UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARABA CENTRO DE CINCIAS EXATAS E DA NATUREZA DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA MOLECULAR Campus I - Cidade Universitria CEP 58059-900

- Joo Pessoa - PB - Brasil

CENTRO UNIVERSITRIO DO LESTE DE MINAS GERAIS

Apostila Prtica de Citologia

Prof Glucia Marques Freitas Ribeiro Acadmico: -------------------------------_____________ Curso: -------------------------Perodo: -------------2007

Parte I Citologia

3 Tcnicas de preparo de materiais para estudos em microscopia

O tamanho pequeno das clulas torna a sua visualizao dependente do uso de microscpios. O microscpio de luz apresenta um conjunto de lentes de vidro, no qual as estruturas celulares so observadas por contraste atravs de corantes. J o microscpio eletrnico apresenta uma srie de lentes eletromagnticas e a questo do contraste resolvida com o uso de contrastantes. Alm do tamanho reduzido, os tecidos tambm so espessos demais para permitir a passagem de luz (microscpio ptico) ou de feixes de eltrons (microscpio eletrnico). Por isso a maioria dos tecidos e rgos so seccionados em fatias finas por meio de instrumentos de grande preciso chamados micrtomos. Previamente, os materiais biolgicos so includos em parafinas ou resinas sintticas que iro facilitar o corte (microtomia). A seguir so listadas as principais etapas do processamento para obteno de lminas permanentes para estudos em microscopia de luz:

FIXAO: (Arajo et al., 2005) UFV A preservao das clulas feita em uma etapa conhecida como fixao, processo que permite estabilizar as estruturas celulares e extracelulares, fazendo com que estas fiquem o mais prximo possvel da sua condio in vivo. A fixao visa tambm evitar o processo de autlise, o que poderia alterar drasticamente a estrutura celular. Mesmo com todos os cuidados tomados nesta etapa, algumas alteraes so introduzidas nas clulas, e desta forma as imagens obtidas ao microscpio apresentam artefatos. Uma boa tcnica de fixao aquela que interfere o mnimo possvel na estrutura da clula, bem como na estrutura e localizao das diferentes macromolculas presentes na mesma. Esta etapa importante tanto para a microscopia de luz quanto para a microscopia eletrnica, seja de transmisso ou de varredura. Existem vrios mtodos fsicos e qumicos de preservao de clulas, sendo que a fixao qumica uma da mais empregadas na biologia celular. A fixao qumica pode ser conseguida utilizando-se de substancias que reagem com determinados stios especficos de

4 diferentes biomacromolculas promovendo a sua estabilidade. Fixadores base de aldedo (formaldedo, paraformaldedo e glutaraldedo), por exemplo, preservam melhor as estruturas celulares, alm de provocar baixa retrao dos tecidos. O tempo e a temperatura de fixao vo depender do tipo de tecido e tamanho do fragmento a ser fixado. Fixadores mais drsticos, como o etanol, o cido actico e outros, que promovem a desnaturao e precipitao de macromolculas, podem tambm ser utilizados em estudos que no visem a anlise estrutural das clulas. A criofixao um mtodo fsico que baseia no congelamento rpido de clulas, o que pode ser obtido com hlio lquido. Esse processo faz com que a gua presente nos meios intracelular e extracelular passe do estado lquido para o slido formando diminutos cristais de gelo, os quais podem danificar as estruturas celulares. A utilizao de substncias crioprotetoras, como o glicerol e a sacarose, impede a formao de cristais de gelo durante o congelamento. As clulas tambm podem ser fixadas quando secas ao ar, porm a gua, ao passar do estado lquido para gasoso, gera uma grande fora de tenso superficial, induzido grandes alteraes na estrutura das clulas. possvel, tambm, a observao de materiais biolgicos, ao microscpio de luz, sem o processo de fixao que so conhecidos como preparaes a fresco. Neste caso o material observado imediatamente aps a sua obteno e, em seguida, descartado (lmina no permanentes). Como exemplo destas preparaes podemos citar: esfregao de lquidos corporais, cortes feitos mo livre de tecidos vegetais, entre outros. DESIDRATAO: (Arajo et al., 2005) UFV Aps a fixao, o material deve ser lavado para remover o excesso de fixador. Em seguida, feita a desidratao utilizando-se uma soluo apropriada, como etanol ou a acetona, em banhos sucessivos de concentraes crescentes. A retirada da gua necessria para que a resina penetre nas estruturas do corte dando maior consistncia ao mesmo. O tempo de desidratao depende do tecido em estudo e do tamanho do fragmento.

