CAPTULO 2.3.7.

ANAPLASMOSIS BOVINA

RESUMEN
La anaplasmosis bovina es consecuencia de la infeccin con Anaplasma marginale. Se conoce desde hace tiempo una segunda especie, A. centrale. No est claro si representa una verdadera especie separada. Anaplasma marginale es responsable de casi todos los brotes de la enfermedad clnica. El microorganismo se clasifica en el gnero Anaplasma, que pertenece a la familia Anaplasmataceae del orden Rickettsiales. Genticamente, A. marginale encaja dentro del genogrupo II de las Ehrlichiae. Los signos caractersticos de la anaplasmosis son anemia e ictericia, pero la enfermedad clnica solo se puede confirmar por identificacin del organismo. Una vez infectado, el ganado puede permanecer toda la vida como portador, y la identificacin de estos animales depende de la deteccin de anticuerpos especficos mediante pruebas serolgicas o del ADN de las rickettsias mediante tcnicas de amplificacin. Identificacin del agente: El examen microscpico de sangre o de frotis de rganos con tincin de Giemsa es el mtodo ms comn para identificar Anaplasma en animales con infeccin clnica. En estos frotis, A. marginale aparece dentro de los eritrocitos como cuerpos densos y redondeados de 0.3-1.0 m de dimetro, la mayor parte de ellos situados en la zona marginal del eritrocito o en su proximidad. Anaplasma centrale es aparentemente similar, pero la mayor parte de los microorganismos se sitan lejos del margen del eritrocito. En algunos pases existen colorantes comerciales que permiten una tincin rpida de Anaplasma. Es importante que los frotis se hagan bien y estn exentos de material extrao. Los frotis de material de ganado vivo deberan prepararse, con preferencia, de sangre obtenida de la vena yugular o de algn otro gran vaso. En el caso de diagnosis post-mortem, los frotis deben proceder de rganos internos (incluyendo hgado, rin, corazn y pulmones) y de la sangre retenida en vasos perifricos. Esto ltimo es particularmente deseable si el estado de descomposicin, despus de la muerte, es avanzado. Pruebas serolgicas: Las pruebas serolgicas ms utilizadas han sido la fijacin del complemento (FC) y las pruebas de aglutinacin en placa. Sin embargo, datos recientes confirman que la prueba FC presenta una sensibilidad baja (20%) que resulta inaceptable para la identificacin de ganado con infeccin persistente. Por consiguiente la prueba FC debe considerarse como una prueba poco fiable para certificar el estado de animales individuales. Para la deteccin de animales portadores se ha demostrado que un enzimoinmunoensayo competitivo (C-ELISA), disponible comercialmente, presenta una sensibilidad muy mejorada (96%). Tambin pueden utilizarse pruebas ELISA indirectas, ELISA puntuales y de inmunofluorescencia indirecta. Se han utilizado pruebas experimentales basadas en el cido nucleico, que son capaces de detectar la presencia de una infeccin de bajo nivel en ganado portador y en las garrapatas que actan como vectores. Cuando se utilizan para el diagnstico pruebas basadas en la reaccin en cadena de la polimerasa est justificada una cierta precaucin, ya que se necesita una reaccin combinada para identificar portadores de bajo nivel y puede tener lugar una amplificacin inespecfica. Requisitos para las vacunas y los materiales de diagnstico: En varios pases se usan vacunas vivas para proteger el ganado contra la infeccin por A. marginale. La vacuna que contiene A. centrale es de uso ms amplio y confiere proteccin contra cepas virulentas de A. marginale.

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Se dispone de vacuna contra Anaplasma centrale en forma refrigerada y congelada. El control de calidad es muy importante ya que pueden estar presentes en el ganado donador otros agentes transmisibles por la sangre que pueden contaminar las vacunas y tener una diseminacin amplia. Por esta razn se recomienda la vacuna congelada que permite un control de calidad posterior a la produccin, lo que limita el riesgo de contaminacin con otros patgenos. Las vacunas contra Anaplasma centrale no son completamente seguras. Una recomendacin prctica es limitar su uso, en la medida de lo posible, a terneros, pues la inmunidad inespecfica reducir el riesgo de algunas reacciones vacunales que pueden requerir tratamiento con tetracicilina o imidocarb. La inmunidad parcial se desarrolla en 6-8 semanas y dura varios aos despus de una nica vacunacin.

