Boletim Tcnico

NOVEMBRO 2011

20
ISSN 0104-9089

BOLETIM TCNICO DA FUNDAO ESTADUAL DE PESQUISA AGROPECURIA Secretaria da Agricultura, Pecuria e Agronegcio Rio Grande do Sul - Brasil

Manual de Coleta e Remessa de Amostras para DIAGNSTICO Laboratorial Veterinrio

Alexander Cenci Alexandre de Carvalho Braga Benito Guimares de Brito Cristine Cerva Fabiana Quoos Mayer Fernando Srgio Castilhos Karam Joo Ricardo de Souza Martins Jos Antnio Simes Pires Neto Jlio Csar de Almeida Rosa Kelly Cristina Tagliari de Brito Mario de Menezes Coppola Maurcio Gauterio Dasso Paulo Michel Roehe Rovaina Laureano Doyle Sandra Maria Borowski

GOVERNO DO ESTADO DO RIO GRANDE DO SUL SECRETARIA DA AGRICULTURA, PECURIA E AGRONEGCIO FUNDAO ESTADUAL DE PESQUISA AGROPECURIA

Boletim Tcnico
MANUAL DE COLETA E REMESSA DE AMOSTRAS PARA DIAGNSTICO LABORATORIAL VETERINRIO

Alexander Cenci Alexandre de Carvalho Braga Benito Guimares de Brito Cristine Cerva Fabiana Quoos Mayer Fernando Srgio Castilhos Karam Joo Ricardo de Souza Martins Jos Antnio Simes Pires Neto Jlio Csar de Almeida Rosa Kelly Cristina Tagliari de Brito Mario de Menezes Coppola Maurcio Gauterio Dasso Paulo Michel Roehe Rovaina Laureano Doyle Sandra Maria Borowski

PORTO ALEGRE, RS 2011

FUNDAO ESTADUAL DE PESQUISA AGROPECURIA - FEPAGRO Diviso de Comunicao Social Programa de Editorao e Publicaes Rua Gonalves Dias, 570 Bairro Menino Deus Porto Alegre/RS CEP 90130-060 Telefone: (51) 3288-8000 Fax: (51) 3233-7607 www.fepagro.rs.gov.br fepagro@fepagro.rs.gov.br editoracao@fepagro.rs.gov.br Comisso Editorial: Luciano Kayser Vargas Presidente; Andr Dabdab Abichequer; Bernadete Radin; Lia Rosane Rodrigues; Paulo Roehe; Rodrigo Favreto; Simone Linck; Zlia M. de Souza Castilhos. Diviso de Comunicao Social: Simone Linck Coordenadora de Comunicao Social; Fernando Kluwe Dias Fotgrafo; Gislaine Freitas Jornalista MTb 6637; Lia Rosane Rodrigues Coordenadora do Programa de Editorao e Publicaes; Nmora Arlindo Rodrigues Bibliotecria CRB 10/820; Diego Luis Policeno dos Santos Estagirio de Biblioteconomia; Rafaela dos Santos Estagiria de Design Grfico. Tiragem: 500 exemplares CATALOGAO NA FONTE
BOLETIM FEPAGRO, Boletim Tcnico da Fundao Estadual de Pesquisa Agropecuria / FEPAGRO ; Secretaria da Agricultura, Pecuria e Agronegcio Porto Alegre, 2011. ISSN 0104-9089 Contedo: n. 20, Cenci, Alexander et al. CDU 636.09

I Cenci, Alexander ; II Braga, Alexandre de Carvalho ; III Brito, Benito Guimares ; IV Cerva, Cristine ; V Mayer, Fabiana Quoos ; VI Karam, Fernando Srgio Castilhos ; VII Martins, Joo Ricardo de Souza ; VIII Simes Pires Neto, Jos Antnio ; IX Rosa, Jlio Csar de Almeida ; X Brito, Kelly Cristina Tagliari de ; XI Coppola, Mrio de Menezes ; XII Dasso, Maurcio Gautrio ; XIII Roehe, Paulo Michel ; XIV Doyle, Rovaina Laureano ; XV Borowski, Sandra Maria XVI Ttulo. 1 Sanidade animal anlises clnicas REFERNCIA CENCI, A. ; BRAGA, A. de C. ; BRITO, B. G. ; CERVA, C. ; MAYER, F. Q. ; KARAM, F. S. C. ; MARTINS, J. R. de S. ; SIMES PIRES NETO, J. A. ; ROSA, J. C. de A. ; BRITO, K. C. T. de ; COPPOLA, M. de M. ; DASSO, M. G. ; ROEHE, P. M. ; DOYLE, R. L. ; BOROWSKI, S. Manual de Coleta e Remessa de Amostras para Diagnstico Laboratorial Veterinrio. Porto Alegre : FEPAGRO, 2011. Boletim Tcnico, n. 20. Acesse a verso online desta publicao em www.issuu.com/fepagro

Apresentao
O Instituto de Pesquisas Veterinrias Desidrio Finamor (IPVDF), localizado em Eldorado do Sul, RS, e pertencente Fundao Estadual de Pesquisa Agropecuria (Fepagro), tem como misso maior atuar no desenvolvimento de pesquisas, realizar anlises laboratoriais para diagnstico das principais enfermidades das espcies domsticas de interesse econmico, formar recursos humanos e difundir tecnologias atuando como centro de referncia em sanidade animal e sade pblica para o Rio Grande do Sul. O presente manual tem por finalidade servir de fonte de informao aos Mdicos Veterinrios que atuam no campo, orientando sobre os procedimentos bsicos de coleta e remessa de materiais biolgicos para confirmao de suspeitas clnicas e complementaridade do diagnstico clnico. Os exames laboratoriais disponveis abrangem provas bacteriolgicas, virolgicas, parasitolgicas, histopatolgicas e moleculares. Os Mdicos Veterinrios que integram os diferentes laboratrios encontram-se disposio para auxiliarem em casos de ocorrncia de suspeitas de surtos de enfermidades em campo, atravs de consultas telefnicas ou meio eletrnico.

Corpo Tcnico da Fepagro Sade Animal Instituto de Pesquisas Veterinrias Desidrio Finamor Diretor Maurcio Gauterio Dasso Laboratrio de Bacteriologia Mario de Menezes Coppola Laboratrio de Biologia Molecular Cristine Cerva Fabiana Quoos Mayer Laboratrio de Brucelose Maurcio Gauterio Dasso Laboratrio de Histopatologia Anglica Cavalheiro Bertagnolli Fernando Srgio Castilhos Karam Laboratrio de Leptospirose/Epidemiologia Jos Antonio Simes Pires Neto Rogrio Oliveira Rodrigues Laboratrio de Parasitologia Joo Ricardo de Souza Martins Jos Reck Jnior Rovaina Laureano Doyle Laboratrio de Patologia Suna Sandra Maria Borowski Laboratrio de Sade das Aves Benito Guimares de Brito Kelly Cristina Tagliari de Brito Laboratrio de Virologia Alexandre de Carvalho Braga Jos Carlos Ferreira Julio Cesar de Almeida Rosa Lissandra Souto Cavalli Paulo Michel Roehe

Sumrio
I. COLETA E REMESSA DE AMOSTRAS PARA
DIAGNSTICO LABORATORIAL VETERINRIO .......................9

1. COLETA DE AMOSTRAS......................................................... 9 2. CONSERVAO E ACONDICIONAMENTO

DAS AMOSTRAS .................................................................... 10

3. IDENTIFICAO DE AMOSTRAS ......................................... 13 4. FORMULRIO PARA SOLICITAO DE EXAMES .............. 14 5. TRANSPORTE DE AMOSTRAS ............................................ 16 6.
REMESSA DAS AMOSTRAS PARA O IPVDF ...................... 17 6.1 COMO ENVIAR POR EMPRESA TRANSPORTADORA ......17 6.2 ENDEREO PARA REMESSA DE AMOSTRAS AO IPVDF ............................................. 17 6.3 PAGAMENTO DOS SERVIOS PRESTADOS............... 17 6.4 CONTATOS...................................................................... 17 II. COLETA DE AMOSTRAS PARA EXAME B ACTERIOLGICO .......................................................19

7. AMOSTRAS PARA EXAME BACTERIOLGICO.................. 19

7.1 VSCERAS ....................................................................... 19 7.2 SANGUE .......................................................................... 20 7.3 EXSUDATO E PUS.......................................................... 20 7.4 AMOSTRAS DE LEITE PARA DIAGNSTICO DE MASTITE BOVINA ........................................................... 21 7.5 AMOSTRAS PARA DIAGNSTICO DE CARBNCULO HEMTICO (ANTRAZ) .......................... 22 7.6 AMOSTRAS PARA DIAGNSTICO DE LEPTOSPIROSE ..................................................................22

7.7 AMOSTRAS PARA DIAGNSTICO DE TUBERCULOSE......23 7.8 AMOSTRAS PARA DIAGNSTICO DE BRUCELOSE ...........24 7.8.1 EXAME DIRETO (BACTERIOLGICO).................. 24 7.8.2 EXAME INDIRETO (SOROLGICO) ...................... 25 7.8.3 ESPCIES ANIMAIS E TESTES SOROLGICOS REALIZADOS NO IPVDF PARA DIAGNSTICO DE BRUCELOSE ..................................................... 28

8. ANTIBIOGRAMA .............................................................. 29 9. DOENAS BACTERIANAS DIAGNOSTICADAS

NO IPVDF E AMOSTRAS A SEREM COLETADAS ....... 30

III. COLETA DE AMOSTRAS PARA EXAME VIROLGICO .......31 10. AMOSTRAS PARA EXAME VIROLGICO ....................... 31 11. TESTES SOROLGICOS ................................................. 32 12. COLETA PARA DOENAS VIRAIS ................................... 33
12.1 RGOS E TECIDOS................................................ 33 12.2 AMOSTRAS PARA DIAGNSTICO DE RAIVA ......... 34 12.2.1 CUIDADOS NA COLETA.................................. 34 12.2.2 INSTRUES PARA COLETA......................... 34 12.3 SECREES ............................................................. 35 12.4 SANGUE ..................................................................... 36 12.5 SORO ......................................................................... 36

13. DOENAS VIRAIS DIAGNOSTICADAS NO IPVDF,

TESTES REALIZADOS E MATERIAIS A SEREM ENVIADOS ..................................................................39

14. FRMULAS........................................................................ 40

IV. COLETA DE AMOSTRAS PARA EXAME PARASITOLGICO .....41 15. AMOSTRAS PARA EXAME PARASITOLGICO .............. 41
15.1 ENDOPARASITOS .................................................... 41 15.2 ECTOPARASITOS...................................................... 43 15.3 HEMOPARASITOS ..................................................... 45

16. FRMULAS........................................................................ 46 V. COLETA DE AMOSTRAS PARA EXAME HISTOPATOLGICO ....47 17. AMOSTRAS PARA EXAME HISTOPATOLGICO ............. 47 18. COLETA DE AMOSTRAS QUANDO A SUSPEITA
FOR INTOXICAO ........................................................... 49 18.1 INTOXICAO POR PLANTAS .................................. 49 18.1.1 COLETA DA PLANTA PARA IDENTIFICAO ......50 18.2 INTOXICAO POR FUNGOS .................................. 51 18.3 INTOXICAO POR PRODUTOS QUMICOS ......... 51

VI. COLETA DE AMOSTRAS PARA O LABORATRIO DE

PATOLOGIA SUNA .................................................................52

19. AMOSTRAS PARA O LABORATRIO DE PATOLOGIA SUNA.... 52

19.1 DOENAS BACTERIANAS DIAGNOSTICADAS NO LABORATRIO DE PATOLOGIA SUNA DO IPVDF ....... 53

VII. COLETA DE AMOSTRAS PARA O LABORATRIO DE

BIOLOGIA M OLECULAR ........................................................54

20. AMOSTRAS PARA O LABORATRIO DE BIOLOGIA

MOLECULAR ..................................................................... 54

VIII. COLETA DE AMOSTRAS PARA DIAGNSTICO DE DOENAS DAS AVES ....................................................................56 21. AVES VIVAS OU MORTAS ............................................... 57