5 INCLUSO: (Arajo et al., 2005) UFV A incluso feita para facilitar a obteno de cortes finos e uniformes durante o processo de microtomia. O meio de incluso mais indicado atualmente uma resina sinttica comercialmente conhecida como glicol metacrilato, constituda por monmeros de monoster de etileno glicol do cido metacrilico. Esta resina apresenta algumas caractersticas que so consideradas bastante importantes: afinidade pela gua (hidrofilia), processamento rpido, fcil manejo, infiltrao e polimerizao temperatura ambiente, baixos nveis de distoro e artefatos e permite a obteno de cortes muito finos (prximos de 0,5 m), com boa resoluo ao microscpio de luz. Uma caracterstica que deve ser ressaltada o fato de que os monmetros que constituem a resina ligam-se uns aos outros durante a polimerizao formando uma trama tridimensional na qual as molculas do tecido so envolvidas. Esta trama, agora um polmero, envolve as clulas, mas no se liga covalentemente aos componentes qumicos celulares, e desta forma as macromolculas presentes no tecido includo mantm seus radicais disponveis, de forma a permitir a ligao de corantes, necessria a obteno do contraste entre as estruturas e/ou regies celulares. A seguir so apresentadas as etapas de incluso com a resina de glicol metacrilato. Pr-infiltrao: Esta etapa tem como objetivo permitir a penetrao da resina

na sua forma no polimerizada, de maneira gradual. Para isso, o tecido embebido em uma mistura de glicol metacrilato e etanol absoluto na proporo de 1:1, por aproximadamente duas horas, em temperatura ambiente. Aps esse perodo, feita a infiltrao propriamente dita. Infiltrao: Na infiltrao o tecido permanece embebido em uma soluo de

infiltrao (glicol metacrilato puro) por uma noite. Caso seja necessrio, o tecido pode ser conservado na soluo de infiltrao por vrios meses. Aps a infiltrao, o tecido colocado em moldes plsticos, contendo soluo de infiltrao + catalisador.

MICROTOMIA: Todo processo descrito at agora proporciona um suporte para que os tecidos resistam passagem da navalha durante a obteno dos cortes. A espessura e a uniformidade dos cortes depende da firmeza com que a navalha passa pelo material. Para

6 tanto, aconselha-se o uso dos micrtomos automticos. O avano da navalha regulvel e pode fornecer cortes com espessuras de 0,5 a 12 m. Aps a microtomia, os cortes so distendidos em gua temperatura ambiente e coletados em laminas histolgicas. Estes cortes devem ser secos em estufa a 45C, por 15 minutos, ou em chapa aquecida a 45C, por 30 minutos. COLORAO: (Arajo et al., 2005) UFV As diversas estruturas celulares apresentam baixo contraste entre si devido proximidade dos seus ndices de refrao. Entretanto, esse contraste pode ser aumentado artificialmente por meio de colorao. Freqentemente, os corantes utilizados tm natureza cida (ex: eosina) ou bsica (ex: hematoxilina), evidenciando componentes celulares bsicos ou cidos,

respectivamente. O ncleo, por exemplo, tem maior afinidade por corantes bsicos, devido concentrao nesta regio de molculas de carter cido (DNA E RNA). J o citoplasma, que rico em protenas bsicas, tem maior afinidade por corantes cidos. MONTAGEM: (Arajo et al., 2005) UFV Uma vez feita a colorao, torna-se necessrio conservar o material corado. O procedimento normalmente utilizado consiste em cobrir o corte com uma lamnula, utilizando para isso uma resina de montagem (ex: entellan). Assim, a lmina permanente j est pronta para ser observada ao microscpio de luz. Existem outras formas de se obter camadas nicas de clulas, porm no utilizando as etapas de incluso e microtomia. No entanto, nestes casos as etapas de fixao, colorao e montagem so ainda necessrias para a obteno de uma lmina permanente. So exemplos de formas alternativas de obteno de camadas nicas de clulas: Esmagamento: consiste em colocar o material biolgico sobre uma lmina,

cobri-lo com lamnula e promover, em seguida, uma presso sobre a mesma, de forma que o material seja esmagado. A lamnula pode ser removida com o auxlio de nitrognio lquido, e a lmina aps secar, transformada em lmina permanente, bastando para isso utilizar a resina de montagem (p. ex., entellan).

7 Decalque: consiste em comprimir suave e firmemente a superfcie de um

fragmento do material fresco sobre uma lmina. As clulas superficiais se destacam e aderem lmina, sendo posteriormente fixadas e coradas. Como geralmente, as clulas se rompem, tais preparados so teis para a obteno de ncleos livres de citoplasma. Esfregao: feito com lquidos corporais, como o sangue, esperma e outros.