A. INTRODUCCIN
Los brotes de anaplasmosis bovina se deben normalmente a la infeccin por Anaplasma marginale. Anaplasma centrale produce una anemia moderada, pero los brotes en el campo son muy raros. En algunos aislamientos de A. marginale se han descrito estructuras adicionales asociadas con los cuerpos de Anaplasma (17); aunque este parsito se ha denominado A. caudatum, no se considera como una especie separada. Anaplasma marginale se presenta en la mayor parte de los pases tropicales y subtropicales, y en algunas regiones ms templadas. Anaplasma centrale se describi por vez primera vez en Sudfrica. Desde entonces el organismo ha sido importado en otros pases incluyendo Australia y algunos pases de Sudamrica, Sudeste asitico y Oriente Medio- para ser utilizado como vacuna contra A. marginale. Las especies de Anaplasma se consideraron en principio como protozoos parsitos, pero la investigacin posterior revel que no posean atributos que justificaran esta descripcin. Desde 1957 se han clasificado en la familia Anaplasmataceae del orden Rickettsiales. Recientemente se ha propuesto una reorganizacin de la familia, que en el pasado inclua los gneros Anaplasma, Aegyptianella, Haemobartonella y Eperythrozoon (31), basndose en una combinacin del anlisis de secuencias del ARN ribosmico 16 S, de groesI, y del gen de la protena superficial (6,37). En la familia Anaplasmataceae reorganizada se incluye toda la subdivisin alfa de Proteobacterias que pertenecen a los gneros Ehrlichia, Anaplasma, Cowdria, Wolbachia y Neorickettsia, reteniendo provisionalmente a Aegyptianella. Adems, el gnero Anaplasma se ha ampliado hasta incluir Ehrlichia phagocytophila, Ehrlichia bovis y Ehrlichia platys, con la nueva designacin de Anaplasma phagocytophila que incluye tanto Ehrlichia equi como la Ehrlichia del agente HGE. Los gneros Haemobartonella y Eperythrozoon se consideran en la actualidad ms prximos a los micoplasmas. Las especies de Anaplasma se trasmiten mecnica o biolgicamente por insectos vectores. Una revisin basada en un estudio cuidadoso de experimentos de transmisin presenta una lista de 14 garrapatas diferentes que han sido descritas como capaces de transmitir experimentalmente A. marginale (13). stas son: Argas persicus, Ornithodoros lahorensis, Boophilus annulatus, B. decoloratus, B. microplus, Dermacentor albipictus, D. andersoni, D. occidentalis, D. variabilis, Hyalomma excavatum, Ixodes ricinus, Rhipicephalus bursa, R. sanguineus and R. simus. Los autores concluyeron que algunos de estos resultados, como los de R. bursa, H. excavatum y O. lahorensis no son muy convincentes y que las garrapatas identificadas como A. persicus eran probablemente A. sanchezi o A. radiatus. Adems, Rhipicephalus e. evertsi y Hyaloma m. rufipes se han descrito como vectores experimentales en Sudfrica (28). La transmisin intra o interespecfica es comn, incluso en las especies de Boophilus de un solo hospedador. Las garrapatas macho pueden ser particularmente importantes como vectores .La demostracin experimental de la implicacin de un vector no implica necesariamente que tenga un papel en la transmisin en condiciones de campo. Sin embargo, las especies de Boophilus son claramente vectores importantes de la anaplasmosis en pases tales como Australia o Sudfrica, y algunas especies de Dermacentor son vectores eficaces en los Estados Unidos de Amrica (USA). Otros artrpodos picadores muy diversos se han considerado como vectores mecnicos, particularmente en USA. Se ha demostrado la transmisin experimental con ciertas especies de Tabanus (mosca del caballo) y con mosquitos del gnero Psorophora (30). La importancia de los insectos picadores en la transmisin natural de la anaplasmosis no est bien documentada y parece variar mucho de una regin a otra. Anaplasma marginale puede transmitirse tambin con facilidad durante la vacunacin contra otras enfermedades, a menos que se utilice una aguja nueva o esterilizada para inyectar a cada animal. Se ha descrito una transmisin similar por medio de instrumentos quirrgicos no esterilizados. Los principales vectores de A. centrale parecen ser garrapatas de hospedadores mltiples, propias de frica, como R. rimus. No se ha demostrado que la garrapata comn de los bvidos (B. microplus) sea un vector. Esto es importante porque A. centrale se utiliza como vacuna en regiones infestadas por B. microplus.

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B. TCNICAS DE DIAGNSTICO
Los sntomas clnicos ms marcados de la anaplasmosis son anemia e ictericia, la ltima con aparicin tarda en la enfermedad. No se presenta hemoglobinemia ni hemoglobinuria, lo que puede ayudar al diagnstico diferencial entre anaplasmosis y babesiosis, que a menudo es endmica en las mismas regiones. No obstante, la enfermedad solo se puede confirmar por identificacin del microorganismo causante.

1.

Identificacin del agente

Las muestras obtenidas a partir de ganado vivo deben incluir frotis finos de sangre y sangre recogida con anticoagulante. Los frotis finos de sangre, secados con aire, se mantienen de modo satisfactorio a temperatura ambiente por lo menos 1 semana. Las muestras de sangre con coagulante deberan mantenerse a 4C a menos que se lleve al laboratorio en unas pocas horas. Esta muestra es til para preparar frotis frescos si los anteriores no fueran satisfactorios. Adems un cierto volumen pequeo de clulas y/o un recuento de eritrocitos puede ayudar a poner de manifiesto la implicacin de Anaplasma cuando en los frotis se detecta solo un nmero pequeo de parsitos, como puede ocurrir en la fase de recuperacin de la enfermedad. En contraste con Babesia bovis, Anaplasma no se acumula en los capilares, de modo que es apropiada la sangre de la yugular u otro gran vaso. Debido a la morfologa poco diferencial de Anaplasma, es esencial que los frotis estn bien preparados y libres de substancias extraas, pues las partculas de restos pueden confundir la el diagnstico. Las extensiones gruesas de sangre, que se utilizan en el diagnstico de la babesiosis, no son apropiadas para el diagnstico de la anaplasmosis, porque Anaplasma es difcil de identificar una vez que se separa de los eritrocitos. Las muestras obtenidas de animales muertos deben ser frotis finos, secados al aire, del hgado, rin, corazn y pulmones y de un vaso sanguneo perifrico. ste ltimo se recomienda, en particular, si hay un retraso notable antes del examen post-mortem porque, en tales circunstancias, la contaminacin bacteriana en los frotis de los rganos puede conducir a una identificacin equvoca de Anaplasma. Los frotis de cerebro, que son tiles en el diagnostico de algunas formas de babesiosis, no tienen valor directo en el diagnstico de la anaplasmosis (14), aunque deberan incluirse para el diagnstico diferencial cuando sea pertinente. Para la preparacin de frotis se requiere la sangre de rganos, mejor que los tejidos de los rganos per se, porque el objetivo es ser capaz de examinar microscpicamente eritrocitos intactos para la presencia de Anaplasma. Los frotis derivados de sangre de rganos se mantienen satisfactoriamente durante varios das a temperatura ambiente (14). Los frotis de sangre y de los rganos se fijan 1 minuto con metanol absoluto y se tien con 10% de colorante de Giemsa durante 30 minutos. Despus de la tincin, los frotis se lavan tres o cuatro veces con agua de grifo para eliminar el colorante adherido y luego se secan al aire. Los frotis se examinan con aceite de inmersin a un aumento de 700-1.000 x. En los frotis teidos con Giemsa, A. marginale aparece como cuerpos densos, redondeados y muy coloreados dentro de los eritrocitos, de aproximadamente 0,3-1,0 m de dimetro. La mayor parte de estos cuerpos se localizan en el margen del eritrocito o en su proximidad. Esta caracterstica diferencia A. marginale de A. centrale, presentando en este ltimo caso los microorganismos una localizacin ms centrada en el eritrocito. En algunos pases1, se dispone de colorantes comerciales para tincin rpida de Anaplasma. El porcentaje de eritrocitos infectados vara segn la fase y la gravedad de la enfermedad. Con A. marginale pueden presentarse parasitemias mximas que superan el 50%. Durante los perodos de alta parasitemia, son comunes las infecciones mltiples de eritrocitos individuales. La infeccin se hace microscpicamente visible en 2-6 semanas despus de la transmisin. Durante la enfermedad clnica, la parasitemia se duplica aproximadamente cada da hasta los 10 das, y luego decrece a una velocidad similar. Puede persistir durante algunas semanas una anemia muy fuerte despus de que los parsitos lleguen a ser virtualmente indetectables en los frotis. Despus de la recuperacin de la infeccin inicial, la mayor parte del ganado permanece con infeccin latente durante el resto de su vida. Para detectar Anaplasma en frotis realizados post-mortem se puede utilizar la tincin con anticuerpos fluorescentes como una tcnica alternativa. Johnston et al. (14) han descrito un procedimiento de inmunofluorescencia directa para el diagnstico post-mortem de anaplasmosis. Aunque parece ser ms sensible que la tincin con Giemsa, la fluorescencia inespecfica es un problema importante.

