La replicacin de ADN en Escherichia coli

BY MATTHEW MESELSON AND FRANKLIN W. STAHL

GATES AND CRELLIN LABORATORIES OF CHEMISTRY, t AND NORMAN W. CHURCH LABORATORY OF CHEMICAL BIOLOGY, CALIFORNIA INSTITUTE OF TECHNOLOGY, PASADENA, CALIFORNIA

Communicated by Max Delbrick, May 14, 1958

Introduction.-Estudios de la transformacin bacteriana y bacteriaphage infection indican fuertemente que el cido desoxirribonucleico (ADN) pueden portar y transmitir tario heredi informacin y puede dirigir su propia replicacin. Las hiptesis para el mecanismo de la replicacin del ADN difieren en las predicciones que toman en relacin con la distribucin entre molculas de progenie de tomos derivados de molculas parentales. Marcadores radioisotpicos se han empleado en los experimentos que influyen en la distribucin de los tomos cin parentales entre molculas de progenie en varios organismos. Nosotros anticipa que una etiqueta que imparte a la molcula de ADN una mayor densidad podra permitir un anlisis de esta distribucin mediante tcnicas de sedimentacin. Para este final, se desarroll un mtodo para la deteccin de pequeas diferencias de densidad entre los

La figura 1. Fotografas de absorcin ultravioleta mostrando sucesiva etapas en las bandas de ADN a partir de E. coli. Una alcuota de lisado bacteriano que contiene aproximadamente 108 clulas lisadas se centrifug a 31.410 rpm en una solucin de CsCl como se describe en el texto. Distancia desde el eje de rotacin aumenta hacia la derecha. El nmero al lado de cada fotografa le da el tiempo transcurrido despus de llegar a 31.410 rpm.

macromolculas. '0 Mediante el uso de este mtodo, hemos observado la distribucin del istopo de nitrgeno pesada N15 entre molculas de ADN tras la transferencia de un N ", la poblacin bacteriana uniformemente 5 marcado con crecimiento exponencial a un medio de crecimiento que contiene el istopo de nitrgeno ordinaria N'4. Densidad-centrifugacin en gradiente de -. Una pequea cantidad de ADN en una solucin concentrada de cloruro de cesio se centrifug hasta equilibrio se acerc estrechamente.
Los procesos opuestos de la sedimentacin y difusin entonces han producido un gradiente de concentracin estable del cloruro de cesio. Los gradientes de concentracin y de presin dan lugar a un aumento continuo de la densidad a lo largo de la direccin de la fuerza centrfuga. Las macromolculas de ADN presente en este gradiente de densidad son impulsados por el campo centrfugo en la regin donde la densidad de la solucin es igual a su propia densidad de flotacin. ' Esta tendencia de concentracin se opone por difusin, con el resultado de que en el equilibrio una sola especie de ADN se distribuye en una banda cuya anchura est inversamente relacionada con el peso molecular de la especie (fig. 1). Si varias especies de densidad diferentes de ADN estn presentes, cada una formar una banda en la posicin donde la densidad de la solucin de CsCl es igual a la densidad de flotacin de esa especie. En esta forma de ADN marcada con nitrgeno pesado (N15) puede ser

La figura. 2-a: La resolucin de ADN N14 de N "1 de ADN por centrifugacin de densidad-gradtient. Una mezcla de N'4 y N "1 lisados bacterianos, cada uno conteniendo aproximadamente 10" clulas lisadas, se centrifug en una solucin de CsCl como se describe en el texto La fotografa fue tomada despus de 24 hounrs de centrifugacin a 44.770 rpm b:.. Un trazado microdensitmetro que muestra la distribucin de ADN en la regin de las dos bandas de. Fig. 2a. La separacin entre los picos corresponde a una diferencia en la densidad de flotacin de 0.014 g. cm.