22. RGOS. .......................................................................... 58 23. SUABES ............................................................................ 59

23.1 TRAQUEIA................................................................ 59 23.2 CLOACA ................................................................... 59 23.3 ARRASTO................................................................. 60

24. SORO ................................................................................ 60 IX. COLETA DE AMOSTRAS DE RAO E FARINHAS

DE ORIGEM ANIMAL PARA EXAME MICROBIOLGICO ......62

25. AMOSTRAS ACONDICIONADAS EM EMBALAGENS

INDIVIDUAIS............................................................................... 62

26. AMOSTRAS ACONDICIONADAS EM EMBALAGENS

NO INDIVIDUAIS ............................................................... 62

X. COLETA DE AMOSTRA DE GUA PARA EXAME

DE CONTAMINAO BACTERIANA .......................................64

27. COLETA DE GUA EM TORNEIRAS E BEBEDOUROS .........65

27.1 PROCEDIMENTOS DE COLETA ................................. 65

28. COLETA DE GUA EM RIOS, POOS, CAIXAS DGUA

E RESERVATRIOS EM GERAL. ..................................... 68 28.1 PROCEDIMENTOS DE COLETA ................................. 68

XI. COLETA DO ENCFALO NA NECROPSIA DE BOVINOS 29. RETIRADA DO ENCFALO ............................................... 70 30. COLETA E SELEO DE AMOSTRAS DO ENCFALO PARA
VIROLOGIA, BACTERIOLOGIA E HISTOPATOLOGIA...........70

XII.

REFERNCIAS .......................................................................80

XIII. ANEXO 1 FORMULRIO DE SOLICITAO DE EXAMES ......83

I Coleta e Remessa de Amostras para Diagnstico Laboratorial Veterinrio

1 Coleta de amostras
Para o diagnstico laboratorial ser realizado com sucesso, importante uma boa anamnese, suspeita clnica fundamentada e amostra coletada corretamente. A qualidade da amostra recebida essencial para o diagnstico. A coleta e o transporte inadequados dificultam ou at inviabilizam o isolamento do agente etiolgico e, por consequncia, o diagnstico da enfermidade. Durante a coleta de material biolgico, h risco de exposio a agentes potencialmente causadores de doenas ao ser humano, razo pela qual altamente recomendvel que o profissional utilize avental ou macaco, luvas, botas de borracha, culos de proteo e mscara no momento da coleta. A coleta dever ser feita de modo a evitar a contaminao com produtos e outros microrganismos presentes no ambiente ou no prprio animal. Por essa razo, frascos, tubos, seringas, agulhas e demais instrumentais a serem utilizados devem estar estreis. Quando no for possvel a utilizao de frascos estreis, recomenda-se lav-los com gua e desinfetante e ferv-los em gua limpa, no mnimo, durante 30 minutos. Amostras contaminadas por produtos ou microrganismos que no esto envolvidos na etiologia da doena dificultam a realizao da prova e a interpretao dos resultados.

2 Conservao e acondicionamento das amostras

A forma de conservao depende da amostra e do tipo de exame requerido e ser descrita nos captulos posteriores do manual. As amostras devero ser remetidas em condies de biossegurana desde o transporte at a chegada ao Instituto. Para tal, devem ser acondicionadas em um sistema de embalagem tripla: a) Embalagem primria: compreende a embalagem que comporta a amostra, entrando em contato direto com a mesma. Podem ser frascos, tubo de ensaio ou embalagem plstica sem utilizao prvia (exemplo: embalagens para congelamento de alimentos, com fecho). b) Embalagem secundria: reveste a embalagem primria, deve ser impermevel e vedada, de modo a evitar vazamentos, garantindo maior segurana (Figura 1). c) Embalagem terciria: recebe o conjunto (embalagem primria dentro da secundria) e deve ser um recipiente isotrmico prova de gua (exemplo: caixa de isopor ntegra). No caso de envio de amostras refrigeradas, no interior da embalagem terciria deve ser colocado gelo reciclvel ou gua congelada dentro de garrafas plsticas, para evitar acmulo de gua. Para aumentar a durabilidade do gelo, adicionar sal gua na proporo de 5 colheres de sopa por litro de gua. O gelo precisa estar em quantidade suficiente para garantir a refrigerao do material. Na Figura 2 esto demonstrados alguns tipos de gelo reciclvel. Gelo seco tambm pode ser utilizado e particularmente recomendado para amostras visando o isolamento de vrus. Nesse caso, as amostras embaladas, como acima descritas, devem ser dispostas

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em uma embalagem terciria (caixa de isopor) ampla, para permitir a colocao de gelo seco suficiente para manter o material congelado at a chegada ao laboratrio. Nitrognio lquido igualmente pode ser utilizado, porm, nesse caso, faz-se necessrio um recipiente especial. Folhas de jornal podem ser usadas para separar o gelo reciclvel dos frascos de coleta e preencher espaos vazios, conforme a Figura 3. A tampa da embalagem terciria deve ser lacrada com fita adesiva. Os recipientes e embalagens devem ser desinfetados externamente com soluo antissptica, como lcool iodado ou hipoclorito de sdio, a fim de evitar a contaminao de indivduos que iro manipular esses objetos durante o transporte e recepo do material. Amostras acondicionadas incorretamente e conservadas de forma inadequada inviabilizam o diagnstico.

Figura 1 Tipos de embalagens primrias dentro das secundrias: (A) Tubos tipo eppendorf dentro de embalagem plstica com n; (B) Tubos com tampas-rosca, dentro de caixa plstica tampada.

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Figura 2 Alguns tipos de gelo reciclvel, disponveis no comrcio, e gelo em garrafas plsticas para conservao da amostra.

Correto

Incorreto

Figura 3 (A) Correto: Tubos de vidro com tampas de borracha (embalagem primria), dentro de caixa plstica tampada (embalagem secundria), no interior de caixa de isopor (embalagem terciria), com gelo reciclvel e folhas de jornal. (B) Incorreto: Amostra em embalagem plstica rompida pelas pedras de gelo soltas na caixa de isopor.

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3 Identificao das amostras

necessrio que os frascos e embalagens, contendo as amostras, sejam corretamente identificados com etiquetas resistentes (exemplo: esparadrapo) e informaes legveis. No devero ser utilizadas canetas para retroprojetor ou similares. A identificao dever estar no frasco de coleta e no na tampa. No lado externo da caixa em que so transportadas as amostras, fixar o formulrio de solicitao de exames (ver item 4 deste captulo) e rtulo de risco biolgico, como demonstrado nas Figuras 4 e 5.

Figura 4 (A) Caixa de isopor (embalagem terciria) para transporte das amostras, com a tampa lacrada. Rtulo de identificao de risco biolgico e formulrio de solicitao de exames fixados no lado externo. (B) Detalhe apresentando formulrio de solicitao de exames no interior de embalagem plstica e de envelope de papel, fixado no lado externo da caixa.

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Figura 5 Rtulo de identificao de risco biolgico que est disponvel no IPVDF e no site do Instituto: www.ipvdf.rs.gov.br .

4 Formulrio para Solicitao de Exames

Todas as amostras encaminhadas para realizao de exames precisam estar acompanhadas do formulrio de solicitao de exames, fornecido pelo IPVDF, disponvel no site www.ipvdf.rs.gov.br e apresentado no Anexo 1 deste manual. No momento do recebimento, ser verificado o adequado preenchimento do formulrio, sendo que no sero processadas pelo IPVDF amostras cuja falta de informaes comprometam a emisso do laudo diagnstico. No formulrio, devem ser preenchidos os dados referentes espcie animal, tipo e quantidade das amostras, conservao das mesmas, data da coleta, modo de transporte (rodovirio, areo), suspeita clnica e exames solicitados. Alm desses, so solicitados dados do cliente, proprietrio e veterinrio responsvel.

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Importante que, no histrico do animal, sejam relatadas informaes como sexo, idade, vacinao e vermifugao, tratamentos realizados, sinais clnicos (incio e durao dos mesmos), descrio das leses, alimentao recebida, provvel ingesto de plantas txicas. Em caso de surtos, incluir o nmero de animais doentes, nmero de mortos e o tempo decorrido entre a morte e a coleta das amostras. Informaes incompletas e preenchimento inadequado do formulrio podem comprometer a realizao do exame laboratorial e o diagnstico. O Formulrio para Solicitao de Exames, ou outro formulrio especfico (ex.: raiva, certificao de granjas), dever ser protegido por uma embalagem plstica e afixado, obrigatoriamente, no lado externo da caixa (embalagem terciria), evitando contato com as amostras.

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5 Transporte das amostras

Para transporte, as amostras devem estar sempre acondicionadas em embalagens triplas (ver item 2 deste captulo) e devidamente identicadas com o rtulo de risco biolgico e o formulrio de solicitao de exames xados.

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6 Remessa das amostras para o IPVDF

6.1 Como enviar por empresa transportadora
O IPVDF dispe de servio de coleta na Estao Rodoviria de Porto Alegre e em garagens de empresas transportadoras terrestres e areas. Para utilizar esse servio, necessrio que seja feito contato prvio com o Setor de Protocolo Tcnico, pelo telefone (51) 3481 3711 (ramais 213 e 214), informando a data e horrio da remessa das amostras, previso de chegada, bem como o nmero do conhecimento de transporte de mercadorias da empresa pela qual foi remetida.

6.2 Endereo para remessa de amostras ao IPVDF

As amostras enviadas diretamente ao Instituto devero ser entregues no Setor de Protocolo Tcnico do IPVDF ou remetidas para o seguinte endereo: INSTITUTO DE PESQUISAS VETERINRIAS DESIDRIO FINAMOR PROTOCOLO TCNICO Estrada do Conde, n. 6000 Bairro Sans Souci Eldorado do Sul RS Brasil CEP 92990-000

6.3 Pagamento dos servios prestados

O custo dos exames obtido atravs de contato com o Setor de Protocolo Tcnico ou pelo site www.ipvdf.rs.gov.br . Os pagamentos pelos servios prestados pelo IPVDF podero ser efetuados diretamente no Setor de Protocolo Tcnico ou atravs de depsito bancrio, em conta informada por este setor.

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Quando o pagamento for feito atravs de depsito bancrio, o comprovante deste dever ser encaminhado ao Setor de Protocolo Tcnico, atravs do fax (51) 3481 3711 (ramal 205) ou e-mail protocolo@ ipvdf.rs.gov.br. No ser aceito material remetido a cobrar, ou cujo recolhimento acarrete algum nus Instituio. O IPVDF somente comunicar os resultados dos exames aps a comprovao do pagamento pelos servios prestados. Os resultados so emitidos pelo IPVDF atravs de laudos remetidos via correio, e-mail ou fax.

6.4 Contatos
Telefone: (51) 3481 3711 Fax: (51) 3481 3711 (ramal 205) E-mail: protocolo@ipvdf.rs.gov.br contato@ipvdf.rs.gov.br Fale conosco, no site www.ipvdf.rs.gov.br.

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II Coleta de Amostras para Exame Bacteriolgico

7 Amostras para exame bacteriolgico
O isolamento de bactrias patognicas em laboratrio depende do envio correto das amostras, de acordo com a suspeita clnica, perodo de tempo aps a morte do animal, forma de coleta, temperatura e acondicionamento e tempo da remessa do material at o laboratrio. Os procedimentos para coleta de amostras para exame bacteriolgico so descritos a seguir neste captulo. As amostras para exame bacteriolgico precisam ser conservadas sob refrigerao, entre 2 e 8C, imediatamente aps a coleta. Amostras de soro sanguneo podem ser congeladas. importante que a coleta, acondicionamento, identificao e remessa das amostras sigam as recomendaes bsicas descritas nos itens de 1 a 6 do captulo I deste manual.