Los colorantes rpidos incluyen Camco-Quick y Diff-Quick, Baxter Scientific Products, McGaw Park, Illinois, USA y Hema 3 y Hema-Quick, Curtin-Matheson, Houston, Texas, USA.

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Un procedimiento costoso, pero en ocasiones justificable para confirmar la infeccin, particularmente en ganado con infeccin latente, consiste en inocular sangre del animal sospechoso en un ternero esplenectomizado (sin bazo). Se inocula intravenosamente una cantidad (hasta 500 ml) de la sangre del donador con anticoagulante en el ternero esplenectomizado, y luego se examinan frotis de sangre al menos cada 2-3 das. Si el donador est infectado, se observar Anaplasma en los frotis del ternero esplenectomizado, por lo general, en 4 semanas, aunque este perodo puede prolongarse a 8 semanas. Las pruebas basadas en los cidos nuclicos para detectar A. marginale en ganado portador son de desarrollo reciente (8, 9, 11, 12, 33). Se ha descrito una sonda radiactiva de ARN que detect parasitemias tan bajas como 0,000025% (8). Las garrapatas infectadas tambin se han identificado utilizando una sonda para ADN clonado (13). La sensibilidad analtica de mtodos basados en la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) se ha estimado en 0,0001% de eritrocitos infectados, pero a este nivel solo se detectara una parte del ganado portador (9, 11). Recientemente se ha utilizado una tcnica PCR combinada que es sensible y potencialmente especfica para identificar ganado portador de A. marginale (33). Esta tcnica es capaz de identificar niveles de menos de 30 eritrocitos infectados por ml de sangre, lo que equivale a una parasitemia de aproximadamente 0,000001%, que est bien por debajo de los niveles ms bajos en los portadores (33). No obstante, la PCR combinada plantea serios problemas de control de calidad para un uso rutinario (33). Los laboratorios que emplean esta prueba deberan reconocer los problemas de especificidad debidos a amplificacin inespecfica. Un paso adicional, como el anlisis con enzimas de restriccin, la hibridacin tipo Southern, o la secuenciacin, puede confirmar la especificidad de lo que resulte amplificado. Por lo general, excepto con animales que han sido tratados o se encuentran en una fase muy inicial de la infeccin (<14 das), el mtodo preferido para identificar animales infectados es el enzimoinmunoensayo competitivo (C-ELISA) o la prueba de hemaglutinacin en placa (CAT) (ver ms adelante).

2.

Pruebas serolgicas

Las infecciones por Anaplasma persisten normalmente durante toda la vida del animal. Sin embargo, excepto en pequeos recrudecimientos ocasionales, no se puede detectar fcilmente Anaplasma en frotis de sangre despus de un episodio de parasitemia. Por tanto, se han desarrollado varias pruebas serolgicas con objeto de detectar los animales con infeccin latente. Una caracterstica del diagnstico serolgico de la anaplasmosis son los resultados tan variables que se han descrito por distintos laboratorios en muchas pruebas respecto a la sensibilidad y la especificidad. Esto se debe, al menos en parte, a la inadecuada evaluacin de las pruebas que usan un nmero significativo de animales positivos y negativos conocidos. En especial, hay que destacar que la capacidad de algunos ensayos para detectar infecciones conocidas de larga duracin raramente se ha enfocado de un modo adecuado. Una excepcin es la tcnica C-ELISA descrita recientemente (ver ms adelante), que ha sido validada utilizando animales verdaderamente positivos y negativos, definidos por PCR combinada (33). Por consiguiente, aunque la mayor parte de las pruebas descritas en esta seccin son tiles para obtener datos epidemiolgicos de una base amplia, se debe tener precaucin en lo que respecta a su uso para la certificacin de la enfermedad. Debe advertirse que en las pruebas serolgicas existe un grado alto de reacciones cruzadas entre A. marginale y A. centrale. Aunque las especies patgenas se pueden identificar a veces con antgenos de la especie homloga o heterloga, en muchas ocasiones se obtienen resultados equvocos.

a)

Enzimoinmunoensayo competitivo
Una tcnica C-ELISA, que utiliza un antgeno recombinante denominado rMSP5 y un anticuerpo monoclonal (Mab) especfico para MSP5, ha resultado muy sensible y especfica para detectar animales infectados por Anaplasma (16, 23, 33, 36). Todas las cepas probadas de A. marginale, A. ovis y A. centrale, expresan el antgeno MSP5 e inducen anticuerpos contra el eptopo inmunodominante reconocido por el Mab especfico de MSP5. La prueba result especfica al 100% utilizando 261 sueros negativos conocidos de una regin no endmica, detectando perfectamente a los 16 das de la infeccin experimental por garrapata o por inoculacin de sangre el ganado infectado. Adems, se demostr capaz de detectar ganado que haba sido infectado experimentalmente 6 aos antes (16). En la deteccin de ganado con infeccin persistente en una regin endmica de anaplasmosis, donde los verdaderos positivos o negativos se definieron mediante un procedimiento de PCR combinada, la C-ELISA con rMSP5 tuvo una sensibilidad del 96% y una especificidad del 95% (33). Un estudio independiente mediante el uso de ELISA indirecto (IELISA) valid el uso de rMPS5 como antgeno de diagnstico (29), Sin embargo, los estudios iniciales sugieren que en su formato actual la tcnica de ELISA indirecto con rMPS5 es menos sensible que CELISA (29).