Coloca-se uma gota do lquido sobre a extremidade de uma lmina e espalha-se o material uniformemente sobre a mesma com o auxilio de outra lmina inclinada em um ngulo de cerca de 45 graus. UTILIZAO DO MICROSCPIO DE LUZ (Arajo et al., 2005) UFV INTRODUO O microscpio de luz um equipamento utilizado para a observao de objetos de dimenses muito reduzidas, impossveis de serem examinados em detalhes, vista desarmada. O tipo de microscpio mais utilizado no estudo da clula o composto, que constitudo, basicamente, por duas lentes convergentes. Neste microscpio a luz atravessa o objeto observado e o conjunto de lentes, antes de atingir o olho, formando uma imagem bidimensional. Assim, o objeto deve ser delgado o suficiente para que a luz possa atravess-lo. DESCRIO DOS COMPONENTES DO MICROSCPIO (Arajo et al., 2005) UFV O microscpio constitudo, basicamente, por dois sistemas: o ptico, formado pelas lentes, e o mecnico, que sustenta o sistema de lentes. A seguir, encontram-se descritas cada uma das partes desses dois sistemas. a. P ou Base: o suporte do microscpio, pea que sustenta todas as outras. b. Estativo ou Brao: a pea que liga a base parte superior do microscpio. Na parte traseira do brao encontra-se uma fenda que utilizada para o transporte do microscpio. c. Platina ou Mesa: uma pea de formato retangular disposta paralelamente base do microscpio. Esta pea destina-se recepo da lamina contendo o material para estudo. No centro da platina existe uma abertura para a passagem da luz. Associada platina

8 encontra-se uma pea composta de dois controles cuja funo movimentar a lamina nos eixos X e Y. Os dois controles esto dispostos lateralmente platina, um sobre o outro, sendo o de dimetro menor o controle do eixo X, que permite o deslizamento da lmina da esquerda para a direita, e o de dimetro maior, o controle do eixo Y, que o responsvel pelo movimento da lmina para frente e para trs. Acoplada a esta pea h uma presilha ou pina que permite o encaixe da lmina. d. Cabeote: a parte superior do microscpio onde se localizam dois tubos, sendo que em suas extremidades encaixam-se as lentes oculares. Entre os dois tubos localiza-se a escala de ajuste de distncia interpupilar. No tubo esquerdo encontra-se o anel de ajuste de dioptrias. O cabeote uma pea frgil que no deve ser usada como apoio e em hiptese alguma ser utilizada para transportar o microscpio. e. Revlver ou porta-objetivas: uma pea circular na qual se inserem as lentes objetivas. Est localizada abaixo do cabeote e dotada de movimento de rotao. O disco negro do porta-objetivas possui ranhuras para que o observador possa gir-lo para mudanas de objetivas. No se deve tocar nas objetivas para a mudana das mesmas. f. Controle macromtrico e micromtrico: as laterais do brao existem dois controles encaixados um no outro. O de maior dimetro o controle macromtrico, que permite grandes avanos ou recuos da platina em relao objetiva. O controle de menor dimetro o micromtrico, que permite pequenos avanos ou recuos da platina. g. Oculares: so as lentes superiores que se encaixam nos tubos. Nas oculares so encontrados os seguintes dados: 10X indica o aumento da lente ocular; 20X nmero de campo este valor utilizado para calcular o dimetro do campo de viso e est associado com o aumento de cada objetiva. Por exemplo, se a objetiva de 40X estiver encaixada, para calcular o dimetro do campo de viso basta dividir o nmero de campo da ocular (20) pelo aumento da objetiva (40). O resultado 0,5 mm que indica o dimetro do campo explorado pela objetiva. Estas oculares permitem tambm o trabalho do observador que usa culos sem a necessidade de retir-los. Os anis de borracha flexvel fixados em cada ocular no devem ser removidos e nem dobrados. h. Objetivas: so as lentes que se encontram encaixadas no revlver e so responsveis pelo aumento e pela resoluo da imagem. Este modelo est equipado com quatro objetivas planas acromticas (4X, 10X, 40X e 100X), que alm da correo

