QO423

Introduo a Espectrometria de
Massas
Prof. Fabio Gozzo

Introduo
Espectrometria de massas (MS, do ingls Mass
Spectrometry) o estudo da matria atravs
da formao de ons em fase gasosa que so
caracterizados pela relao m/z (relao
massa/carga).

Aplicabilidade

Usos da MS

Instrumentao
Introduo
de
amostras

Fonte de
Ionizao

Analizador
de m/z

Detector
Vcuo

Direto
GC
HPLC
CE

EI
CI
APCI
APPI
ESI
MALDI
.

B
Q
Tof
IT
LIT
ICR
Orbitrap

Multiplicador eMCP

Qual a massa de um tomo ?

M=5

1H (1p, 1e) = 1.0079

2H (1p, 1n, 1e) = 2.0141
4He (2p, 2n, 2e) = 4.0026
4He/

2H = 1.98 !!

Componentes do tomo

Como o ncleo
no explode ?!!

4 Foras Universais

E = MC2

Fuso de um ncleo
E

Repulso
Eletromagntica
+

+
x

Atrao
Fora Nuclear

Quando dois prtons se funde

Qual a massa de um tomo ?

Massa
=
Soma das massas das partculas

Energia liberada na formao do tomo (ncleo)

E = MC2

Defeito de Massa
Nenhum tomo (c/ excesso do 12C) tem
massa inteira
Diferena chamada de Defeito de Massa

Defeito de Massa

Energia de Ligao do Ncleo e

Defeito de Massa

Unidade de Massa Atmica (u)

u = 1.6605 x 10-27 kg ( 1/12 12C)

Proton: 1.672610-27 kg (1.0073 u)
Nutron:1.6749 x 10-27 kg (1.0086 u)
Eltron: 9.1093 10-31 kg (0.0005u)
1 Da = 1 u

Tipos de Massas Atmicas

Nominal:
Massa aredondada em 1 u:
H = 1, C = 12, O= 16

Mdia
Massa mdia dos istopos:
H = 1.0079, C = 12.0107, N = 14.0067

Monoisotpica:
Massa do istopo mais abundante:
H = 1.0078, C = 12.0000, N = 14.0030

Massas Moleculares Exatas

Consiste na soma das massas atmicas
monoisotpicas
nica para cada frmula:
N2 = 28.0061
C2H4 = 28.0313
CO = 27.9949
B2H6 = 28.0656

Istopos Naturais
Substncias Orgnicas:
1H (99.98%), 2H (0.01%)
12C (98.93%), 13C (1.07%)
14N (99.63%), 15N (0.37%)
16O (99.80%), 18O (0.20%)
32S (94.93%), 34S (4.29%)
35Cl (75.78%), 37Cl (24.22%)
79Br (50.69%), 81Br (49.31%)

MS e Padro Isotpico
MS mede istopos individuais e no massas
mdias
Substncias apresentam vrias massas
dependendo da composio isotpica
Composio isotpica varia de acordo com a
composio qumica

O Espectro de Massas
Intensidade relativa ao
sinal mais intenso (100%)

Sinal mais intenso:

Pico base

Relao m/z de cada on

Padro Isotpico: Efeito do C

M

C20H42

C10H22

CH4
M+1

M+1

M+1

M+2

17

284

C50H102

706

C100H202

C150H302

Padro Isotpico: Efeito do C

C20H42

284

C20H28

270

No de carbonos ~ I(M+1)-10%
Ex: Intensidade do M+1 = 22 No de carbonos ~ 22-10% = 20

C20H28N2O4

Aumento do Nmero de C

OeN
Oxignio e Nitrognio tem abundncia bem
menor que C e H
Oxignio afeta a intensidade do M+2 (16O x
18O)
Nitrognio pode afetar M+1 em molculas
ricas em N

Efeito dos Halognios

37Cl 33% do 35Cl
81Br 50% do 79Br
F e I no tm istopos naturais

CH3Cl

CH3Br

Cl e Br
C15H31Cl
C20H41Br

C15H30Cl2
C20H40Br2

Regra do Nitrognio
Uma molcula orgnica neutra s ter massa
mpar se ela tiver nmero mpar de tomos de
nitrognio:
C2H4O: 44
CH3CONH2: 59
C6H4(NH2)2: 108
C10H22O: 158

Instrumentao
Introduo
de
amostras

Fonte de
Ionizao

Analizador
de m/z

Detector
Vcuo

Direto
GC
HPLC
CE

EI
CI
APCI
APPI
ESI
MALDI
.

