A Electroforese Capilar num Laboratrio de Gentica

Instituto de Gentica Mdica Faculdade de Medicina da Universidade de Coimbra

Lus Mesquita

A Electroforese Capilar num Laboratrio de Gentica

A Electroforese Capilar num Laboratrio de Gentica

Objectivos:
Conhecer os princpios laboratoriais da electroforese capilar. Descrever a tcnica de Sequenciao pelo mtodo de Sanger - Tcnica - Anlise - Aplicaes - Outras metodologias de sequenciao Descrever a tcnica de Anlise de fragmentos - Tcnica - Aplicaes

Princpios laboratoriais da electroforese capilar

ELECTROFORESE CAPILAR
Electroforese separao de partculas carregadas por aplicao de um campo elctrico. O capilar o suporte slido, com 25 a 100m de dimetro interno, que contm a fase estacionria (polmero)

A separao depende: - Tempo de migrao - Temperatura - Fora inica do tampo - Intensidade do campo elctrico - Viscosidade do meio

Princpios laboratoriais da electroforese capilar

Os cidos nucleicos migram para o nodo porque a pH neutro tm carga negativa.

A velocidade de migrao inversamente proporcional ao tamanho dos fragmentos gerados.

Sequenciao pelo mtodo de Sanger: Tcnica Terminadores: ddNTP marcados fluorimetricamente onde na posio 3 da
desoxirribose um grupo OH substitudo por um H, impossibilitando o formao de uma ligao fosfodiester e a continuao da reaco de polimerizao.

ddCTP

Sequenciao pelo mtodo de Sanger: Tcnica

1 -Fazendo uma reaco

para cada terminador

Direco da migrao na electroforese

T -

+ s reaco com os 4 terminadores marcados com diferentes fluorocromos

2 Uma

Sequenciao pelo mtodo de Sanger: Tcnica

Sequenciao pelo mtodo de Sanger: Tcnica

Amplificao da sequncia alvo por PCR Purificao do produto PCR Eliminao de primers Eliminao de sais Protocolo de sequenciao Purificao da PCR de sequenciao Eliminao de primers Eliminao de terminadores (ddNTPs) no incorporados Electroforese capilar Interpretao dos dados

Sequenciao pelo mtodo de Sanger: Tcnica

Aps a amplificao da sequncia alvo por PCR Controlo da amplificao com electroforese em gel de agarose a 2 3% Purificao
Isolar a banda

Sequenciao pelo mtodo de Sanger: Tcnica

Protocolo de sequenciao
Adequar a quantidade de produto PCR ao n de pb Isolar bandas se necessrio Purificao

Sequenciao pelo mtodo de Sanger: Tcnica

Protocolo de sequenciao Protocolos de sequenciao
Protocolo normal: Produtos PCR Plasm Plasmdeos Sequncias dif difceis: Estruturas secund secundrias shRNA Conte Contedo em G e C Regies homopolim homopolimricas Regies repetitivas

Normal
96 96 50 60
1min 10seg 5seg 4min 25x

Sequncias difceis
98 98 50 60
1min 25seg 10seg 4min 35x

- PCR enhancer: DMSO a 5% - Terminadores: Aumento

Sequenciao pelo mtodo de Sanger: Anlise computacional dos resultados

Raw data

Sequenciao: Anlise computacional dos resultados

Sequenciao de um plasmdeo

Sequenciao: Anlise computacional dos resultados

Correco dos dados obtidos - Sequencing analysis (AppBio) Gerar uma sequencia consenso, entre a sequencia F e R. - SeqScape (AppBio) - NCBI (alinhamento de 2 seq) - Outros softwares

Sequenciao: Anlise computacional dos resultados

Comparar a sequncia obtida, com outras publicadas NCBI Blast Manual SeqScape (AppBio)

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Sequenciao: Anlise manual dos resultados

Sequenciao pelo mtodo de Sanger: Anlise computacional dos resultados

Formatos (Sequencing file formats) Formato GenBank
- Uma sequncia no formato GenBank pode conter vrias sequncias.

- Uma sequncia no formato GenBank comea com uma linha contendo a palavra LOCUS. - O incio da sequncia, est marcado com a palavra "ORIGIN" - O fim da sequncia est marcado est marcado com duas barras "//. - Tem 60 nucleotidos por linha em grupos de 10.
Exemplo:
LOCUS AB000263 368 bp mRNA linear PRI 05-FEB-1999 DEFINITION Homo sapiens mRNA for prepro cortistatin like peptide, complete cds. ACCESSION AB000263 ORIGIN
1 acaagatgcc attgtccccc ggcctcctgc tgctgctgct ctccggggcc acggccaccg 61 ctgccctgcc cctggagggt ggccccaccg gccgagacag cgagcatatg caggaagcgg 121 caggaataag gaaaagcagc ctcctgactt tcctcgcttg gtggtttgag tggacctccc 181 aggccagtgc cgggcccctc ataggagagg aagctcggga ggtggccagg cggcaggaag 241 gcgcaccccc ccagcaatcc gcgcgccggg acagaatgcc ctgcaggaac ttcttctgga 301 agaccttctc ctcctgcaaa taaaacctca cccatgaatg ctcacgcaag tttaattaca 361 gacctgaa //