9 cromtica corrige a curvatura de campo, produzindo um campo de observao com o centro e a periferia simultaneamente em foco. Nas objetivas esto impressos dados como aumento, abertura numrica e outros. Por exemplo, na objetiva de 40X, alm do nmero 40 que indica o aumento, encontramos a inscrio () que indica que a objetiva est corrigida para tubo de qualquer extenso, ou seja, podemos acoplar uma mquina fotogrfica ou uma cmera digital, que sempre a imagem projetada estar em foco. O valor 0,17, impresso abaixo do aumento, indica que a objetiva est corrigida para lamnulas com espessura de at 0,17mm. O sinal (-) nas objetivas de 10X e 100X indica que as mesmas podem ser utilizadas em focalizaes com ou sem lamnulas. Na objetiva de 100X existe a inscrio oil e a tarja negra indicando que esta objetiva trabalha com imerso em leo. i. Condensador: um conjunto de lentes situado abaixo da platina que concentra e torna paralelo o feixe luminoso, fornecendo luz necessria iluminao do objeto em estudo. O controle do ajuste do condensador est localizado lateralmente, esquerda e abaixo da platina. Este controle permite a movimentao do condensador que deve ser mantido na posio mais elevada para a obteno de uma iluminao mxima. j. Diagrama ou ris: uma pea regulvel e associada ao condensador que controla a quantidade de luz entra no condensador. A regulagem do diagrama feita atravs de uma alavanca e para tanto existe uma escala numrica em branco impressa no diagrama. Os valores de abertura do diagrama devem coincidir com os valores de abertura numrica das objetivas, ou seja, a cada mudana de objetiva o usurio deve regular a abertura do diagrama. k. Filtro: um disco de vidro azul fixado abaixo do diagrama e que permite a converso da iluminao de halognio em luz branca, exibindo a amostra em suas cores naturais. l. Fonte de Luz: consiste em uma lmpada halgena embutida na base do microscpio. O interruptor principal que liga a lmpada localiza-se na lateral direita do brao. Abaixo do interruptor encontra-se o boto seletor de intensidade luminosa, que permite regular a intensidade da luz.

10 AUMENTO E PODER DE RESOLUO (Arajo et al., 2005) UFV Normalmente, relaciona-se a qualidade do microscpio sua capacidade de ampliao da imagem de um dado objeto. No entanto, a qualidade dos microscpios est, antes de tudo, associada ao seu poder de resoluo, ou seja, sua capacidade de fornecer imagens ntidas, ao objeto e a resoluo, riqueza de detalhes da imagem obtida. O poder de resoluo de um microscpio pode ser inferido pelo limite de resoluo. O limite de resoluo (LR). Limite de resoluo a menor distncia que deve existir entre dois pontos, de forma que ainda apaream individualizados na imagem formada pelo sistema de lentes. Logo, se esses pontos estiverem separados por uma distancia menor do que o limite de resoluo, sero vistos como um nico ponto, independente da ampliao da imagem. Portanto, quanto menor o limite de resoluo, maior o poder de resoluo e melhor a qualidade da imagem. O limite de resoluo do olho humano normal aproximadamente 0,1 mm; do microscpio de luz, ao redor de 0,25 m e do microscpio eletrnico, de 3 a 5 . O limite de resoluo (LR) calculado pela seguinte frmula: LR = K . AN Sendo: K = uma constante experimental estimada em 0,61. = o comprimento de onda da energia utilizada (luz ou feixe de eltrons). NA = a abertura numrica da lente objetiva.

A abertura numrica calculada pela seguinte frmula: AN = n. sen Sendo: n = o ndice de refrao do material intercalado entre a lamnula e a lente objetiva (ar, leo de imerso, glicerina, gua e etc, dependendo do tipo de objetiva usada). a = metade do ngulo de abertura da lente objetiva (ngulo formado entre o eixo ptico da lente objetiva e o raio de luz mais externo utilizado na formao da imagem). Por meio dessa frmula, verifica-se que o limite de resoluo diretamente proporcional ao comprimento de onda da fonte de iluminao utilizada e inversamente proporcional abertura numrica. A diminuio do comprimento de onda ( ) pode ser

11 feita utilizando-se outras fontes de iluminao como a luz ultravioleta (400 nm) ou utilizando-se um feixe de eltrons cujo = 0,005 nm (microscpio eletrnico). A mdia dos comprimentos de onda da luz branca de aproximadamente 550 nm ou 0,55 m o qual representa a mdia dos comprimentos de do espectro da luz visvel.