B
Q
Tof
IT
LIT
ICR
Orbitrap

Multiplicador eMCP

Ionizao por Eltrons (EI)

Molculas neutras, na fase gasosa (dessoro trmica), a

uma presso tpica de 10-5 torr, so bombardeadas por
eltrons, com energia tpica de 70 eV. Ocorre
principalmente a retirada de um eltron formando ons
M+.
M + e- (70 eV) M+. (~ 5-10 eV) + 2e- (~60- 65 eV)

EI: Caractersticas
Processo unimolecular. Os ons formados so rapidamente extrados da
fonte de ionizao pelo eletrodo de repulso ("repeller).
ons moleculares so formados com excesso de energia interna e se
fragmentam total ou parcialmente.
EI bastante popular: produz tanto o on molecular (massa) como
tambm fragmentos (estrutura); espectros reprodutveis; bibliotecas de
espectros de EI a 70 eV; estvel; fcil de operar; alta sensibilidade.
Aplica-se a molculas de mdia e baixa polaridade e baixo peso molecular
(~500u), volteis e termo-estveis: molculas orgnicas relativamente
pequenas.
Quando o on molecular no observado (devido a dissociao completa),
existe um processo dissociativo exotrmico e portanto M+. uma espcie
instvel.

EI ocorre em ~10-16 s. Uma em cada 103-105 molculas que entram na

fonte de EI ionizada.

Energia dos Ions

Espectro de Massas

Energia dos Eltrons

Fragmentao
105

100
77
O

50
51
120

43
39
27
0
20
30
40
(mainlib) Acetophenone

74

63

45
50

60

85
70

80

91
90

98 102
100

110

120

130

Fragmentao
124

100

OH
288

246

50

O
147
41

79
55
67

29

91
203

105
133

228

165
173

213

187

255

273

0
20
40
60
80
100
120 140
(mainlib) Androst-4-en-3-one, 17-hydroxy-, (17)-

160

180

200

Testosterona

220

240

260

280

300

Ismeros
43

100

43

100

41
29

50

57

50

71

85
57

29

100

39

15
0

53

0
10
(mainlib) Heptane

20

30

40

85

62 65

50

60

0
70

80

90

100

110

43

100

15

37

10
20
30
(mainlib) Hexane, 2-methyl-

50
40

71

63

50

60

100

77

70

80

90

100

110

57

100

43

41
71

50

50

85
29
27

41

29

55

39
0

15

10
20
30
(mainlib) Pentane, 3-ethyl-

50 53

37
40

50

39
15

57
62 65
60

100

84
70

80

0
90

100

110

12

0
10
20
30
(mainlib) Butane, 2,2,3-trimethyl-

63
40

50

60

69
70

77 81
80

99
90

100

110

Fragmentao
Quatro mecanismos bsicos:
Dissociao sigma
Clivagem alfa
Clivagem indutiva
Fragmentao remota