Sequenciao pelo mtodo de Sanger: Anlise computacional dos resultados

Formatos (Sequencing file formats)

Formato FASTA - Uma sequncia no formato FASTA pode conter vrias sequncias. - Cada sequncia comea , com uma linha descritiva e dados informativos. - O formato FASTA comea sempre com o sinal ">" na primeira coluna.

Exemplo:
>AB000263 |acc=AB000263|descr=Homo sapiens mRNA for prepro cortistatin like peptide, complete cds.|len=368
ACAAGATGCCATTGTCCCCCGGCCTCCTGCTGCTGCTGCTCTCCGGGGCCACGGCCACCGCTGCCCTGCC CCTGGAGGGTGGCCCCACCGGCCGAGACAGCGAGCATATGCAGGAAGCGGCAGGAATAAGGAAAAGCAGC CTCCTGACTTTCCTCGCTTGGTGGTTTGAGTGGACCTCCCAGGCCAGTGCCGGGCCCCTCATAGGAGAGG AAGCTCGGGAGGTGGCCAGGCGGCAGGAAGGCGCACCCCCCCAGCAATCCGCGCGCCGGGACAGAATGCC CTGCAGGAACTTCTTCTGGAAGACCTTCTCCTCCTGCAAATAAAACCTCACCCATGAATGCTCACGCAAG TTTAATTACAGACCTGAA

Sequenciao: Aplicaes

Sequenciao do genoma humano; Sequenciao de outros genomas com aplicao na biologia, filogenia, alimentao, zootcnia e outros. Controlo de PCR, RFLPs, etc (confirmao de outras metodologias) Identificao de microorganismos (vrus, bactrias e fungos)

o nico mtodo que descreve a sequncia nucleotdica completa

Sequenciao: Aplicaes

- Farmacogentica (NAT2 e a acetilao da Isoniazida, resistncia a

antiretrovirais na SIDA)
-

Tipagem HLA de alta resoluo para transplantes Pesquisa de mutaes em DNA de doentes/possveis portadores particularmente til nas situaes monognicas com heterogeneidade allica (BRCA1/2; HNPCC, ) Identificao de mutaes em tumores: para avaliao prognstica e seleco teraputica (ex: mutaes do EGFR e kRAS e cancro do pulmo) Identificao de alteraes epigenticas: metilao das regies promotoras

Sequenciao: Aplicaes
Metilao

- Metilao de C em resduos CpG nas regies promotoras - Silenciamento transcricional - Converso da citosina metiladas a uracil com bissulfito

Antes do bisulfito

Aps bisulfito

Sequenciao: Outros mtodos de sequenciao

Outros mtodos de sequenciao: - Maxam Gilbert - 454 Life Sciences/Roche - Illumina - Solid/Applied Biosystems
Massively parallel sequencing

Anlise de fragmentos: Tcnica

Gerar produtos marcados fluorimetricamente PCR de amplificao, com um dos primers marcados. Sondas especficas para a regio em estudo.

Anlise de fragmentos: Aplicaes

Rastreio de mutaes Anlise de STRs (Short Tandem Repeats) Pesquisa de Indels (Insertions/Delections) Multiplex Ligantion-dependent Probe Amplification (MLPA) Estudo de RNA de protenas inflamatrias Cancro hereditrio Farmacogenmica Cromossomopatias;

OLA (Oligonucleotide Ligation Assay)

Anlise de fragmentos: Aplicaes

Mtodos de rastreio de mutaes

Indicaes: heterogeneidade allica e gentica Anlise conformacional

HA-CAE (Heteroduplex analysis-capillary array electrophoresis) SSCP (Single strand conformation polymorphism etc
Desvantagens: - n de amostras muito grande - Polmero Conformation Analysis Polymer (CAP)

Anlise de fragmentos: Aplicaes

Mtodos de rastreio de mutaes
Cancro hereditrio da mama Normal

PCR Fragmentos gnicos correspondentes aos exes

Mtodos de rastreio: DGGE, SSCP, HA-CAE Para identificar o segmento suspeito

Sequenciao do segmento suspeito

Mtodos de rastreio de mutaes: HA-CAE

Seq. normais

Identificao de um perfil de migrao anmalo

Mtodos de rastreio de mutaes: SSCP

Mtodo mais usado

Anlise de fragmentos: Aplicaes Caracterizao de STRs

...AGCATTATCC primer ...AGCATTATCC primer GTA

GTA

GTA

GTA

ACTGTTA... primer

(GTA)n, n=3
ACTGTTA... primer

GTA

GTA

GTA

GTA

(GTA)n, n=5

PCR com um primer marcado Electroforese capilar em condies desnaturantes: - Diluio da amostra em gua - Diluio da amostra em formamida - Desnaturao 96C 3min - 4C sobre glo 3min