12 Identifique os componentes de um microscpio ptico a partir do desenho esquemtico abaixo:

M L

D E
F G

I J

13 Instrues para o manuseio do microscpio ptico (M.O.) (Ribeiro, 2000) - UFMG O microscpio ptico um instrumento frgil, por isso de extrema importncia que todos saibam manuse-lo da maneira correta. Siga os passos abaixo: 1 Retire a capa de proteo e a coloque embaixo da bancada. Encaixe o plug na tomada. 2 Acenda a luz. 3 Abaixe a mesa totalmente usando o parafuso macromtrico. Encaixe a objetiva de menor aumento (4X) girando o revlver. 4 Coloque a lmina sobre a platina, prendendo-a com a presilha. 5 Levante a platina movimentando o parafuso macromtrico at o seu ponto mximo. 6 Com os dois olhos abertos, observe a lmina atravs da ocular. Agora, utilizando o parafuso macromtrico, abaixe lentamente a platina at a visualizao de alguma imagem. 5Focalize o corte histolgico movimentando os parafusos macromtrico e micromtrico. 6Utilizando o charriot com uma das mos e o parafuso micromtrico com a outra, faa uma varredura por toda a lmina. 7Observe tambm o corte em mdio (10X) e grande (40X) aumento girando o revlver como fez anteriormente. O ajuste da focalizao realizado utilizando apenas o parafuso micromtrico. 8Antes de desligar o microscpio, encaixe a objetiva de menor aumento, retirando posteriormente a lmina. Reduza a intensidade luminosa girando o boto da fonte de luz. Desligue o microscpio. Coloque a capa protetora.

NUNCA MOVIMENTE A PLATINA COM A OBJETIVA DE MAIOR AUMENTO ENCAIXADA. NO ARRASTE O MICROSCPIO NA BANCADA E NEM MUDE O MESMO DE LUGAR.

14 TABELA COMPARATIVA DE MICROSCPIOS Microscpio ptico Obteno da Imagem Lentes Limite de Resoluo 1 Lente 2 Lente 3 Lente Tamanho da Ampliao Material Fixao Desidratao Clarificao Incluso Microtomia Espessura dos cortes Material da Navalha Distenso Cortes Colorao Feixe Luminoso Vidro 0,5m Condensador Objetiva Ocular 1000 1500 X Pode ser Vivo ALFAC, Bouin, 10% lcool etlico Xilol Em Parafina Micrtomo 1 a 6 micrmetros Metal Lmina de Vidro Microscpio Eletrnico Feixe de Eltrons Bobina Eletromagntica 0,001m Bobina Condensadora Bobina Projetora Bobina Objetiva 2.000.000 X Nunca pode ser Vivo Formol Glutaraldedo (4C), Tetrxido de Osmio Acetona, xido de propileno e lcool etlico No existe esta etapa Resina Epxi, Araldite Ultra-Micrtomo 0,02 a 0,1 micrmetros Vidro ou Diamante Esteira Eletromagntica

Usa-se Corante. Azul de No se usa Corante. Usa-se Metileno, Eosina, etc. Acetado de Uranila (aumenta a densidade aos eltrons)

Fonte: Junqueira e Carneiro, Biologia Celular e Molecular, 7ed.

15 1. Por que os materiais biolgicos, para serem observados ao microscpio de luz, no devem ser espessos?

2. Qual a importncia da fixao de materiais biolgico?

3. O que voc entende por microtomia?

4. Qual o objetivo da colorao?

16 Formao da imagem O condensador um conjunto de lentes situado abaixo da platina que concentra o feixe luminoso. A luz que atravessa o condensador incide na lente objetiva. A imagem formada pela objetiva ser real, maior e invertida. Seguindo seu trajeto, a luz passar agora pela lente ocular, formando uma imagem virtual, maior e direta em relao objetiva. Concluindo, a imagem final do objeto, proporcionada pelo microscpio ser virtual, maior e invertida em relao ao mesmo.

Exerccio Escreva o nmero 2, caneta, em um pedao de papel de 5 cm. Coloque esse papel sobre uma lmina de vidro e depois cubra-o com uma lamnula. Desenhe o que se v vista desarmada e com os aumentos de 40X e 100X. Sem microscpio Aumento de 40X.
ocular) (aumento da

Aumento de 100X.
da ocular)

(aumento

objetiva multiplicada pelo aumento da

da objetiva multiplicada pelo aumento

Quais as diferenas entre a imagem da letra observada com a viso desarmada e a sua imagem vista ao microscpio?

17 Clulas da Mucosa Oral - Coloque uma gota de soluo salina sobre uma lmina. - Com um palito de fsforo faa uma suave raspagem na mucosa bucal. - Transfira o material para a gota de soluo salina. - Cubra o material com lamnula e observe ao microscpio, utilizando as lentes objetivas de 4, 10 e 40X. - Inicie a focalizao do material com o diafragma fechado, porm, regulando a sua abertura a cada mudana de objetiva. - Aps a observao com a lente objetiva de 40X, volte lente objetiva de 10X e retire a lmina do microscpio. - Coloque uma gota do corante azul de metileno em uma das bordas da lamnula. - Encoste um pedao de papel de filtro no lado oposto ao da gota de corante.O papel absorver a soluo salina, permitindo que o corante passe por capilaridade para o espao entre a lmina e a lamnula. - Aguarde alguns minutos e observe o material ao microscpio. - Inicie a focalizao regulando abertura do diafragma a cada mudana de lente objetiva. - Aps a observao, responda s questes de a a e. a. Esquematize uma clula, observando o material com a lente objetiva de 40X e indique o ncleo, o citoplasma e o limite celular.