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Los resultados de la prueba C-ELISA con el rMSP5 se pueden obtener en menos de 2,5 horas. Una prueba 2 comercializada contiene las instrucciones especficas. En general, sin embargo, se realiza del modo siguiente. Reactivos del equipo Una placa de microtitulacin con 96 pocillos recubiertos con el antgeno rMSP5, Una placa de adsorcin/transferencia con 96 pocillos recubiertos para la adsorcin de suero y reduccin de la unin de fondo, Conjugado MaAb/peroxidasa, 100 x, Solucin de lavado y tampn preparado para dilucin del conjugado, 10 x, Substrato para usar y soluciones para detener las reacciones, Controles positivos y negativos i) ii) iii) iv) v) vi) vii) Procedimiento de la prueba Aadir 70 l de suero sin diluir a la placa de adsorcin/transferencia recubierta e incubar 30 minutos a temperatura ambiente. Transferir 50 l del suero adsorbido por pocillo a la placa recubierta de rMSP5 e incubar 60 minutos a temperatura ambiente. Eliminar el suero y lavar dos veces la placa utilizando la solucin de lavado, diluida. Aadir 50 l por pocillo del conjugado Mab/peroxidasa diluido a la placa recubierta de rMSP5, e incubar 20 minutos a temperatura ambiente. Eliminar el conjugado Mab/peroxidasa diluido y lavar la placa cuatro veces utilizando la solucin de lavado diluida. Aadir 50 l por pocillo, de la solucin de substrato, cubrir la placa con papel de aluminio, e incubar 20 minutos a temperatura ambiente. Aadir 50 l por pocillo de la solucin para detener las reacciones a la solucin de substrato que se encuentra en los pocillos y golpear ligeramente por los lados de la placa para mezclar el contenido de los pocillos.

viii) Leer las placas en el equipo de lectura a 620 nm. Validacin de la prueba

La densidad ptica media (OD) del control negativo debe estar entre 0.40 y 2.10. El porcentaje de inhibicin del control negativo debe ser > 30%. Interpretacin de los resultados

El porcentaje de inhibicin se calcula del siguiente modo: 100 OD de la muestra x 100/ OD media del control negativo = Porcentaje de inhibicin. Las muestras con <30% de inhibicin son negativas: Las muestras con >30% de inhibicin son positivas.

b)

Prueba de aglutinacin en placa

La ventaja de la CAT es que es una tcnica sensible, que puede realizarse en el laboratorio o en el campo, y que proporciona el resultado en unos pocos minutos. Las reacciones inespecficas pueden ser un problema. El antgeno para CAT es una suspensin de partculas de A. marginale. Se infectan terneros esplenectomizados por inoculacin intravenosa con sangre que contenga eritrocitos infectados por Anaplasma. Cuando la parasitemia excede 50%, el animal se sangra, los eritrocitos infectados se lavan, se lisan, y las membranas de los eritrocitos y las partculas de Anaplasma se centrifugan. Los sedimentos se sonican, se lavan, y luego se resuspenden en una solucin de colorante para producir la solucin de antgeno.

VMRD, Inc., 4641 Pullman_Albion Rd., P.O. Box 502, Pullman, Washington 99163, USA. Tel.: (1.509) 334.58.15; Fax: (1.509) 332.53.56; http://www.vmrd.com

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Un procedimiento con ligeras modificaciones del descrito originalmente (1,2) es el siguiente: i) ii) Comprobar antes de su uso que todos los componentes de la prueba estn a una temperatura de 2526C (esta temperatura constante es un factor crtico en la prueba). En cada crculo de la placa de ensayo (un plstico claro tipo perspex o una placa de cristal con crculos marcados de 18 mm de dimetro), colocar juntos, pero sin tocarse, 10 l de factor de suero bovino (BSF), 10 l del suero de ensayo, y 5 l del antgeno CAT3. En cada placa se deben probar sueros negativos y dbilmente positivos. BSF es suero de un animal seleccionado con un alto nivel de conglutinina. Si se desconoce el nivel de conglutininas, se puede utilizar suero fresco de un animal que est libre de Anaplasma. La raza Jersey es adecuada, habitualmente. El BSF se debe guardar a 70C en pequeas alcuotas, y cada vez que se realizan las pruebas se utiliza una alcuota fresca. La inclusin de BSF mejora la sensibilidad de la prueba. Mezclar bien con una varilla de vidrio. Despus de mezclar cada prueba, limpiar la varilla de vidrio con un papel limpio para evitar la contaminacin cruzada. iv) v) Colocar la placa de prueba en una cmara hmeda y agitar a 100-110 rpm durante 7 minutos. Leer inmediatamente contra una luz. Una aglutinacin caracterstica del antgeno (valorada de +1 a +3) se considera un resultado positivo. Se considera que la prueba da un resultado negativo cuando no existe esa aglutinacin caracterstica.

iii)

c)

Prueba de fijacin de complemento

Se han publicado manuales detallados para realizar tanto la versin estndar (34) como la versin en microttulo (35) de la prueba FC para anaplasmosis. Aunque la prueba de FC se ha empleado ampliamente durante muchos aos usando ambas tcnicas, datos recientes confirman que carece de sensibilidad y falla en la deteccin de una proporcin importante de ganado portador (3). Por consiguiente, la prueba FC no puede ser recomendada como ensayo fiable para detectar animales infectados.

d)