Possibilidades de rearranjo
Rearranjo de McLafferty

Dissociao Sigma
57

100

43

71
50

85
41
29
99
0

113

127

14

10
20
30
(mainlib) Dodecane

40

50

60

70

80

90

100

110

120

130

170
141
140

150

160

170

180

Dissociao Sigma
57

100

50

41
29
27
0

32 39

20
30
40
50
60
(mainlib) Decane, 2,2-dimethyl-

71
69
70

85
82
80

99
90

100

155

112
110

120

130

140

150

160

170

180

Clivagem Alfa
43

100

58

50

15

42
14
0

27
16 18

10
15
(mainlib) Acetone

20

25

29

39
31

30

35

41

40

44
45

52
50

59
55 57
55

60

65

70

Clivagem Alfa

43

100

57

100

29
O

O
50

50

72

86
29

27
27
28
26

15

57
39

42 44

71 73

0
10
20
(mainlib) 2-Butanone

30

40

50

60

70

43

100

50

86
41
27
0

28 31

71

39 42

20
30
40
(mainlib) 2-Butanone, 3-methyl-

53 56 59
50

60

87

67 70
70

80

90

100

41

15 18

10
20
(mainlib) 3-Pentanone

80

30

40

50
50

62 65 68 71
60

70

84
80

90

100

Rearranjo de McLafferty
43

100

43

100

O
O

50

58

50

86
41
39

27
0

15
17

10
20
(mainlib) 2-Pentanone

34

71

58
49 52

60 63

67

29
27

73

15
30

40

50

60

70

80

90

100

18

0
10
20
(mainlib) 2-Hexanone

31
30

41
39
37
40

50

55

67
60

83
70

100

85

71
50

80

91
90

100

110

Rearranjo de McLafferty

43

100

58

50

41
27

71

39
55
53

15

85

0
10
20
30
(mainlib) 2-Octanone

40

50

95 99

77 81
60

70

80

90

100

128

113
110

120

130

140

57

100

29

O
50
27
85
41
72
114

39 43
15
0

19

31

10
20
30
(mainlib) 3-Heptanone

45
40

63
50

60

78
70

80

91
90

98
100

110

120

130

Compostos Aromticos
78

100

50

77
51
39
15

38

26

40

0
10
20
(mainlib) Benzene

30

40

49
50

74

63

79

53
60

70

80

90

Compostos Aromticos
91

100

92

50

65

39
27

38 41

0
20
30
(mainlib) Toluene

40

45

63

51
52 55
50

64
60

74 77
70

83 86
80

89
94
90

100

Compostos Aromticos
91

100

50

106

51

65

39
15

77

63

27

74

86

0
10
20
30
(mainlib) Ethylbenzene

40

50

60

70

80

89
90

100

110

120

91

100

50

120

15

27

10
20
30
(mainlib) Benzene, propyl-

39
40

51
50

65
63

57
60

78

105

85 89
70

80

90

100

115
110

120

130

Compostos Aromticos
91

100

50

134

65
39

27
0

15

32

10
20
30
(mainlib) Benzene, butyl-

43
40

57
50

105

78

51

63

60

89

69 74
70

80

90

115
100

110

128
120

130

140

150
91

100

50

148

29
0

15

43

10
20
30
40
(mainlib) Benzene, pentyl-

105

65

41

78

51 57
63
50

60

119

89
70

80

90

100

110

120

133
130

140

150

160

Qual a molcula ?

GC-MS
EI s til se analisarmos uma sustncia pura
Raramente temos uma substncia pura
Acoplamento de cromatografia gasosa (GC)
com espectrometria de massas (MS) uma
combinao muito poderosa
GC separa cada substncia da amostra (alta
resoluo cromatogrfica
MS identifica e quantifica qualquer composto
que saia do GC

GC/MS

GC/MS

GC/MS
Substncias que saem da coluna esto na fase
gasosa
MS pode detectarqualquer substncia que
esteja na fase gasosa
MS Detector universal com capacidade de
identificao de compostos sem necessidade
de padro
Quantificao simultnea de qualquer
composto

Limitaes EI

A substncia tem que estar na fase gasosa

Fonte de EI tem uma presso de 10-5 mbar
Gases e lquidos volteis se vaporizam
Lquidos menos volteis necessitam de leve
aquecimento
Slidos necessitam de maior temperatura
Para isso, substncias que que ser
termoestveis e possuir uma pequena presso
de vapor

Ionizao por Eletrospray (ESI)

Inventada por John Fenn em 1989
Promove a ionizao de molculas sem a
necessidade de volatilizar termicamente
Tem uma ampla gama de aplicao
Amostra introduzida em soluo
John Fenn ganhou o Nobel de Qumica em
2002

Eletrospray (ESI)

Princpios de ESI
Fase Gasosa ?
CIDO
(HCOOH)

Soluo

ESI +

BASE
(NH4OH)

contra-on ?
solvente ?

