitos na leso). Clulas gigantes e
clulas epiteliides so os tipos celulares mais comuns encontrados nesses granulomas. As
mononucleadas, porm aumentadas so as epiteliides. Elas so derivadas de macrfagos
ativados pelas citocinas. Estas clulas secretam continuamente TNF, fazendo com que o
processo inflamatrio continue. As clulas polinucleadas so as clulas gigantes do tipo
Langerhans (originadas pela fuso de vrios macrfagos).

Clula gigante tpica de granulomas
Fonte: Junqueira, 2004 (Histologia Bsica)
156
O Granuloma


Granuloma um tipo de inflamao crnica, que tenta conter a propagao de algo
que o organismo no conseguiu dar cabo. Tambm o padro da resposta de
hiperssensibilidade tipo IV. Esse tipo de resposta imune ser abordado nas aulas de
Imunologia Mdica (BP336), bem como na aula terica da Microbiologia Mdica.


A Histologia de um Granuloma Tuberculoso

Uma rea central de necrose caseosa (ncleo semi-slido macio), circundada por
uma outra rea cheia de macrfagos, clulas epiteliides e clulas gigantes. Adjacente a
essa coroa existe uma bainha de linfcitos T e mais externamente uma deposio fibrosa,
com fibroblastos e formao de colgeno tipo I (est comeando a ser formada a trplice
hlice do pr-colgeno. Uma vez empacotado pelo complexo de Golgi, esse colgeno fica
mais denso e delimita os granulomas). Se a pessoa infectada for incapaz de produzir uma
resposta imunolgica adequada, o granuloma bem menos organizado e pode consistir
apenas em um agregado de macrfagos, sem arquitetura clssica das clulas gigantes. Ou
seja, a anatomia patolgica pode sugerir por si s um quadro de imunocomprometimento
(suspeitar de HIV e correlacionar sempre com a histria clnica do paciente).
Histologia do granuloma
157
Necrose caseosa: a rea central necrosada adquire um aspecto de queijo branco (do latim
caseum).
Necrose a morte celular forada, quando a clula atinge o ponto de no-retorno. Quando
uma clula no tem mais suprimento de O
2
, alimento, eletrlitos, substratos, etc. Isso ocorre
nas isquemias prolongas, por exemplo. Isquemia o bloqueio na conduo do sangue para
uma certa regio do corpo. Como no h suprimento sanguneo, tambm no haver mais
oxignio nem suprimento para as clulas.

Granulomas microscopia ptica (isso ser visto com detalhes na Anatomia Patolgica)
Fonte: Bogliolo, 2006 Fonte: Rubin, 2006



Complexo de Ghon

Complexo de Ghon um nome que damos a um quadro na TB. E isso explica o
porqu da imunidade na tuberculose do tipo celular. A prpria formao do granuloma
explica que a imunidade celular.
158
As clulas T sensibilizadas liberam linfocinas (linfocina uma citocina que recebe
esse nome porque veio do linfcito). Na verdade o prprio granuloma explica isso, uma vez
que o organismo no consegue dar conta de matar o BAAR.

Resumo:
Complexo de Ghon = granulomas no pulmo + linfonodos hilares e mediastnicos
comprometidos.


Complexo de Ghon

Formas clnicas:

Tuberculose Primria: Complexo de Ghon

Tuberculose Primria progressiva:
Uma pequena poro de microrganismos fica vivel por anos. A tuberculose
pulmonar primria progressiva uma evoluo alternativa menos comum, na qual a
resposta imunolgica no consegue controlar a multiplicao dos BAAR da tuberculose. A
infeco toma esse curso em menos de 10% dos adultos normais, mas comum nas
crianas com menos de 5 anos de idade e em pacientes com imunidade suprimida ou
prejudicada. O foco de Ghon no pulmo aumenta e pode mesmo erodir dentro da rvore
brnquica. Os linfonodos hilares e mediastnicos acometidos tambm aumentam, s vezes
comprimindo os brnquios a ponto de produzir atelectasias do pulmo distal; o colabamento
do lobo mdio ("sndrome do lobo mdio") uma conseqncia comum dessa compresso.
159
Em alguns casos, os linfonodos infectados erodem em uma via respiratria, disseminando
microrganismo pelos pulmes (pneumonia tuberculosa).


Tuberculose Secundria:
Esse estgio quando h reativao da TB pulmonar primria ou uma nova infeco
em hospedeiro previamente sensibilizado por TB primria. Ocorre uma resposta imune
celular aps um intervalo latente e essa resposta provoca a formao de muitos granulomas
e necrose tissular extensa. Os segmentos apical e posterior dos lobos superiores so mais
comumente acometidos. Desenvolve-se uma leso mal definida, fibrtica e difusa, que exibe
reas focais de necrose caseosa. a TB cavitria. A parede da cavidade feita de uma
membrana interna delgada, cinza, que compreende ncleos necrticos moles, uma zona
mdia de tecido de granulao e uma borda colagenosa. A luz preenchida de material
caseoso contendo BAAR. A cavidade tuberculosa em geral comunica-se livremente com um
brnquio, e a liberao do material infeccioso para as vias areas serve para disseminar a
infeco no pulmo. a reativao da regio de granulomas.

Disseminao bronquial

Tuberculose Miliar:
A infeco localiza-se em disseminadas regies produzindo leses nodulares
amarelas (granulomas tuberculosos), pequenas e mltiplas em vrios rgos. O termo miliar
usado porque tem aparncia amarela (como milho). Pulmes, linfonodos, rins, supra-
renais, fgado, bao e medula ssea so locais comuns de leses miliares. Resulta da
disseminao hematognica dos BAAR, em geral de TB pulmonar secundria, mas muitas
vezes de TB pulmonar primria ou de outros locais. A leso progressiva pode atingir as
meninges e provocar meningite tuberculosa.
160
Disseminao hematognica e TB miliar
Fonte: Rubin, 2006


161
Revisando:

Fonte: Robbins, 2005
A seqncia de eventos na tuberculose pulmonar primria, comeando com a inalao do M. tuberculosis e
culminando com o desenvolvimento da imunidade adaptativa celular. A Eventos que ocorremnas primeiras trs
semanas aps a exposio ao BAAR. B Eventos posteriores: o desenvolvimento da resistncia ao organismo
acompanhado pelo aparecimento de um teste tuberculnico (PPD) positivo.


Exame Fsico da TB Pulmonar

- Sibilos e Roncos
- Diminui murmrio vesicular
- Broncofonia (pelo derrame pleural)
- Sopro anfrico
- Hepatoesplenomegalia
- Hemoptise (presente em 50% dos casos)


Diagnstico Laboratorial

Material: de acordo com a localizao.
162
Pulmonar: 1 Escarro.
2 Contedo gstrico.
3 Lavado gstrico.
4 Lavado brnquico.
Renal: Urina.
Meningite: Lquido cefalorraquiano.
ssea / ganglionar: Puno.
Observao:
Descontaminar: escarro, urina, pus de abscessos fistulizados.
No precisa descontaminar: lquor, derrame peritoneal, derrame articular, lquido
pleural (colheita assptica, frasco estril).

Diagnstico Laboratorial
Direto (bacterioscopia) 1. Bacterioscopia: Ziehl-Neelsen, antes e
aps homogeneizao.
2. Cultura: Lewenstein-Jensen (30 dias).
3. Inoculao: cobaia, coelho.
Indireto 1. Sorolgico: hemaglutinao, fixao do
complemento.
2. Alrgico: intradermorreao com PPD
pela tcnica de Mantoux ou outras.

A localizao mais freqente a tuberculose pulmonar. O material a coletar o
escarro. Quando este resultar negativo, podem-se usar outros materiais conforme citado.

Coleta do material

1. Recolher o escarro em frasco limpo. Orientar o paciente que recolha material da
expectorao e no a saliva.
2. Levar ao laboratrio. No laboratrio o escarro ser submetido a uma
bacterioscopia pelo mtodo de Ziehl-Neelsen.



163
Tcnica

1. Depositar a parte do escarro de preferncia mais purulenta ou sanguinolenta e
distribuir uniformemente.
2. Secar.
3. Fixar na chama.
4. Corar pelo mtodo de Ziehl-Neelsen. Em caso positivo, aparecero os BAAR em
vermelho em maior ou menor quantidade.


BACILOSCOPIA DO ESCARRO

A colocarao de rotina o Ziehl Neelsen. microscopia pica, apresentam-se
como bacilos retos ou ligeiramente curvados, isolados ou dispostos em grupos irregulares
ou paliada. Paliada uma disposio como se fosse um muro.


Paliadas do Mycobacterium tuberculosis observadas ao MO.


Resultado Quantitativo

No escarro necessrio usar a contagem de maneira sistemtica anotando-se o
nmero de campos examinados e a quantidade de bactrias. Considerado como exame
bsico obrigatrio em todos os laboratrios de anlises clnicas, que fazem rotina
bacteriolgica para diagnstico e controle de tratamento. As lminas, mais de uma, devem
ser examinadas exaustivamente; em caso de no aparecer os BAAR, examinar no mnimo
400 campos microscpicos em cada lmina (segundo a recomendao do Instituto Pasteur,
referncia internacional em tuberculose).
Fonte: Robbins 2005
164
Segundo a OMS, temos os resultados da seguinte maneira:

- Nenhum BAAR em 100 campos examinados.
+ Menos de 1 BAAR por campo, em 100 campos examinados.
++ De 1 a 10 BAAR por campo, em 50 campos examinados.
+++ Mais de 10 BAAR por campo, em 20 campos examinados.

