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Cual es el objetivo de realizar Biotecnologa animal? A.

Se pueden generar animales modificados (animales transgnicos) para muchos propsitos, que sirvan de modelos a enfermedades humanas o introducir nuevos caracteres a animales importantes en produccin como vacas o peces Mtodos genticos como seleccin asistida por marcadores (MAS) ayuda a identificar zonas en el cromosoma con caracteres importantes como crecimiento Los genes se pueden transferir a travs de especies, familias e incluso reinos como resultado de tecnologa del DNA recombinante Los principales objetivos de la biotecnologa animal son razas que sean ms nutritivas y animales econmicamente ms productivos, incrementen el crecimiento y desarrollo, as como anticuerpos y produccin de vacunas

Biotecnolog Biotecnologa animal

B. C. D.

Mtodos de transferencia de genes en animales


Para insertar un gen correctamente en un animal, el gen (denominado el transgen) necesita expresarse en el momento adecuado y la cantidad y lugar adecuado del animal Promoters y secuencias reguladoras son esenciales El gen se debe incorporar al cromosoma para una expresin adecuada

Mtodos de transferencia de genes en animales


Microinyeccin 1. La inyeccin del gen de inters en un huevo fertilizado de un animal donador 2. El gen debe ser insertado antes que la primera divisin celular de tal modo que todas las clulas del animal contienen el gen

3.

Los pasos en el proceso son: a. Identificaci Identificacin (y a veces modificaci modificacin por mutaci mutacin) de un gen de inter inters b. Inserci Insercin del gen de inter inters en el vector apropiado c. Microinyecci Microinyeccin del DNA dentro del pronucleo de un huevo fertilizado d. Implantaci Implantacin del huevo microinyectado en una madre de alquiler e. Permitir el desarrollo del embri embrin hasta su nacimiento f. Demostraci Demostracin que el gen ha sido incorporado de manera estable en el genoma huesped y es heredado en la descendencia g. Demostrar que el gen se expresa y es correctamente regulado en el organismo del huesped

Transferencia gnica de clula madre embrionaria

4. Animales fundadores, fundadores, que son los animales que tienen el nuevo gen en las c ) clulas germinales (reproductivas (reproductivas) se cruzan para establecer nuevas l lneas gen genticas con las caracter caractersticas de inter inters 5. Se ha desarrollado la Microscop Microscopa diferencial de interferencia de manera que el el n n cleo de los huevos son visibles para insertar en las madres lo antes posible 6. Problemas potenciales: potenciales: a. Sobreviven pocos huevos inyectados b. El gen se inserta al azar en los cromosomas c. No todas las c clulas del animal reciben el gen d. El gen no se expresa lo suficiente

1.

(ES) Clulas indiferenciadas que se dividen para producir clulas diferenciadas mientras mantienen sus caractersticas de indiferenciadas (llamadas clulas pluripotentes) 2. Clulas madre embrionarias Embryonic stem (ES) cells se usan para promover reemplazamiento gnico dirigido (recombinacin homloga) de manera que el gen se inserta en el cromosoma adecuado 3. Los pasos son los siguientes: a. Clulas ES se extraen del embrin b. El gen de inters se inserta en las clulas (llamado transfeccin) c. El gen es dirigido por recombinacin homloga y marcadores de seleccin d. Las clulas ES con el gen adecuado se inyectan en embriones parcialmente desarrollados denominados blastocitos, que se implanta en una madre e. La descendencia es cribada por el caracter de inters 4. Se puede usar para modelos de enfermedades humanas como la enfermedad de Gehrig, cancer, Alzheimer, fibrosis cistica

Problemas con recombinacin homloga


Recombinacin no-homloga frecuente

Solucin: vectores de reemplazo


La construccin KO contiene 1) Gen neoR Flanqueado por 2) 2 segmentos de gen objetivo y 3) El gen HSVtk