Enzimoinmunoensayo indirecto
Se ha encontrado un mtodo I-ELISA, basado en el uso de un antgeno normal de eritrocitos (antgeno negativo) y de un antgeno de eritrocitos infectados por A. marginale (antgeno positivo), que es fiable para la deteccin de sueros positivos frente a A. marginale (7). Aunque ms lento que las pruebas que utilizan un solo antgeno, esta prueba elimina los sueros con niveles de actividad inespecfica debidos a los isoanticuerpos para los componentes de los eritrocitos normales. La prueba identific correctamente los 100 sueros positivos conocidos tomados de ganado bovino hasta despus de 3 aos de la infeccin, mientras que el 3% de sueros negativos, el 2% de sueros de Babesia bovis y el 4% de sueros de B. bigemina dieron falsos resultados positivos. La prueba con los dos antgenos se realiza como se indica. Antgeno negativo

La sangre de un ternero esplenectomizado se recoge en etiln diamino tetra-actico sdico (EDTA). Las clulas se lavan tres veces son solucin salina tamponada con fosfato (PBS) y se centrifugan 10 minutos a 5.000 g a 5C. Despus de la centrifugacin, se extraen los glbulos blancos diluyendo las clulas diez veces en PBS y pasndolas a travs de una columna de celulosa Whatman CFI1. Despus de otra centrifugacin, se diluye un volumen de las clulas en dos volmenes de PBS y se guardan en alcuotas de 2.5 ml en la fase de vapor de nitrgeno lquido. Cuando se necesita, se descongela una alcuota a temperatura ambiente y se sonica 30 segundos a 100 W con una pequea sonda a 0C. El producto sonicado se diluye luego, segn se necesite, para utilizar en la prueba ELISA. Antgeno positivo

Un ternero que se ha utilizado previamente para producir antgeno negativo se infecta con A. marginale por inoculacin sangunea. Cuando la parasitemia alcanza el 80-85%, se toman 500-1.000 ml de sangre, se procesan y se almacenan como se ha descrito antes. Cuando se necesitan, se sonican alcuotas, como antes, y se diluyen convenientemente.

En EE.UU. y Mxico la prueba se realiza con volmenes mayores de reactivos: antgeno (15 l), suero (30 l), y factor de suero bovino (30 l) en un tiempo de reaccin de 4 minutos (ver paso iv).

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Procedimiento de la prueba

Se utilizan placas de micro-ELISA, con 96 pocillos, de fondo plano. Con cada lote nuevo de antgeno se realizan las titulaciones estndar del antgeno, tanto positivo como negativo, por el sistema del tablero de ajedrez, para determinar el rango de trabajo, que normalmente es 1/400 (150-200 g de protena/ml). A cada pocillo de la placa se aade el antgeno diluido (200 l) , una mitad de la placa con antgeno positivo, y la otra mitad con antgeno negativo. Las placas se cierran con sus tapaderas y se incuban toda la noche a 4C. Despus de la incubacin, se extrae la solucin de antgeno y las placas se lavan tres veces con PBS que contenga 0.1% de Tween 20 (PBST), y luego se bloquean con una solucin de suero normal de caballo al 1% en PBS durante 60 minutos a 37C. Despus dell bloqueo, las placas se lavan cinco veces con PBST antes de aadir 200 l de los sueros de prueba. (Los sueros de prueba se diluyen de 1/400 a 1/800 con PBST que contenga 1% de suero de caballo). Las placas se cierran con sus tapaderas y se incuban 2 horas a 37C. Luego se lavan los pocillos cinco veces con PBST y se aaden 200 l del segundo anticuerpo conjugado (IgG anti-bovina obtenida de cabra conjugada con peroxidasa de rbano), a una dilucin 1/400 en PBS con 1% de suero de caballo. Las placas se cierran con sus tapaderas y se incuban 2 horas a 37C. Despus de la incubacin, se extrae el conjugado y los pocillos se lavan cinco veces con PBS antes de la adicin de 200 l de substrato, de preparacin reciente. El substrato se prepara as; se disuelve cido 5-amino saliclico recristalizado a concentracin de 1 mg/ml en tampn fosfato, pH 6.8, a 32C; por cada ml de solucin se aaden luego 2 l de perxido de hidrgeno al 30%. Despus de la adicin del substrato se cierran las placas y se agitan suavemente 30 minutos a 22C. A continuacin, inmediatamente, se leen las placas a 492 nm con un lector de placas. La columna uno de cada placa se usa siempre como blanco. Para cada muestra las lecturas netas se calculan restando el resultado del antgeno negativo del resultado del antgeno positivo. En cada lote de ensayos, se prueba rutinariamente un grupo de 20 sueros negativos y un suero estndar positivo para A. marginale. Se calcula un umbral como la lectura de la absorbancia neta media (ms dos desviaciones estndar) de los 20 sueros negativos estndar. La relacin de todas las otras absorbancias netas se determina usando como unidad el umbral. El suero positivo se utiliza para determinar que cada lote de prueba se realiza con normalidad.

e)

Enzimoinmunoensayo de punto
Comparado con I-ELISA, la prueba ELISA de punto tiene las ventajas potenciales de ser rpida, barata, y sencilla de realizar. Se ha descrito que el mtodo de ELISA de punto descrito a continuacin presenta una sensibilidad del 93% y una especificidad del 96% (21). i) ii) iii) iv) v) vi) vii) Preparacin del antgeno Recoger sangre con parasitemia elevada en EDTA. Eliminar el plasma y lavar los eritrocitos con tampn glicina 0,1 M, pH 3,0. Lavar los eritrocitos con PBS, pH 7,4, en presencia de inhibidores de proteasas (tetrationato sdico 3,5 mM) y 0,01% de timerosal. Eliminar la capa de leucocitos despus de cada lavado. Resuspender los eritrocitos en PBS a dilucin 1/5, sonicar, someter a tres ciclos de congelacin y descongelacin, y volver a sonicar el lisado. Mezclar el material con un volumen igual de Nonidet P-40 en PBS, e incubar 3 minutos a 25C. Recoger los cuerpos de Anaplasma por centrifugacin diferencial.

viii) Lavar el precipitado tres veces con tampn fro (cloruro de colina 155 mM, HEPES [N-2hidroxietilpiperazina, cido N-2-etanesulfnico] 5 mM, pH 7,4). ix) Resuspender el precipitado en PBS y medir la concentracin de protena. Depositar el antgeno (1,0 l/disco; 25 g de protena/ml) sobre discos (de 6 mm de dimetro) de nitrocelulosa cortados con una taladradora de papel. Secar al aire los discos recubiertos con el antgeno. En estos discos el antgeno permanece estable durante ms de 2 aos si se mantienen a 20C o a 4C, y por al menos 3 meses cuando se conservan a 25C.