Com o resultado quantitativo, o clnico pode avaliar se o tratamento foi adequado.
Um bom critrio averiguar se a carga bacilar do paciente est diminuindo. Em alguns
casos h necessidade de mudar o esquema teraputico.
Quando o resultado direto do escarro der negativo, pode se recorrer chamada
homogeneizao. Existem diversos materiais usados para esta finalidade, como: tratar com
KOH ou cidos diludos ou trifosfato de sdio, uns mais agressivos, outros menos. Estes
produtos vo fluidificar o escarro dissolvendo a mucosidade. Centrifugado em seguida,
concentra as bactrias antes presas na viscosidade do muco. Ao mesmo tempo serve para
descontaminar o escarro, rico em microbiota contaminante. Do sedimento faz-se nova
bacterioscopia pelo Ziehl-Neelsen, em caso negativo, utilizar o restante do sedimento para
cultura. Persistindo suspeita clnica, solicitar novas amostras de escarro.

Cultivo

O cultivo feito em meios especiais como o de Lewenstein-Jensen enriquecido com
lipdeos. Fechar o tubo com parafina para evitar a ressecao do meio que vai ficar
incubado a 37
o
C de 30 a 60 dias.
O bacilo da tuberculose de crescimento lento; o tempo de gerao de mais ou
menos 20h.
O clnico pode requisitar o antibiograma caso haja resistncia do bacilo aos
medicamentos prescritos.

Meio de cultura: Lowenstein-Jensen
Fonte: Prof Alessandra Daur
165
O meio Bactec consegue promover crescimento do bacilo da tuberculose dentro de
15 dias e pode ser uma revoluo no cultivo desta espcie para diagnstico. Isso ser
discutido na disciplina clnica de Pneumologia.

4) Teste PPD cutneo
Para identificar M. tuberculosis quando a bacterioscopia deu negativa.
TA (tuberculina antiga) reao cutnea em TB

CORRELAES CLNICAS:

DIFERENCIAR HIPERSENSIBILIDADE TUBERCULNICA DE HIPERSENSIBILIDADE
GRANULOMATOSA (BP336). Ser que o indivduo j no foi vacinado com a BCG?
O PPD mais serve para ver como est a imunidade do paciente frente ao bacilo do
que como um mtodo de diagnstico propriamente dito.
bom lembrar que ele s dar positivo num perodo de 3 (s vezes at 6) semanas
semanas aps a infeco do bacilo. feito uma inoculao do Mycobacterium bovis
atenuado na pele, e aguarda-se 48-72h para ver se tem endurecimento local e eritema.


Tratamento da Tuberculose: terapia RIP
Rifampicina
Isoniazida
Pirazinamida Fonte: Robbins, 2005

166
HANSENASE (Mal de Hansen)

uma doena crnica conhecida desde a mais remota antiguidade. Estudada
exaustivamente durante muito tempo, ainda assim pouco se sabe sobre o perodo de
incubao e maneira de transmisso.
O bacilo causador, Mycobacterium leprae, no cultivvel em meios bacteriolgicos
ou culturas celulares. Ele um agente monoxeno. Outros mamferos tm o BAAR, mas no
o manifestam.
Em patogenicidade experimental em homens, as tentativas resultaram infrutferas.
Em animais de laboratrio, h descries de multiplicao do bacilo de Hansen em
camundongos, tatus e primatas.

Transmisso: aglomeraes excessivas e falta de higiene. Contato direto e inoculao de
aerossis. A exposio prolongada a uma fonte infectada necessria para ocorrer
transmisso. Acredita-se que para contrair a doena tenha que se ter uma predisposio
gentica.

As caractersticas clnicas da hansenase dependem de resposta celular.

O Mycobacterium leprae cresce dentro de outras clulas

Especialmente histicitos (histicitos so aqueles macrfagos no ativados que
residem no tecido conjuntivo e ficam esperando algo para algum dia fagocitar, bem como os
macrfagos no ativados da pele chamam-se clulas de Langerhans, os do SNC de
micrglia, os do fgado de clulas de Kupffer, os do tecido conjuntivo normal chamam-se
histicitos.

H dois tipos de Hansenase. Na verdade o agente etiolgico sempre o mesmo, o
Mycobacterium leprae. Mas h dois tipos de manisfestaes clnicas, e sim, so detectveis
clinicamente.

Hansenase tuberculide (TT): leses eritematosas com reas anestesiadas na face,
tronco e extremidades.. Espessamento palpvel dos nervos perifricos (o BAAR se
multiplica nas bainhas dos nervos perifricos) O indivduo tem resposta alrgica exagerada
167
e tem maior predisposio a outras infeces bacterianas. H intensa resposta da
imunidade celular. H formao de granulomas na derme, por isso, tuberculide.

Fonte: Mims, 2005

Hansenase lepromatosa (LL): Tem envolvimente extenso da pele. H perda parcial das
sobrancelhas (um sinal clnico importantssimo e PATOGNOMNICO da hansenase,
chama-se MADAROSE), espessamento e dilatao das narinas, orelhas e bochechas,
resultando na aparncia tpica leonina. H destruio do septo nasal e a parede nasal fica
rica em bactrias. Nessa fase, a resposta imune celular fraca. No exame, os BAAR
tornam-se extracelulares e agrupam-se em globias.

Com o tempo, pode haver destruio intensa das estruturas faciais, nervos
perifricos, o que, pela conseqente falta de sensibilidade, leva a traumatismos repetitivos
em mos e ps, com conseqente infeco bacteriana secundria. SECREES
(PRINCIPALMENTE NASAIS) DE PACIECTES COM HANSENASE LEPROMATOSA SO
INFECTANTES (H GLOBIAS).



Fonte: Prof Alessandra Daur Fonte: Anatomia Patolgica do HC

168
Diagnstico Laboratorial

Mycobacterium leprae no cresce em nenhum meio de cultura.
Cresce em temperaturas menores do que 37C, por isso sua preferncia por habitar a
pele e a linfa (tecidos perifricos que tm temperaturas mais baixas).
O crescimento lento, pode levar at anos para que ocorram as manifestaes clnicas.

O diagnstico laboratorial feito praticamente pela bacterioscopia, por Ziehl-Neelsen
em material coletado das leses ou da serosidade da pele; eventualmente podero ser
usadas provas sorolgicas.


Tcnica de Wade (para coleta de linfa cutnea)

Local da coleta:
a) 2 lbulos da orelha;
b) 2 cotovelos.
1. Fazer assepsia do local com lcool iodado. Fazer isquemia com auxlio de pina
ou dedos para evitar o fluxo de sangue.
2. Com o bisturi, fazer cortes na pele, de aproximadamente de 5 mm de
comprimento e 2 mm de profundidade e recolher a serosidade (linfa) sobre uma
lmina nova. A linfa ser coletada dos quatro locais uma ao lado da outra sobre a
mesma lmina.
3. Identificar os esfregaos e a lmina.
4. Secar os esfregaos ao ar.
5. Fixar na chama.


LD LE CD CE







6. Corar pelo mtodo de Ziehl-Neelsen.
Leitura: os bacilos aparecero em vermelho, isolados e formando grupamentos
chamados globias, que so caractersticas do Mycobacterium leprae.
169
microscopia so vistos BAAR em forma de globias.

Fonte: Prof Alessandra Daur
Fernando Bortolozzi

Fonte: Tortora, 2005



Histologia dos Tipos Clnicos de Hansenase

Fonte: Rubin, 2006


170
CAPTULO 13: CAPTULO 13: CAPTULO 13: CAPTULO 13: LEPTOSPIROSE


AGENTES ETIOLGICOS

O gnero Leptospira, em meio ao mundo contemporneo das tcnicas de Biologia
Molecular, j foi classificado em 18 genomoespcies (s distinguidas por PCR).
Classicamente, esse gnero possua apenas duas espcies: a L. interrogans e a L. biflexa,
distinguidas fenotipicamente. A espcie patognica era a Leptospira interrogans e a
saprfita, a Leptospira biflexa. No entanto alguns conceitos esto mudando.
As duas espcies juntas apresentam aproximadamente 260 sorovares (cepas
aglutinao com soro anti-sorovares conhecidos). E estas cepas podem ser classificadas
por biologia molecular (gentipo) e por sorologia (fentipo). Sorologicamente, estes
sorovares se agrupam em aproximadamente 27 sorogrupos (24 sorogrupos patognicos e 3
sorogrupos saprfitas). Sorogrupos relacionam a relao antignica entre os sorovares. A
Biologia Molecular classifica o gnero Leptospira em 16 a 18 espcies genmicas (no s
as duas espcies clssicas da imunologia), h uma classificao mais detalhada). Destas 18
genomoespcies, dez so constitudas por sorovares patognicos, seis com sorovares
saprofitas e duas com sorovares patognicos e saprfitas.