7.1 Vsceras
Para a realizao do exame bacteriolgico, podem ser coletados fragmentos dos rgos, no sendo necessrio o envio de rgos inteiros. O fragmento deve conter a poro que apresenta alteraes macroscpicas, quando estas existirem.

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A coleta deve ocorrer de forma mais assptica possvel, durante a necropsia, para evitar a presena de microrganismos contaminantes que podem interferir no isolamento do agente etiolgico. Alm disso, a carcaa e os rgos no devem estar em estado de autlise. As amostras devem ser remetidas sob refrigerao, preferencialmente em at 48 horas aps a coleta, acondicionadas individualmente em frascos estreis ou em sacos de plstico resistentes e de tamanho apropriado.

7.2 Sangue
Antes da coleta, deve ser feita antissepsia do local, com lcool 70%. O sangue deve ser coletado por puno da veia jugular ou coccgea com seringa e agulha estreis. O contedo deve ser transferido para tubos ou frascos estreis e remetido sob refrigerao, preferencialmente em at 24 horas aps a coleta. No adicionar anticoagulante, pois pode interferir no isolamento bacteriolgico.

7.3 Exsudato e pus

Conforme o tipo de leso e a regio afetada, coletam-se esses materiais com seringa e agulha ou swabs estreis. Se o exsudato ou pus for coletado por puno do abscesso, a superfcie da leso e a regio ao redor da mesma devem ser descontaminadas com soluo antissptica, como lcool iodado ou PVPI (povidone iodo). O contedo da seringa deve ser transferido para tubos ou frascos estreis. No caso de secreo ocular, nasal ou genital, os swabs estreis devem ser densamente envolvidos com material infeccioso e acondicionados individualmente em tubos e remetidos sob refrigerao, preferencialmente em at 24 horas aps a coleta.

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7.4 Amostras de leite para diagnstico de mastite bovina

Para evitar a contaminao da amostra para o diagnstico, devese, antes da coleta, desprezar os primeiros 3 ou 4 jatos de leite e realizar a antissepsia dos tetos com lcool 70%, iniciando pelos quartos mais distantes em relao ao operador e, aps, o restante dos quartos mamrios, para evitar que ocorra a recontaminao durante a limpeza. O leite deve ser coletado em frascos ou tubos estreis, em um volume de aproximadamente 10 ml. Podem ser enviadas amostras de leite de tanque ou de cada animal. As amostras de cada quarto mamrio devero ser coletadas em recipientes individuais, conforme demonstrado na Figura 6, pois a causa da infeco pode no ser a mesma. recomendvel que, durante a coleta, o tubo permanea aberto o menor tempo possvel. Os frascos devem conter a identificao do quarto mamrio coletado, de acordo com o seguinte cdigo: AD - Teto anterior direito AE - Teto anterior esquerdo PD - Teto posterior direito PE - Teto posterior esquerdo As amostras devem ser remetidas sob refrigerao, preferencialmente em at 24 horas aps a coleta.

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Figura 6 - Amostras de leite em tubos com rtulo de identificao.

7.5 Amostras para diagnstico de carbnculo hemtico (Antraz)

Quando ocorrer suspeita desta doena, no recomendvel a realizao da necropsia, para evitar a disseminao dos esporos da bactria no ambiente e a contaminao dos demais animais do rebanho. Alm disso, sendo uma zoonose, a bactria ou seus esporos podem vir a contaminar humanos por inalao ou leses cutneas. Pode-se coletar sangue da veia jugular ou auricular aps a morte do animal, com seringa e agulha estreis, e transferir para tubo de ensaio. Essas amostras devem ser enviadas sob refrigerao.

7.6 Amostras para diagnstico de leptospirose

O material de eleio para diagnstico sorolgico de leptospirose o soro sanguneo, que deve ser lmpido, no hemolisado, sem cogulo

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e enviado congelado ao laboratrio. Caso seja de interesse o acompanhamento da evoluo dos ttulos de anticorpos, podem ser coletadas amostras de soro do mesmo animal, com intervalo de 15 a 20 dias entre as coletas (amostras pareadas). Para isolamento do agente, podem ser enviados fetos, natimortos e urina. A velocidade de processamento do material para isolamento de Leptospira sp. crucial, de forma que a remessa deve ser comunicada ao IPVDF para evitar atrasos no processamento das amostras. Urina, para tentativa de isolamento, no deve exceder o intervalo de duas horas entre a coleta e a chegada ao laboratrio. Para isolamento de Leptospira sp., a amostra no pode ser congelada em hiptese alguma.

7.7 Amostras para diagnstico de tuberculose

As amostras de origem animal para diagnstico de tuberculose so linfonodos ou partes de rgos e tecidos procedentes de matadouro sob inspeo sanitria e de necropsias realizadas. Para avaliar melhor as leses dos rgos e tecidos, efetuar cortes durante a inspeo ou necropsia. Coletar preferencialmente linfonodos do trato respiratrio: mediastinais (anteriores, posteriores e ventrais), bronquiais (esquerdo, direito, dorsal ou mdio) e pulmonares. Observar a pleura e o tecido pulmonar por palpao, a fim de constatar reas com leses nodulares. Verificar presena de leses tuberculosas nos linfonodos mesentricos e no fgado. Inspecionar ainda os linfonodos da cabea e os cervicais. Coletar os fragmentos, logo aps a morte do animal. Retirar somente a leso de aspecto caseoso, evitando resduos, como, por exemplo, sangue e outros lquidos. importante coletar parte do tecido lesado e parte do tecido normal de uma mesma pea, perfazendo um total de at 200 gramas. As amostras para diagnstico bacteriolgico de tuberculose devero ser acondicionadas conforme o item 7.1 deste

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captulo. Enviar tambm parte da amostra em soluo de formol a 10 % para exames histopatolgicos, seguindo as instrues descritas no captulo V. O tempo tcnico para isolamento de tuberculose pode variar de 60 a 90 dias.

7.8 Amostras para diagnstico de brucelose

Todas as amostras enviadas para diagnstico de brucelose devem estar acondicionadas no sistema de embalagem tripla, descrita no item 2 do captulo I.

7.8.1 Exame direto (bacteriolgico)

A amostra ideal para o isolamento de Brucella sp. o proveniente do aborto. Entre os materiais de eleio, destacam-se: Feto e anexos fetais O feto pode ser enviado inteiro. Se for mediante necropsia efetuada no prprio estabelecimento, coletar pulmo, linfonodo bronquial, bao, fgado, swab retal e lquido do abomaso. No caso de membranas fetais, escolher aqueles cotildones que apresentem aspecto anormal, com perda da cor e do brilho caracterstico; eles devero ser cuidadosamente manipulados (usar luvas e mscaras especiais com pelo menos 95% de eficincia), em funo da alta concentrao de bactrias presentes. Exsudato vaginal A eliminao de Brucella abortus pode durar vrias semanas aps o parto ou aborto. O exsudato vaginal deve ser coletado mediante o uso de swabs especiais ou pipetas de inseminao. Existem swabs comerciais com meio de transporte que mantm as bactrias viveis por perodos mais prolongados.

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 Leite Para coleta, seguir os mesmos procedimentos descritos no item 7.5 sobre amostras de leite para diagnstico de mastite bovina. Animais necropsiados ou coleta em matadouro Os materiais de escolha para isolamento de Brucella sp so os componentes do sistema retculo-endotelial. Os linfonodos mais importantes so os supramamrios, parotdeos, retrofarngeos, ilacos internos e pr-escapulares, alm do bao. Nas fmas, cotildones, tero e bere so tambm recomendados. Nos machos, alm do bao e linfonodos, so tambm teis para isolamento, testculos, prstata, epiddimo e vesculas seminais. Para o exame histopatolgico, podem ser remetidas amostras dos mesmos linfonodos ou rgos indicados acima, com ou sem leses macroscpicas, conforme as instrues descritas no captulo V.

7.8.2 Exame indireto (sorolgico)

Soro A coleta de sangue para a obteno de soro visando realizao dos testes para o diagnstico de brucelose, alm de ser mais simples, oferece menor risco de contgio ao profissional, se comparada com a coleta de material para o exame bacteriolgico. O material para a coleta deve ser constitudo de tubos que contenham vcuo (sem anticoagulante) e siliconizados, para facilitar a retrao do cogulo, com agulhas individuais e descartveis. Tubos e agulhas convencionais tambm podem ser utilizados; apresentam, porm, o inconveniente de aumentar o risco de contaminao biolgica na manipulao. As etapas da coleta exigem o cumprimento de algumas normas que podem ser assim resumidas:

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a) A amostra de sangue coletada deve cobrir no mnimo 50 % da capacidade de um tubo de 10 ml. Na Figura 7 est exemplificada a coleta de sangue da veia caudal de um bovino; b) Para obter um soro adequado, os tubos com sangue devem ser mantidos temperatura ambiente por, no mnimo, 2 ou 3 horas, ao abrigo da luz, at que ocorra a coagulao sangunea. Aps a separao do cogulo, transferir o soro para um frasco estril. No usar frascos ou tubos midos, pois pode ocorrer hemlise do sangue. Na Figura 8 est representada uma amostra de soro ideal e uma imprpria, hemolisada; c) O soro deve ser conservado refrigerado e enviado o quanto antes ao laboratrio, evitando-se, assim, a deteriorao da amostra. Em caso de demora no envio (mais de 72 horas), deve-se congelar o soro e enviar sob refrigerao; d) Os tubos devem ser identificados de modo que o nmero corresponda ao especificado no Formulrio de Solicitao de Exames, preenchido conforme as recomendaes do item 4 do captulo I; e) necessrio constar no formulrio dados referentes situao relativa vacinao (data da vacinao).

Figura 7 - Coleta de sangue de bovino da veia caudal.

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Figura 8 (A) Amostra de soro ideal. (B) Amostra de soro imprpria (soro hemolisado).

Leite (para o Teste do Anel em Leite) A coleta correta da amostra fundamental para a obteno de resultados confiveis. As amostras devem ser coletadas de mistura de leite em resfriador ou tanque de expanso. preciso misturar o leite para homogeneiz-lo de forma que o creme no se separe. A agitao suave do leite no recipiente de coleta imprescindvel para uma boa homogeneizao da gordura. O leite deve ser coletado utilizando-se como conservante o formol a 1 %, ou o cloreto de mercrio a 2 %, na proporo de 1 ml de conservante para cada 10 ml de leite. A amostra de leite deve ser refrigerada e enviada ao laboratrio. A prova pode ser afetada pelos seguintes fatores: amostra de leite mal homogeneizada, contendo excesso ou falta de gordura; excessivos: aquecimento, tempo de armazenamento, temperatura e agitao. Amostras armazenadas a 4 C, durante at duas semanas, podem ser usadas para o teste, j que no h perdas nos ttulos de anticorpos, sucedendo o contrrio com o aumento de temperatura.

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A prova pode apresentar resultados falso-positivos nas seguintes situaes: Alterao do leite como consequncia de mastites que originam a presena de protenas, clulas e bactrias no habituais, que dificultam a leitura da prova; Presena de colostro; Utilizao de leite fresco, ou seja, quando o teste realizado no mesmo dia da coleta. Em geral, essa situao desaparece aps a refrigerao do leite.