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i) ii) iii) iv)

Procedimiento de la prueba Colocar los discos con el antgeno en pocillos con el fondo plano de placas de microtitulacin. Todos los procedimientos se realizan a 25C y utilizando reacciones de 200 l de volumen. Incluir sueros positivos y negativos conocidos y controles de antgeno. Para el bloqueo, aadir PBS que contenga 0,5% de Tween 20 a cada pocillo, incubando luego 15 minutos. Probar los sueros a una concentracin inicial de 1/200 en PBS que contenga 0,05% de Tween 20, e incubar 1 hora. Lavar tres veces, 10 minutos cada vez, con PBS que contenga 0,1% de Tween 20. Aadir el conjugado de fosfatasa alcalina/ protena A, diluido 1/500 en PBS que contenga 0,5% de Tween 80, e incubar los pocillos 30 minutos, lavando despus como antes, excepto que el ltimo lavado se hace con PBS solo.

v)

vi) vii)

viii) Aadir nitroazul de tetrazolio/5-bromo-4-cloro-indoxil fosfato en tampn Tris 0,1 M, pH 9,5, y permitir que el color aparezca por 10-20 minutos. ix) La aparicin de un punto de color prpura, de intensidad variable, indica una reaccin positiva; no se ve color en los discos con reacciones negativas.

f)

Prueba de inmunofluoresencia indirecta con anticuerpo

Debido al nmero limitado de pruebas de inmunofluorescencia indirecta con anticuerpo (IFI) que puede realizar diariamente un operador, se suelen preferir otras pruebas serolgicas. La prueba IFI se realiza como se describe para la babesiosis bovina en el Captulo 2.3.8., excepto que para la preparacin de frotis de antgeno se utiliza sangre infectada por A. marginale. Un problema serio de esta prueba es la fluorescencia inespecfica. Es muy probable que el antgeno obtenido de sangre recogida tan pronto como aparezca una parasitemia adecuada (5-10%) resulte idneo. La fluorescencia inespecfica debida a anticuerpos que se adhieren a eritrocitos infectados puede reducirse lavando los eritrocitos en un tampn glicina cido antes de que se preparen los frotis de antgeno (22). Los eritrocitos infectados se lavan dos veces en tampn glicina 0.1 M (pH 3,0, centrifugado a 1.000 g por 15 minutos a 4C) y luego una vez en PBS, pH 7,4.

C. REQUISITOS PARA LAS VACUNAS Y LOS MATERIALES DE DIAGNSTICO

Se han utilizado varios procedimientos de inmunizacin para proteger al ganado bovino contra la anaplasmosis en pases donde la enfermedad es endmica, pero ninguno es ideal (19). El uso de la especie menos patgena A. centrale, que proporciona una proteccin parcial cruzada frente a A. marginale, es el mtodo aceptado ms ampliamente, aunque no se utiliza en Amrica del Norte. Otro mtodo implica el uso de una cepa de A. marginale atenuada por pases en hospedadores no bovinos, como el ciervo o la oveja (32). En esta seccin, se describe la produccin de vacuna viva de A. centrale. Incluye la infeccin de un ternero esplenectomizado susceptible y el uso de su sangre como vacuna. Existen descripciones detalladas del procedimiento de produccin y se debe hacer referencia a estas publicaciones para detalles de los procedimientos que se resumen aqu (4, 10,25). Las directrices para la produccin de vacunas se presentan en el Captulo I.1.7. Principios de la produccin de vacunas veterinarias. Las normas dadas aqu y en el Captulo I.1.7. intentan ser de naturaleza general y pueden completarse con requisitos nacionales y regionales. La vacuna para Anaplasma centrale puede suministrarse en forma congelada o refrigerada dependiendo de la demanda, redes de transporte y la disponibilidad de servicios de nitrgeno lquido o de hielo seco. En la mayor parte de los casos se recomienda la vacuna congelada, ya que permite un control de calidad de cada lote despus de la produccin. Sin embargo, es ms costosa de producir y ms difcil de transportar que la vacuna refrigerada. El riesgo de contaminacin hace que el control despus de la produccin sea esencial, pero puede ser prohibitivamente costoso.

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Captulo 2.3.7. Anaplasmosis bovina

1.
a)

Control del inculo

Caractersticas del inculo
Anaplasma centrale se aisl por primera vez en 1911 en Sudfrica y se ha utilizado como vacuna en Sudamrica, Australia, frica, Oriente Medio, y Sudeste Asitico. Solo suministra proteccin parcial, pero adecuada, en regiones donde las cepas que provocan la enfermedad son de una virulencia moderada (como Australia) (10). En los trpicos hmedos, donde A. marginale parece ser un parsito muy virulento, la proteccin suministrada por A. centrale puede ser inadecuada para evitar la enfermedad en algunos animales. Normalmente, Anaplasma centrale causa infecciones benignas, especialmente en terneros menores de 9 meses de edad. Se han descrito reacciones graves despus de la vacunacin cuando se inocula ganado adulto. El pase rpido de A. centrale por terneros esplenectomizados parece reducir su virulencia (10).

b)

Preparacin y conservacin de los estabilizados

El material infeccioso se conserva fcilmente en nitrgeno lquido o en hielo seco como estabilizados congelados de la sangre infectada. El crioconservante recomendado es dimetil sulfxido (DMSO), ya que permite la administracin intravenosa del estabilizado despus de la descongelacin. En otra parte (10) se describe con detalle la tcnica de congelacin pero, en resumen, se basa en lo siguiente: se recoge sangre infectada, se enfra a 4C, y se aade, lentamente y con agitacin, crioconservante fro (4 M DMSO en PBS) en una proporcin final sangre/conservante de 1:1, para dar una concentracin final 2 M de DMSO. Todo el proceso de dilucin se realiza en un bao de hielo y la sangre diluida se distribuye en recipientes adecuados (por ejemplo, en crioviales de 5 ml), que se congelan tan pronto como sea posible en la fase de vapor de un contenedor de nitrgeno lquido.

c)

Validacin como vacuna

La idoneidad de un aislamiento de A. centrale como vacuna se determina inoculando ganado susceptible, observando las reacciones posteriores, y estimulando luego a los animales y a controles susceptibles con una cepa virulenta local de A. marginale. Tanto la seguridad como la eficacia se pueden estimar observando las parasitemias en extensiones de sangre teida y el descenso volumtrico de clulas empaquetadas de ganado vacuno durante la vacunacin y durante los perodos de reaccin estimulante. Se puede determinar la pureza del aislamiento, para posibles contaminantes presentes, mediante un estudio serolgico de sueros en parejas del ganado bovino utilizado en la prueba de seguridad (26).