Anlise de fragmentos: Caracterizao de STRs

(TTTA)n

266 pb + nx4 STRs (Short Tandem Repeats) CYP19 (TTTA)n (intro 4) identificado por electroforese capilar, em sequenciador automtico, de produtos de PCR obtidos utilizando o primer proximal marcado com 6FAM. Amostra de heterozigoto, sendo visveis a azul dois picos de 302 e 318pb, correspondentes a 9 e 13 repeties, respectivamente. Utilizou-se o marcador de peso molecular 500 LIZ (picos a laranja).

Sequenciao que confirma a existncia de 12 repeties TTTA correspondendo a um fragmento de 314pb de um indivduo homozigoto.

Anlise de fragmentos: STRs

Aplicaes
Estudos de associao Medicina Forense Controlo de transplantes medulares Controlo de linhas celulares

Identifiler

Anlise de fragmentos: Pesquisa de Indels

Aplicao: Pesquisa de deleces (9 a 24pb) do exo 19 do EGFR em carcinoma epidermide do pulmo

Tecido tumoral del15 pb

Tecido normal

Anlise de fragmentos: Pesquisa de Indels

Deleces no exo 19 do EGFR de NSCLCs sensveis aos ITKs, gefitinib ou erlotinib

Pao W et al. PNAS 2004;101:13306-13311

Anlise de fragmentos: MLPA

Estudo quantitativo do n de cpias mltiplas sequncias (DNA ou RNA) em simultneo Baseia-se na utilizao de sondas especficas para cada sequncia, com prolongamentos comuns a todas as sondas, desenhados de modo a criar sequncias de dimenses diferentes; Os primers so universais e vo ligar-se aos prolongamentos das sondas As sequncias so identificadas pelo seu comprimento especfico; A intensidade do sinal vai ser proporcional ao n de cpias da sequncia alvo

Anlise de fragmentos: MLPA

/cDNA

Electroforese capilar em condies desnaturantes: - Diluio da amostra em formamida - Desnaturao 96C 3min - 4C sobre glo 3min

Anlise de fragmentos: MLPA

Aplicaes
Estudo de expresso gnica (RNA)
ex: protenas inflamatrias

Identificao de deleces e duplicaes em genes responsveis por doenas hereditrias

ex: cancro da mama hereditrio, neurofibromatose;

- Identificao de deleces e duplicaes em genes de metabolismo

ex: farmacogenmica

Identificao de deleces e duplicaes cromossmicas

ex. atraso mental de causa desconhecida

Anlise de fragmentos: MLPA

Reaco multiplex: - cDNA de 45 protenas inflamatrias

Anlise de fragmentos MLPA: aplicao ao cancro da mama hereditrio

Anlise do BRCA1 por MLPA

A diminuio da altura dos picos identifica deleces

Anlise de fragmentos : MLPA

Diagnstico de microdeleo de novo em 1p

Com sonda marcada e primers especficos de sequncias de regies subtelomricas de vrios cromossomas

Anlise de fragmentos: Oligonucleotide Ligation Assay (OLA)

Determinao das 31 mutaes mais frequentes do gene CFTR, presentes na mucoviscidose, por OLA

Mutao em heterozigotia em local de splicing

realizada uma PCR multiplex a que se segue a ligao de sondas. As sondas so desenhadas de modo a que as sequncias mutadas e no mutadas se distingam por diferentes comprimentos e diferentes fluorescncias.

A Electroforese Capilar num Laboratrio de Gentica

Objectivos:
Analisar electroferogramas Identificar mutaes

Analisar electroferogramas
Troubleshooting

Dyeblobs

Regies difceis

Analisar electroferogramas
Troubleshooting

Pouca descriminao perto dos primers

Mltipla ligao de primer

Analisar electroferogramas
Troubleshooting

Pouco DNA, DNAses, primer ineficaz

Analisar electroferogramas

Sobreposio de mltiplos picos: dois produtos PCR no detectveis em gel de agarose a 1,5%

