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PRINCIPAIS

TCNICAS

MTODOS

UTILIZADOS

NA

AVALIAO

MICROBIOLGICA DE ALIMENTOS DE ORIGEM ANIMAL 1 INTRODUO Os mtodos de enumerao de microrganismos viveis podem ser divididos, de acordo com sua maior ou menor preciso, em dois grupos, os estimativos e os quantitativos diretos. Do mesmo modo, esses microrganismos podem ser determinados atravs da visualizao direta de suas clulas, como na contagem microscpica direta, ou indiretamente, atravs de seu crescimento na forma de colnias ou, ainda, atravs de produtos de seu metabolismo, como ser vista nos mtodos discutidos em seguida. Em microbiologia de alimentos s vezes se faz necessrio a determinao de microrganismos ou grupos microbianos com populao to reduzidas ou injuriadas, que se tornam inviveis as tcnicas de quantificao. Para esses casos pode ser adotado o teste de presena/ausncia. 2 MTODOS ESTIMATIVOS 2.1 Mtodo do nmero mais provvel (NMP) A concentrao de clulas viveis pode ser estimada pelo mtodo do nmero mais provvel (NMP), o qual envolve uma deduo matemtica da contagem de microrganismos viveis, de uma frao do inculo, capazes de crescer numa srie de tubos contendo um meio apropriado (KOCH, 1981). O mtodo consiste em se inocular diversas diluies (quantidades conhecidas da amostra), em baterias com tubos repetidos, contendo o meio que permitir o crescimento. Aps a incubao, os tubos podem ou no apresentar crescimento e as diluies que no apresentarem, presumivelmente no receberam nenhum microrganismo capaz de crescer. O mtodo do NMP, do ponto de vista estatstico, no uma medida precisa da populao microbiana, porque cada tubo corresponde a uma pequena frao da superfcie de uma placa de Petri. Consequentemente, o NMP tem maior preciso quanto maior for o nmero de pores examinadas em cada diluio, principalmente nas diluies crticas, onde se devem encontrar resultados tanto positivos quanto negativos (APHA, 1992). As diluies empregadas deveriam, idealmente, serem tais que as mais baixas dessem resultado positivo na maioria ou em todas as pores e as mais altas resultados negativos tambm para a maioria ou em todas as pores inoculadas. O valor numrico estimado para o contedo bacteriano obtido pelas diluies, considerando os tubos com resultados positivos e negativos.

FRMULA MATEMTICA QUE PERMITE O CCULO DO NMERO MAIS PROVVEL (NMP) ATRAVS DO MTODO DOS TUBOS MLTIPLOS.

NMP/100 ml ou = grama

nmero de tubos + x 100

ml ou g da amostra nos tubos negativos

ml ou g da amostra em todos os tubos

O NMP foi calculado para as diferentes combinaes possveis de resultados, que podem ser obtidos quando se usam diferentes diluies em diferentes sries de inoculaes, e foram organizadas tabelas apropriadas de NMP, tambm chamada tabela de Hoskins. Estas tabelas trazem os NMP correspondentes s diferentes combinaes de resultados obtidos em diversas sries de volumes inoculados. Geralmente as tabelas so para sries de 3 ou 5 pores dos volumes de 10, 1,0 e 0,1 ml ou, para alimentos slidos, pores de 1,0, 0,1 e 0,01 g. Quando se empregam no exame mais de trs diluies, se dever tomar os resultados de apenas trs delas, j que as tabelas de NMP trazem, no mximo, combinaes de resultados para trs diluies ou volumes diferentes e, para escolher quais as trs significantes a regra geral manda que se tome a diluio mais alta que de todos os resultados positivos (sem que nenhuma diluio mais baixa apresente nenhum resultado negativo) e as duas diluies seguintes (mais altas). Em resumo, deve-se escolher trs diluies consecutivas, a partir daquela mais alta que tenha dado todos os tubos com resultado positivo. As aplicaes do mtodo do NMP so inmeras. Ele particularmente importante nos procedimentos padres de determinao de coliformes a partir de gua e de diferentes tipos de alimentos. Este mtodo pode tambm ser utilizado na enumerao de Staphylococcus, Vibrio parahaemolyticus, Salmonella e Bacillus cereus (APHA, 1992; SILVA e cols., 1997), desde que se utilize meios adequados e se realize a pesquisa do microrganismo a partir de sries de volumes ou diluies diferentes. 2.2 Aplicaes mais comuns do mtodo do NMP

