POE Coloracion de Zielh Neelsen OK

LABORATORIO
E.S.E. SANTIAGO DE TUNJA

MANUAL DE PROCESOS Y PROCEDIMIENTOS
PROCEDIMIENTO
Pgina 1 de 10 Versin 1 25/03/2014 PROCEDIMIENTO OPERATIVO ESTANDAR PARA LA COLORACION DE ZIELH NEELSEN
1. OBJETIVO Estandarizar el procedimiento para la realizacin de la coloracin de Zielh Neelsen en el laboratorio clnico de la ESE Santiago de Tunja. 2. ALCANCE Este documento aplica al rea de coloraciones del Laboratorio Clnico de la E.S.E. Santiago de Tunja para la realizacin de la coloracin de Zielh Neelsen. 3. RESPONSABLE El personal auxiliar encargado del rea de coloraciones del Laboratorio Clnico E.S.E. Santiago de Tunja.
4. REFERENTE TERICO Manual y gua tcnica, MANUAL PARA EL DIAGNOSTICO BACTERIOLOGIOCO DE LA TUBERCULOSIS, parte 1 baciloscopio, Organizacin panamericana de la salud, oficina regional de la organizacin mundial de la salud, 2008, consultado el:10/08/13, disponible en: http://files.sld.cu/tuberculosis/files/2009/12/tb-labsbaciloscopia1.pdf Ledermann Walter, UNA HISTORIA PERSONAL DE LAS BACTERIAS, Sociedad Chilena de Infectologia, Ril Editores 2007, pg. 167, Consultado el: 10/08/13, Disponible en: http://books.google.com.co/books?id=pydkwNBz9dEC&pg=PA167&dq= historia+de+la+tincion+de+ziehl+neelsen&hl=es419&sa=X&ei=1PMHUtX5CarO2wXe24GYDw&ved=0CCwQ6AEwAA#v =onepage&q=historia%20de%20la%20tincion%20de%20ziehl%20neels en&f=false Rodrguez Cavallini Evelyn, Gamboa Coronado Maria del Mar, Hernndez Chavarra Francisco, Garca Hidalgo Jorge Danilo, BACTERIOLOGIA GENERAL: PRINCIPIOS Y PRACTICAS DE
ELABOR 25/03/2014 BACTERIOLOGA ALEJANDRA VELASCO REVIS AUDITOR DE CALIDAD MONICA SALAMANCA APROB GERENTE JULIANA CORTAZAR
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LABORATORIO, Editorial Universidad de Costa Rica, pg. 68, consultado el:10/08/13, disponible en: http://books.google.com.co/books?id=vwB0fgirgN0C&printsec=frontcov er#v=onepage&q&f=false Historia y fundamento, Disponible en: http://demostraciondelbacilodekoch.blogspot.com/2011/06/metodo-decoloracion-de-ziehl-neelsen_03.html http://es.scribd.com/doc/39054818/Tincion-de-Ziehl-Neelsen Fundamento de la tincin de zielh Neelsen y fotografas, disponible en: http://microinmuno.files.wordpress.com/2011/05/5-tincionesespeciales.pdf Instituto Nacional de Salud. Laboratorio Nacional de Referencia Micobacterias. Bacteriologa de tuberculosis, Baciloscopia y cultivo.
5. CAMBIOS EFECTUADOS No. VERSIN DESCRIPCIN DEL CAMBIO FECHA
6.
DESARROLLO 5.1. INTRODUCCION La tincin de Ziehl-Neelsen (BAAR) es una tcnica de tincin diferencial rpida y econmica, para la identificacin de microorganismos patgenos, fue desarrollada inicialmente por Paul Ehrlich para poner de manifiesto la presencia de los bacilos causantes de la tuberculosis en muestras clnicas de pacientes. Despus dos mdicos alemanes, Franz Ziehl (1859 a1926), un bacterilogo y Friedrich Neelsen (1854 a 1894), un patlogo, plantearon otros colorantes, por lo cual se les atribuye su descubrimiento.
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5.2. FUNDAMENTO Este mtodo se basa en que las paredes celulares de bacterias contienen cido graso cidos grasos (por ejemplo, el cido miclico) de cadena larga (50 a 90 tomos de carbono) que les confieren la propiedad de resistir la decoloracin con alcohol-cido, despus de la tincin con colorantes bsicos. Por esto se denominan cido-alcohol resistencia bacilos cido-alcohol resistente o BAAR. Las micobacterias como Mycobacterium tuberculosis M. tuberculosis y Mycobacterium marinum M. marinum y se caracterizan por sus propiedades de cido-alcohol resistencia. La coloracin clsica de ZiehlNeelsen requiere calentamiento para que el colorante atraviese la pared bacteriana que contiene ceras. La tcnica de Z-N fuerza la penetracin de la fucsina bsica en la pared celular mediante la accin combinada del fenol y el calor, que aumentan la fluidez de la capa de cidos miclicos: el calor derrite el componente ceroso y el fenol acta a modo de disolvente, permitiendo el paso del colorante bsico que se une a los cidos miclicos con carga negativa. Cuando cesa la aplicacin de calor y/o se elimina el exceso de fenol mediante un lavado con agua, la pared recupera su consistencia cerosa, pero las molculas de fucsina quedan atrapadas en su espesor.