Fonte: Google Imagens
171


No entanto, de uma maneira geral, os microbiologistas ainda denominam a
Leptospira interrogans como agente etiolgico da leptospirose, uma vez que as tcnicas de
PCR ainda so relativamente novas.

Os microrganismos do gnero Leptospira so espiroquetas finas e mveis, muito
espiraladas, com 5-20 m de comprimento. Apresentam um movimento rotacional ativo e
possuem dois flagelos internos (periplasmticos), que se originam em cada extremidade da
bactria (isto permite que ela escave tecidos do hospedeito). So aerbios obrigatrios e
necessitam de cidos graxos de cadeia longa para sua nutrio. Eles no se coram
adequadamente pelos corantes de rotina e necessitam de microscopia de campo escuro, ou
impregnao pela prata (Fontana Trebondeau), para sua visualizao ao MO.
As extremidades da Leptospira interrogans curvam-se no formato de um "ponto de
interrogao", por isso seu nome.


Classificao Molecular:
18 espcies genmicas
10 com sorovares patognicos
06 com sorovares saprfitas
02 com patognicos e saprfitas
Classificao Sorolgica:
24 sorogrupos patognicos
03 sorogrupos saprfitas
(+ de 260 sorovares)
172
Estas bactrias necessitam de condies e meios especiais (meio Fletcher) para que
haja crescimento, podendo ser necessrias vrias semanas para que a cultura se torne
positiva (o perodo de multiplicao de aproximadamente 12 horas).
As espiroquetas morrem com exposio ao ressecamento, ao calor ou a detergentes
e desinfetantes, mas permanecem viveis por vrias semanas na gua alcalina e no solo
mido. Os meios de cultura utilizados so os meios de Fletcher.


EPIDEMIOLOGIA

A leptospirose uma (antropo)zoonose importante, de distribuio mundial.
tambm uma doena infecciosa emergente que ocorre em surtos. A notificao ao Ministrio
da Sade compulsria, no entanto, ela est entre as doenas comuns e disseminadas
mais mal diagnosticadas que existem.
O microrganismo acomete cerca de 160 espcies de mamferos. Os roedores, em
particular os ratos, so os reservatrios naturais mais importantes. Outros animais
silvestres, pecurios e domsticos tambm fazem parte dessa lista. A relao harmnica
do tipo mutualismo, a Leptospira sobrevive por anos nos tbulos contorcidos proximais
destes animais. No entanto, estes mamferos desenvolvem infeco renal crnica
assintomtica (e no tem grande nmero de bactrias na urina).

173
A Leptospira um ser euribionte, encontrado em todos os estados do Brasil, assim
como na sia, Amrica Central, no restante da Amrica do Sul e nos EUA.
Em 2006 no Brasil houve 4308 casos reportados (272 no Paran), dos quais 401
foram a bito (taxa de mortalidade de 0,093).


TRANSMISSO

importante lembrar que cada sorovar tem ser mamfero hospedeiro prprio, ou
seja, o homem um hospedeiro acidental. Exemplos so os sorovares
icterohaemorrhagiae/copenhageni de ratos, grippotyphosa de ratazanas, hardjo de bovinos,
canicola de ces, pomona de porcos, etc.
Os humanos so infectados pela ingesto ou exposio gua ou alimentos
contaminados. As bactrias, auxiliadas por sua motilidade, penetram atravs de abrases
da pele ou mucosas ntegras, de modo que a infeco pode ser adquirida quando o
indivduo nada, trabalha ou brinca em gua contaminada. Portanto, mineradores,
fazendeiros, etc., apresentam risco elevado de contaminao (isso tambm explica o porqu
da maior prevalncia do sexo masculino, 87% do total de casos). Ou seja, ela pode,
inclusive, ser considerada uma doena ocupacional, uma vez que a contaminao est
ligada ao trabalho do paciente. Certos grupos ocupacionais correm risco particularmente
elevado; nesses grupos esto includos veterinrios, agricultores, trabalhadores com gua
de esgoto, empregados de abatedouros e trabalhadores da indstria pesqueira. Esses
indivduos podem adquirir leptospirose por exposio direta ou contato com gua e solo
contaminados.
A contaminao pode suceder o contato direto com urina, sangue ou tecidos de um
animal infectado, ou aps a exposio a um ambiente contaminado. A Leptospira
excretada na urina humana, mas a transmisso interpessoal rara. No entanto, a bactria
sobrevive por meses em gua doce, sendo esta um importante veculo de transmisso.
As epidemias de leptospirose podem resultar da exposio prolongada a guas de
enchentes contaminadas pela urina de animais, principalmente em grandes centros urbanos
onde h esgoto a cu aberto, grande nmero de bueiros e outros habitats de roedores.
No globo, a regio em que mais ocorre leptospirose entre os trpicos, prximo ao
Equador. O clima e as precrias condies de higiene favorecem a sobrevida do patgeno.
Em muitos pases em desenvolvimento, a leptospirose ainda representa um problema
174
subestimado. Dados confiveis da morbidade e da mortalidade da leptospirose comearam
gradualmente a aparecer.
A leptospirose tambm foi reconhecida em cidades do interior semi-abandonadas,
onde a populao de ratos est se expandindo.
Alm disso, pessoas que praticam natao em rios, canoagem, windsurf, esqui
aqutico, etc. Microgotculas de gua que contenham a bactria podem ser ingeridas ou a
bactria entrar por escoriaes da pele.
A leptospirose tambm pode ser enquadrada entre as "doenas do viajante",
principalmente quando o destino so os pases tropicais. A maioria dos casos ocorre
durante o vero e outono nos pases ocidentais e durante a estao chuvosa nos trpicos.
Em resumo, a leptospirose uma patologia intimamente associada a condies
scio-econmicas, de imensa importncia em sade pblica, pois est associada com
higiene, maus hbitos de vida, etc.


FATORES DE PATOGENICIDADE

A Leptospira penetra em pele com abrases e nas membranas mucosas integras
(principalmente conjuntiva e revestimentos da orofaringe e nasofaringe), uma vez que essa
bactria possui dois flagelos periplasmticos em suas extremindades, que facilitam a sua
introduo no hospedeiro (movimento "saca-rolha"). Ela ento se dissemina atravs da
corrente sangnea (leptospiremia) e disseminao para todos os rgos. A multiplicao
ocorre no sangue e nos tecidos e a bactria pode ser isolada no sangue e no LCR nos
primeiros 4-10 dias da doena.
Alm disso, esse microrganismo secreta hialuronidade, uma enzima que destri as
molculas de cido hialurnico e outras glicosaminoglicanas da matriz intersticial do tecido
conjuntivo da derme e de submucosas, facilitando a introduo do patgeno. Enzimas
lipolticas tambm fazem parte do arsenal de patogenicidade da Leptospira, destruindo
cidos graxos insaturados da epiderme.






175
FISIOPATOLOGIA

O mecanismo ainda no est totalmente elucidado. A bactria pode penetrar por
pele, mucosas, penetrao em boca, faringe e esfago durante a ingesto de gua, etc.
importante salientar que quem causa o efeito patolgico so os anticorpos e a
reao inflamatria, e no o microrganismo em si. Isso pode explicar porque algumas cepas
no so patognicas. O sorovar patognico libera o antgeno de membrana na circulao
desencadeando a reao inflamatria. As cepas saprfitas permanecem com os antgenos
ligados parede celular bacteriana.

As leses causadas pela Leptospira so causadas em virtude de seus efeitos diretos,
como motilidade, quimiotaxia e patogenicidade, mas principalmente da resposta imune do
hospedeiro. Cepas virulentas exibem quimiotaxia, o que facilita a mobilidade e produz vrias
enzimas citotxicas.
A lipoprotena LipL32, por exemplo, causa hemlise, aumenta a expresso de
quimiocinas e do fator NFkB. A protena de membrana OmpL1 e a esfingomielinase H so
citotxicas, produzindo poros nas membranas celulares. Glicoprotenas, a protena LigA
(immunoglobulin-like) e as protenas fibronectiba-ligantes auxiliam a invaso dos tecidos
176
pela bactria, por facilitarem sua adeso com a pele e mucosas, ou dos neutrfilos com o
endotlio.
O papel da resposta imune do hospedeiro durante a infeco ainda obscuro. Alm
de ser responsvel pela imunidade, essa resposta est envolvida na formao da uvete e
talvez das leses pulmonares. A resposta humoral , sem dvidas, uma grande vil nesse
quadro patolgico. No entanto, grandes bacteremias podem ocorrem mesmo quando haja
um grande ttulo de anticorpos circulantes.
A reao imunolgica acaba por ocasionar uma reao de hipersensibilidade tipo III,
gerando complexos imunes. Esses complexos so responsveis pela leso endotelial e
consequentemente pela hemorragia. A vasculite responsvel pelas manifestaes mais
importantes da doena. Os rgos alvos preferenciais da leptospirose so os rins, o fgado e
os pulmes.