2.
a)

Mtodo de fabricacin
Produccin de vacuna congelada
Se descongelan las cantidades del estabilizado congelado (5-10 ml) por inmersin de los viales en agua precalentada a 40C. El material descongelado se mantiene en hielo y se usa tan pronto como sea posible (en 30 minutos) para infectar un ternero susceptible esplenectomizado por inoculacin intravenosa. La parasitemia del ternero donante de analiza diariamente examinando extensiones de sangre teida de la yugular, y se recoge la sangre para produccin de la vacuna cuando se alcanza una parasitemia adecuada. El mnimo requerido para produccin de la vacuna es una parasitemia de 1 x 108/ml (aproximadamente 2% de parasitemia en la sangre de la yugular). Si no se obtiene una parasitemia adecuada, puede ser necesario realizar un pase de la cepa mediante subinoculacin de 100-200 ml de sangre a un segundo ternero esplenectomizado. La sangre del donante se recoge mediante canulacin asptica de la yugular o la cartida, utilizando heparina como anticoagulante (5 Unidades Internacionales [UI] de heparina/ml de sangre). En el laboratorio, la sangre parasitada se mezcla a 37C con un mismo volumen de glicerol 3M en PBS, suplementado con 5mM de glucosa (concentracin final de glicerol 1,5 M). La mezcla se equilibra a 37C durante 30 minutos y se distribuye en recipientes adecuados (por ejemplo, en crioviales de 5 ml). Los viales se enfran en la fase de vapor de nitrgeno lquido a una velocidad aproximada de 10C/minuto y, cuando estn congelados, se guardan en la fase lquida (5). En lugar de glicerol se puede utilizar DMSO como crioconservante. En este caso se lleva a cabo del mismo modo que para la preparacin del estabilizado (20,24).

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Captulo 2.3.7. Anaplasmosis bovina

Si se tiene que diluir la vacuna preparada en glicerol, el diluyente debe ser PBS con 1.5 M de glicerol y 5 mM de glucosa (15). Las vacunas crioconservadas con DMSO deben diluirse con diluyente que contenga la misma concentracin de DMSO que la sangre original crioconservada (27).

b)

Produccin de vacuna refrigerada

El material infeccioso para vacunas refrigeradas se preparara como para las vacunas congeladas, pero debe ser procesado y utilizado tan pronto como sea posible despus de su recogida. La sangre infecciosa 7 se puede diluir para lograr 1 x 10 parsitos por dosis de vacuna. Un diluyente adecuado es 10% de suero bovino estril en una solucin de glucosa/solucin salina equilibrada que contenga las siguientes cantidades por litro: NaCl (7,00 g), MgCl2.6H2O (0,34 g), glucosa (1,00 g), Na2HPO4 (2,52 g), KH2PO4 (0,90 g), y NaHCO3 (0,52 g). Si no se dispone de diluyente, se debera utilizar como anticoagulante dextrosa citrato cido (20% [v/v]) o dextrosa citrato fosfato (20% [v/v]) para suministrar la glucosa necesaria para la supervivencia de los organismos.

c)

Utilizacin de la vacuna
En el caso de las vacunas congeladas, los viales se descongelan por inmersin en agua precalentada a 40C, y el contenido se mezcla con un diluyente adecuado hasta la dilucin requerida. Si se preparan vacunas con glicerol, deben mantenerse fras y utilizarlas en un tiempo de 8 horas despus de la preparacin (5). Si se utiliza DMSO como crioconservante, las vacunas preparadas deben mantenerse en hielo y utilizarse en 15-30 minutos (24). El modo ms comn de administracin de la vacuna es por va subcutnea. Las vacunas refrigeradas se deben mantener en fro y utilizarse dentro de los 6 das siguientes a su preparacin. La cepa de A. centrale que se usa en las vacunas es de virulencia reducida, pero no es por completo segura. En consecuencia, un consejo prctico es limitar el uso de las vacunas a terneros, en los que la inmunidad inespecfica reducir el riesgo de reacciones debidas a la vacunacin. Cuando se tienen que vacunar animales de mayor edad, existe el riesgo de reacciones graves. Estas reacciones no son frecuentes, pero la presencia de animales de reproduccin valiosos o en estado de gravidez merece atencin, y deberan observarse los animales entre las 4 y 6 semanas despus de la vacunacin. Los animales clnicamente enfermos deben tratarse con tetraciclina o imidocarb a dosis recomendadas por los fabricantes. La inmunidad de proteccin se desarrolla en 6-8 semanas y por lo general persiste varios aos. A menudo se utilizan en paralelo las vacunas contra la anaplasmosis y la babesiosis, pero no es recomendable utilizar simultneamente otras vacunas.

3.
a)

Control interno
Origen y mantenimiento de los donantes de vacuna
Debe identificarse una fuente de terneros exentos de infeccin natural por Anaplasma y de otras enfermedades transmitidas por garrapatas. Si no se dispone de ellos, puede ser necesario criar los terneros bajo condiciones libres de garrapatas con el propsito especfico de produccin de vacunas. Los terneros deben mantenerse en condiciones que eviten su exposicin a enfermedades infecciosas y a garrapatas e insectos picadores. En ausencia de servicios adecuados, debe valorarse el riesgo de contaminacin con agentes de enfermedades infecciosas que estn presentes en el pas concreto, y se deben comparar los beneficios derivados de la produccin local de vacunas frente a las posibles consecuencias adversas de difundir enfermedades (10).

b)

Ciruga
Para permitir el mximo rendimiento de obtencin de organismos para produccin de vacunas, los terneros donantes deben ser esplenectomizados. Esto se lleva a cabo con preferencia en terneros jvenes con anestesia general. Los detalles de esta tcnica, incluyendo los procedimientos pre- y post-operatorios, se describen en otra parte (10).