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Con la coloracin de Ziehl Neelsen, las micobacterias se observan como bastoncitos delgados, ligeramente curvos, rojo fucsia, destacndose claramente contra el fondo azul.
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5.3. DEFINICIONES BACILOSCOPIA: en una prueba seriada de tres das consecutivos, donde se toma una muestra de esputo (catarro), para ver qu bacteria se encuentra presente. Esta prueba se utiliza para dictar el diagnstico bacteriolgico de la tuberculosis. BACTERIAS CIDO-ALCOHOL RESISTENTES: es la propiedad fsica de algunas bacterias a la resistencia a la decoloracin de la fucsina bsica (rojo) la cual penetra en la clula por accin del fenol y el calor. MICOBACTERIAS: son bacterias aerobias y no mviles (con excepcin de la especie M. marinum, que ha mostrado ser mvil dentro de los macrfagos). Tienen cido-alcohol resistencia, no producen endosporas ni cpsulas y suelen considerarse gram positivas. CIDO MICLICO: Los cido miclicos son -alquil--hidroxicidos grasos de cadena larga (60-90 tomos de carbono) y son los lpidos mayoritarios de la pared celular de micobacterias.
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5.3.
CONDICIONES GENERALES
El rea de trabajo debe encontrarse en perfecto orden. Se requiere para esta prueba, extendidos hechos a partir de una muestra clnica como esputo. Ver Manual de Toma de Muestras Las muestras deben estar correctamente identificadas con el nmero de ingreso, nombres y apellidos completos. Los procedimientos de neutralizacin y disposicin de los reactivos usados para el desarrollo de la metodologa, se encuentran registrados en el Plan de Gestin Integral de Residuos Slidos y Hospitalarios del Laboratorio Clnico de la ESE Santiago de Tunja Todas las muestras de pacientes y controles debern ser manipulados como posibles agentes potencialmente infecciosos. Utilizar todas las normas de Bioseguridad requeridas en el Laboratorio Clnico, para el montaje de estas pruebas, segn regulaciones aplicables. (Ver Manual de Bioseguridad)
6. EQUIPO ADICIONAL Microscopio con lente de inmersin Mecheros 7. PROCEDIMIENTO 7.1. PREPARACION DEL EXTENDIDO Coloque las muestras en el sitio de trabajo. Procese mximo 6 muestras a la vez. Coloque el mechero entre las muestras a procesar y usted. Deje un espacio de la lamina para marcarla con lpiz de cera azul o negro, indicando primero el nmero consecutivo del paciente y luego el nmero de
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la muestra (primera, segunda o tercera segn el caso). El resto de la lmina es para hacer el extendido de la muestra. Revise que el frasco de la muestra que se va a procesar y la lmina tengan el mismo nmero. Coloque el mechero en la mitad entre la muestra y usted para evitar riesgo de contaminacin. Divida el bajalenguas en dos y con una de las partes seleccione la partcula til que es el moco de color verde, caf o amarillo y en algunos casos tiene sangre Coloque la lmina por el lado que tiene el nmero de registro y con el bajalenguas extienda la partcula til sobre la lmina de modo uniforme sin llegar hasta el borde de ella. Cuando el extendido de la muestra sea muy delgado, deje secar y realice otra vez el extendido sobre la misma lamina. Tape el recipiente que contiene la muestra y deje secar el extendido a temperatura ambiente cerca del mechero. No acelere el secado pasando las lminas sobre la llama, esto deteriora el extendido y dificulta la observacin al microscopio pues el calor fuerte altera la estructura de los bacilos y su posterior tincin; adems puede generar aerosoles. Una vez secos los extendidos pselos rpidamente sobre la llama del mechero tres veces con el extendido hacia arriba con el fin de fijar la muestra. Ver Anexo 1. Flujograma de preparacin de extendido. 7.2. COLORACION Tenga en cuenta las lminas de control de calidad de coloracin de ZN control positivo y control negativo. (Ver control de calidad) Coloque las lminas sobre el soporte con el extendido hacia arriba separadas en orden numrico. Cubra la totalidad de la lmina con fucsina de Ziehl Neelsen previamente filtrada (rojo).