Parte del gen se reemplaza con neoR


Clulas ES se seleccionan por la integracin NeoR y contra ka integracin de HSVtk* (NeoR+/ HSVtk-) en ganciclovir

el

to d

de

Vectores de reemplazo
en gm

ge n

lg

en

gm

NeoR

en

5. HSVtk
Plsmido de reemplazo linearizado

Recombinacin homloga

Integracin al azar

NeoR

Puede inactivar gene para monitorizar el efecto en crecimiento o para desarrollar tratamientos 6. Mutag Mutagnesis dirigida en rat ratn a. Inserci Insercin de DNA en un lugar espec especfico del cromosoma b. Genes se pueden tambi tambin inactivar (llamado (llamado KO) c. Los pasos en crear ratones KOs son: 1) Un gen se inactiva al eliminar una parte del gen e insertar un gene de resistencia a antibi antibitico en su lugar. DNA hom homlogo donde la recombinaci recombinacin va a ocurrir flanquea ambos lados del marcador. . El DNA insertado tambi n lleva un gen que marcador tambi produce la piel negra 2) El gen se transfiere a c clulas madres embrionarias. embrionarias. La clulas contendr contendrn dos copias del gen de inter inters y dos copias del de del gen de piel negra (en homozigosis)

NeoR+/ HSVtk-

se

se

to

NeoR+/ HSVtk+
HSVtk convierte ganciclovir en una droga txida y mata clulas HSVtk+

3) Las c clulas se criban con antibi antibiticos para determinar la correcta inserci insercin del DNA 4) Las c clulas madre embrionarias se transfieren a embriones de rat ratn tempranos 5) Los embriones se implantas en madres se permite su nacimiento 6) La descendencia tendr tendrn piel blanca y negra, negra, siendo la piel negra un marcador para el gen eliminado. eliminado. Esto se llama una quimera, quimera, osea un rat ratn con c clulas normales y c clulas modificadas 7) La descendencia se cruzan con un rat ratn blaco y cualquier rat ratn completamente negro ser ser un rat ratn KO, conteniendo el gen inactivado en cada c clula. lula. Esto muestra que el gen inactivado est est presente en todas las c clulas d. El ma maz KO se confirma para el gen diana por PCR

Retrovirus y transferencia g gnica 1. Puede infectar a un animal de manera muy eficiente e integrar DNA en genomas 2. Usa RNA como genoma e infecta c clulas sin matarlas 3. Durante al infecci infeccin el RNA se convierte en DNA por la enzima transcriptasa reversa. reversa. El DNA se integra en el genoma de la clula huesped expres expresndose los genes vricos y formando el virus 4. Puede infectar diferentes tipos celulares con una sola copia de DNA, pero solo puede llevar pequeas candidades de DNA 5. Si el virus se usa como vector, el virus es inactivado eliminando los genes necesarios para el empaquetamiento y transcripci transcripci n reversa

Animales transg transgnicos y sus aplicaciones


A. Animales transg transgnicos tiene genes eliminados (Knockout, KO) o genes a , KI) dependiendo de la aplicaci aadidos (Knockin (Knockin, aplicacin del animal B. Ratones 1. Se usa como modelo para enfermedades humanas bien por KO del gen or reemplazando el gen normal con un gen mutado 2. Es posible usarlos como factor factoras vivas: vivas: a. Productos transg transgnicos como factor IX de coagulaci coagulacin en leche animal b. El gen de inter inters se debe expresar bajo un promotor espec especfico de mamas c. Las prote protenas que se secretan en la leche son m ms f fciles de aislar porque se pueden unir a la membrana plasm plasmtica de clulas de grasa producida en la leche

C.

Vacas 1. Producidas por microinyecci microinyeccin de huevos siguiendo los pasos siguientes: siguientes: a. Coleccionar vulos de terneras sacrificadas b. Maduraci Maduracin del vulo in vitro c. Fertilizaci Fertilizacin del vulo in vitro d. Microinyecci Microinyeccin de DNA en el pron proncleo masculino e. Desarrollar los embriones hasta el estad estado de bl blstula f. Cribar c clulas de embriones es estadod de bl blstula por el gen insertado (transgen ) usando PCR (transgen) g. Implantar los embriones en vacas reci recin fertilizada h. Nacimento de terneros 2. Ingenier Ingeniera gen gentica se usa en alterar composici composicin de la leche para producir prote protenas humanas, humanas, como insulina, insulina, eritropoietina (EPO), y anticuerpos monoclonales

Se pueden generar vacas con una mayor resistencia a enfermedades, enfermedades, reduciendo la cantidad de vacunas, vacunas, antibi antibiticos y visitas de veterinarios 4. Somatotropina bovina recombinante (rBST) ) ha sido aprovada como rBST droga animal y permite a las vacas incrementar la producci produccin de leche hasta un 25%. La controversia es que aunque se ha probado que la rBST no es t txica en humanos y las vacas no tienen mayor cantidad de prote protenas en su cuerpo D. Cerdos, Cerdos, Ovejas y Cabras 1. Modificadas por ingenier ingeniera gen gentica como bioreactores para producir prote protenas como factores VIII y IX de coagulaci coagulacin, hormona del crecimiento e interleukinas 2. Las prote protenas se pueden secretar en leche de ovejas y cabras sin efecto en los animales

3.