SINTOMATOLOGIA

importante procurar obter uma histria de exposio a materiais contaminados.
Obtm-se avidncias sorolgicas de infeco inaparente pregressa em 15-40% dos
indivduos expostos, mas que no adoeceram. Ou seja, so assintomticos.
Nos casos de quem apresenta sintomatologia, esta pode se apresentar de maneira
leve (mais de 90% dos casos), s vezes grave e fatal em alguns casos (menos que 1%). A
sintomatologia no est relacionada ao sorogrupo que o paciente esteja portando.
O perodo de incubao varia de 2 a 20 dias, sendo a mais comum entre o 7 e o 14
dia ps-exposio. Tipicamente, a fase leptospirmica aguda seguida de uma fase
leptospirrica imune. A distino entre a primeira e a segunda fase nem sempre clara, e os
casos mais leves nem sempre incluem a segunda fase. Por esses achados, classificamos a
leptospirose como uma doena bifsica.
Na fase anictrica, a leptospirose pode se apresentar semelhantemente a uma gripe,
com febre, calafrios, cefalia intensa, nuseas, vmitos e mialgia. A miagia afeta
principalmente as panturrilhas, o dorso e o abdome. Em alguns casos pode haver irritao
da garganta, exantema, comprometimento pulmonar com tosse, dor torcica e hemoptise. O
achado clnico mais comum nessa fase a febre junto sufuso conjuntival.
A maioria dos pacientes se torna assintomtica em aproximadamente uma semana.
O incio da segunda fase, a imune, coincide com o surgimento dos anticorpos na circulao
sangnea. Nessa fase, as mialgias e a febre tm intensidade menor. Pode ocorrer
177
meningite assptica nessa fase, principalmente em crianas. Embora no mais que 15% dos
pacientes exibam sinais e sintomas de meningite, muitos exibem pleocitose no LCR, o qual
desaparece aps duas semanas. Irite, iridociclite e coriorretinite so complicaes tardias
que podem ocorrer e persistir por vrios anos. Em alguns casos, podem ser perceptveis j
na terceira semana da doena.
A Sndrome de Weil a forma mais grave da leptospirose, sendo caracterizada por
ictercia, disfuno renal, ditese hemorrgica e taxa de letalidade de 5 a 15%. O incio da
doena semelhante ao da leptospirose de grau leve, no entanto, aps 4 a 9 dias, a
ictercia surge junto vasculite a disfuno renal. A pele fica com uma tonalidade laranja e
nesse estgio geralmente ocorre necrose heptica com hepatomegalia perceptvel
palpao profunda do hipocndrio esquerdo. No rim, a hipovolemia e a diminuio da
perfuso renal contribuem para o desenvolvimento de necrose tubular aguda, com oligria
ou anria. s vezes a dilise se faz necessria.
Com freqncia ocorre comprometimento pulmonar, com achados clnicos j
relatados anteriormente. Observam-se manifestaes hemorrgicas na sndrome de Weil:
epistaxe, petquias, prpuras e equimoses.
Durante a leptospirose grave, descreveram-se rabdomilise, hemlise (pela
lipoprotena LipL32), miocardite, pericardite, insuficincia cardaca congestiva, choque
cardiognico, sndrome da agstia respiratria do adulto, pancreatite necrosante e falncia
de mltiplos rgos.


TRATAMENTO

A terapia antimicrobiana indicada para as formas mais graves da doena. Na forma
leve a teraputica ainda discutida. O tratamento pode, inclusive, ser iniciado aps os
primeiros quatro dias da doena. Ainda h uma boa resposta dos indivduos tratados com
beta lactmicos. Na forma leve, os antibiticos de escolha so a doxicilina e a ampicilina.
Nos casos de leptospirose moderada a grave, usa-se amoxicilina via oral ou penicilina G
intramuscular. No necessrio introduzir antibitico associado aos bloqueadores de beta
lactamases, uma vez que a Leptospira interrogans no tem potencial para produo desta
enzima.



178
CAPTULO 14 CAPTULO 14 CAPTULO 14 CAPTULO 14: :: : OS FUNGOS E AS MICOSES



CARACTERSTICAS GERAIS

So seres eucariontes, uni ou pluricelulares (99% so pluri)
SEM CLOROFILA e HETERTROFOS
FUNGOS NO FORMAM TECIDOS VERDADEIROS (no mximo formam hifas)
Aproximam-se muito mais do Reino Animmalia do que do Reino Plantae:
Armazenam GLICOGNIO
Parede celular de QUITINA
A digesto pode ser extracorprea, por meio de enzimas no substrado.
Seres UBIQUITRIOS: vivem em qualquer lugar que tenha matria orgnica em
decomposio (ex: tecidos necrosados). Podem ser aerbios e anaerbios.
Exemplos: Mofos, bolores, fermentos, levedos, leveduras, cogumentos, etc.


MODOS DE VIDA

Saprbios: obtem seus alimentos decompondo organismos mortos. Vivem sobre a matria
orgnica.
Mutualistas: sem grande importncia mdica. So os liquens (cianobactria + fungo) e
micorrizas (fungo + raiz de fanergama).
Predadores: capturam pequenos animais.
Parasitas: obtm alimentos de organismos vivos.
Ex: Candida albicans, Trycophyton sp.


TIPOS BSICOS DE FUNGOS

1. BOLORES
- Macroscopicamente aspecto pulvurulento, cotonoso (de cotton, algodo em ingls),
plumoso. ASPECTO SECO
Exemplos: Penicillium sp., Aspergillus sp.
179
Fonte: Koneman, 2001


2. LEVEDURAS Formato esfrico, oval, tem parede dupla ao MO.
Aspecto macroscpico cremoso, pastoso, gelatinoso. ASPECTO MIDO
Exemplos: Cryptococcus neoformans, Candida albicans.

Fonte: Koneman, 2001 Fonte: Mims, 2005

3. DIMRFICOS podem ser bolores e leveduras, depende da condio do ambiente
(umidade, temperatura). Causam doenas endmicas e so potentes patgenos em
indivduos imunocomprometidos (principalmente doenas pulmonares).
Ex: Histoplasma capsulatum, Paracocciodioides brasiliensis

Histoplasma capsulatum Fonte: Google Imagens
180
Fonte: Mims, 2005

HIFAS: Nos bolores, encontramos um corpo formado por HIFAS (filamentos
multinucleados), no por tecidos. As hifas so pequenos filamentos secos que
correspondem ao corpo do fungo, denominado MICLIO. Miclio o coletivo de hifas.


Fonte: Material didtico do Grupo Positivo
181
H dois tipos de miclio: o vegetativo (hifas que adentram nos tecidos ou substrato
em busca de alimento) e o reprodutivo, em que as hifas tm a funo de propagao e do
origem aos esporos. O reprodutivo chama-se de corpo de frutificao e geralmente so os
que ficam pra fora da pele nas leses cutneas.
Fonte: Grupo Positivo

REPRODUO DOS FUNGOS

A reproduo pode ser assexuada, por brotamento, como nas formas unicelulares
(Candida albicans e Paracocciodioides brasiliensis quando se apresenta como levedura) ou
por fragmentao do miclio nas pluricelulares (Aspergillus sp.). A reproduo sexuada
envolve a unio de hifas gamticas com a formao do zigoto.
O principal meio de reproduo a formao de ESPOROS. Podem ser mveis
(zosporos) ou imveis (aplansporos) que so transportados pelo vento (fungos do ar). As
estruturas que produzem os esporos so denominadas esporngios.
Fonte: Grupo Positivo

CONDIO = reproduo por brotamento
ESPORO = reproduo sexuada
182
CLASSIFICAO DOS FUNGOS

1) Mixomicetos: Fungos gelatinosos que habitam ambiente mido e sombrio. Em
certas fases da vida se assemelham aos protozorios (emitem pseudpodos). Pode
ser formado por clulas uninucleadas ou se assemelhar a um plasmdio
(polinucleado). No possui parede celular, apenas uma membrana flexvel. Deslizam
sobre o solo e englobam partculas orgnicas, alm de bactrias e outros fungos.
Fonte: Corel Shock Photos


2) Eumicetos: "fungos verdadeiros". Divididos em grupos:

a) Zigomicetos ou ficomicetos: Fungos primitivos constitudos por hifas no septadas.
Reproduzem-se por alternncia de geraes Geralmente so decompositores, no
entanto algumas espcies podem parasitar plantas e animais.
Ex: bolor preto do po (Mucor sp.)

b) Oomicetos: Engloba fungos unicelulares at miclios filamentosos. Podem se
alimentar de matria orgnica em decomposio (Saprolegnia sp.). Alguns so
parasitas de vegetais (Phytophthora infestans, que causa ferrugem ou requeima no
tubrculo de batata). Reproduzem-se assexuadamente por zosporos flagelados e
sexuadamente por gametas distintos. Podem ser formar em garrafas plsticas de
gua mineral quando o recipiente for reutilizado diversas vezes. Prximo ao gargalo
e tampa podem se formar colnias pretas de oomicetos.

c) Ascomicetos: constitudos por hifas septadas. Seus esporos chamam-se
ascsporos e so produzidos por esporngios em forma de um pequeno saco,
denominados ascos. Nos unicelulares, a reproduo pode ocorrer por brotamento.
Ex: levdos, Penicillium sp., Aspergillus sp., Saccaromyces cervisiae (fermento da
cerveja, do vinho e do po), Claviceps purpurea (Esporo do centeio, de onde vem a
ergotamina). Os ascomicetos tambm so os fungos que se cultivam no interior dos
183
guarda-roupas, principalmente no vesturio de inverno, causando o odor forte tpico,
que em muitos casos pode desencadear asma alrgica por reao de
hiperssensibilidade tipo I (anafiltica).
Fonte: Fernando Bortolozzi
Aspergillus sp. Penicillium sp.

d) Basidiomicetos: So os fungos mais conhecidos (cogumelos) e os mais evoludos.
So pluricelulares e constitudos por hifas septadas. Formam esporos
(basidisporos) que se fixam externamente em estruturas chamadas basdios. O
corpo de frutificao chama-se basidiocarpo (chapu). Podem ser encontrados em
tronco de rvores, solos midos, plantas e em matria orgnica. Alguns so
parasitas de vegetais. Exemplos: cogumelos e orelhas de pau, Agaricus campestris
(champignon), Amanita muscarina.
Fonte: Google Imagens

e) Deuteromicetos: os fungos de maior importncia MDICA. Os chamados fungos
"imperfeitos", no apresentam fase sexuada no ciclo reprodutivo. A maioria
patognica ao ser humano. Ex: maioria das micoses, Candida albicans,
Cryptococcus neoformans, Trycophyton sp. (que causa as frieiras).
Fotos na seo de micoses.