Aumento: _____

b. Por que na questo anterior foi dito limite celular e no membrana plasmtica? _________________________________________________________________________ c. Houve dificuldades na observao das clulas antes da colorao? Justifique. _________________________________________________________________________

18 d. Qual foi o efeito do corante sobre as clulas? ___________________________________________________________________

Problemas de interpretao de cortes (Junqueira e Carneiro, 2000)

A) Artefatos: Ao interpretar os cortes de tecidos deve-se levar em conta as distores causadas pelas tcnicas de processamento. Como exemplos de distores podemos citar a retrao, pregas, precipitados de corantes ou de sujeira.

B) Duas dimenses e trs dimenses: Quando uma estrutura tridimensional cortada em seces muito delgadas, essas parecem ter s duas dimenses: comprimento e largura.

Para se obter uma viso tridimensional do corte faz-se necessrio a realizao de seces consecutivas em planos diferentes.

19 Exemplo Represente as formas geomtricas abaixo seccionadas transversalmente e longitudinalmente.

Corte transversal

Corte longitudinal

20 CROMATINA E CROMOSSOMOS (Carvalho e Recco Pimentel, 2001) Cromatina o complexo de DNA, protenas histnicas e no histnicas, presente no ncleo de clulas em interfase. Molculas de RNA podem fazer parte temporariamente desse complexo. Durante a fase de diviso celular, a cromatina sofre alteraes em sua morfologia, composio e funo, apresentando-se sob a forma de unidades individualizadas conhecidas por cromossomos. Nos ncleos interfsicos, a cromatina pode se apresentar frouxa ou compactada, granulosa ou filamentosa e com distribuio textural variada, quando se consideram clulas de um mesmo tecido ou, at mesmo, tipos celulares em diferentes momentos fisiolgicos, sendo assim identificados diferentes fentipos nucleares. Em nvel ultra-estrutural, a cromatina mostra-se constituda por uma estrutura filamentosa com cerca de 10 a 30 nm de espessura, que sofre nveis adicionais de empacotamento. Como esse filamento se encontra organizado no interior dos ncleos ou mesmo constituindo os cromossomos, somente pde ser compreendido com a associao de tcnicas bioqumicas, de biologia molecular e de microscopia eletrnica mais modernas, tendo sido muito importante, em todos os casos, o emprego de enzimas especiais, como as endonucleases.

NUCLOLO O nuclolo a estrutura celular facilmente visvel, mesmo sem colorao e in vivo, em microscopia de luz comum, o que possvel graas ao seu ndice de refrao mais elevado do que o dos outros elementos do ncleo e do citoplasma. Embora j tivesse sido descrito por Fontana, em 1781, sua denominao, como a conhecemos hoje, foi dada por Valentim somente em 1839. O nuclolo a organela celular cuja funo produzir ribossomos. Seu tamanho e forma dependem do estado funcional celular, variando conforme a espcie e, dentro de uma espcie, de tecido para tecido e mesmo de clula para clula. Muitas vezes o nuclolo visto prximo periferia nuclear, porm essa no uma regra fixa. Quanto mais forte a sobrecarga funcional celular, maior ser o nuclolo. o que ocorre em clulas em processo de secreo (clulas glandulares e neurnios) e em muitas clulas tumorais. Por outro lado, como exemplo de clulas com nuclolos pequenos, temos as clulas endoteliais e as da glia.

21 Podem ser observados um ou mais nuclolos por ncleo, porm a maioria das clulas possuem apenas um nuclolo. Hepatcitos, clulas vegetais e clulas animais em cultura so alguns exemplos de clulas onde ocorrem mais de um nuclolo. No caso extremo de ocitos de anfbios, podem ser encontrados, em algumas circunstancias, at 3.000 nuclolos por ncleos. Ncleos poliplides, ou seja, com vrios lotes do genoma, geralmente contm mais nuclolos do que ncleos diplides. A falta de uma membrana ao redor do nuclolo pode significar que no exista barreira para difuso entre nuclolo e nucleoplasma. O ncleo se associa a stios cromossmicos especficos (zonas organizadoras do nuclolo, NOR) que carregam os genes codificadores dos RNAr mais pesados. Pode ocorrer uma nica NOR por lote cromossmico haplide. No entanto, dois nuclolos podem se fundir ou uma zona organizadora do nuclolo pode se encontrar distribuda em mais de um cromossomo do lote haplide. Nos seres humanos, por exemplo, os genes para RNAr se situam nas extremidades de 5 diferentes pares cromossmicos. comum tambm se observar uma regio de heterocromatina em ntima associao com o NOR. Em hepatcitos de roedores, a heterocromatina se distribui ao redor do nuclolo, enquanto o inverso ocorre em hempteros sugadores de sangue. Durante o ciclo celular, podem ocorrer alteraes na forma e tamanho dos nuclolos. Costuma-se afirmar que, durante a diviso celular, os nuclolos desaparecem a partir do fim da prfase, reaparecendo no final da telfase. H,no entanto, excees regra.