resuelto a partir de ADN no marcado. La Figura 2 muestra las dos bandas formadas como resultado de la centrifugacin de una mezcla de cantidades aproximadamente iguales de N14 y N15-ADN coli Escherichia. En este papel referencia se har con el peso molecular aparente de las muestras de ADN se determina por medio de gradiente de densidad de centrifugacin. Una discusin se ha dado "'de las consideraciones en las que dichas determinaciones se basan, as como de varias fuentes posibles de error. Experimental.-Escherichia coli B fue aumentado a 360 C. con aireacin en un medio que contiene glucosa sales de cloruro de amonio como nica fuente de nitrgeno. "El crecimiento de las bacterias) la poblacin fue seguido por el recuento de clulas microscpicas y por ensayos de colonias (Fig. 3). Las bacterias marcadas uniformemente con N "5 fueron preparados por clulas lavadas en crecimiento durante 14 generaciones (a un ttulo de 2 X 108/ml) en medio que contiene 100, ug / ml de N'5H4Cl del 96,5 ciento de pureza isotpica por. Un cambio brusco de a continuacin, se llev a cabo medio N14 aadiendo al cultivo en crecimiento de un exceso de diez veces de N14H4Cl, junto con ribosides de adenina y uracilo en el experimento 1 y ribosides de adenina, guanina, uracilo, citosina y en el experimento 2, para dar una concentracin de L 10 g / ml de cada ribsido. Durante el crecimiento posterior del ttulo bacteriana se mantuvo entre

La figura. 3.-El crecimiento de las poblaciones bacterianas primero en N15 y N14 en el medio. Los valores de las ordenadas dan los ttulos reales de los cultivos hasta el momento de la adicin de N'4. A partir de entonces, durante el perodo en que se estn retirando muestras para la densidad de gradiente de centrifugacin, el ttulo real se mantuvo entre 1 y 2 X 108 por adiciones de medio fresco. Los valores de las ordenadas durante este ltimo perodo se han corregido para los retiros y adiciones. Durante el perodo de muestreo para la densidad de gradiente de centrifugacin, el tiempo de generacin era 0,81 horas en el Experimento 1 y 0,85 horas en el Experimento 2.

1 y 2 X 108/ml por adiciones apropiadas de mediano contiene ribosides N14 frescas. Las muestras que contienen alrededor de 4 X 109 bacterias se retiraron de la cultura justo antes de la adicin de N14 y despus a intervalos de varias generaciones. Cada muestra fue inmediatamente refrigerada y centrifugada en el fro durante 5 minutos a 1800 x g. Despus de la resuspensin en 0,40 ml. de una solucin fra 0,01 M en NaCl y 0,01 Min. etilendiamina tetra-acetato (EDTA) a pH 6, las clulas se lisaron por la adicin de 0,10 ml. de 15 por ciento de dodecil-sulfato de sodio y se almacena en el fro.

La figura4-a : Fotografas de absorcin ultravioleta que muestran las bandas de ADN que resultan en gradientes de densidad centrifugacin de lisados de bacterias en la muestra a diversos tiempos despus de la adicin de un exceso de sustratos NI4 a un Ni creciente "cultura de la etiqueta. Cada fotografa fue tomada despus de 20 horas de centrifugacin a 44.770 rpm en las condiciones descritas en el texto. La densidad de la Solucin de CsCl aumenta hacia la derecha. Regiones de igual densidad ocupan la misma posicin horizontal en cada fotografa. El tiempo de muestreo se mide desde el momento de la adicin de Ni4 en unidades del tiempo de generacin. Los tiempos de generacin para los Experimentos 1 y 2 se estimaron a partir las mediciones de crecimiento bacteriano presentan en la figura. 3. 6 trazados micro densitmetro de la Bandas de ADN se muestran en las fotografas adyacentes. El desplazamiento de la pluma microdensitmetro arriba la lnea de base es directamente proporcional a la concentracin de ADN. El grado de etiquetado de un especies de ADN corresponde a la posicin relativa de su banda de entre las bandas de