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Captulo 2.3.7. Anaplasmosis bovina

c)

Seleccin de donantes para vacunas antes de la inoculacin

Los terneros donantes deben examinarse en cuanto a todas las infecciones sanguneas que sean prevalentes en el pas productor de la vacuna, incluyendo Babesia, Anaplasma, Cowdria, Theileria y Trypanosoma. Esto se lleva a cabo mediante examen rutinario de extensiones de sangre teidas despus de la esplenectoma, y preferiblemente tambin por serologa. Cualquier ternero que muestre evidencias de infecciones naturales debe ser rechazado. Tambin debe confirmarse la ausencia de otros agentes infecciosos. Estos pueden incluir a los agentes de la leucosis enzotica bovina, enfermedad de las mucosas, rinotraqueitis bovina infecciosa, fiebre efmera, enfermedad de Akabane, lengua azul, glosopeda o fiebre aftosa y peste bovina. Las pruebas dependern de las enfermedades prevalentes en el pas y de la disponibilidad de ensayos, pero en ltimo trmino deberan contemplar la serologa de sueros pareados y, en algunos casos, el aislamiento del agente (5, 24, 26).

d)

Observacin de parasitemias despus de la inoculacin

Es necesario determinar la concentracin de parsitos en la sangre recogida para vacunas. Existen tcnicas cuidadosas para determinar el contaje de los parsitos (10), pero, en ausencia de stas, la concentracin de parsitos se puede calcular a partir del contaje de eritrocitos y de la parasitemia (porcentaje de eritrocitos infectados).

e)

Recoleccin de sangre para vacunas

Antes del uso, debe esterilizarse todo el equipo (por ejemplo, en autoclave). Una vez alcanzada la parasitemia deseada, la sangre se recoge con heparina utilizando tcnicas aspticas estrictas. Esto se realiza ms fcilmente si se seda al ternero y se usa un circuito cerrado de recoleccin. Se pueden extraer hasta 3 litros de sangre con niveles de infeccin elevados de un ternero de 6 meses. Si el ternero va a permanecer vivo, es adecuada la transfusin de una cantidad similar de sangre de un donante apropiado. Alternativamente, el ternero debe ser sacrificado inmediatamente despus de la extraccin de la sangre.

f)

Distribucin de las vacunas

Todo el proceso se realiza en un ambiente apropiado, como en una cabina de flujo laminar, utilizando tcnicas estriles estndar. El uso de un agitador mecnico o magntico asegura una buena mezcla de la sangre y del diluyente a travs de todo el proceso de distribucin.

4.

Control de lotes

En el caso de las vacunas refrigeradas, la potencia, seguridad y esterilidad de los lotes de vacuna no se puede determinar, y para las vacunas congeladas las especificaciones dependen del pas concreto. Las siguientes indicaciones se aplican a las vacunas congeladas producidas en Australia.

a)

Esterilidad y ausencia de contaminantes

Para cada lote de vacuna y diluyente se emplean tcnicas estndar de esterilidad (ver Captulo I.1.5). La ausencia de contaminantes se confirma inoculando ganado y observndolo serolgicamente en cuanto a agentes infecciosos que potencialmente podran contaminar la vacuna. El ganado inoculado durante la prueba de potencia (ver seccin C.4.c) es adecuado para este fin. Dependiendo del pas de origen de la vacuna, estos agentes incluyen los microorganismos que causan la leucosis enzotica bovina, rinotraqueitis bovina infecciosa, enfermedad de las mucosas, fiebre efmera, enfermedad de Akabane, virus Aino, lengua azul, parainfluenza, glosopeda o fiebre aftosa, enfermedad nodular, rabia, fiebre del Valle del Rift, peste bovina, pleuroneumona bovina contagiosa, enfermedad de Jembrana, cowdriosis, especies patgenas de Theileria y Trypanosoma, Brucella abortus, Coxiella y Leptospira (5).

b)

Seguridad
Las reacciones vacunales del ganado inoculado en la prueba de potencia (ver seccin C.4.c) se observan mediante la medicin de la parasitemia y el descenso volumtrico en clulas empaquetadas. Solo se ponen en circulacin para uso los lotes con niveles de patogenicidad iguales o inferiores a un estndar predeterminado.

c)

Potencia
La vacuna se descongela y se diluye 1/50 con un diluyente adecuado (15). La vacuna diluida se incuba luego 8 horas a 30C, y se inoculan subcutneamente cinco cabezas de ganado con dosis de 2 ml. Los

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Captulo 2.3.7. Anaplasmosis bovina

animales inoculados se observan para presencia de infecciones examinando frotis de sangre, teidos. Para que un lote sea aceptable todos deberan estar infectados. Un lote que sea infeccioso al 1/50 se recomienda para uso a una dilucin 1/5 con diluyente isotnico.

d)

Duracin de la inmunidad
Despus de una inoculacin se logra inmunidad parcial, pero duradera. No existe evidencia de que la vacunacin repetida tenga un efecto estimulante.

e)

Estabilidad
Cuando se almacena en nitrgeno lquido, la vacuna se puede mantener durante 5 aos. Una vez que se descongela, pierde rpidamente su potencia. La vacuna descongelada no puede congelarse de nuevo.

f)

Conservantes
No se aaden conservantes. En la fase de distribucin, se aade a la vacuna penicilina (500.000 UI/litro) y estreptomicina (370.000 UI/litro).

g)

Precauciones (riesgos)
La vacuna no es infecciosa para humanos. Cuando el producto se almacena en nitrgeno lquido, se aplican las precauciones normales en cuanto a conservacin, transporte y manejo del material ultracongelado.

5.
a)

Pruebas sobre el producto final

Inocuidad
Ver Seccin C.4.b

b)

Potencia
Ver Seccin C.4.c

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