Identificar mutaes: Casos prticos

NAT2 Genotipagem
DNA
NAT2 N-acetyltransferase 2 (arylamine N-acetyltransferase) Genebank accession: NT_030737 6102361 6102421 6102481 6102541 6102601 6102661 6102721 6102781 6102841 6102901 6102961 6103021 6103081 6103141 6103201 6103261 6103321 6103381 6103441 6103501 6103561 tacctataat gtttttcttg aactctagga gctgttccct gctatttttg cttctgtact tacatccctc attgacggca cctctagaat gaagagagag gaatttctta cttgaacctc acatcttcat ttggtgggct gagtttaaaa tccttgggga gaacaaaata tcagatatcc atccataaaa cattttcaaa cagagtgatt tagtcacacg aggaaatcaa atgctaaagt atgatatgtt tttatgtttt cttag[gggat catggacatt gaagcatatt ttgaaagaat tggctataag acaaattgga cttggaaaca ttaactgaca ttcttgagca ccagatccgg ttgagaacct taacatgcat tgtgggcaag ccatggagtt gggcttagag atcacattgt aagaagaaac cggggtgggt ggtgtctcca ggtcaatcaa gggctctgac cacaatcggt tttcagacca caatgttagg agggtatttt cagttaacaa atacagcact ggcatggttc accttctcct gcaggtgacc ggaattacat tgtcgatgct gggtctggaa gctcctccca gatgtggcag taatttctgg gaaggatcag cctcaggtgc cttgcatttt ctgcttgaca gaatctggta cctggaccaa atcaggagag agcagtatat tacaaacaaa attctcatct cctgccaaag aagaaacacc aaaaaatata cttatttacg gaacaattga agattttgag tctatgaata catacctgca gacgtctcca ttataaccac atcattttgt tccttgcaga ccccagaagg ggtttactgt tcatcctcac ctatagaaaa ttcaattata aagacaatac agatctggtc ctctcactga ggaagaggtt gaagaagtgc tgaaaaatat atttaagatt gaaatctcgt gcccaaacct ggtgatggat cccttactat ttagaataag aacccttgtg tatgtatcac ccaactcact aattatcaac ttatgtgcta tctctaccct cacgttattt tgaagaaaat cctaaacatc aaatactttc atgtcagcat ttattaaaaa acaataactt tttaaagaaa cataaggaca ttaataaaaa taaaggcatt ttaaggatgg cctgtgatta tcttgggaag catgctagaa aacatttaat attgatttat gttgaattc] Segmento 2 434A>C 481C>T 590G>A 803A>G 845A>C 857G>A Base n 1 [DNA=RNA]

Segmento 1 111T>C 191G>A 282C>T 341T>C

Identificar mutaes: Casos prticos

Polimorfismo/Mutao em homozigotia

DUPLICADO Sequenciao - casos prticos

Polimorfismo/Mutao em heterozigotia

Identificar mutaes: Casos prticos

Wild-type aaaatt cccgtcgcta tcaaggaatt aagagaagca acatctccga

Escreva qual o alelo mutado.

Identificar mutaes: Casos prticos

Del15pb Mutant aaaatt cccgtcgcta tcaagacatctccga

Identificar mutaes: Casos prticos

Wild type aatgcacctggttcttttactaagtgttcaaataccagtgaacttaaagaat

Escreva qual o alelo mutado.

Identificar mutaes: Casos prticos

c.2231_2259dup20. Frameshift

Mutant aatgcacctggttcttttactatgcacctggttcttttactaagtgttcaaataccagtgaacttaaagaat

Identificar mutaes: Casos prticos

Wild-type agaaagaata aatactgcag attatgtagg aaattatttgtatgaaaata attcaaacag tactatagct

Escreva qual o alelo mutado.

Identificar mutaes: Casos prticos

c.5374_5377delTATG. Frameshift

Mutant agaaagaata aatactgcag attatgtagg aaattatttgaaaata attcaaacag tactatagct

Identificar mutaes: Casos prticos

Como classifica a mutao?

BRCA2 - c.2624A>G. p.K1132K.

Wild type: ttt gaa ttt act F E F T Mutada: ttt gaa ttt act F E F T

cag ttt aga aaa cca agc tac ata ttg cag aag agt Q F R K P S Y I L Q K S cag ttt aga aag cca agc tac ata ttg cag aag agt Q F R K P S Y I L Q K S

Mutao em local de splicing no gene LCA5 associada amaurose congnita de Leber

Pai saudvel

Doente

Causa frequente de dfice visual grave congnito. Situao monognica com heterogeneidade gentica, com mutaes descritas em mais de 13 genes . Qual a mutao? A doena dominante ou recessiva? A mutao localiza-se na ltima base do exo 6. Como poderemos verificar se interfere com o splicing?

RT-PCR para caracterizao do mRNA

(continuao)

Exo 6

Exo 7

Exo 6

Exo 7

A sequenciao do produto de RT-PCR mostrou que a mutao levou utilizao de um segundo local de splicing, localizado no intro 6, do que resultou a insero de 5 bases (GTATG) do intro 6, efeito de frameshift e a criao de um codo stop prematuro.