marcado totalmente y ADN no marcado se muestra en el marco ms inferior, que sirve como referencia de densidad. Una prueba de la conclusin de que el ADN en la banda de densidad intermedia slo est etiquetada medio-es proporcionada por el marco que muestra la mezcla de generaciones 0 y 1,9. Cuando se toma en cuenta la relacin cantidades de ADN en los tres picos, el pico de densidad intermedia se encuentra para ser centrado en 50 [2 por ciento de la distancia entre el N "y NI," picos. Para gradiente de densidad de centrifugacin, 0.010 MNL. del lisado dodecil sulfato se aadi a 0,70 ml. de solucin de CsCl tamponada a pH 8,5 con 0,01 M de tris (hidroximetil) aminometano. La densidad de la solucin resultante fue de 1,71 g. cm.-3 Esto se centrifug a 140.000 x g. (44.770 rpm) en un modelo Spinco E ultracentrfuga a 250 durante 20 horas, momento en el que el ADN haba alcanzado esencialmente equilibrio de sedimentacin. Las bandas de ADN fueron entonces encontraron en la regin de densidad de 1,71 g. cm.-3, est aislado del resto de los componentes macromoleculares de lisado bacteriano. Fotografas de absorcin ultravioleta tomadas durante el curso de cada centrifugacin fueron escaneados con un densitmetro de grabacin (Fig. 4). La densidad de flotacin de una molcula de ADN puede esperarse que vare directamente con la fraccin de etiqueta N15 que contiene. El gradiente de densidad es constante en la regin entre las bandas de ADN totalmente etiqueta y etiqueta. Por lo tanto, el grado de etiquetado de una especie parcialmente la etiqueta de ADN se puede determinar directamente a partir de la posicin relativa de su banda de entre la banda de ADN totalmente marcado y la banda de ADN no marcado. El error en este procedimiento para la determinacin del grado de etiquetado se estima en alrededor del 2 por ciento. Resultados -. Figura 4 muestra los resultados de la centrifugacin en gradiente de densidad de lisados de bacterias en la muestra a diversos tiempos despus de la adicin de un exceso de sustratos N'4-que contienen a un N1 creciente "marcado cultura Se puede ver en la Figura 4. que el ADN, hasta que ha transcurrido el tiempo de generacin en generacin, las molculas se acumulan halflabeled, mientras que el ADN marcado se agote completamente. Uno tiempo de generacin despus de la adicin de N 14, stos-media etiquetados o se observan molculas "hbridos" por s solo. Posteriormente, slo la etiqueta media- y se encontr ADN completo sin etiqueta. Cuando hayan transcurrido dos tiempos de generacin despus de la adicin de N'4, media etiqueta y sin etiqueta de ADN se encuentran presentes en cantidades iguales. . Discusin -. Estos resultados permiten las siguientes conclusiones que se pueden extraer en relacin con la replicacin del ADN en las condiciones del presente experimento. 1. El nitrgeno de una molcula de ADN se divide por igual entre dos subunidades que permanecen intactas a travs de muchas generaciones. La observacin de que los padres de nitrgeno se encuentra slo en molculas de medio marcado en todo momento despus del paso de un tiempo de generacin demuestra la existencia en cada molcula de ADN de dos subunidades que contienen cantidades iguales de nitrgeno. El hallazgo de que en la segunda generacin de molculas de media etiqueta y etiqueta son encontrado en cantidades iguales muestra que el nmero de sobrevivir subunidades de los padres es dos veces el nmero de molculas parentales inicialmente presente. Es decir, las subunidades se conservan.