O maior organismo do planeta um fungo! Pertence ao gnero Armillariella e
encontrado nos EUA, cobrindo uma rea de 1,5 x 10
5
m
2
.
184
CORRELAES CLNICAS:

Ergotamina um alcalide. Alcalides so uma classe de medicamentos, utilizados
nas crises agudas de enxaquecas, por inativar os receptores de dopamina. So
agonistas -adrenrgicos nos vasos sangneos, que fazem vasocontrio. No entanto,
em outros locais a ergotamina um antagonista parcial de serotonina a 5-hidroxi-
triptamina (5-HT). A ergotamina a matria prima do LSD.

O Claviceps purpurea infecta plantaes de cereais e pode ser responsvel por casos
ocasionais de envenenamento em seres humanos que consumiram aquele cereal. Essa
espcie tambm produz outros alcalides como a ergometrina, que utilizada para
evitar hemorragia ps-parto; a metisergida, que trata a sndrome carcinide; e a
bromocriptina, que utilizada no Parkinson e em distrbios endcrinos.

Fungos que produzem drogas alucingenas (possuem muitos alcalides): Amanita
muscarina (age nos receptores muscarnicos), Conocybe sp. e Psilocybe sp. Podem
gerar micotoxicose em humanos.





FUNGOS E MEDICINA


Aproximadamente 10
6
espcies patognicas.

Os fungos patognicos podem ser classificados com base nas suas formas de
crescimento ou no tipo de infeco que causam.

Micotoxicose: NO sinnimo de micose. Micose infeco por fungo; micotoxicose
ingesto e/ou inalao de fungo que produz produtos txicos ao organismo humano (ex:
alcalides), gerando um quadro de intoxicao por substncias orgnicas.

Doenas de Hipersensibilidade: Respostas alrgicas que certas pessoas tm quando
vestem um casaco que estava h muito tempo guardado no armrio (ascomicetos), por
exemplo. Neste caso, o fungo no se desenvolve nos tecidos. As manifestaes patolgicas
ocorrem em virtude da produo de imunoglobulinas pelos linfcitos B sensibilizados. Essas
reaes alrgicas por esporos fngicos (os imungenos em questo) se enquadram nas
185
reaes de hipersensibilidade tipo I (anafilaxia), vistas na disciplina Imunologia Mdica
(BP336).
Exemplos de anafilaxia por fungos: renite alrgica, asma brnquica, alveolite, etc.


Tipos de Micoses


1) SUPERFICIAIS: Colonizam as camadas mais superficias da pele (crnea e lcida),
incluindo os plos. Provocam alteraes de importncia esttica.

a) Ptirase Versicolor: Seu agente etiolgico a Malassezia furfur. Caracteriza-se por
leses acrmicas ou hiperpigmentadas, de bordos delimitados, localizadas no couro
cabeludo, trax, abdome, pescoo e face, principalmente. O tratamento pode ser feito com
sulfeto de selnio.

b) Tinha Nigra: O agente etiolgico a Exophiala werneckii, um fungo dimrfico que
produz melanina, conferindo uma colorao marrom leso. normalmente assintomtica,
e as manifestaes clnicas, quando existem, consistem em leses maculares bem
demarcadas (manchas pigmentadas na pele), que so elevadas acima da superfcie. As
leses so observadas com maior freqncia em palmas das mos e plantas dos ps.

c) Piedra: H dois tipos de Piedra a Piedra Branca e a Piedra Negra.
A Piedra Negra uma infeco nodular dos fios de cabelo causada pela Piedraia hortae.
A Piedra Branca decorrente da infeco por Trichosporon beigelii, manifesta-se na forma
de ndulos amarelados, maiores e de consistncia mais mole nos plos (axilares, pbicos,
barba e cabelos). O tratamento consiste na remoo dos plos e aplicao de antifngicos
tpicos. Muitas vezes estas duas doenas esto associadas falta de higiene do paciente.


2) CUTNEAS: Localizam-se mais profundamente na epiderme (camada granulosa e
basal), incluindo doenas invasivas de plos e unhas. So as DERMATOMICOSES, por
isso, os fungos etiolgicos so denominados DERMATFITOS (que vivem s custas da
queratina da pele e das unhas) e por espcies do gnero Candida.

186
Dermatfitos: Pertencem principalmente a trs gneros.

GNEROS ESPCIES

Trichophyton
T. rubrum
T. mentagrophytes


Microsporum
M. canis
M. gypseum

Epidermophyton E. floccosum

As manifestaes clnicas dos dermatfitos so tambm conhecidas como tinha ou
tinea. O termo tinha (ou tinea) origina-se do Latim e significa verme ou traa. A adio
do outro termo indica o local anatmico afestado.
Tinha pedis: Micoses dos ps (frieiras, p-de-atleta).
Tinha capitis: Micoses do couro cabeludo (pode causar alopecia).
Tinha manus: Micoses nas mos.
Tinha unguium: Micoses nas unhas (ONICOMICOSE). Crescem em baixo das unhas.
Tinha corporis: Micoses generalizadas no corpo.

O tratamento consiste na utilizao de derivaros imidazlicos como o cetoconazol, o
miconazol, o fluconazol e principalmente o Itraconazol.

b) Dermatomicoses por Candida sp.: Ocorrem principalmente pela contaminao com
Candida albicans. Podem determinar leses de pele, plos, unhas e mucosas de indivduos
que apresentam fatores predisponentes como obesidade, diabetes meliltus, uso prolongado
de antibiticos ou glicocorticides e indivduos que manuseiam muita gua.

Fonte: Mims, 2005
Candida em pele
187
As leses mais freqentes so em unhas e espaos interdigitais das mos. A leso
que se encontra ao redor do leito ungueal (paroniquia) tambm comum. A paronquia
uma tumefao anormal ao redor das unhas que pode ser causada por diversos agentes,
como o Staphylococcus aureus. Isso ser visto na disciplina de Propedutica Mdica II.

3) SUBCUTNEAS: Os fungos que provocam micoses subcutneas normalmente residem
no solo e na vegetao. Penetram na pele ou tecido subcutneo por inoculao traumtica
com material contaminado. Em geral as leses tornam-se granulomatosas (reao de
hipersensibilidade tipo IV) e propagam-se lentamente a partir da rea de implantao. So
infeces que afetam a derme, tecidos subcutneos, msculos e fscias. Podem ser
doenas ocupacionais por causa do tipo de trauma. Ex: cortadores de coco. TEM QUE
HAVER TRAUMA CUTNEO PARA ATINGUIR A DERME (TECIDO CONJUNTIVO).

a) Esporotricose: uma infeco crnica caracterizada por leses nodulares e ulcerativas
(local correto para a coleta do material para exame microscpico) que se desenvolve ao
longo dos vasos linfticos. Os ndulos amolecem, rompem-se e liberam exsudato purulento.
tambm conhecida como Doena do Jardineiro e do Floricultor ( uma doena
ocupacional).
O agente etiolgico o fungo Sporothrix schenckii. um fungo saprfito encontrado
no solo, nas roseiras, nos arbustos, em cascas de rvore e nas brifitas. A infeco
acontece mediante a um traumatismo. Surge como uma pequena ppula ou ndulo
subcutneo que se desenvolve entre 1 semana e 6 meses. Posteriormente atinge as
cadeias linfticas.
Outras formas raras de esporotricose incluem soluo saturada de iodeto de
potssio, itraconazol e os demais derivados imidazlicos. Quando a infeco assume
carter sistmico, o tratamento intrahospitalar com Anfotericina B.
Fonte: Mims, 2005
188
b) Cromoblastomicose (cromomicose): Crescimento de ndulos verrucosos que
aparecem nos locais de inoculao. Com o tempo assume o aspecto de couve flor. Os
pontos enegrecidos so os locais certos para a coleta do material para exame.
O agente etiolgico predominante no Brasil a Fonsecaea pedrosoi. Mas h outras
espcies que podem provocar a cromoblastomicose: Phialophora verrucosa, Rhinocladiella
aquaspersa, Fonsecaea compacta e Cladosporidium carrionii. Esses microrganismos
habitam o solo e coletivamente so denomindos fungos dematiceos, com parede celular
melaninizada.
uma doena comum em trabalhadores rurais, principalmente nas reas
descobertas do corpo.
O tratamento consiste na cauterizao e na remoo cirrgica das leses inicias. J
na doena avanada, torna-se necessrio o uso de quimioterpicos.