2.2.2 Determinao do NMP de coliformes totais, fecais e Escherichia coli (APHA, 1992; SILVA e cols., 1997). 2.2.1 Material requerido para a anlise Preparao da amostra e diluies seriadas: Diluente: 225 ml de gua peptonada 0,1% (H2Op). Tubos de diluio: 3 a 5 com 9 ml de H2Op/tubo. Pipetas: 3 a 5 de 1,0 e 2,0 ml, esterilizadas. Sacos plsticos ou frasco para a diluio, dependendo do tipo de alimento. Teste presuntivo Meios de cultura: 9 ou 12 tubos com 6 a 8 ml de caldo lauril sulfato triptose (LST) ou caldo LST suplementado com 50 mg/litro de 4-metil-umbeliferil--D-glucurondio (LSTMUG) com tubos de Durhan. Estufa bacteriolgica regulada a 35-37oC. Determinao do NMP de coliformes totais Meio de cultura: Aproximadamente 9 tubos com 6 a 8 ml de caldo lactosado bile verde brilhante, com tubos de Durhan. Ala de nquel-cromo Determinao do NMP de coliformes fecais Meio de cultura: Aproximadamente 9 tubos com 6 a 8 ml de caldo Escherichia coli (EC), com tubos de Durhan. Ala de nquel-cromo. Cepa padro positiva: cultura de Escherichia coli. Cepa padro negativa: cultura de E. aerogenes. Banho-maria com temperatura controlada a 45,50,2oC para alimentos de uma forma geral e 44,50,2oC para amostras de gua, pescado e moluscos. APHA (1992) estabelece 45,00,2oC em laboratrios que analisam diferentes tipos de produtos. Determinao do NMP de Escherichia coli (mtodo tradicional) Placas com gar eosina azul de metileno. Tubos com gar nutriente inclinado. Tubos com 4 ml de gar citrato de Simmons. Tubos com caldo triptona a 1%. Tubos com 4 ml de caldo MR-VP.

Reagente Kovacs para o teste do indol. Soluo de vermelho de metila para o teste do VM. Reagente de Barritt para o teste do VP (sol. de alfa-naftol a 5% e soluo de KOH a 40%). Determinao do NMP de E. coli mtodo LST-MUG Cmara escura com lmpada ultravioleta 365 nm (luz negra) 2.2.2 Procedimento aPreparao das amostras e diluies seriadas (discutido no ponto sobre

amostragem) b- Inoculao teste presuntivo Selecionar trs ou mais diluies adequadas da amostra e, com uma pipeta, de 1 ou 2 ml, inocular cada uma das sries de trs tubos de caldo LST. As diluies escolhidas vo variar em funo da amostra, de acordo com as seguintes situaes: Amostras com populaes estimadas elevadas deve-se inocular diluies maiores. Por outro lado, com populaes com reduzidas as diluies devem ser mais baixas e at, em alguns casos a inoculao de 10 ml em LST dupla concentrao; Na anlise de espessantes (gomas, pectinas) a diluio inicial deve ser maior, 1/100 por ex., em funo da viscosidade do material. Quando a populao for reduzida deve-se inocular 10 ml da diluio 1/100 em trs tubos de LST dupla concentrao; Na anlise de condimentos, principalmente cravo, canela, mostarda, alho e cebola, deve-se iniciar com diluies mais elevadas, tendo em vista a presena de compostos antimicrobianos. Em populaes reduzidas inocular 10,0 1,0 e 0,1ml da diluio 1/100; Na anlise de produtos cidos, como maionese e outras coberturas para salada, recomenda-se neutralizar a acidez da amostra com NaOH 1N estril, depois da homogeneizao e antes da inoculao nos tubos de LST. Alternativamente pode-se utilizar tampo fosfato pH 7,2, como diluente, o que elimina a necessidade de neutralizao. c- Incubao Incubar os tubos de LST a 35oC/24 horas e observar se h crescimento com produo de gs. Em caso positivo, passar aos itens subseqentes. Em caso negativo, reincubar at completar 48 horas e repetir a leitura, passando para os itens subseqentes em caso de crescimento com produo de gs.