3. 4.

Cerdos transg transgnicos tienen problemas como letargo, letargo, piel m ms gruesa, gruesa, problemas de hgado, gado, lceras y artritis El nico xito con cerdos ha sido con somatotropina de cerdo producida en E. coli y usado para tratar cerdos 5. Xenotransplante a. El uso de rganos animales en pacientes humanos b. Cerdos es el nimal elegido puesto que son f fcil de crecer y cruzar, cruzar, tiene rganos de tama tamao similar al humano y pueden ser modificados gen genticamente. ticamente. c. Preocupaciones sobre la tecnolog tecnologa incluye aspectos ticos, ticos, uso de rganos animales en humanos, humanos, y enfermededes como retrovirus end endgenos porcinos (PERV), similar a HIV, que se puede transmitir a humanos

d. El mayor obst obstculo es impedir la respuesta inmune por el cuerpo humano. humano. Cerdos alterados gen genticamente con ant antgenos de superficie modificados, modificados, y la producci produccin de cerdos sin una copia del gen implicada en respuesta inmune e. La primera aplicaci aplicacin ser ser m ms probablemente el transplante de isletas celulares porcinas productoras de insulina de cersos KO (que (que no producen insulina de cerdo) cerdo) para tratar diabetes. Coraz Corazn e h hgado ser sern los primeros rganos transplantados E. Revoluci Revolucin biotecnol biotecnolgica: gica: Humanizac Humanizacon de tejidos y rganos de cerdos 1. PPL Therapeutics ha producido el primer cerdo clonado con un gen inactivado que codifica la enzima 1,3 galactosil transferasa (GT), que cataliza el movimiento de galactosa a la superficie de las clulas del cerdo 2. El sistema inmune humano, humano, que reconoce la galactosa en c lulas extra extraas ataca c clulas o tejidos con el az azcar, car, causando el rechazo de rganos

3.

4.

Cerdos con KO en los dos genes GT se est estn investigado, investigado, junto con cerdos enanos que con tienen PERV y son deseables para xenotransplantes Los receptores usados por el PERV para entrar c clulas se han caracterizado, caracterizado, y un m mtodo de cribado se ha desarrollado para identificar si el PERV est est en c clulas animales, animales, asegurando la inocuidad del xenotransplante

Aves 1. 2.

3.

4.

Productos de granja como el pollo se puede mejorar disminuyendo el contenido de grasa y colesterol de los huevos Los huevos pueden servir como bioreatores para producir prote protenas valiosas a trav travs de conseguir que secreten prote protenas valiosas dentro del huevo Los retrovirus son candidatos para la transfecci transfeccin de embriones en estado de blatodermos. blatodermos. Los problemas mayores es la inestabilidad del gen introducido y el peque pequeo tama tamao. La estructura del vulo hace dificil la penetraci penetracin por microinyecci microinyeccin El uso de liposomas en un posible sistema de transformaci transformacin de clulas del blastodermo. blastodermo. Clulas transformadas se insertan en embriones del huesped debajo del espacio subgerminal para producir un animal quim quimricoL

Propagacin animal
A. Inseminaci Inseminacin artificial 1. Permite animales de inter inters gen gentico ser cruzados m m eficientemente, eficientemente, permitiendo el esperma diluido de un un toro ser inseminado entre 500 y 1000 vacas 2. Usado en ternero para incrementar la frecuencia de caracteres de inter inters 3. Ha incrementado la diversidad gen gentica de animales en extinci extincin entre zool zoolgicos B. Clones animales 1. Clonaci ) ha sido com Clonacin de germoplamas vivos (lifestocks (lifestocks) comn durante los ltimos 20 a aos 2. Las c clulas se pueden separar despu despus de fertilizar (entre (entre 8 y 19 clulas), lulas), y los embriones se pueden desarrollar como gemelos. gemelos. Esto se ha intentado en humanos pero producen embriones defectivos y no se implantaron

3.