7.8.3 Espcies animais e testes sorolgicos realizados no IPVDF para diagnstico de brucelose
ESPCIE Bovina Bubalina Caprina Equina Suna Ovina Canina TESTE REALIZADO PROVA COMPLEMENTAR

Antgeno Acidificado Tamponado

2-Mercaptoetanol

Imunodifuso em Gel de gar Imunodifuso em Gel de gar e Antgeno Acidificado Tamponado

2-Mercaptoetanol

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8 Antibiograma
Quando os animais doentes submetidos ao tratamento com antibiticos no se recuperam como esperado, conveniente realizar um antibiograma, que possibilita a escolha de antibiticos efetivos contra o agente bacteriano causador da infeco. Para determinar a sensibilidade do agente frente a um grupo de princpio-ativo de antimicrobianos, necessrio o isolamento da bactria em laboratrio a partir de amostras coletadas de animais doentes.

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9 Doenas bacterianas diagnosticadas no IPVDF e amostras a serem coletadas

DOENA CLOSTRIDIOSES HEPTICAS E MIONECROSES CARBNCULO HEMTICO (ANTRAZ) MASTITE BOVINA PNEUMONIAS CERATO CONJUNTIVITE INFECCIOSA BOVINA LEPTOSPIROSE TUBERCULOSE BRUCELOSE AMOSTRAS Fragmentos de fgado, bao e rim No caso de mionecroses, enviar tambm exsudato da tumefao muscular e fragmentos do msculo com a leso Sangue Leite Fragmento do pulmo, contendo a rea com a leso Lquido conjuntival de animais na fase inicial da doena antes do aparecimento das leses da crnea, coletado com swabs estreis Soro sanguneo, fetos, natimortos e urina Linfonodos do trato respiratrio: mediastinais, bronquiais e pulmonares Exame bacteriolgico: fetos e anexos fetais, exsudato vaginal, leite, linfonodos, bao. Fmeas: cotildones, tero e bere. Machos: testculos, prstata, epiddimo e vesculas seminais. Exame sorolgico: soro sanguneo, leite

No caso de necessidade de diagnstico de outras doenas bacterianas no contempladas neste manual, entrar em contato com o Laboratrio de Bacteriologia pelo telefone (51) 3481 3711 (ramal 223) ou pelos e-mails bacteriologia@ipvdf.rs.gov.br, brucelose@ipvdf.rs.gov.br e leptospirose@ipvdf.rs.gov.br.

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III Coleta de Amostras para Exame Virolgico

10 Amostras para exame virolgico
O laboratrio de virologia do IPVDF realiza o isolamento viral, a deteco antignica e a avaliao sorolgica (pesquisa de anticorpos especficos) para algumas viroses importantes sade animal. importante que a coleta, acondicionamento, identificao e remessa das amostras sigam as recomendaes bsicas descritas nos itens de 1 a 6 do captulo I deste manual. Durante a fase aguda da doena, perodo em que geralmente ocorre a viremia, a chance de deteco do vrus maior. Nesta fase, buscase identificar diretamente o agente viral ou seus antgenos. Assim, o melhor material para o isolamento do vrus ou para a deteco antignica aquele coletado no incio da enfermidade, quando esto presentes os sinais clnicos. A coleta deve ser efetuada no animal vivo, ou logo aps a sua morte, e a amostra enviada o mais breve possvel ao laboratrio. Para o isolamento viral e a deteco antignica, as amostras a serem coletadas podem ser fragmentos de rgos ou tecidos, secrees, fezes e sangue.

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11 Testes sorolgicos
O exame sorolgico outra importante ferramenta de diagnstico laboratorial. Na maioria das infeces, a resposta imune humoral do hospedeiro torna-se detectvel aps a fase aguda, geralmente 3 a 4 semanas depois do incio dos sinais clnicos. Esta resposta pode ser detectada atravs da pesquisa de anticorpos especficos. Se houver interesse em detectar a evoluo dos nveis de anticorpos no animal (por exemplo, para confirmar a suspeita de determinado vrus em doena aguda recente), podem ser coletadas amostras pareadas de soro, uma durante a fase aguda da doena e outra 3 a 4 semanas aps a primeira coleta. A suspeita confirmada se houver aumento igual ou superior a quatro vezes o ttulo de anticorpos detectados entre a primeira e a segunda amostra. Para analisar o desenvolvimento de anticorpos no soro de um mesmo animal, aps a administrao de uma vacina, estes anticorpos podem ser titulados em amostras seriadas, isto , coletadas em sequncia. Para tanto, os soros podem ser coletados no dia da vacinao (dia zero) e subsequentemente nos dias 30, 60 e 90, ou ainda mais adiante, caso exista interesse em acompanhamento mais prolongado.

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12 Coleta para doenas virais

As amostras devem ser acondicionadas, separadamente, em frascos estreis. Os frascos e as embalagens devem estar bem vedados para evitar extravasamento do material. Cada amostra deve ser corretamente identificada, com rtulos resistentes e letras e nmeros legveis. Os materiais especficos a serem coletados para cada tipo de teste que se deseja solicitar esto descritos no item 13.

12.1 rgos e tecidos:

a) Coletar os rgos de animais com quadro clnico compatvel ao da suspeita, aps o sacrifcio ou logo em seguida da morte, de forma mais assptica possvel, no devendo ser utilizados instrumentos com os quais se fez a necropsia; b) Existindo a suspeita clnica, na realizao da necropsia, coletar inicialmente os rgos alvo de escolha para a doena em questo, e posteriormente o restante. O item 13 indica os rgos recomendados para o diagnstico das doenas virais; c) Os rgos podem ser coletados inteiros. Se for necessrio seccionar, o fragmento a ser submetido deve incluir o tecido com a leso; d) Para conservao de rgos e tecidos, utiliza-se a refrigerao. Em caso de demora no envio (mais de 72 horas), pode-se congelar o material e envi-lo sob refrigerao; e) No recomendvel o congelamento de amostras para o isolamento viral, a no ser em temperaturas muito baixas (por exemplo, gelo seco ou nitrognio lquido), pois temperaturas de 0 a -40 oC podem inativar alguns vrus;

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f) Para o isolamento viral, existe a possibilidade de conservao de amostras em preservativos com glicerina tamponada, conhecidos como lquido de Bedson ou lquido de Valle (vide frmulas no item 14 deste captulo), mantidos refrigerados. Estes preservativos so muito eficazes, pois tm atividade bactericida e preservam os vrus. No Formulrio de Solicitao de Exames, deve ser informado qual o preservativo utilizado; g) Formol, glutaraldedo, lcoois ou outros produtos qumicos no devem ser utilizados para a remessa de amostras para diagnstico virolgico, pois estas substncias inativam os vrus.

12.2 Amostras para diagnstico de raiva 12.2.1 Cuidados na coleta:

a) Uma vez que as amostras para exame de raiva representam claro risco sade humana, o uso de equipamentos de proteo individual (luvas, avental, macaco, botas, culos de proteo e mscara) muito importante no momento da coleta; b) Na coleta de morcegos, muito cuidado ao coletar animais vivos, pois eles podem eventualmente reagir e morder a pessoa ao serem capturados, causando a necessidade de tratamento ps-exposio. Para este tipo de coleta, fundamental o uso de luvas grossas. Na indisponibilidade de luvas, coletar o morcego com o auxlio de uma caixa ou vidro, de forma a evitar o contato direto com o animal; c) Profissionais de campo devem ser previamente imunizados contra a raiva.

12.2.2 Instrues para coleta:

a) Coletar encfalo do animal suspeito. No captulo XI est descrita a coleta de encfalo na necropsia de bovinos;

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b) No caso de morcego, envi-lo inteiro ao laboratrio, de preferncia morto; c) As amostras devem ser conservadas refrigeradas e em embalagens hermeticamente fechadas. Em caso de demora no envio (mais de 72 horas), pode-se congelar o material; d) Encfalo de bovino no deve ser congelado. O congelamento prejudica o exame diferencial de Encefalopatia Espongiforme Bovina (BSE), feito atravs da histopatologia.

12.3 Secrees
a) Secrees para isolamento viral devem ser coletadas com swabs sem alginato de sdio, uma vez que esta substncia inativa alguns vrus; b) Os swabs devem ser colocados em frascos ou embalagens estreis e mantidos refrigerados, enviados em embalagem tripla; c) Se for inevitvel o congelamento das amostras, utilizar gelo seco ou nitrognio liquido, quando se desejar o isolamento viral, pois temperaturas de 0 a -40 oC podem inativar alguns vrus; d) Para o isolamento viral, existe a possibilidade de conservao destas amostras em preservativos com glicerina tamponada, conhecidos como lquido de Bedson ou lquido de Valle (vide frmulas no item 14 deste captulo), mantidos refrigerados. Estes preservativos so muito eficazes, pois tm atividade bactericida e preservam os vrus. No Formulrio de Solicitao de Exames, deve ser informado qual o preservativo utilizado; e) Formol, glutaraldedo, lcoois ou outros produtos qumicos no devem ser utilizados para a remessa de amostras para diagnstico virolgico, pois estas substncias podem inativar os vrus;

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f) A amostra deve ser remetida ao laboratrio o mais breve possvel, j que as secrees so coletadas, geralmente, para isolamento viral ou deteco antignica.

12.4 Sangue
a) Para coleta de sangue, o local da puno deve ser desinfetado e devem ser utilizados materiais estreis, como seringas e agulhas ou tubos de vacutainer com anticoagulante; b) Se forem utilizados, para o envio de sangue, frascos de antibiticos ou de outros quimioterpicos, deve-se ter o cuidado de realizar lavagem adequada, com detergente e gua corrente, antes de fervlos, pois os produtos contidos nos frascos podem tornar o sangue txico para o teste realizado, inviabilizando o diagnstico. Estes frascos no so recomendveis; c) A amostra deve conter, aproximadamente, 1 ml de sangue para cada teste solicitado; d) Para conservao de sangue, utiliza-se a refrigerao, nunca o congelamento; e) O sangue deve ser remetido ao laboratrio em at 24 horas.

12.5 Soro
a) Para se obter o soro deve-se coletar o sangue, com material estril; b) Se forem utilizados, para envio de soro, frascos de antibiticos ou de outros quimioterpicos, deve-se ter o cuidado de realizar lavagem adequada, com detergente e gua corrente, antes de ferv-los, pois os produtos contidos nos frascos podem tornar o soro txico para o teste realizado, inviabilizando o diagnstico. Estes frascos no so recomendveis;

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c) Os tubos ou seringas, contendo o sangue, precisam permanecer temperatura ambiente ( sombra), para que ocorra a separao entre o soro e o cogulo, o que se consegue mais facilmente mantendo o tubo inclinado; d) Separar o cogulo do soro, transferindo este ltimo, cuidadosamente, para um novo tubo estril; e) Se o soro no for separado do cogulo, durante o transporte, o sangue poder hemolisar, inutilizando a amostra; f) O soro deve ter aparncia lmpida, de colorao amarelo claro e sem turbidez (Figura 9); g) A amostra deve conter 0,5 ml de soro para cada teste solicitado; h) O soro deve ser conservado refrigerado e, em caso de demora no envio (mais de 72 horas), pode-se congel-lo e envi-lo sob refrigerao; i) Nunca congelar amostras de soro contendo cogulo, pois ocorrer hemlise, tornando o soro imprprio para o exame; j) Para amostras pareadas de soro, a primeira pode ser congelada e enviada ao laboratrio juntamente com a segunda, que dever ser coletada de 3 a 4 semanas aps a primeira. As amostras precisam estar bem identificadas em relao data da coleta e ao animal coletado.

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Incorreto

Correto

Figura 9 (A) Frascos de antibitico, sem lavagem e desinfeco corretas, contendo soro hemolisado. (B) Frascos lavados e esterilizados, corretamente identificados, contendo soro translcido.