2. Followinq replicacin, subunidad de los padres.

cada

molcula

hija

ha

recibido

una

El hallazgo de que todas las molculas de ADN son el tiempo-medio marcado una generacin despus de la adicin de N'4 muestra que cada molcula hija recibe una subunidad parental ". 4 Si las subunidades de los padres se haban separado de cualquier otro modo entre las molculas hijas, no se habra encontrado en la primera generacin de algunos totalmente etiquetados y algunas molculas de ADN sin etiqueta, que representan a esas hijas que recibieron dos o no hay subunidades de los padres, respectivamente. 3. Los resultados acto replicativa en una duplicacin molecular. Esta declaracin es un corolario de conclusiones 1 y 2 anteriores, de acuerdo con whicheach molcula de los padres le transmite a la progenie de dos subunidades de molculas y cada molcula de progenie recibe slo una subunidad de los padres. De ello se desprende que cada uno individuales resultados acto reproductivo moleculares en una duplicacin del nmero de molculas que entran en ese acto. Las conclusiones anteriores se representan esquemticamente en la figura 5.El de Watson-Crick Model.-Una estructura molecular de ADN ha sido propuesto por Watson y Crick.15 Se ha sometido a refinement'6 preliminar sin alteracin de sus caractersticas principales y est apoyado por fsico y estudios de qumica. "7 La estructura consta de dos cadenas de polinucletidos enrolla helicoidalmente alrededor de un eje comn. La base de nitrgeno (adenina, guanina, timina, o citosina) en cada nivel

La figura. recogidas en nitrgeno de subunidades.

5.-representacin esquemtica de las conclusiones el texto de los datos presentados en la figura. 4. El cada molcula de ADN se divide por igual entre dos Despus de la duplicacin, cada molcula hija recibe

uno de estos. Las subunidades duplicaciones sucesivas.

se

conservan

travs

de

en una cadena es hidrgeno unido a la base en el mismo nivel en la otra cadena. Requisitos estructurales permiten la aparicin de slo la base de enlaces de hidrgeno pares de adenina-timina y guanina-citosina, dando como resultado una complementariedad detallada entre las dos cadenas. Esto sugiri a Watson y Crick "8 una hiptesis definida y estructuralmente plausible para la duplicacin de la molcula de ADN. De acuerdo con esta idea, las dos cadenas se separan, la exposicin de los sitios de enlace de hidrgeno de las bases. Entonces, de acuerdo con las restricciones de emparejamiento de bases, cada cadena sirve como plantilla para la sntesis de su complemento. Por consiguiente, cada molcula hija contiene una de las cadenas parentales emparejados con una cadena recin sintetizada (fig. 6). Los resultados del presente experimento concuerdan exactamente con las expectativas del modelo de Watson y Crick para la duplicacin del ADN. Sin embargo, se debe enfatizar que no se ha demostrado que las subunidades moleculares que se encuentran en el presente experimento son cadenas de polinucletidos individuales o incluso de que las molculas de ADN estudiaron aqu corresponden a las molculas de ADN individuales que poseen la estructura propuesta por Watson y Crick. Sin embargo, alguna informacin se ha obtenido de las molculas y sus subunidades; que se resume a continuacin.

La figura. 6 -. Ilustracin del mecanismo de duplicacin de ADN propuesto por Watson y Crick. Cada molcula hija contiene una de las cadenas de los padres (negros) se combina con una cadena nueva (blanco). Al continuar la duplicacin, las dos cadenas originales

matrices permanecen intactos, por lo que siempre se encontrarn dos molculas, cada una con una cadena de los padres. Las molculas de ADN derivadas de E. coli mediante lisis inducida detergente tienen una densidad de flotacin en CsCl de 1,71 gm. cm-3, en la regin de densidades encontrados para el ADN del bacterifago T2 y T4, y para el ADN de ternera-timo y de esperma de salmn purificada. La solucin altamente viscosa y elstica de ADN N14 se prepar a partir de un lisado de dodecil sulfato de E. coli por el mtodo de Simmons19 seguido por desproteinizacin con cloroformo. La purificacin adicional se llev a cabo mediante dos ciclos de centrifugacin gradiente de densidad preparativa en solucin de CsCl. Este ADN bacteriano purificado era encontrado que tienen la misma densidad de flotacin y el peso molecular aparente, 7 X 106, como el ADN de los lisados bacterianos (Figs. 7, 8). Es Denaturation. ha encontrado calor que el ADN de E. coli se diferencia importante a partir de ADN de esperma de salmn purificada en su comportamiento a la desnaturalizacin por calor. La exposicin a temperaturas elevadas se conoce para provocar un colapso abrupto de la molcula de ADN nativa relativamente rgido y extendido y para poner a disposicin para la titulacin cidobase de una gran fraccin de los grupos funcionales que se presumen bloqueado por la formacin de enlaces de hidrgeno en la estructura nativa. 19, 20, 21, 22 Rice y Doty22 han informado de que este colapso no va acompaada de una reduccin en el peso molecular determinado a partir de dispersin de luz. Estos resultados han sido corroborados por gradiente de densidad de centrifugacin de DNA.23 de esperma de salmn Cuando este material es