22 Lmina 69 Corte de Fgado Aps fixar a lmina sobre a platina, focalize o material em menor aumento (objetiva de 4 vezes). Olhando pela ocular, movimente o charriot a fim de visualizar o corte histolgico por inteiro. Agora, utilizando a objetiva de mdio aumento (objetiva de 10 vezes), observe o aspecto esponjoso do fgado e suas cavidades delgadas entre as fileiras de clulas. Utilizando a objetiva de grande aumento (40 vezes), identifique os capilares sanguneos sinusides, que se localizam nas cavidades delgadas supracitadas, e as clulas do tecido heptico, tambm denominadas hepatcitos. Em relao aos hepatcitos, procure seu citoplasma (corado em rseo pela eosina); o ncleo (arredondado e corado em roxo pela hematoxilina); no interior do ncleo, observe um ou mais nuclolos (corados em roxo pela hematoxilina). Observao: tcnica de colorao histolgica, hematoxilina e eosina. Identifique: 1. Fileiras de hepatcitos 2. Capilares sinusides 3. Morfologia dos hepatcitos: a. Ncleo b. Nuclolos c. Citoplasma

23

Foto 01 M.E.T.

Aumento: 29.000 X. rea citoplasmtica com algumas organelas visveis. Observe o ncleo vesiculoso, com cromatina dispersa e nuclolo associado a pequenos aglomerados de cromatina densa, que se apresentam, ao M.E., como reas mais escuras.

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Foto 02 M.E.T.

Aumento: 29.000 X. rea de citoplasma envolvendo ncleo denso, com predominncia de cromatina espiralizada, mais eltron-densa, e regies menores de cromatina dispersa.

25 MITOCNDRIA (Carvalho e Recco Pimentel, 2001) As mitocndrias comearam a ser observadas em 1840, em clulas de rim e de fgado, coradas pelo mtodo de Rgaud. As estruturas observadas tinham formas alongadas e arredondadas, respectivamente. Da o nome de mitocndria, juno do termo grego mitos, que quer dizer alongado, e chondrion, que significa pequeno grnulo, em aluso aos aspectos morfolgicos que as mitocndrias podem assumir na clula. As mitocndrias podem ser facilmente distinguidas de outras organelas, mesmo com a clula viva, usando-se um corante chamado verde janus. Este corante, por ser uma substancia redox, capaz de assumir caractersticas de um composto reduzido ou oxidado, em contato com a mitocndria, pode ser oxidado para uma forma corada pelo citocromo c oxidase, um dos componentes da cadeia respiratria. No geral, as mitocndrias exibem formas alongadas, como ocorre em tubos de Malpighi, glndulas salivares de insetos e pncreas de mamferos, mas mitocndrias esfricas tambm so encontradas em intestino e fgado. Alm disso, tcnicas de microcinematografia tm evidenciado que as mitocndrias podem assumir vrias conformaes em diferentes momentos da vida da clula. O tamanho das mitocndrias tambm varivel, podendo medir de 0,2 a 1,0 m de dimetro e de 2 a 8 m de comprimento. A quantidade de mitocndrias tambm varia para clulas de diferentes origens, estando diretamente relacionada demanda energtica da clula. Assim, temos em alguns ovcitos uma quantidade de 300.000 mitocndrias por clula, em ameba gigante pode chegar a 10.000, em hepatcitos de 500 a 1.600, em clulas renais, em torno de 300, em espermatozides cerca de 25 e algumas algas verdes chegam a ter apenas uma mitocndria. As clulas vegetais, em geral, apresentam uma quantidade bem menor de mitocndrias em relao s clulas animais. A distribuio de mitocndrias no interior da maioria das clulas ocorre totalmente ao acaso, mas h casos em que se concentram em regies onde a demanda energtica maior. Em clulas musculares, por exemplo, as mitocndrias esto associadas aos filamentos contrteis que requerem ATP; em espermatozides, elas se localizam na pea intermediria, justamente para facilitar o provimento de ATP para a movimentao da cauda. Muitas vezes, as mitocndrias esto associadas com glbulos de gordura, de forma a

26 expor a maior rea possvel de sua superfcie, em contato como os lipdios e, conseqentemente, aproveitar melhor os cidos graxos resultantes da ao das lipases.