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13 Doenas virais diagnosticadas no IPVDF, testes realizados e materiais a serem enviados

DOENA DOENA DE AUJESZKY PROVA ELISA 2 SN 1 IV
4 5 5 5 9

AMOSTRA PARA COLETA Soro 9 Soro Pulmo, bao, rim, encfalo de animais doentes
9 9 9 9

PARVOVIROSE SUNA PESTE SUNA CLSSICA NEWCASTLE INFLUENZA AVIRIA DIARREIA VIRAL BOVINA (BVD)
5 5

IHA

Soro Soro Soro Soro

ELISA ELISA ELISA

1

IV

ELISA ELISA 2 SN 1 IV

Sangue total, leses de mucosas, soro, fezes, fragmentos de rgos, placas de Peyer do intestino 9 Soro
9 9

IBR / IPV / IPB (BHV-1) MAMILITE POR HERPESVRUS (BHV-2) ENCEFALITE BOVINA POR HERPESVRUS (BHV-5) LNGUA AZUL LEUCOSE BOVINA
8

Soro Soro Leses vesiculares nas mucosas, pulmo, bao, rim, swabs nasais e conjuntivais, feto e tecidos fetais Leses vesiculares na glndula mamria
9

IV

1 6 6

SN IV

Soro Encfalo
9 9

IDGA IDGA IVIC

1

Soro Soro

ENCEFALITE EQUINA

Encfalo Encfalo, pulmo, tecidos fetais Cabea/Encfalo Cabea/Encfalo

HERPESVRUS EQUINO TIPO-1

8

IV IF

RAIVA
7

IVIC

IV = isolamento viral em cultivo celular 2 SN = prova sorolgica de soroneutralizao, qualitativo ou quantitativo (titulagem) 3 IF = deteco antignica por imunofluorescncia 4 IHA = prova sorolgica de inibio da hemoaglutinao 5 ELISA = prova sorolgica de ELISA para deteco de anticorpos 6 IDGA = prova sorolgica de imunodifuso em gel de gar 7 IVIC = isolamento viral com inoculao em camundongo (prova biolgica) 8 Zoonoses = doenas transmissveis ao homem 9 Em caso de quadro clnico, recomenda-se amostras pareadas

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14 Frmulas
Frmula do Lquido de Bedson gua Destilada Deionizada.......................................475 ml Glicerina neutra..........................................................500 ml Fosfato Dissdico (Na2HPO4).....................................5,27 g Fosfato Monopotssico (KH2PO4)...............................2,02 g Tcnica: misturar a glicerina na gua e acrescentar os fosfatos. Ajustar o pH a 7,5 - 7,6 com o prprio fosfato tanto dissdico quanto monopotssico. Esterilizar em autoclave, 115 C, 15 minutos. Frmula do Lquido de Valle: Fosfato Monopotssico (KH2PO4)..............................................0,9 g Fosfato Bipotssico (K2HPO4)..................................................1,15 g gua Destilada Deionizada......................................................500 ml Glicerina neutra........................................................................500 ml Tcnica: dissolver os fosfatos na gua e, em seguida, adicionar a glicerina. Ajustar o pH a 7,6 com NaOH. Esterilizar em autoclave, 115 C, 15 minutos. No caso de solicitao de outro exame virolgico que no esteja descrito no manual, contatar o Laboratrio de Virologia, pelo telefone (51) 3481 3711 (ramais 220 e 238) ou por e-mail virologia@ipvdf.rs.gov.br

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IV Coleta de Amostras para Exame Parasitolgico

15 Amostras para exame parasitolgico
importante que a coleta, acondicionamento, identificao e remessa das amostras sigam as recomendaes bsicas descritas nos itens de 1 a 6 do captulo I deste manual.

15.1 Endoparasitos
a) Para contagem de ovos e pesquisa de oocistos em fezes: Recomenda-se coletar um mnimo de 20 g de fezes, diretamente do reto do animal. Pode-se utilizar, por exemplo, uma luva de toque que serve de embalagem quando invertida aps a coleta da amostra. Para preservao, o material deve ser mantido refrigerado at chegar ao laboratrio ou em formol a 10 % na proporo de uma parte para quatro de fezes (considerar que o formol pode alterar a morfologia dos protozorios e larvas) ou, ainda, em MIF (mertiolato, iodo, formol), cuja frmula encontra-se no item 16 deste captulo. As amostras devem ser embaladas em sacos plsticos amarrados nas extremidades ou em frascos de plstico/vidro tampados, identificadas individualmente. Enviar ao laboratrio sempre sob refrigerao.

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b) Para contagem e identificao de parasitos adultos: rgos suspeitos de conter helmintos, como abomaso e intestino, devem ter as extremidades ligadas, para se evitar perda de contedo, e ser enviados ao laboratrio sob refrigerao ou congelados. As demais vsceras devem ser embaladas em sacos plsticos devidamente identificados, preservadas sob refrigerao ou congeladas. Ao colher helmintos adultos, torna-se importante que eles sejam manipulados sem laceraes, para se evitar alteraes morfolgicas. Aps lavagem (separar sujidades, fezes, sangue), os helmintos devem ser colocados em frascos contendo lquidos adequados para remessa e preservao (Lquido de Raillet: 5 ml de Formol, 2 ml de cido Actico e 93 ml de gua Destilada). c) Pesquisa de anticorpos contra Toxoplasma sp.: Em casos de suspeitas de aborto por toxoplasmose, recomenda-se coletar aproximadamente 5 ml de sangue do animal suspeito em tubos, sem anticoagulante e siliconizados, para facilitar a retrao do cogulo, utilizando-se seringa e agulhas estreis descartveis. Aps a separao do soro, o mesmo deve ser removido para outro frasco, devidamente identificado e tampado, deve ser mantido sob refrigerao e enviado ao laboratrio em 24 horas. Se no for possvel o envio nesse perodo, o soro pode ser congelado aguardando remessa posterior nessas condies. Considerar a possibilidade do envio de amostras pareadas. O Laboratrio de Parasitologia Veterinria do IPVDF realiza testes sorolgicos para pesquisa de anticorpos contra Toxoplasma nas espcies suna, canina, felina, ovina e caprina.

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15.2 Ectoparasitos
a) Carrapatos: Para testes carrapaticidas: Amostras de fmeas adultas ingurgitadas (teleginas) devem ser coletadas diretamente dos bovinos, antes de qualquer tratamento carrapaticida (ideal 3 semanas aps o ltimo tratamento), e enviadas ao laboratrio dentro de 24 horas. Enviar, no mnimo, 100 teleginas, para que possam ser testados os principais carrapaticidas. Os carrapatos devem ser acondicionados em recipientes limpos, realizando-se pequenas perfuraes que permitam a entrada de ar (garrafas plsticas de gua mineral, por exemplo). Evitar sempre a exposio a raios solares durante o armazenamento e transporte at o laboratrio (Figura 10). Se possvel, enviar as amostras em embalagem tripla, conforme captulo I, porm sem gelo. No caso da propriedade utilizar banheiro de imerso, importante uma remessa da calda do banheiro em uso, a qual deve ser coletada aps a homogeneizao da mesma, o que se consegue imediatamente aps a passagem de pelo menos 20 bovinos adultos, coletando-se amostras aproximadamente a 1 metro da superfcie, em uma garrafa tipo pet (500 ml), por exemplo. Manter e enviar ao laboratrio sempre separada das amostras de carrapatos. importante que o histrico de utilizao de produtos carrapaticidas na propriedade, bem como carrapaticida em uso e demais informaes de manejo bovino, constem na ficha de requisio do teste carrapaticida. Para identificao: Amostras de carrapatos (colhidos em outras espcies de animais) devem ser colocadas em frascos vedados, contendo lcool 70 (preferentemente) ou 96, e enviadas ao laboratrio, com identificao do hospedeiro, local e data de coleta.

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b) Sarnas: raspados profundos da leso, especialmente das bordas, so os mais apropriados para a pesquisa de caros causadores de sarna. A coleta deve ser feita da seguinte maneira: Fazer uma prega na pele do animal, prxima s bordas da leso. Caso no apresente leses, preferir regies da base da cauda ou orelhas (especialmente no caso de sunos); Pingar algumas gotas de leo (mineral ou de soja) sobre a prega de pele; Raspar a prega de pele vrias vezes com uma lmina de vidro ou de bisturi, usada em ngulo de 90 em relao pele, promovendo escarificao profunda at o aparecimento de pequenos pontos de sangue; Colocar o material sobre uma lmina de vidro e cobrir com outra lmina de mesmo tamanho, lacrando todas as bordas com fita adesiva ou enrolando as lminas em filme de PVC at a chegada ao laboratrio; Conter adequadamente o animal durante a raspagem, para evitar possveis acidentes por agresses, uma vez que este procedimento pode provocar dor e desconforto/irritao. c) Piolhos: exemplares para identificao laboratorial devem ser mantidos em frascos lacrados a seco ou imersos em lcool 70. Amostras de plo ou l com material suspeito devem ser mantidas em recipientes vedados (placas de Petri com as bordas lacradas por fita adesiva, por exemplo). d) Larvas de dpteros (moscas): as larvas causadoras de bernes e bicheiras devem ser colhidas diretamente do animal e podem ser enviadas ao laboratrio para identificao em frascos contendo lcool 70. Para evitar o escurecimento das larvas em soluo conservante, podese coloc-las em gua fervente e depois transferi-las para a soluo.

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e) Outros ectoparasitos: moscas, mosquitos, hempteras (barbeiros) e outros insetos para identificao podem ser mantidos em frascos tampados a seco, com naftalina, evitando-se o contato direto com o espcime (conforme Figura 11) ou imersos em soluo conservante, preferentemente lcool 70.

15.3 Hemoparasitos
a) Esfregaos de sangue: exames para confirmar suspeita de babesiose e anaplasmose bovina podem ser requisitados atravs de esfregaos finos de sangue, preferencialmente fixados em metanol. A coleta deve ser feita em extremidades como orelhas ou cauda, coletandose a primeira gota extravasada aps a perfurao da pele com agulha estril. Para formar o esfregao, distende-se suavemente a gota de sangue sobre uma lmina para microscopia com o auxlio de outra lmina. Logo a seguir, com rpidos movimentos, agita-se a lmina no ar, de modo que a secagem do esfregao acontea o mais rpido possvel. A lmina pode ser identificada com o auxlio de um lpis comum e remetida ao laboratrio devidamente protegida, preferentemente aps fixao em lcool metlico. Alternadamente, uma pequena amostra de sangue (2 a 5 ml), coletada com anticoagulante (ACD ou EDTA, por exemplo), mantida sob refrigerao, pode ser enviada ao laboratrio para a pesquisa de hemoparasitas. b) Vsceras: fragmentos de bao, fgado, corao, rim e crebro (suspeita de babesiose cerebral) devem ser colhidos durante a necropsia, embalados em recipientes ou sacos plsticos devidamente vedados, e enviados ao laboratrio em embalagem tripla como descrito no item 2 do captulo I. c) Soros: devem ser enviados sob refrigerao ou congelados para a pesquisa de anticorpos contra Babesia sp. e Anaplasma marginale. Utiliza-se sorologia especialmente para estudos epidemiolgicos, avaliaes de estabilidade ou instabilidade enzotica dos rebanhos bovinos e acompanhamento de animais imunizados contra babesiose e anaplasmose.

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16 Frmulas
SOLUO MIF gua destilada......................................... 250 ml Mertiolato N 99 a 1:1000........................200 ml Formol.........................................................25 ml Glicerina........................................................5 ml LCOOL 70: lcool 96 (comercial)..............................750 ml gua .........................................................250 ml

Figura 10 - Embalagem correta para envio de carrapatos para testes carrapaticidas.

FIGURA 11 - Forma correta de envio de ectoparasitos (insetos) a seco para identificao.

Em caso de dvidas, entrar em contato com o Laboratrio de Parasitologia, pelo telefone (51) 3481 3711 (ramal 236) ou pelo e-mail parasitologia@ipvdf.rs.gov.br .