Existem outras micoses subcutneas, porm de incidncia muito baixa, entre elas a
Feo-Hifomicose, o Micetoma Eumictico, a Zigomicose, a Lobomicose e a Rinosporidiose.


4) SISTMICAS: Todos os fungos que causam infeces sistmicas so DIMRFICOS. Em
meios de cultura simples (entre 24 e 28C) e na natureza formam colnias micelianas
formadas por hifas (bolores). Nos tecidos e nos meios de cultura especiais (entre 35 e
37C), desenvolvem a forma de leveduras, que a forma parasitria. Localizam-se
principalmente nos rgos internos e vsceras podendo abranger muitos tecidos diferentes.
H preferncia pelos pulmes.

a) Paracoccidioidomicose (blastomicose Sul-Americana ou Micose de Lutz-Splendore
Almeida): O agente etiolgico o fungo dimrfico Paracoccidioides brasiliensis.

Aspectos Clnicos:
Aspecto radiogrfico do pulmo em asa de borboleta
Presena de vesculas no sulco gengival (muitas vezes o diagnstico feito pelo
cirurgio-dentista e o paciente chega ao mdico por encaminhamento)
O 1 rgo de acometimento o pulmo; o 2 rgo a mucosa bucal. Muitas vezes
leses na boca aparecem antes (at dois anos) das manifestaes pulmonares.
a nica micose pulmonar que atinge o imunocompetente
Na prtica clnica a paracoccidioidomicose chamada de PCM
189
Alm do pulmo, pode fazer leso osteoltica, disseminar-se para o SNC, rgos genitais,
TGI. s vezes o cirurgio encontra ao fazer uma laparotomia.
A infeco pode resultar tanto da inoculao de estruturas do fungo consideradas
infectantes, como a reativao de algum foco pr-existente.
O nmero de homens afetados desproporcional ao nmero de mulheres (9:1). Esta
diferena foi atribuda a fatores de alto risco, doena subjacente, desnutrio e diferenas
hormonais.
Pneumonia por Paracoccidioides brasiliensis muito difcil de tratar. O tratamento
consiste no uso prolongado de Itraconazol, algumas vezes associado a Sulfametoxazol e
Trimetropim (Bactrim).


5) OPORTUNISTAS: Nmeros fungos foram identificados como agnetes etiolgicos de
infeces oportunistas. Muitas vezes ocorre em ambientes hospitalares. Pacientes
transplantados, usurios crnicos de glicocorticides e HIV positivos merecem ateno
especial nesses casos, uma vez que a cura torna-se muito dificultada.

a) Candidase, candidose e Candida sp.
A Candida sp. o patgeno fngico mais comum do paciente imunocompetente.
uma levedura oportunista em uma variedade de pacientes e em vrios stios do corpo. No
intestino ela atua como agente de microbiota normal.
A espcie mais comum, epidemiologicamente, a Candida albicans. Essa levedura
gera diversos tipos de quadros clnicos como candidase bucal e candidase vaginal. Hoje
em dia estes termos no so mais utilizados pela nmina anatmica moderna. Usa-se o
termo CANDIDOSE para manifestaes na cavidade bucal e o termo CANDIDASE para as
demais infeces por Candida sp. Alm disso, pode provocar alteraes cutneas,
gastrointestinais e endocardites, particularmente em usurios de drogas ilcitas.
Fonte: Koneman, 2001
Candida sp.
190
A candidose pode ser encontrada em uma variedade de pacientes
imunocomprometidos, pessoas com uso de prteses odontolgicas mal adaptadas,
portadores de diabetes mellitus, em tratamento com antibiticos de largo espectro, usurios
crnicos de glicocorticides, xerostomia (hipoproduo de saliva) entre outros. A
manifestao mais freqente se d por meio de placas esbranquiadas (forma
pseudomembranosa) de fcil destaque com o auxlio de um algodo, principalmente em
dorso de lngua e palato duro. H tambm a forma eritematosa, que se manifesta por meio
de leses hiperemiadas. O tratamento pode ser feito com o uso tpico de nistatina,
anfotericina e derivados imidazlicos. Se o paciente for imunocomprometido e/ou a infeco
j tiver adquirido carter mais invasivo, deve se apelar para o uso de antifngicos
sistmicos.
* Causas comuns xerostomia: pacientes que fazem quimioterapia (que destri grndulas
salivares colateralmente) e usurios de antidepressivos como inibidores da recaptao de
serotonina (5-HT). Esses pacientes so fortes candidatos a possuiem candidose.

Aspecto pseudomembranosos em palato duro Pseudohifas e leveduras
Fonte: Rubin, 2006

A candidase vaginal uma das doenas que mais comumente acometem mulheres
jovens, principalmente em pases de clima tropical como o Brasil. Esta patologia pode,
inclusive, ser enquadrada dentro do grupo das DSTs, uma vez que o contato sexual uma
das formas mais comuns de contgio. O homem tem a Candida albicans na microbiota
normal peniana, portanto uma atividade sexual sem preservativo faria com que a mulher
191
entrasse em contato direto com a levedura. Se ela estiver em uma queda imunolgica pode
desenvolver a doena, bem como cultiv-la, fazendo sexo repetidamente com o mesmo
parceiro (portador). Salienta-se tambm que as pessoas que fazem sexo oral sem proteo
esto sujeitas a contrarem candidose por entrarem em contato com a microbiota normal do
pnis. imprescindvel que o tratamento seja feito com o casal, ambos devem prosseguir
com a terapia at a erradicao das leveduras.
Outra fonte de contgio so os fmites contaminados (toalhas, roupas ntimas,
acessrios diversos, etc.). O compartilhamento deste tipo de material pode acarretar um
intercmbio de espcies de Candida sp., ou mesmo de diferentes cepas de Candida
albicans, geralndo infeces com mecanismos mais resistentes.
Fonte: Netter, 2006

A candidase mucocutnea uma manifestao rara e no invasiva, embora
persistente, das membranas mucosas dos cabelos, da pele e das unhas. Em crianas, com
defeito especfico de clulas T, podem se tornar alrgicoa Candida, tendo que fazer uso
de antifngicos intermitentes.

A candidase gastrointestinal encontrada em pacientes que passaram por cirurgia
gstrica ou abdominal (ex: cirurgia de reduo de estmago), ou em pacientes que tm
neoplasias. O microrganismo pode atravessar a parede intestinal e disseminar-se a partir de
um foco gastrointestinal. O diagnstico in vivo difcil, e cerca de 25% dos pacientes no
apresentam sintomas nos etgios iniciais da doena. Se ocorrer disseminao a partir do
intestino, as hemoculturas podem se tornar positivas e antgenos de Candida podem ser
detectveis no soro. A terapia fungicida deve ser iniciada precocemente em pacientes com
suspeita de infeco, mas a doena disseminada frequentemente fatal.
192
A candidase disseminada provavelmente adiquirida via TGI, mas tambm pode se
originar de infeces relacionadas a cateteres intravasculares. Pacientes com linfomas e
leucemia correm maior risco. A disseminao hematolgica alcana quase todos os rgos.
Infeces nos olhos (endoftalmia) e da pele (leses mucocutneas nodulares) so
importantes porque fornecem evidncias para o diagnstico, sem as quais os sintomas
inespecficos de febre e choque sptico dificultam o diagnstico precoce. Pacientes
imunocomprometidos, por vezes, recebem terapia antifngica emprica se apresentam febre
e falham em responder aos agentes antibacterianos de largo espectro.

Hoje em dia h aumento da resistncia aos antifngicos para tratar as espcies de
cndidas. A Candida albicans responde bem aos derivados imidazlicos como o
cetoconazol e fluconazol. No entanto, est aumentando gradativamente as infeces pelas
Candida no-albicans, e estas espcies possuem mecanismos de defesa bem mais
resistentes. O fluconazol apresenta atividade muito reduzida contra essas espcies, fazendo
com que os pacientes sejam obrigados a usarem o Itraconazol via oral por longos perodos.
A anfotericina B tambm um antifngico com boa atividade contra as cndidas, porm ela
tem muitos efeitos colaterais e seu uso na prtica mdica mais reservado.


CORRELAES CLNICAS:

A secreo da candidase diferente das demais secrees infecciosas da vagina. O
aspecto pseudomembranoso da cndida se manifesta como placas brancas facilmente
destacveis com auxlio de algodo, sem odor ftido. As demais secrees como a do
Trichomonas vaginalis, das vaginites e vaginoses bacterianas so verde-amareladas
(exsudato purulento), viscosas e geralmente de odor ftido.