La figura. 7.-microdensitmetro trazado de una fotografa que muestra la absorcin en el ultravioleta densidad ptica en la regin de una banda de N14 de E. coli ADN en el equilibrio. Sobre 2 fg. de ADN purificada como se describe en el texto se centrifug a 31.410 rpm a 250 en 7,75 molar de CsCl a pH 8,4. El gradiente de densidad es esencialmente constante en la regin de la banda y es 0,057 gm./cm.4. La posicin del mximo indica una densidad de flotacin de 1,71 gm. cm -. 'En este trazado la densidad ptica por encima de la lnea de base es directamente proporcional a la concentracin de ADN en elgiratoria celular centrfuga. La concentracin de ADN en el mximo es de aproximadamente 50, g. / Ml.

La figura. 8.-El cuadrado de la anchura de la banda de la figura. 7 trazan en funcin del logaritmo de la concentracin relativa de ADN. Las divisiones a lo largo de la abscisa partieron intervalos de 1 mm.2. En la ausencia de heterogeneidad densidad, la pendiente en cualquier punto de una grfica de este tipo es directamente proporcional al peso molecular promedio en peso de la ADN situado en la posicin correspondiente en la banda. La linealidad de este grfico indica monodispersidad del ADN en bandas. El valor de la pendiente corresponde a un peso molecular aparente de la sal de Cs-ADN de 9,4 X 10., correspondiente a un peso molecular de 7,1 X 10. para la sal de sodio. mantenido a 1000 durante 30 minutos, ya sea en las condiciones empleadas por Rice y Doty o en el medio de centrifugacin en CsCl, se produce un aumento de la densidad de 0,014 g. cm.r3 sin cambio en el peso molecular aparente. Se obtienen los mismos resultados si el ADN de esperma de salmn se trata previamente a pH 6 con EDTA y dodecil sulfato de sodio. Junto con el aumento de la densidad, de calentamiento provoca una fuerte reduccin en el tiempo requerido para la formacin de la banda en el gradiente de CsCl. En el ausencia de un aumento en el peso molecular, la disminucin en el tiempo de bandas debe ser ascribed10 a un aumento en el coeficiente de difusin, lo que indica una extensa colapso de la estructura nativa.

La figura. 9.-La disociacin de las subunidades de ADN de E. coli a la desnaturalizacin por calor. Cada curva suave conecta los puntos obtenidos por microdensitometra de una fotografa de absorcin ultravioleta tomada despus de 20 horas de centrifugacin en solucin de CsCl a 44.770 rpm. La densidad de la lnea de base se ha eliminado mediante sustraccin. A:. Una mezcla de N1 "lisados bacterianos calentadas y no calentadas lisado climatizada nico que da una banda en la posicin indicada lisado no climatizada esta en este experimento, para la comparacin. Calefaccin ha trado consigo un aumento de la densidad de 0,016 g. cm. -3 Y una reduccin de alrededor de la mitad en el peso molecular aparente de la ADN. B: lisado climatizada de bacterias N16 cultivados para una generacin en medio de crecimiento N14. Antes de desnaturalizacin por calor, el ADN hbrido contenida en este formas de lisado slo una banda, como puede verse en la figura. . 4 C:. Una mezcla de N14 calienta y se calienta N "lisados bacterianos La diferencia de densidad es 0,015 g cm.. Se observan La disminucin en el tiempo de bandas y un aumento de la densidad cerca de la que se encuentra tras el calentamiento de ADN de esperma de salmn (fig. 9, a) cuando un lisado bacteriano que contiene N marcado uniformemente "5 o ADN N14 de E. coli se mantiene a 100 C . durante 30 minutos en el medio de centrifugacin en CsCl, pero el peso molecular aparente Ofthe ADN bacteriano caliente se reduce a aproximadamente la mitad que el del material no calentado. ADN marcado mitad contenida en un lisado de detergente de clulas de E. coli N'5 cultivadas para una generacin en medio N14 se calent a 1000 C durante 30 minutos en el medio de