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Caliente las lminas por debajo pasando la llama del mechero hasta que se produzcan vapores. Empiece a contar 10 minutos, retire el mechero y cuando los vapores desaparezcan caliente nuevamente, haga esto cuantas veces sea necesario hasta completar el tiempo. Evite que el colorante hierva o se seque, si esto pasa agregue ms colorante y contine produciendo los vapores. Deje enfriar y lave suavemente con agua de chorro. Cubra el extendido con alcohol cido durante 1 minuto y despus de este tiempo lave suavemente con agua de chorro como lo hizo anteriormente. Cubra el extendido decolorado con azul de metileno durante 2 minutos, lave suavemente con agua de chorro. Limpie con papel suave la parte de atrs de la lmina, es decir donde no est el extendido para retirar los residuos de colorante que pueden interferir con la lectura. Dejar secar a temperatura ambiente protegidos de la luz directa del sol. Una vez secos los extendidos revise la numeracin y rotule con el nombre del paciente, nmero consecutivo y el nmero de muestra y pase los extendidos al rea de microscopa para su observacin.
Ver Anexo 2. Flujograma de Coloracion Ziehl Neelsen 8. CONTROL DE CALIDAD Cada vez que se realize la coloracin de Ziehl Neelsen es necesario haga el montaje de controles positivo y negativo con el fin de garantizar un proceso adecuado. Para el control positivo se utilizarn bacilos acido alcohol resistentes, que pueden obtenerse de la vacuna BCG. El control negativo se realizar con bacilos acido alcohol sensibles lo cual se puede lograr con una muestra negativa a la cual se haya realizado Baciloscopia.
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9. REPORTE DE RESULTADOS (-) Ausencia de BAAR en 100 campos observados (+) Menos de un BAAR por campo, en 100 campos observados (++) 1-10 BAAR por campo, en 50 campos observados (+++) + 10 BAAR por campo, en 20 campos observados Los resultados sern registrados en la carpeta de registro de baciloscopias y adicionalmente se digitan en el software CNT por nmero de documento o por seccin.
10. ANEXOS ANEXO 1. FLUJOGRAMA DE PREPARACION DEL EXTENDIDO ANEXO 2. FLUJOGRAMA DE COLORACION ZIEHL NEELSEN
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ANEXO 1. FLUJOGRAMA DE PREPARACION DEL EXTENDIDO
Disponga las muestras en el sitio de trabajo poniendo el mechero entre las muestras a procesar y usted y proceda a marcar la lmina con lpiz azul o negro con nmero consecutivo seguido de un guin y nmero de muestra.
Revise que el frasco de la muestra que se va a procesar y la lmina tengan el mismo nmero. Coloque el mechero en la mitad entre la muestra y usted
Divida el bajalenguas en dos y con una de las partes seleccione la partcula til . Coloque la lmina por el lado que est marcada y con el bajalenguas extienda muestra sobre la lmina uniformemente.
Cuando el extendido de la muestra sea muy delgado, deje secar y realice otra vez el extendido sobre la misma lamina. No acelere el secado pasando las lminas sobre la llama.
Una vez secos los extendidos pselos rpidamente sobre la llama del mechero tres veces con el extendido hacia arriba con el fin de fijar la muestra.
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ANEXO 2. FLUJOGRAMA DE COLORACION ZIEHL NEELSEN
No olvide realizar el montaje de los controles negativo y posistivo al momento de hacer la coloracin. Coloque las lminas sobre el soporte con el extendido hacia arriba separadas en orden numrico.
Cubra la totalidad de la lmina con fucsina de Ziehl Neelsen previamente filtrada .
Caliente las lminas por debajo pasando la llama del mechero hasta que se produzcan vapores. Empiece a contar 10 minutos sin dejar hervir ni secar el colorante, en este caso reponer con ms colorante.
Deje enfriar y lave suavemente con agua de chorro.
Cubra el extendido con alcohol cido durante 1 minuto y despus de este tiempo lave suavemente con agua de chorro
Cubra el extendido decolorado con azul de metileno durante 2 minutos, lave suavemente con agua de chorro.
Limpie con papel suave la parte de atrs de la lmina y deje secar a temperatura ambiente. Pase las lminas al area de microscopa.

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ANEXO 2. FLUJOGRAMA DE COLORACION ZIEHL NEELSEN

Cubra la totalidad de la lmina con fucsina de Ziehl Neelsen previamente filtrada .

Deje enfriar y lave suavemente con agua de chorro.

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