Mtodos de transferencia nuclear incrementa el n nmero de descendientes de una hembra a cientos o miles a. La primera clonaci clonacin animal con xito fu fu el de una oveja en 1986, pero los estudios se iniciaron en los 1950s, donde ncleos de c lulas en diferentes estados de desarrollo se c transfirieron a vulos enucleados (sin n ncleo) cleo) para estudiar el desarrollo de una rana leopardo b. La comercializaci comercializacin permite caracteres de inter inters ser propagados y mantenidos en organismos vivos, vivos, para aplicaciones en agricultura y medicina

4.

La clonaci clonacin de Dolly a. Se realiz realiz en 1996 en el instituto Roslyn en Escocia y fue la primera vez que un animal fue clonado usando c c lulas som somticas b. El m m todo usado fue: fue: 1) A c c lulas de ovulo en metafase se les elimin elimin el n n cleo 2) Una c c lula mamaria de oveja en cultivo se le elimin elimin los nutrientes para que entre en el ciclo estacionario G0 3) Las dos c c lulas se fusionaron por choque el el ctrico ( (electrofusi electrofusi n) 4) Las c clulas que se desarrollaron en cultivo para formar un embri embri n se introdujeron en una madre preparada hormonalmente para implantaci implantaci n 5) El embri embri n se desarroll desarroll totalmente y el genotipado de DNA confirm confirm que Dolly era un clon c. Dolly muri muri en 2003 de un c cncer de pulm pulmn normalmente encontrado en ovejas de m m s edad; edad; an anlisis de DNA demostr demostr que los tel tel meros eran m m s cortos de lo normal d. La controversia permanece, permanece, no est est claro si Dolly fue clonada de una clula mamaria o de una c c lula madre embrionaria. Se necesitaron 277 para clonar Dolly, lo que lo hace muy ineficiente

Electrofusin
Clulas se ponen juntas

http://www.brinkmann.com/pdf/cell_fusion.pdf

Pulso de fusin

Fase de Heterokaryon: Producto de fusin ncleos distintos

Fusin inducida por un pulso elctrico

5. por que arm arm tanto revuelo? revuelo? Porque clonar puede producir desarrollos importantes: importantes: a. Se puede estudiar los efectos ambientales en animales id id nticos b. La gen gentica de las enfermedades puede estudiarse en m m s detalle c. Se puede estudiar la gen gen tica del desarrollo en m ms detalle d. Animales modificados gen gen ticamente y clonados posteriormente pueden producir grandes cantidades de prote protenas terap terap uticas humanas en la leche 6. Ratones se clonaron en 1998 usando una inyecci inyecci n de n cleo en vulos enucleados, enucleados, y se han clonado cabras, cabras, conejos y gatos

Regulaci Regulacin de animales transg transgnicos


A. Mucho m ms preocupaci preocupaci n p pblica de animales que de plantas transg transg ncias, ncias, debido a su efecto potencial en el medio ambiente, ambiente, el riesgo a la salud de consumir alimientos modificados gen genticamente La cr crtica tiene preocupaci preocupaci n porque la FDA quiere regular animales modificados gen gen ticamente de la misma manera que drogas animales, animales, animales transg transgnicos pueden ser aprovados demasiado r rpido y sin la revisi revisi n del gobierno

B.

Patente de animales modificados gen genticamente


A. En 1930 el congreso de los EEUU aprob aprob el Acto de patentes, patentes, pero plantas no se patentaron hasta 1970. En 1987, la oficina de patentes de EEUU declar declar que organismos multicelulares no humanos que no ocurren normalmente, normalmente, incluyendo animales se pueden patentar Patentes, Patentes, trademarks, copyrights, y andtrade secrets se consideran propiedad intelectual y hay un gran debate por desarrollos en biotecnolog biotecnologa en los ltimos 15 a aos. os. Mucho debate se ha generado en patentes animales Se incluye interrogantes sobre posibles consecuencias de los usos comerciales de organismos patentados, patentados, incluyendo implicaciones medioambientales, medioambientales, la salud del animal modificado y efectos potenciales del proceso evolutivo Agricultores est estn preocupados de patentes animales, animales, puesto que animales patentados pueden generar un menor n nmero de granjas y ms potentes y peque pequeos granjeros no pueden tener la nueva tecnolog a o animales tecnolog Discusi Discusines abiertas sobre aspectos ticos, ticos, sociales, sociales, y legales osn importatnes para asegura el progreso adecuado de la biotecnolog biotecnologa

B.

C.

D.

E.