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V Coleta de Amostras para Exame Histopatolgico

17 Amostras para Exame Histopatolgico
Os tecidos para exame histopatolgico devem ser colhidos na necropsia logo aps a morte, para se evitar autlise, e no podem ser congelados. Devem ser remetidos em soluo fixadora de formol a 10 %. Os fragmentos precisam ser delgados (mximo de 1 centmetro de espessura) e devem estar imersos na soluo na proporo de 1 parte de tecido para 10 partes de formol (Figura 12).

Incorreto

Correto

Figura 12 (A) Frasco contendo excesso de tecido em relao quantidade de formol e (B) Proporo adequada de tecidos e formol e frasco identificado corretamente.

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O material deve conter, sempre que possvel, pores do tecido lesado e do tecido normal adjacente. Deve-se colocar uma camada de algodo na parte superior do frasco quando forem coletados tecidos que flutuam, como no caso do pulmo, evitando-se que alguma poro no fique imersa no formol. Os frascos necessitam ter boca larga, evitando a dificuldade do laboratorista para retirar o tecido fixado do recipiente. Cada frasco deve ser bem vedado e estar identificado de forma legvel, acompanhado do Formulrio para Solicitao de Exames, demonstrado no Anexo 1. importante que a coleta, acondicionamento, identificao e remessa das amostras sigam as recomendaes bsicas descritas nos itens de 1 a 6 do captulo I deste manual. Caso haja necessidade de exame bacteriolgico e/ou virolgico, tambm, devem ser remetidas pores de material conservado sob refrigerao, sem serem fixados no formol. Frmula do formol a 10 % Formaldedo (35 40 %) (= formalina comercial) ........... 100 ml gua de torneira............................................................. 900 ml

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18 Coleta de amostras quando a suspeita for intoxicao

Para o diagnstico de intoxicao, fundamental que o material enviado seja acompanhado de informaes que incluam espcies atingidas, idade dos animais, sintomas, curso clnico, achados de necropsia, regio, localizao e lotao de animais na propriedade, bem como as condies em que costuma ocorrer a manifestao clnica da doena. Em muitas intoxicaes, o diagnstico definitivo fornecido pela histopatologia.

18.1 Intoxicao por plantas

Para a grande maioria das intoxicaes com plantas, alm da histria clnica e necropsia, a histopatologia de extrema importncia e, muitas vezes, determinante para o diagnstico. Neste caso, sempre devem ser enviadas amostras de fgado, sistema nervoso central, rim, miocrdio, pulmo e, quando houver envolvimento do trato gastrintestinal, amostras do rmen e retculo mais prximas ao crdia, bem como partes lesadas do tubo digestivo. aconselhvel tambm o envio de bexiga, vescula biliar, bao e fragmentos de qualquer outro rgo e/ou tecido com leses macroscpicas, devidamente identificados, sendo que a remessa deve ser feita da mesma forma como descrita anteriormente para exame histopatolgico. No Rio Grande do Sul, as plantas responsveis por cerca de 50 % das intoxicaes em bovinos so do gnero Senecio (maria mole) e as mais frequentes na epidemiologia da doena so S. brasiliensis (Figura 13) e S. selloi (Figura 14).

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Figura 13 Senecio brasiliensis.

Figura 14 Senecio selloi.

Dentre outras plantas, variando entre regies, so importantes tambm: Ateleia glazioviana (timb), Pteridium aquilinum (samambaia), Nierembergia veitchii, Baccharis coridifolia (mio-mio), Cestrum spp. (coerana), Lantana spp., Amaranthus spp. (caruru), Enterolobium spp. (timbava), Halimium brasiliense, Solanum fastigiatum (jurubeba), Ammi majus, Xanthium cavanillesii (carrapicho), Manihot spp. (mandioca brava), Prunus spp. (pessegueiro bravo) e Mascagnia sp.

18.1.1 Coleta da planta para identificao

As amostras de plantas devem ser colocadas entre jornal e papelo. Na parte interna, colocam-se dados como nome popular da planta, local da coleta (alm do municpio e regio, informar se foi encontrada em mato, banhado, etc.); poca de ocorrncia; se uma rvore, arbusto, cip etc.; ocorrncia de flores (poca, cor, forma) e de frutos (forma, tamanho); data, nome e telefone do coletor. Esse material deve ser prensado ou atado com cordo. Se for curto o espao de tempo entre a coleta e a remessa do material, as plantas podem ser colocadas em sacos plsticos individuais com os dados correspondentes.

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18.2 Intoxicao por fungos

Intoxicaes por fungos como Fusarium moniliforme (leucoencefalomalcia equina), Ramaria flavo-brunnescens (mal do eucalipto), Claviceps paspali (mal do melador), dentre outros, podem ter a histopatologia como auxlio importante no diagnstico. O material a ser enviado, alm da histria clnica, deve seguir a mesma orientao descrita na suspeita de planta txica.

18.3 Intoxicao por produtos qumicos

Intoxicaes por produtos base de organofosforados, carbamatos, ureia, etc. podem, tambm, ter a histopatologia como auxiliar no diagnstico. O material a ser enviado segue as mesmas recomendaes feitas anteriormente, alm da histria clnica. Em caso de dvidas, entrar em contato com o Laboratrio de Patologia, pelo telefone (51) 3481 3711 (ramal 223) ou pelo e-mail patologia@ipvdf.rs.gov.br .

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VI Coleta de Amostras para o Laboratrio de Patologia Suna

19 Amostras para o Laboratrio de Patologia Suna
O Laboratrio de Patologia Suna realiza a necropsia de sunos, exame macroscpico e bacteriolgico. Quando necessrio, exames complementares so realizados, principalmente para estabelecer o diagnstico diferencial. importante que a coleta, acondicionamento, identificao e remessa das amostras sigam as recomendaes bsicas descritas nos itens de 1 a 6 do captulo I deste manual.

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19.1 Doenas bacterianas diagnosticadas no Laboratrio de Patologia Suna do IPVDF

DOENA Colibacilose Neonatal Colibacilose da 3a semana Doena do edema Exame histopatolgico Exame bacteriolgico Enterotoxemia Exame histopatolgico Exame bacteriolgico Salmonelose Exame histopatolgico PROVA LABORATORIAL Exame bacteriolgico Exame bacteriolgico Exame bacteriolgico MATERIAL A SER ENVIADO Alas intestinais, fezes, suabe retal ou leito em refrigerao Alas intestinais, fezes, suabe retal ou leito em refrigerao Alas intestinais, fezes, suabe retal ou leito em refrigerao Encfalo em formol a 10 % Alas intestinais ou leito em refrigerao Fragmentos de alas intestinais em formol a 10 % Alas intestinais, fezes, suabe retal, bao ou leito em refrigerao Fragmentos de alas intestinais (leo e ceco) em formol a 10 % Leses serofibrinosas, lquido pericrdico, lquido cefaloraquidiano, lquido sinovial, corao, bao, crebro, fgado, leito em refrigerao Pulmo, pleura ou leito em refrigerao Pulmo, pleura em formol a 10 % Pulmo, pleura ou leito em refrigerao Suabe nasal, tonsilas (em meio de transporte, sempre que possvel) em refrigerao Encfalo, suabes de meninge, lquido cefaloraquidiano ou leito em refrigerao Fragmento de encfalo, incluindo meninge em formol a 10 % Bao, lquido sinovial, leses de pele em refrigerao Pele, suabes da pele lesionada, rins ou leito em refrigerao Suabe da articulao ou lquido sinovial em refrigerao

Doena de Glasser

Exame bacteriolgico

Pleuropneumonia Pasteurelose pulmonar (Pasteurella multocida tipo capsular A e D) Rinite atrfica progressiva

Exame bacteriolgico Exame histopatolgico Exame bacteriolgico

Exame bacteriolgico

Exame bacteriolgico Meningite estreptoccica Exame histopatolgico Erisipela Epidermite exsudativa Artrites Exame bacteriolgico Exame bacteriolgico Exame bacteriolgico

Em caso de dvida, entrar em contato com o Laboratrio de Patologia Suna, pelo telefone (51) 3481 3711 (ramal 231) ou pelo e-mail sunos@ipvdf.rs.gov.br .

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VII Coleta de Amostras para o Laboratrio de Biologia Molecular

20 Amostras para o Laboratrio de Biologia Molecular
O laboratrio atua na realizao de anlises laboratoriais de DNA e RNA de agentes infecciosos de animais de produo, utilizando tcnicas de biologia molecular, mantendo tambm o foco em atividade de pesquisa. importante que a coleta, acondicionamento, identificao e remessa das amostras sigam as recomendaes bsicas descritas nos itens de 1 a 6 do captulo I deste manual. Atualmente, esto sendo realizados os diagnsticos das seguintes enfermidades pela tcnica de PCR:

Agente infeccioso Listeria monocytogenes Escherichia coli Salmonella sp. Campylobacter jejuni Mycobacterium bovis Mycobacterium tuberculosis Mycobacterium complexo MAC

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Os materiais a serem enviados so: sangue com EDTA, leite, outros fluidos e tecidos. Os materiais devem ser enviados sob refrigerao em at 48 horas aps a coleta e, depois deste perodo, enviar congelado. Dependendo da demanda, h a possibilidade da implantao de diagnstico molecular para outros microrganismos. Em caso de dvida, entrar em contato com o Laboratrio de Biologia Molecular, pelo telefone (51) 3481 3711 (ramais 208 e 243), ou pelo e-mail biologiamolecular@ipvdf.rs.gov.br .

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VIII Coleta de Amostras para Diagnstico de Doenas das Aves

As principais enfermidades diagnosticadas no Laboratrio de Sade das Aves do IPVDF so: importante que a coleta, acondicionamento, identificao e remessa das amostras sigam as recomendaes bsicas descritas nos itens de 1 a 6 do captulo I deste manual.
Doenas das Aves Aspergilose Botulismo Colibacilose Clostridiose Pasteurelose Salmonelose Micoplasmose Metapneumovirose Anemia Infecciosa Doena de Gumboro Bronquite Infecciosa

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21 Aves vivas ou mortas

Tipos de exames: necropsia, bacteriolgico, antibiograma, micolgico e PCR. Quando possvel, desejada uma amostragem mnima de 10 aves de 1 dia de idade ou 5 aves adultas por lote. As aves mortas devem ser encaminhadas sob refrigerao (2-8 C), o mais rpido possvel, evitando o estado de decomposio. As aves vivas devem ser enviadas em caixas forradas, evitando estresse e/ou morte por temperatura, oxigenao e espao inadequados.

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22 rgos
Tipos de exames: bacteriolgico, antibiograma, micolgico, bioensaios e PCR. Os rgos devem ser coletados de forma assptica, durante a necropsia, para evitar a contaminao do material e interferncia no isolamento do agente etiolgico. Tambm no devem estar em estado de autlise. Coletar amostras de 5 animais do mesmo lote, sendo 3 aves com sintomas e 2 aparentemente sadias. Pode ser coletado crebro, cerebelo, traqueia, pulmo, sacos areos, corao, papo, proventrculo, moela, fgado, bao, timo, pncreas, rim, bursa, tonsilas cecais, intestinos, ovrio, testculo, ossos, nervo citico e vago. As amostras devem ser enviadas em embalagens limpas e estreis sob refrigerao (2-8 C), em at 24 horas.

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23 Suabes
23.1 Traqueia
Tipos de exames: bacteriolgico, antibiograma e PCR. A coleta deve ser realizada com a ave bem imobilizada e observada a introduo do suabe estril (haste com algodo) no local correto, atentando para a proximidade entre o rgo alvo e o esfago. necessrio abrir o bico da ave e abaixar a lngua da mesma para poder atingir a traqueia. Os suabes estreis devem ser abertos e seguros pelo cabo onde no h algodo, sendo esfregados com firmeza em toda a circunferncia da parede da traqueia, evitando que toquem nas mucosas da boca. Utilizar um suabe por ave e, aps a coleta, cortar a extremidade que estava em contato com a mo e mergulhar o restante no frasco que contm o meio de transporte Stuart. O caldo Frey deve ser utilizado como meio de transporte quando o exame for para PCR para Mycoplasma. Devem ser coletados suabes individuais de 20-30 aves por lote. Utilizar um tubo com meio de transporte para cada suabe coletado. As amostras devem ser enviadas sob refrigerao (2-8 C), no intervalo mximo de 24 horas.

