TALLER ENZIMAS Y CRECIMIENTO MICROBIANO

1. Se ha determinado la velocidad inicial de una reaccin catalizada por una enzima para diversas concentraciones de sustrato. Los datos obtenidos son los siguientes: [S ] (mol/l) 5 10 20 50 100 200 V[(mol/l)min-1] 22 39 65 102 120 135

a. Calcule Vmax y KM a partir de un grfico directo de V vs [S]. Tiene dificultades para obtener respuestas claras? b. Utilice ahora una representacin de Lineweaver-Burk para analizar los mismos datos. Funciona mejor?

2. a. Si la concentracin total de la enzima en el problema 8 fuera de 1nmol/l, cuntas molculas de sustrato puede procesar una molcula de enzima cada minuto? b. En la Tabla 2 se muestran algunas enzimas en orden de eficacia con los valores de kcat, KM y la relacin entre estas dos variables.

Enzima Quimotripsina Pepsina Tirosil-tRNA sintetasa Ribonucleasa Anhidrasa carbnica Fumarasa

KM (mol/l) 1.5x10-2 3x10-4 9x10-4 7.9x10-3 2.6x10-2 5x10-6

kcat (s-1) 0.14 0.5 7.6 7.9x102 4x105 8x102

kcat/ KM [(mol/l)s-1] 9.3 1.7x103 8.4x103 1.0x105 1.5x107 1.6x108

Calcule kcat/KM para el problema 1. Es sta una enzima eficaz con respecto a esos valores de referencia?

3. Los siguientes datos describen la catlisis de la ruptura de los enlaces peptdicos en pptidos pequeos por la enzima elastasa.

Sustrato PAPAG PAPAA PAPAF

KM (mol/l) 4.0 1.5 0.64

kcat (s1)

26 37 18

La flecha indica el enlace peptdico que se rompe en cada caso. Si se presentara una mezcla de estos tres sustratos a la elastasa, con una concentracin de cada pptido igual a 0.5mM, cul sera digerido con mayor rapidez? Cul lo sera de la forma ms lenta? Asuma que la enzima se encuentra presente en exceso y no hay competencia entre sustratos.

4. Se estudia la cintica del estado estacionario de una enzima en ausencia y en presencia de un inhibidor (inhibidor A). La velocidad inicial viene dada en funcin de la concentracin de sustrato en la tabla siguiente: [S ] (mmol/l) 1.25 1.67 2.50 5.00 10.00 V[(mol/l)min-1] Sin inhibidor 1.72 2.04 2.63 3.33 4.17

Inhibidor A 0.98 1.17 1.47 1.96 2.38

a. Determine Vmax y KM en ausencia y en presencia del inhibidor. b. Qu tipo de inhibicin se produce? 5. La misma enzima del problema 4 se estudia en presencia de un inhibidor diferente (inhibidor B). En este caso se utilizan dos concentraciones diferentes de inhibidor. Los datos son los siguientes: [S ] (mmol/l) V[(mol/l)min-1] Sin inhibidor Inhibidor B (3mM) 1.72 1.25 2.04 1.54 2.63 2.00 3.33 2.86 4.17 3.70

1.25 1.67 2.50 5.00 10.00

Inhibidor B (5mM) 1.01 1.26 1.72 2.56 3.49

a. Determine Vmax y KM para cada concentracin para cada caso. b. Qu tipo de inhibidor es el inhibidor B.

6. Un cultivo por lotes se realiz a 15 C en un fermentador con 10 litros de caldo, inoculado con 300 ml de cultivo con una concentracin de biomasa de 12 g/L. Cuando el cultivo tiene la mitad de la concentracin del inculo la temperatura aumenta a 35 C, mantenindose hasta que el cultivo alcanza la concentracin del inculo, momento en el cual se termina la fermentacin. Se sabe que el tiempo de duplicacin de esta cepa es, a 20 C, de 32 minutos, y a 30 C de 24 minutos. Calcular el tiempo total de fermentacin. 7. En un reactor por lotes se realiza un cultivo mixto con dos tipos de bacterias. Al comienzo del cultivo (X1)0 = 2 (X2)0, y se sabe por bibliografa que 2 = 21, donde 1 es de 0.45 h-1. Determine el tiempo que debe transcurrir para que la relacin inicial se invierta. Obtenga adems el tiempo en el cual la concentracin de la cepa 1 es igual a la de la cepa 2.
8.

Un tipo de microorganismo fue cultivado en modalidad batch, y los siguientes datos fueron obtenidos: t (horas) 0 9 16 23 30 34 36 40 [N]g/l 0,125 2,45 5,1 10,5 22 33 37,5 41 [S]g/l 100 97 90,4 76,9 48,1 20,6 9,38 0,63

a. En que tiempo termina la fase de latencia o lag y comienza la fase exponencial o log? b. Segn los datos presentados, Cul es la posible causa de terminacin de la fase de crecimiento exponencial? c. Calcule los tiempos de generacin teniendo en cuenta y las velocidades especficas de crecimiento para: - Todo el intervalo de tiempo de la fermentacin (global). - Solo en el intervalo de la fase exponencial. - Comienzo de la fase exponencial hasta la mitad. - Mitad de la fase exponencial hasta el final. Explique las diferencias y similitudes de los resultados. d. Calcule la constante global de afinidad del microorganismo por el sustrato. e. Calcule el rendimiento global de sustrato a biomasa. f. Manteniendo constante el rendimiento global de sustrato-biomasa y la concentracin inicial de biomasa, calcule la concentracin final de biomasa si la concentracin inicial de sustrato fuera de 150 g/l.

9. La siguiente grfica ilustra el record de datos obtenidos de la fermentacin de un microorganismo con dos sustratos diferentes: el sustrato 1 (S1) es glucosa y el sustrato 2(S2) es xilosa. Se realizaron tres pruebas con concentraciones iniciales de sustrato diferentes

Caso A

Caso B

a. b. c.

d.

Caso C Qu nombre recibe este tipo de crecimiento con dos sustratos? Calcule los tiempos de generacin para dada uno de los sustratos en cada uno de los casos. Cmo afecta la concentracin inicial de sustrato a: rendimiento sustrato-biomasa, tiempo de generacin global, tiempo total de fermentacin y concentracin final de biomasa. Si se desea hacer una fermentacin con un solo sustrato, Cul elige?