Fonte: Netter, 2006

Colo uterino: Candida spp. Colo uterino: Trichomonas vaginalis, gonococo,
Gardnerella vaginalis e Chlamydia trachomatis
193
b) Criptococose
O agente etiolgico o Cryptococcus neoformans. Um fungo leveduriforme que
possui uma cpsula espessa de polissacardeos complexos ao redor de sua parede celular.
um microrganismo euribionte, uma vez que o criptococo transmitido pelas fezes dos
pombos. Curitiba certamente uma cidade com uma populao densa dessas aves,
portanto uma importante questo de sade pblica que merece ateno especial.
No pombo o fungo inativo, pois a cpsula de carboidrato no se desenvolve no
interior da ave. Quando a levedura chega ao organismo humano, a cpsula se desenvolve a
partir dos carboidratos do nosso metabolismo ( um fator de patogenicidade, junto a
produo de melanina e enzimas). Por fim, e o fungo adquire sua verdadeira forma ativa e
infectante. A inoculao geralmente pulmonar e assintomtica. Esse fungo tem tropismo
pelo SNC (vem dos pulmes por via hematognica). Pode fazer meningite criprocccica
quando atinge as meninges. Acredita-se que o criptococo possa atravessar a barreira
hematoenceflica via infeco de moncitos e/ou clulas endoteliais. Essa forma de
meningite responsvel pela morte de muitos pacientes com AIDS e outros
imunocomprometidos na imunidade celular. A resposta imunolgica do hospedeiro se faz
pela ativao dos linfcitos CD4 e produo de IFN.
No entanto alguns pacientes imunocompetentes so acometidos tambm, porm
numa porcentagem bem menor e com sintomas mais brandos, alm de terem uma cura
mais rpida e eficaz.
Nos casos de meningite criptocccica, a levedura pode ser demonstrada no lquido
crebro-espinhal. A identificao tambm pode ser feita pela deteco do antgeno no teste
de aglutinao em ltex, usando ltex recoberto com anticorpos especficos.
O tratamento engloba uma combinao entre anfotericina B e flucitosina, e pode ser
monitorado pela queda na concentrao de antgenos no LCE. O prognstico varia muito de
acordo com a doena de base do paciente; nos pacientes severamente
imunocomprometidos, a mortalidade gira em torno de 50%. Nos pacientes com AIDS
praticamente impossvel erradicar o microrganismo, mesmo com a terapia intensiva.
Pacientes com leucemia, linfomas, LES, linfoma de Hodgkin ou sarcoidose merecem
ateno especial tambm.


Inalao pulmes meningite via hematognica SNC

194
Fonte: Mims, 2005
Cryptococcus neoformans e a cpsula de carboidratos

c) Histoplasmose: Doena das Cavernas, Doena dos Espelelogos
O agente etiolgico o fungo dimrfico Histoplasma capsulatum. Este fungo cresce
em reas contaminadas com excretas de morcegos e aves. Embora as aves no sejam
infectadas, ocorre infeco natural nos morcegos. O fungo pode ser encontrado em pores,
reas escuras, torre de igreja, etc
A doena ocorre no mundo todo. Na maioria dos casos assintomtica. Nos casos
sintomticos observam-se sintomas clnicos de pneumonia aguda, seguidos com menor
freqncia de doena disseminada progressiva.
Os esporos ou fragmentos de hifas so aspirados nos alvolos e estes so
fagocitadas pelos macrfagos alveolares e em seguida convertidos em leveduras (so
capazes de se replicar dentro dos macrfagos). Nos imunocompetentes os macrfagos
controlam a infeco eliminando as hifas. No imunocomprometido a infeco prossegue.
Com o tempo ocorre dissiminao linftica. Trata-se de um fungo altamente
infeccioso que causa infeco pulmonar aguda, porm benigna em pessoas saudveis.
Culturas de sangue, de medula, de escarro e de LCR podem conter Histoplasma no
paciente suspeito, mas a bipsia e o exame histolgico da medula, fgado e de linfondos
so, muitas vezes, necessrios para chegar a um diagnstico definitivo.
Fonte: Robbins, 2005
Histoplasma capsulatum colonizando linfonodo de paciente imunocomprometido
195
CORRELAES CLNICAS:

Alm do Histoplasma capsulatum, quais outros agentes etiolgicos de infeces
tambm so parasitas intracelulares de macrfagos?



c) Aspergilose
O Aspergillus sp. ubiquitrio no meio ambiente e faz parte da microbiota normal do
organismo humano. Seus esporos so regularmente inalados sem conseqncias danosas.
um gnero que contm vrias espcies, das quais a que merece maior destaque o
Aspergillus fumigatus, que pode provocar diversas manifestaes patolgicas, tais como:
- Aspergilose broncopulmonar alrgica, que, como seu nome sugere, uma resposta
alrgica presena do antgeno. Aspergillus nos pulmes podem desencadear um processo
de hipersensibilidade tipo I e culminar em asma brnquica. O mecanismo da asma ser
abordado em seminrios da disciplina de Imunologia Mdica (BP336).
- Aspergiloma em pacientes com cavidades pulmonares preexistentes (ex: seqela de TB)
ou distrbios pulmonares crnicos. O fungo coloniza a cavidade e cresce para produzir uma
massa de hifas em forma esfrica, a qual denominada aspergiloma. Esses fungos no
invadem os tecidos pulmonares, porm o tamanho do aspergiloma pode desencadear
dificuldade respiratria.
- Doena disseminada no paciente imunocomprometido quando o fungo invade a partir dos
pulmes.
A aspergilose invasiva geralmente fatal no imunocomprometido, pois os pacientes
so neutropnicos (com poucos neutrfilos circulantes). As hifas deste fungo, quando
crescem, destroem alvolos e septos alveolares. O crescimento das hifas em ngulo de
45, o que acaba por destruir a arquitetura pulmonar.
Fonte: Mims, 2005
196
d) Pneumocistose
O Pneumocystis jiroveci (antigamente chamado de Pneumocystis carinii) um fungo
atpico, comumente encontrado em seres humanos normais e roedores. A infeco
transmitida por meio de gotculas respiratrias (aerossis). A doena ocorre em indivduos
debilitados e imunodeficientes. Antes do advento da terapia antiretroviral altamente ativa, a
terapia HAART (que ser discutida nos seminrios de Imunologia Mdica), uma alta
proporo dos pacientes com AIDS desenvolvia pneumonia por pneumocistos, podendo ser
fatal. Apenas causa doena sintomtica em pessoas com a imunidade celular deficiente.
O Pneumocystis sp. ocorre em uma forma trfica, com at 5 m de dimetro, na
forma de esporocistos e reservatrios de esporos. Os esporos so liberados quando estes
reservatrios se rompem. A doena est associada a uma pneumonite instesticial, com
infiltrao de plasmcitos. J foram relatadas infeces em locais diferentes que no o
pulmo.


CORRELAES CLNICAS:

Fazem pneumonia: Pneumocystis, Histoplasma, Aspergillus, Candida e
Paracococcidioides, este ltimo, tambm em imunocompetentes.
Para tratar, pneumonia fngica o pior tipo de pneumonia que existe. As bacterianas so
infinitamente mais fceis de curar com os antimicrobianos. A classe de drogas de primeira
escolha em pneumonia bacteria so as quinolonas de 3, 4 e 5
a
gerao (levofloxacino,
moxifloxacino e gemifloxacino respectivamente). A tigeciclina uma alternativa em teste.
Nos casos de pneumonias fngicas, os frmacos de escolha ainda so os derivados
imidazlicos tradicionaos de grande abrangncia (Itraconazol). A anfotericina B pode ser
uma arma de retaguarda. No entanto, a partir de 2007 surgiram novas drogas triazlicas no
mercado farmacutico que prometem dar uma nova abordagem ao tratamento dessas
pneumonias. O voriconazol e o posoconazol so exemplos delas. Todavia, o tratamento
com esses antifngicos de custo muito elevado e no pode ser bancado pela grande
maioria dos pacientes.

Paciente portador de pneumonia fngica deve necessriamente ser submetido
a exames para investigao de imunossupresso, incluindo o anti-HIV (ELISA-
Western Blot).

Pneumonia em paciente idoso: investigar infeco por fungos. Em especial o
Aspergillus fumigatus.

As drogas referidas como glicocorticides so a dexametasona, a betametasona, a
prednisona, a mimetasona, a predinisolona, etc. Essas drogas mimetizam a atividade
cataltica dos glicocorticosterides produzidos pelos espongicitos da camada fasciculada
do crtex da glndula adrenal. So muito utilizados no tratamento das doenas auto-imunes.
Seus efeitos so antiinflamatrios e imunossupressores. Antiinflamatrios por fazerem
inibio da enzima fosfolipase A
2
, assim interferindo no metabolismo do cido aracdnico,
como foi visto nas aulas de Patologia Mdica Molecular (BP337). E imunossupressores
197
porque essas drogas interferem na ao do IFN nos macrfagos, suprimindo sua atividade
como clula apresentadora de antgeno e silenciando a transcrio dos genes do MHC.
Assim, toda a atividade imunolgica do indivduo estar comprometida enquanto ele estiver
fazendo o uso deste medicamento. Haver uma aula terica dentro da disciplina de
Imunologia Mdica (BP336) para abordar este tema.


Para pensar: O tratamento das hepatites virais, como a hepatite B feito com altas doses
de IFN (interferon). Na sua prtica clnica, chega a voc, mdico, um paciente portador de
HBV com um quadro de esteatose avanada. Porm, ele portador de artrite reumatide
(uma das doenas auto-imunes que tratada com glicocorticides). Com base no
mecanismo de ao descrito acima e aprofundado nas aulas de Imunologia Mdica, voc
prescreveria o uso prolongado de IFN para este paciente? Por qu?