23.2 Cloaca
Tipos de exames: bacteriolgico, antibiograma e PCR. A coleta deve ser realizada com suabe estril seguro pelo cabo onde no h algodo, realizando movimentos circulares no orifcio da cloaca. Utilizar um suabe por ave e, aps a coleta, cortar a extremidade que estava em contato com a mo e mergulhar o restante no frasco que contm soluo de gua peptonada tamponada estril.

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Devem ser coletados suabes de 20-30 aves por lote, agrupando 10 suabes em cada recipiente. As amostras para isolamento bacteriano e PCR devem ser enviadas sob refrigerao (2-8 C), no intervalo mximo de 24 horas.

23.3 Arrasto
Tipos de exames: bacteriolgico, antibiograma e PCR. Fazer todo o procedimento utilizando luvas descartveis estreis. A coleta deve ser realizada com gaze ou esponja estril, que sero arrastadas pelo galpo para entrarem em contato direto com a cama do avirio. Aps o trmino, colocar o material coletado no frasco contendo soluo de gua peptonada tamponada estril. As amostras para isolamento bacteriano e PCR devem ser enviadas sob refrigerao (2-8 C), em at 24 horas.

24 Soro
Tipos de exames: SAR e bioensaios. A coleta do sangue deve ser realizada de maneira assptica, utilizando material e instrumentos estreis, conforme descrito nos itens 12.4 e 12.5 deste manual. No adicionar anticoagulante, para no interferir nos resultados dos exames. Nas aves adultas, a coleta pode ser realizada por puno cardaca ou na veia ulnar (asa). Em aves de 1 dia, realizar puno cardaca ou na veia jugular (decapitao). O nmero de amostras mnimo para realizao de testes sorolgicos de 25 soros por lote de pontos distintos do galpo. Observar os itens 12.4 e 12.5 deste manual para o envio das amostras. Os soros enviados para o teste de SAR no podem ser congelados.

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Enfermidade Aspergilose Botulismo Colibacilose

Exames Isolamento fngico Bioensaio em camundongos Isolamento bacteriano PCR Isolamento bacteriano SAR Isolamento bacteriano PCR PCR PCR PCR PCR PCR

Amostras Aves e pulmes Soro, fgado, contedo do papo, moela e intestinos Aves e rgos afetados (ovrio, fgado, corao, sacos areos e tecido subcutneo) Aves e intestinos Aves, suabes, fgado, pulmes, traqueia, corao, barbelas, cabea e ossos longos (fmur) Soros, aves, suabes, rgos afetados (fgado, intestinos, corao, bao e ovrio) Aves, suabe traqueal, traqueia, pulmes e sacos areos Aves, suabe traqueal, traqueia, pulmes e cabea Aves, timo e bao Aves e bursa Aves, pulmes, traqueia e rins

Clostridiose Pasteurelose

Salmonelose

Micoplasmose Metapneumovirose Anemia Infecciosa Doena de Gumboro Bronquite Infecciosa

Em caso de dvida, entrar em contato com o Laboratrio de Sade das Aves, pelo telefone (51) 3481 3711 (ramais 248 e 249) ou pelo e-mail aves@ipvdf.rs.gov.br .

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IX Coleta de Amostras de Rao e Farinhas de Origem Animal para Exame Microbiolgico

Tipos de exames: contagem de mesfilos, contagem de coliformes totais / termotolerantes / E. coli, contagem de bolores e leveduras, contagem de estafilococos coagulase positiva, contagem de clostrdio sulfito redutor e pesquisa de Salmonella spp. e Listeria monocytogenes.

25 Amostras acondicionadas em embalagens individuais

As amostras devem ser enviadas em quantidade igual ou superior a 200 g, na sua embalagem original, fechada e intacta. Caso na embalagem unitria a quantidade no atinja a recomendada para o envio, coletar vrias embalagens unitrias.

26 Amostras acondicionadas em embalagens no individuais

Quando as amostras estiverem contidas em embalagens de grande quantidade, deve-se promover a homogeneizao do material a ser analisado antes do incio da amostragem. Fazer a coleta de maneira assptica em pores representativas da massa total para frascos estreis ou embalagens novas, em quantidade igual ou superior a 500 g.

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As amostras devem ser enviadas sob refrigerao (2-8 C), no tempo mximo de 24 horas. importante que a coleta, acondicionamento, identificao e remessa das amostras sigam as recomendaes bsicas descritas nos itens de 1 a 6 do captulo I deste manual.
Microrganismos Meslos Coliformes Totais / Termotolerantes / E.coli Estalococos Coagulase Positiva Clostrdio Sulto Redutor Salmonelose Listeria monocytogenes Bolores e Leveduras Mtodo de anlise Contagem Contagem Contagem Contagem Isolamento bacteriano PCR PCR Contagem

Em caso de dvida, entrar em contato com o Laboratrio de Sade das Aves, pelo telefone (51) 3481 3711 (ramal 248) ou pelo e-mail aves@ipvdf.rs.gov.br .

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X Coleta de Amostra de gua para Exame de Contaminao Bacteriana

A gua considerada recurso de primeira necessidade para todos os seres vivos. Portanto, a sua salubridade de grande importncia, pois mesmo sendo subterrnea pode ficar exposta a poluentes e contaminantes. A poluio aqutica pode ocorrer tanto por substncias qumicas quanto por contaminantes biolgicos, os quais podem ser veiculados para o homem ou para os animais, causando doenas. A gua para consumo humano e animal deve ser potvel, ou seja, isenta de agentes biolgicos patognicos, compostos txicos, excesso de substncias orgnicas e minerais. Uma das formas de controle da qualidade da gua atravs da anlise bacteriolgica, que determina o nmero de bactrias totais e de origem fecal, sendo o grupo coliforme bastante utilizado como indicador de contaminao.

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27 Coleta de gua em torneiras e bebedouros

A amostragem da gua dever ser realizada em frascos estreis com volume mnimo de 200 ml. A coleta e o manuseio dos recipientes devero ser realizados com cuidado, para evitar a contaminao microbiolgica da amostra. Os recipientes devero ser abertos somente no momento da coleta da amostra e pelo tempo necessrio para seu preenchimento, devendo ser fechados imediatamente aps a coleta. importante que a coleta, acondicionamento, identificao e remessa das amostras sigam as recomendaes bsicas descritas nos itens de 1 a 6 do captulo I deste manual.

27.1 Procedimentos de coleta:

a) Lavar a torneira no local de sada da gua e lavar as mos para evitar a contaminao:

b) Abrir a torneira, no ponto de coleta, de forma a obter um fluxo baixo e constante de gua e deixar escoar a gua por dois minutos antes da coleta:

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c) Abrir o frasco neste momento e colher a gua mantendo o mesmo inclinado para evitar a sua contaminao pelo ar. Manter a tampa virada para baixo e nunca tocar nas suas bordas ou no interior do recipiente:

d) Coletar um volume de amostra que preencha 2/3 do recipiente. Tampar o frasco rpida e firmemente para que se evite a contaminao e o vazamento da amostra durante o transporte ao laboratrio:

e) Identificar o recipiente com as seguintes informaes, escritas de forma legvel: Tipo de gua: Ponto de amostragem: Local: Data e hora da coleta: Nome do responsvel pela coleta:

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f) Enviar a amostra ao laboratrio imediatamente aps a coleta. Ela deve ser enviada em caixa isotrmica, chegando ao laboratrio num perodo mximo de 12 horas aps sua coleta. Os recipientes devero ser acondicionados de forma que os espaos vazios sejam preenchidos com papel amassado, evitando-se que o recipiente se desloque dentro da caixa durante o trajeto. Enviar a amostra em esquema de embalagem tripla, descrita no item 2 do captulo I. O Formulrio para Solicitao de Exames (Anexo 1) e o rtulo de risco biolgico (item 3 do captulo I) devem ser preenchidos e fixados no lado externo da caixa que contm as amostras:

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28 Coleta de gua em rios, poos, caixas dgua e reservatrios em geral

A amostragem da gua dever ser realizada em frascos estreis com volume mnimo de 200 ml. A coleta e o manuseio dos recipientes devero ser realizados com cuidado, para evitar a contaminao microbiolgica da amostra. Os recipientes devero ser abertos somente no momento da coleta da amostra e pelo tempo necessrio para seu preenchimento, devendo ser fechados imediatamente aps a coleta.

28.1 Procedimentos de coleta:

a) Lavar as mos e as demais partes do corpo que entraro em contato com a amostra, para evitar a contaminao:

b) Para facilitar a coleta, amarrar o recipiente com uma corda previamente lavada e desinfetada. Abrir o frasco no momento da coleta. Descer o recipiente abaixo do nvel da gua, cerca de vinte centmetros de profundidade, evitando o mximo possvel a gua da superfcie:

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c) Coletar um volume de amostra que preencha 2/3 do recipiente. Tampar rapidamente o frasco e de maneira firme, para evitar a contaminao e o vazamento da amostra durante o transporte ao laboratrio:

d) Identificar o recipiente, que deve conter as informaes necessrias, escritas de forma legvel, conforme descrito anteriormente no item 27.1.e; e) Enviar a amostra imediatamente aps a coleta ao laboratrio, conforme descrito anteriormente no item 27.1.f. Em caso de dvidas, entrar em contato com o Laboratrio de Sade das Aves, pelo telefone (51) 3481 3711 (ramal 248) ou pelo e-mail aves@ipvdf.rs.gov.br .

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XI Coleta do Encfalo na Necropsia de Bovinos

Esse captulo, assim como suas ilustraes, foi reproduzido e/ou adaptado a partir do Manual de procedimentos para diagnstico histolgico diferencial da Encefalopatia Espongiforme dos Bovinos (BSE), de Barros et al., 2001. A coleta no criteriosa de amostras de crebro no fixado pode dificultar o exame no laboratrio. Quando houver vrios animais para necropsia, num surto de uma doena neurolgica, o tempo para a retirada do encfalo pode ser um fator limitante. Nesse caso, selecione alguns animais para o exame neuropatolgico. Deve-se coletar o material tentando eliminar ou diminuir ao mximo os danos ao tecido nervoso durante a sua retirada.

29 Retirada do encfalo
a) Atravs de um acesso ventral, remova a cabea, desfazendo a articulao atlanto-occipital. Localize o ponto da articulao, colocando o dedo na regio e movimentando a cabea do animal (Figuras 15 e 16). Seccione msculos e ligamentos e faa a extenso da articulao, empurrando o focinho do cadver para baixo; b) Seccione a pele, longitudinalmente, da nuca ao focinho, rebatendo-a. Remova msculos e tecidos moles; c) Trace uma linha imaginria logo aps as apfises supraorbitrias dos ossos frontais, unindo o extremo caudal de um olho ao outro (Figura 17) e, utilizando um escopro e um martelo ou serra, seccione a seguir;

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d) Seccione os ossos temporais e o occipital, unindo os extremos da seco anterior ao forame magno; e) Retire a calota craniana, fazendo trao com um pequeno gancho ou usando o escopro como alavanca; f) Utilizando tesouras, retire a dura-mter, seccionando a foice do crebro e o tentrio do cerebelo, certificando-se de que a poro de meninges entre o crebro e o cerebelo tenha sido retirada, para remover o conjunto de forma intacta (Figura 18 e 19); g) Vire a cabea do animal de modo que o crebro fique para baixo e, assim, aproveitando a gravidade, seccione com cuidado a emerso dos nervos cranianos, retirando delicadamente o encfalo da cavidade craniana; h) O gnglio do nervo trigmeo (gnglio de Gasser) deve ser tambm coletado. O exame desse par de gnglios nervosos do 5 par de nervos cranianos importante para o diagnstico de doenas como raiva e doena de Aujeszky. A rede admirvel carotdea retirada com o gnglio e a hipfise: fazem-se dois cortes longitudinais e paralelos, como se estivessem unindo o clinide cranial com o vrtice do rochedo temporal. Posteriormente, secciona-se transversalmente o diafragma hipofisrio, cranialmente ao clinide cranial e posteriormente prximo ao vrtice do rochedo temporal. Com uma pina, retira-se o diafragma hipofisrio e, em seguida, o gnglio trigeminal. Em casos de encefalite da febre catarral maligna, os vasos da rede admirvel mostram leso (vasculite) caracterstica. Em casos de raiva e Aujeszky, a inflamao (ganglioneurite) do gnglio do nervo trigmeo um achado frequente; i) Observe com ateno o encfalo, evitando pression-lo, pesquisando leses macroscpicas como aumento de volume, assimetrias, vascularizao, pontos de amolecimento, hemorragias, exsudatos, etc.