centrifugacin en CsCl. Resultados de este tratamiento en la prdida del material de medio marcado original y en la aparicin de cantidades iguales de dos especies nuevas de densidad, cada uno con aproximadamente la mitad del peso molecular aparente inicial (fig. 9, b). La diferencia de densidad entre las dos especies es 0.015 gm. cm. -, Cerca del mnimo de la producida por el etiquetado N'6 del ADN sin calefaccin. Este comportamiento sugiere que el calentamiento de la molcula hbrida produce la disociacin de la subunidad NI5-que contiene de la subunidad N'4. Esta posibilidad fue probada por un examen gradiente de densidad de una mezcla de N'5 ADN climatizada y ADN N14 climatizada (fig. 9, C). La estrecha semejanza entre los productos de ADN de calentamiento hbrido (Fig. 9 B) y la mezcla de productos obtenidos a partir de calentar N14 y ADN N'5 por separado (Fig. 9, C) conduce a la conclusin de que los dos subunidades moleculares de hecho han disociado tras el calentamiento. Puesto que el peso molecular aparente de las subunidades as obtenidos se encontr que cerca de la mitad de la molcula intacta, se puede concluir tambin que las subunidades de la molcula de ADN que se conservan en la duplicacin son estructuras individuales, continuas. El esquema para la duplicacin del ADN propuesto por Delbrfick24 est gobernado por lo tanto fuera. Para recapitular, tanto de esperma de salmn y ADN de E. coli se calent bajo condiciones similares colapso y someterse a un aumento de densidad similar, pero el ADN de salmn conserva su peso molecular inicial, mientras que el ADN bacteriano se disocia en las dos subunidades que se conservan durante la duplicacin. Estos resultados permiten a dos interpretaciones diferentes. Por un lado, si suponemos que el ADN de salmn contiene subunidades anlogas a las que se encuentran en el ADN de E. coli, entonces debemos suponer que las subunidades de ADN de salmn estn unidos entre s con ms fuerza que los de la ADN bacteriano. Por otro lado, si se supone que las molculas de ADN de salmn no contienen estas subunidades, entonces debemos conceder que la molcula de ADN bacteriano es una estructura ms compleja de lo que es la molcula de ADN de salmn. La ltima interpretacin cuestiona la suficiencia del modelo de ADN de Watson y Crick para explicar la distribucin observada de los tomos de nitrgeno de los padres entre la progenie molculas. Conclusion.-La estructura de ADN propuesto por Watson y Crick dio a luz una serie de propuestas sobre cmo esta molcula podra replicar. Estas propuestas hacen predicciones especficas sobre la distribucin de los tomos de los padres entre las molculas de progenie. Los resultados presentados aqu dan una respuesta detallada a la pregunta de esta distribucin y al mismo tiempo dirigir nuestra atencin a otros problemas cuya solucin debe ser el siguiente paso en el avance hacia una completa comprensin de la base molecular de la duplicacin del ADN. Cules son las estructuras moleculares de las subunidades de ADN de E. coli que se transmiten intactas a cada molcula hija? Cul es la relacin de estas subunidades entre s en una molcula de ADN? Cul es el mecanismo de la sntesis y la disociacin de las subunidades in vivo? Resumen.-mediante centrifugacin en gradiente de densidad, hemos podido observar la distribucin de N'5 entre las molculas de ADN de la bacteria despus de la transferencia de un crecimiento exponencial de la poblacin de E. coli N'5 sustituido de manera uniforme a medio N'4. Nos encontramos con que el nitrgeno de una molcula de ADN se divide en partes iguales entre dos subunidades fsicamente continuos; que, despus de la duplicacin, cada molcula hija recibe uno de estos; y que las subunidades se conservan a travs de muchas duplicaciones.