Ultra-Estrutura As mitocndrias podem ser detectadas com microscopia ptica comum, mas detalhes da sua estrutura s so observados com o uso de um microscpio eletrnico. Estas organelas so constitudas de duas membranas, estrutural e funcionalmente distintas. Elas definem dois compartimentos na mitocndria, o espao intermembrana, que separa as membranas interna e externa, e a matriz mitocondrial, que est circundada pela membrana interna. Na matriz podem ser observados ribossomos e alguns glbulos eltron-densos de fosfato de clcio. A membrana interna se invagina para o interior da mitocndria, constituindo as cristas mitocondriais. Estas projees para o interior da organela permitem um considervel aumento da rea da membrana interna, que, como veremos a seguir, o local onde esto os componentes da cadeia respiratria e o complexo enzimtico F1F0 responsvel pela sntese de ATP. As membranas interna e externa so estrutural e funcionalmente diferentes. A utilizao da tcnica de freeze-etching permitiu visualizar o aspecto bastante particulado da membrana interna, enquanto a membrana externa exibia um aspecto mais liso. Logicamente, as diferenas estruturais entre as duas membranas so conseqncias diretas de suas composies qumicas e das interaes entre alguns de seus componentes. A composio qumica das membranas, em geral, de lipdios e protenas, mas a quantidade relativa desse dois componentes pode variar. Assim, a membrana externa contm 50% de lipdios e 50% de protenas, enquanto na interna encontramos apenas 20% de lipdios e 80% de protenas. Entre estas protenas, esto os citocromos, que fazem parte da cadeia respiratria, a ATP sintetase, que participa da sntese do ATP, NADH desidrogenase, que libera um par de eltrons para a cadeia respiratria, a succinato desidrogenase, que catalisa uma das reaes do ciclo de Krebs, a carnitina aciltransferase, que participa da transferncia de cido graxo do espao intermembrana para a matriz mitocondrial, entre muitas outras protenas, quem tm funo de transporte de vrios metablitos.

27 Origem Existem duas teorias para explicar a origem das mitocndrias. Uma delas afirma que a mitocndria surgiu de uma associao simbitica entre um eucarioto anaerbico e um procarioto aerbico. A outra teoria, no simbitica, defende a idia de que a mitocndria deve ter surgido de um processo que envolvia invaginao de membrana de um procarioto, contento componentes da cadeia respiratria e complexo ATP sintetase, seguido do desprendimento daquele segmento de membrana e subseqente incorporao de fragmento de molcula de DNA. Hoje h fortes indicaes de que as mitocndrias tenham origem simbitica. Alguns aspectos que favorecem esta teoria so: 1. A dupla hlice de DNA encontrada em mitocndrias circular, tal como ocorre em bactrias. 2. Os mitorribossomos tm um coeficiente de sedimentao em torno de 55S, sendo, portanto, mais prximos daquele encontrado em bactrias, que de 70S, enquanto os ribossomos encontrados no citosol de eucariotos tm 80S. 3. A sntese de protenas em mitocndrias inibida por cloranfenicol, o mesmo antibitico que inibe a sntese de protena em procarioto, porm, no citosol, a sntese inibida por cicloheximida. 4. O aminocido iniciador da sntese de protenas em mitocndria o formilmetionina, da mesma forma como ocorre em bactrias. O genoma mitocondrial dos animais em geral carrega uma quantidade mnima de genes, juntamente com algumas seqncias no codificadoras, mas que servem para regular a atividade gnica. O tamanho compacto do genoma das mitocndrias de hoje provavelmente resultado de uma gradual transferncia de genes da mitocndria para o genoma nuclear.

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Foto 07 M.E.T.

Aumento: 20.000 X. rea de citoplasma mostrando parte do ncleo, gotas lipdicas (G) e numerosas mitocndrias esfricas (M), com grande nmero de cristas em forma de tbulos cortados transversalmente.

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Foto 04 M.E.T.

Aumento: 65.000 X. rea de citoplasma apresentando vesculas dilatadas e presena de mitocndrias de forma alongada. Observe alguns de seus componentes ultraestruturais: membrana externa, membrana interna com cristas, espao intermembranoso e matriz mitocondrial.

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Foto 08 M.E.T.

Aumento: 16.000 X. rea citoplasmtica com grande quantidade de mitocndrias esfricas (M): na foto superior (A) so mitocndrias vistas ao M.E. de varredura e, na foto inferior (B), mitocndrias vistas ao M.E. de transmisso.