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Figura 15 Remoo da cabea. A faca inserida no ponto indicado pela seta (reproduzido de Olafson in: Barros et al., 2001).

Figura 16 Remoo da cabea. A cabea separada do resto do cadver na articulao antlanto-occiptal (reproduzido de Olafson in: Barros et al., 2001).

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Figura 17 As linhas marcam os locais onde o crnio deve ser serrado para retirada do crebro (reproduzido de Olafson in: Barros et al., 2001).

Figura 18 O crebro ento exposto com a dura-mter intacta (reproduzido de Olafson in: Barros et al., 2001).

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30 Coleta e seleo de amostras do encfalo para virologia, bacteriologia e histopatologia

A coleta e a seleo de amostras para exames virolgicos e bacteriolgicos devem ser feitas antes da fixao do encfalo, da seguinte forma: a) Inicialmente, remova o cerebelo, seccionando-o ao nvel dos pednculos cerebelares. Introduza a ponta de uma lmina no 4 ventrculo pela parte caudal do cerebelo. Seccione rostral e horizontalmente os pednculos cerebelares, separando o cerebelo do bulbo num dos lados e, depois, no outro (Figura 20 e 21); b) Corte na altura do tlamo, separando o tronco enceflico do resto do encfalo (Figura 22). Ao findar essa operao, voc obter trs partes: a) o tronco enceflico, b) o cerebelo e c) o restante do encfalo (Figura 23); c) Para obter a amostra 1, retire uma fatia sagital (cerca de 0,5 cm) do verme do cerebelo (Figuras 24 e 25); d) Para obter a amostra 2, corte uma fatia transversal fina (cerca de 0,5 cm) do bulbo, no ponto onde o tronco enceflico foi separado da medula espinhal (Figuras 26 e 27); e) A amostra 3 obtida dividindo-se um dos hemisfrios cerebrais na altura do quiasma ptico, separando-se a parte rostral do restante (Figura 28); f) Nesse ponto, as trs amostras a serem enviadas para o exame virolgico e/ou bacteriolgico foram obtidas (Figura 29). Os fragmentos selecionados so adequados para o exame da raiva e para exame de outras doenas causadas no sistema nervoso de bovinos por vrus e bactrias. Essas trs amostras devem ser conservadas no refrigera-

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dor e remetidas refrigeradas. No entanto, se o tempo entre a coleta e a remessa for maior que 24 horas, aconselhvel congelar essas amostras e envi-las congeladas, mas nunca fixar em formol; g) O restante do encfalo (Figura 30) deve ser fixado em formol, conforme descrito no Captulo V, e encaminhado ao exame histolgico, assim como o bloco de tecidos constitudo pela rede admirvel carotdea, o gnglio do nervo trigmeo e a hipfise. Atravs da histopatologia, pode-se diagnosticar a Encefalopatia Espongiforme Bovina (BSE).

Figura 19 Tanto quanto possvel, o crebro deve ser removido intacto. As letras mostram os locais onde esto localizados a foice (F) do crebro e o tentrio (T) do cerebelo.

Figura 20 Introduza a ponta de uma lmina no 4 ventrculo, pela parte caudal do cerebelo. Corte rostral e horizontalmente os pednculos cerebelares, separando o cerebelo do bulbo num dos lados e, depois, no outro.

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Figura 21 Ao findar a operao descrita na Figura 20, o cerebelo estar completamente separado do encfalo. Os hemisfrios telenceflicos (T), o 4 ventrculo (IV) e o cerebelo (C) esto identificados na figura.

Figura 22 Separe o tronco enceflico do resto do encfalo, cortando em ambos os lados, na altura do tlamo, como mostra a figura.

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Figura 23 Ao findar a operao descrita na Figura 22, o encfalo estar dividido em trs partes: o tronco enceflico (acima, direita), o cerebelo (abaixo, direita) e os hemisfrios telenceflicos.

Figura 24 Para a obteno da amostra 1, a ser enviada para exames virolgicos e/ou bacteriolgicos, uma fatia de cerca de 0,5 cm retirada ao longo do verme do cerebelo.

Figura 25 Esta fatia (1) deve ser refrigerada ou congelada.

Figura 26 Para obter a amostra 2, corte uma fatia transversal de aproximadamente 0,5 cm do bulbo, no ponto onde o tronco enceflico foi separado da medula espinhal.

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Figura 27 O fragmento (2) deve ser refrigerado ou congelado e o restante fixado em formol.

Figura 28 A amostra 3 obtida dividindo-se um dos hemisfrios cerebrais na altura do quiasma ptico, separando-se a parte rostral (3) do restante.

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Figura 29 Estas so as amostras destinadas ao exame virolgico e/ou bacteriolgico: 1) fatia do cerebelo seccionado ao longo do verme; 2) fatia do bulbo/medula cervical e 3) metade rostral de um dos hemisfrios telenceflicos. Esses fragmentos devem ser remetidos refrigerados ou congelados.

Figura 30 O material mostrado nesta figura o que resta aps a retirada das amostras 1-3 para exames virolgicos e/ou bacteriolgicos. Este material formado por todo o tronco enceflico (acima, esquerda), duas partes do cerebelo (ao centro) e dos hemisfrios telenceflicos. Destina-se ao exame histolgico e deve ser fixado em formol a 10 %.

Em caso de dvidas, entrar em contato com o Laboratrio de Patologia, pelo telefone (51) 3481 3711 (ramal 223) ou pelo e-mail patologia@ipvdf.rs.gov.br .

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XII Referncias
ALTON G.G.; JONES L.M.; ANGUS R.D.; VERGER J.M. Techniques for the Brucellosis Laboratories. Paris: INRA, 1988. 190 p. BARROS C.S.L.; LEMOS R.A.A.; CAVALLRO J.C.M. Manual de Procedimentos para Diagnstico Histolgico Diferencial da Encefalopatia Espongiforme dos Bovinos (BSE). So Paulo: Lemos, 2001. 56 p. BRASIL. Ministrio da Agricultura, Pecuria e Abastecimento. Secretaria de Defesa Agropecuria. Departamento de Defesa Animal. Manual Tcnico do Programa de Controle e Erradicao da Brucelose e Tuberculose Animal. Braslia, 2005. 190 p. PNCEBT. ______. Laboratrio de Apoio Animal/Recife. Diagnstico de Doenas dos Animais: Manual de Instrues para Coleta, Conservao e Remessa de Material para Laboratrio. 5. ed. Braslia, 2003. FEPAGRO. Manual de Coleta e Remessa de Materiais para Diagnstico de Doenas de Animais. 2. ed. Porto Alegre, 1998. 21 p. Circular Tcnica, 6. GUERREIRO M.G. et al. Bacteriologia Especial. Porto Alegre: Sulina, 1984. HIRSH D.C.; ZEE Y.C. Microbiologia Veterinria. Rio de Janeiro: Koogan, 2003. 446 p. HOFFMAN R.P. Diagnstico de Parasitismo Veterinrio. Porto Alegre: Sulina, 1987. 156 p. HBNER S.O.; OLIVEIRA A.P.; FRANCO A.C.; ESTEVES P.A.; SILVA A.D.; SPILKI F.R.; RIJSEWIJK, F.A.M.; ROHE P.M.. Experimental Infection of Calves with a gI, gE, US9 Negative Bovine Herpesvirus Type 5. Comparative Immunology, Microbiology & Infectious Diseases, Oxford: Elsevier. n. 28, p.187-196, 2005. MERIAL. Manual: Necropsia e Remessa de Material para Laboratrio. Campinas, 2006. 58 p. OLIVEIRA S.J. Guia Bacteriolgico Prtico: Microbiologia Veterinria. 2. ed. Canoas: Ulbra, 2000. 240 p.

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PANAFTOSA. Instruciones para el Envo de Muestras. Rio de Janeiro, 1998. Folleto de Informacin Pblica, 5. PIANTA C. Mastite Bovina: Informaes ao Produtor. FEPAGRO, 1997. Circular Tcnica, 15. Porto Alegre:

RADOSTITS O.M.; GAY C.C.; BLOOD D.C.; HINCHCLIFF K.W. Clnica Veterinria. 9. ed. Rio de Janeiro: Koogan, 2002. 1735 p. RIET-CORREA F.; MNDEZ M.C.; SCHILD A.L. Intoxicaes por Plantas e Micotoxicoses em Animais Domsticos. Montevideo: Agropecuaria Hemisferio Sur, 1993. 340 p. ______; SCHILD A.L.; MNDEZ M.C. et al. Doenas de Ruminantes e Eqinos. Pelotas: UFPEL, 1998. 651 p.

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XIII ANEXO 1 Formulrio para Solicitao de Exames

Secretaria da Agricultura, Pecuria e Agronegcio
Preenchimento sob responsabilidade do IPVDF Rubrica Protocolo Recebido em N / / /

FORMULRIO PARA SOLICITAO DE EXAMES

Cliente: ______________________________________________________________________________ Proprietrio: _________________________________________________________________________ Municpio de origem das amostras: ______________________________________________________ Caso o cliente no esteja cadastrado no IPVDF ou necessite atualizar o cadastro, preencha o quadro abaixo: C.N.P.J. / C.P.F.: Endereo para correspondncia: Bairro: Tel. Fixo: e-mail: I.E. / R.G.: Cidade: Tel. Cel: UF: Fax: CEP: -

Md. Veterinrio responsvel pela remessa: _________________________________________ Caso o Md. Veterinrio no esteja cadastrado no IPVDF ou necessite atualizar o cadastro, preencha o quadro abaixo: CRMV/UF: Endereo para correspondncia: Bairro: Tel. Fixo: E-mail: Cidade: Tel. Cel: UF: Fax: CEP: C.P.F: R.G:

Identicao das amostras remetidas: Espcie:____________________________Tipo de Material:____________________________________ Data da Coleta: _____ / _____ / _____ Quantidade de Amostras:________________________________ Conservao durante transporte: ____________________ Tipo de transporte: _________________ Preenchimento pelo Protocolo do IPVDF: Estado de conservao da amostra no recebimento: ________________________________________ Informaes sobre o histrico do animal e/ou suspeita clnica: _____________________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________ Exames solicitados: _____________________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________________ __________________________________________________ Eu, ____________________________ assumo total responsabilidade pelas informaes acima prestadas. ______________________,______ de _______________ de 20___. ____________________________ Assinatura do responsvel pelas informaes
IPVDF - ESTRADA DO CONDE, N 6000 - CEP: 92990-000 - ELDORADO DO SUL - RS BRASIL Fone/Fax: 51 3481 3711 - Site: www.ipvdf.rs.gov.br; e-mail: protocolo@ipvdf.rs.gov.br / saude-animal@fepagro.rs.gov.br

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