ESI
repulso
!
eletrosttica

ESI

ESI: modo negativo

ESI Glu-Fibrinopeptdeo (1568.9)

GFP
TEST4 7 (0.144)
GFP
TEST4 7 (0.144) Sm (Mn, 2x3.00)

100

TOF MSMS 785.80ES+

204

785.46

100

TOF MSMS 785.80ES+

234

785.46

785.97

786.47

786.95
0

m/z
785

0
50

786

787

788

m/z
100

150

200

250

300

350

400

450

500

550

600

650

700

750

800

850

900

(1568.9 + 2 ) / 2 = 785.46
(1569.9 + 2 ) / 2 = 785.96

ons Multicarregados:
Padro Isotpico
+1 = 1/1 = 1.00
+2 = 1/2 = 0.50
+3 = 1/3 = 0.33
+4 = 1/4 = 0.25

ons Multicarregados
B-Gal 10 fm/uL

B-Gal 10 fm/uL

hilo08 83 (2.432)

1: TOF MS Survey ES+

302
671.41

100

hilo08 83 (2.432)

671.90

567.38

1: TOF MS Survey ES+

228

567.38

100

m=2264.48 Da

567.12
567.63

567.63

668.70
567.85

617.44

575.82
576.81 587.29 604.17

672.42

567.85

626.92
672.91

568.11

653.41

627.90

568.39

m/z
560

570

580

590

600

610

620

630

640

650

660

670

680

m/z
567

568

B-Gal 10 fm/uL

B-Gal 10 fm/uL
hilo08 83 (2.432)

1: TOF MS Survey ES+

103

668.37 668.70

100

1: TOF MS Survey ES+

302

671.41

100

m=2002.11 Da

m=1340.82 Da

671.90

669.04

hilo08 83 (2.432)

672.42

669.37

669.68
668.18

672.91

670.10 670.38

667.36
0

673.40
m/z

668

669

670

m/z
671

672

673

674

ESI de Protenas
(16881 + 20) / 20 = 845.1
(16881 + 21) / 21 = 804.9
(16881 + 22) / 22 = 768.3

Mioglobina: (16881 Da) :

teste

Mioglobina 891 (16.772) Cm (889:907)

TOF MS ES+
1.48e3

804.9

100

804.9 = (M + x) / x
768.3 = (M + x +1) / (x +1)
0

m/z
805

806

teste

Mioglobina 891 (16.772) Cm (889:907)

735.0 768.3

100

804.9

TOF MS ES+
1.48e3

845.1
889.5

704.4

938.9
676.3
994.1
1056.1

804

1126.5

650.3

1206.9

m/z
650

700

750

800

850

900

950

1000

1050

1100

1150

1200

ESI: Complexos no covalentes

Urease da Helicobacter pylori

Complexos no covalentes

1.05 MDa !

Complexos Organometlicos
O

913.0

100

Ru

912.0

911.0
910.0

O
O

914.0

Ru

N
915.0

O
O

Ru

909.0

O
O

916.0
908.0

907.0

O
906.0

917.0 918.0

905.0
904.0
919.1

0
903

904

905

906

907

908

913.0

100

m/z
620

640

660

680

700

720

740

760

780

800

820

840

860

880

900

920

940

909

910

911

912

913

914

915

916

917

918

919

920

921

922

m/z
923

Polmeros
C9H19

O(CH2CH2O)n

LC-MS
ESI: Introduo de amostra em soluo
Possibilidade de acoplamento c/ HPLC

LC-MS

LC-MS Urina: Metablitos

LC-MS: Co-Eluio
ESI no gera fragmentos
Compostos tem massas diferentes (exceto
isbaros)
Possibilidade de co-eluio

Total: ~1500 Compostos !

Mtodos de Ionizao

Massa

ESI
EI
Polaridade