Drogas Antifngicas


A base do tratamento delas inibir a sntese do esgosterol da membrana celular
do fungo. Porm, esse ergosterol muito parecido com a nossa molcula do colesterol. Por
sinal, ele tem a mesma funo do colesterol nas membranas celulares animais. A droga se
confunde e destri ambos os lipdeos. Por isso dizemos que os antifngicos atingem tanto o
hospedeiro como o fungo.

Principais grupos de drogas:

1) Agentes polinicos Anfotericina B
Mecanismo de ao: liga-se ao ergosterol da MP do fungo.
Efeitos colaterais: hipotenso, dor abdominal, reaes alrgicas, anemias, leso renal.
Padro ouro para cndida, ao lado do Itraconazol.
Tambm usada no tratamento de Leishmanioses.

CURIOSIDADE, MAS IMPORTANTSSIMO: Anfotericina B no pode, em hiptese alguma,
ser administrada em pacientes que fazem uso de digitlicos cardacos (digoxina), pois
potencializa a ao e pode causar intoxicao digitlica. NO MATEM SEUS PACIENTES!

2) Nistatina
Mecanismo de ao: impede a ligao ao ergosterol da MP fngica.
198
3) Flucitosina
Mecanismo de ao: inibio da sntese de cidos nuclicos, porm sua toxicidade
seletiva. Pode ser utilizada no tratamento da candidase sistmica.
Efeitos colaterais: depresso da medula ssea, anemias e discrasias sangneas.

4) Derivados azlicos: Cetoconazol, Miconazol, Clotrimazol, Fluconazol, Itraconazol
Mecanismo de ao: inibio da sntese de ergosterol

5) Novas drogas triazlicas: voriconazol e posaconazol (um dos antifngicos mais fortes
que existem). So muito caros. Terapia para 5 dias: R$3.000,00 (em 2007).



CORRELAES CLNICAS:

Efeito colateral dos antifngicos: quase todos eles deixam resduos metablicos na
cavidade bucal, fazendo com que o paciente sinta um gosto amargo de metal durante o
tratamento (o que s vezes dificulta a adeso ao mesmo).

So medicamentos que em geral tm melhor absoro em pH cido. Portanto bom
recomentar o paciente tomar o medicamento junto s refeies, ou com refrigerante do tipo
cola.

O que o trocisco?





















199
CAPTULO 15: CAPTULO 15: CAPTULO 15: CAPTULO 15: HERPES-VRUS


HHV-1 ou HSV-1: Herpes Simplex Vrus 1 (Herpes bucal no oral)
HHV-2 ou HSV-2: Herpes Simplex Vrus 2 (Herpes Genital - hoje em dia 1 e 2 esto em
conflito no stio por causa do sexo oral). Pode fazer carcinoma genital.
HHV-3 ou VZV: Varicela Zoster Vrus
HHV-4 ou EBV: Epstein-Barr Vrus (Mononucleose infecciosa)
HHV-5 ou CMV: Citomegalovrus (Mononucleose tambm, de maneira siminar)
HHV-6: Causa rosola infanto
HHV-7
HHV-8: Pode causar o Sarcoma de Kaposi

EBV e CMV Muito comuns e importantes.
Eles causam a mononucleose infecciosa (esse termo mais usado para o EBV), conhecida
tambm como doena do beijo (tambm mais usado para o EBV). Ela transmitida
beijando, via saliva.

O CMV tambm pode ser transmitido pelo sangue, urina, smen e secrees cervicais. o
maior herpes vrus humano e s tem um sorotipo. O nome refere-se a incluses
intranucleares que so respostas caractersticas desse patgeno.
Fonte: Fernando Bortolozzi
Doena de incluso citomeglica em pulmo de perinato. Comparar o tamanho desta clula
setada com as demais. CitoMEGALOvrus.
200
A infeco pelo CMV geralmente assintomtica. Uma infeco muitas vezes
silenciosa do trato respiratrio superior. Dissemina-se via linfcitos e moncitos (os
MONOMORFONUCLEARES, MMN) e envolve linfonodos e bao (defesa secundria e
terciria). O vrus condiciona-se a clulas epiteliais, glndulas salivares, tbulos renais, colo
uterino, testculos e epiddimo. H febre e letargia.
Esses vrus "escapam" das defesas imunolgicas. So alvos ruins para as clulas T
citotxicas por interferirem no transporte de molculas do MHC-I e induzem a transcrio de
genes que codificam receptores Fc, e estes so expressos nas clulas infectadas.


EBV Epstein Barr Vrus

- transmitido pela saliva. Conhecida como a DOENA DO BEIJO.
- S tem um sorogrupo. Antigenicamente diferente do CMV.
- Utilizados no diagnstico: o capsdeo viral (VCA), os antgenos precoces (EA) que so
produzidos antes da sntese do DNA viral e os antgenos nucleares associados ao EBV
(EBNA), que esto no ncleo das clulas infectadas.


ANTICORPOS HETEROFLOS

O EBV se multiplica nos linfcitos B (eles tem na membrana um receptor, o C3d
(CD21), que se liga ao vrus). Os linfcitos T respondem imunologicamente s clulas B
infectadas (aumentanto cerca de 50 vezes em nmero) e aparecem no sangue perifrico
como "linfcitos atpicos do EBV". Essa doena uma verdadeira "guerra civil imunolgica".
Digamos que as clulas T no se habituam com as clulas B infectadas em fazem um
confronto por meio de citocinas. E essas citocinas das clulas quem causam os sintomas
da doena, semelhante aos estragos que as armas blicas fazem numa regio onde est
tendo uma guerra. Os linfcitos T em guerra so denominados de clulas de Downey.
Esses linfcitos B infectados so estimulados a diferenciar-se e produzir
anticorpos (ativao policlonal das clulas B, O QUE RESPONSVEL PELA FORMAO
DOS ANTICORPOS HETERFILOS DO EBV reao com eritrcitos de carneiro ou de
cavalo). Auto anticorpos tambm so produzidos, como o IgM para eritrcitos (crio-
aglutininas).
201

Linfcitos atpicos do EBV Fonte: Robbins, 2005 Fonte: Mims, 2005

Os anticorpos heterofilos so detectados pela Reao de Paul Bunnel (>40 positivo;
<40 negativo)
Esses anticorpos podem aparecer na mononucleose infecciosa (+++), na doena do soro
(+++) e mesmo em indivduos normais (+).
O mdico dever pedir IgM contra o capsdeo viral para o diagnstico, bem como o IgG.
Hemograma til por causa da formao dos linfcitos atpicos.
Outros achados clnicos incluem a esplenomegalia, hepatomegalia e linfadenopatia.
No h antiviral eficaz contra o EBV, o que faz com que a doena siga seu curso
autolimitado em pacientes sadios e no-imunocomprometidos. Autolimitada uma doena
que se cura sem interveno medicamentos. Ex: gripe, varicela.



NEOPLASIAS INDUZIDAS PELO EBV

Linfoma de Burkitt: s o EBV no consegue fazer o linfoma. Ele se associa com
algumas espcies de Plasmodium sp. como o Plasmodium falciparum ou o Plasmodium
infantum, enfraquecendo o controle das clulas T e talvez causando ativao policlonal das
clulas B, tornando-as suceptveis a maior formao neoplsica. O DNA e o RNA transcritos
so encontrados nas clulas tumorais, que tambm mostram uma translocao dos
oncogenes myc no cromossomo 8 para o locus da cadeia pesada da imunoglobulina
localizada no cromossomo 14.


202
Fonte: Robbins, 2005 Fonte: Robbins, 2005

Resultado =
Fonte: Bogliolo, 2006 Fonte: Mims, 2005




203
Carcinoma Naso-Faringeal: O DNA do EBV detectvel nas clulas tumorais, e um co-
carcingeno, possivelmente de nitrosaminas ingeridas com peixes em conserva. Fatores
genticos do hospedeiro que controlam o HLA (human leucocyte antigen) e a resposta
imune podem ser fatores de suceptibilidade.
HHV-2 faz carcinoma genital e HHV-8 faz Sarcoma de Kaposi.


CORRELAES CLNICAS:

Antes de chegar a estas aberraes, temos como obrigao fazer o diagnstico.
Boa anamnese e bom exame fsico so essenciais.


Fonte: Mims, 2005

esquerda, a MEMBRANA nas tonsilas palatinas ocasionada pelo EBV; direita, as placas
proporcionadas pelo j conhecido de vocs, Streptococcus pyogenes (Estreptococo beta
hemoltico do grupo A de Lancefield), entre outros agentes. Vo prescrever antibiticos para
qual dos dois quadros mesmo?

Clnica sem diferenciao:
Infeces por Streptococcus pyogenes / Haemophilus influenzae / Moraxella catarrhalis
Fonte: Fernando Bortolozzi
204
REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS PARA ATUALIZAO
DO MATERIAL EM 2008

MIMS, C. et al.; Microbiologia Mdica, editora Elsevier, 3 edio, 2005.
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Material Didtico do Grupo Positivo


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