d- NMP de coliformes totais teste confirmativo Tomar todos os tubos com produo de gs e transferir uma alada bem carregada de cada cultura para tubos de caldo lactosado bile verde brilhante. Incubar a 35oC por 24 a 48 horas e observar se h crescimento com produo de gs. Anotar o nmero de tubos com gs, confirmativo da presena de coliformes totais e determinar o NMP por grama ou ml em uma tabela apropriada s diluies inoculadas. e- NMP de coliformes fecais teste confirmativo Tomar os tubos de LST com produo de gs e transferir uma alada bem carregada de cada cultura para tubos de caldo E. coli (EC). Incubar em banho-maria a 45,5oC (com as ressalvas j apresentadas) por 24 horas e observar se h crescimento com produo de gs. Anotar o nmero de tubos de EC com produo de gs, confirmativo da presena de coliformes fecais e determinar o NMP/g ou ml em uma tabela adequada s diluies inoculadas. f- NMP de Escherichia coli mtodo tradicional De cada tubo com produo de gs em 24 horas, estriar uma alada da cultura em placas de gar eosina azul de metileno (EMB). Incubar as placas a 35oC/24 horas e observar se h desenvolvimento de colnias tpicas E. coli (nucleadas com centro negro, com ou sem brilho metlico). Havendo colnias tpicas, transferir duas delas bem isoladas, de cada placa, para tubos contendo gar nutriente ou PCA inclinados e incubar a 35oC por 24 horas. A partir das culturas puras, fazer colorao de Gram e inocular os meios teste para a realizao de provas bioqumicas de indol, VM, VP e citrato (IMViC). gNMP de E. coli mtodo LST-MUG este mtodo aparece como um mtodo Tomar todos os tubos de LST-MUG com crescimento em 24 horas ou 48 horas, com ou sem produo de gs e observar sob lmpada de luz ultravioleta (3 a 6 w), ondas longas (365nm), numa cabina escura. Considerar como positivo todos os tubos que apresentarem fluorescncia azul, confirmativa da presena de E. coli. Anotar o nmero de tubos positivos e determinar o NMP em uma tabela adequada s diluies utilizadas. Nota: O MUG um composto no fluorescente, utilizado como substrato para indicar a presena da enzima -glicuronidase. Essa enzima caracteristicamente produzida pela E. coli (96% das cepas), mas no pelos seus acompanhantes habituais na anlise de gua e alimentos, exceto Shigella (44%) e Salmonella (29%). Quando o MUG degradado pela -glicuronidase, o produto resultante (4-metilumbeliferona) fluorescente sob luz ultravioleta.

moderno de determinao, tendo a marca comercial denominada de colilert.

Os tecidos de ostras, mexilhes e mariscos apresentam atividade natural de glicuronidase, que pode provocar resultados falso positivos. 3 MTODOS QUANTITATIVOS DIRETOS 3.1 CONTAGEM CELULAR DIRETA POR MICROSCOPIA Vrios mtodos microscpicos envolvendo contagem em cmaras e esfregaos em lminas tm sido desenvolvidos para a enumerao de microrganismos em alimentos. As vantagens desses mtodos diretos que so rpidos e que podem ser obtidas outras informaes como morfologia e colorao. A principal desvantagem dos processos de contagem ao microscpio a de no haver meios de se determinar a viabilidade das bactrias contadas, alm do que, em suspenses demasiadamente diludas so impraticveis e em culturas muito densas so necessrias diluies (APHA, 1992). 3.1.1 Contagem em cmara Para este mtodo existem algumas cmaras disponveis, incluindo a de Helber, de Hawksley e a de Petroff-Hauser. Todas so similares, consistindo de uma lmina quadriculada que coberta por uma lamnula de vidro, que se fixa a uma certa distncia da superfcie. As contagens so normalmente realizadas em aumento de 400 X, muito embora a cmara de Hawksley permita o uso de lentes de imerso. O volume do lquido colocado na cmara igual rea da mesma, vezes a profundidade. O nmero de clulas contado em uma determinada rea, multiplicado pela recproca do volume em mililitro (fator de cada cmara) igual a concentrao de microrganismos no diluente. Os fatores geralmente so da ordem de 4x106 a 2x107. Alguns fatores podem interferir diminuindo a preciso do mtodo, entre eles a adsoro de bactrias na superfcie de vidrarias, principalmente pipetas, j que as quantidades de suspenso utilizadas so muito pequenas. Este problema pode ser minimizado com a utilizao de uma soluo de alta fora inica ao invs de gua ou pelo uso de uma soluo de formaldedo neutralizada com fosfato cido de potssio acrescida de traos de detergente aninico, no preparo das diluies. A vantagem do formaldedo que ele inibe o crescimento e motilidade das clulas enquanto que a soluo fosfato cida de potssio-detergente previne possveis agregaes. Outra alternativa para evitar grandes erros na contagem, pela aderncia de clulas s paredes, a utilizao de recipientes e pipetas de plstico apropriado. 3.1.2 Contagem a partir de esfregao em lmina.

Este mtodo foi desenvolvido e amplamente utilizado na anlise de leite. Mtodos similares foram aplicados para ovos e numerosos outros tipos de alimentos. O princpio geral consiste em se fazer um esfregao de uma quantidade conhecida do alimento em uma rea pr estabelecida da lmina e, aps fixao e colorao do mesmo, realizar a contagem em campos microscpicos. O valor final ser obtido atravs de diferentes arranjos matemticos, utilizando-se para tal a mdia dos campos contados e o fator do microscpio utilizado. O fator do microscpio consiste na rea abrangida pela sua objetiva. A vantagem do mtodo o fato de ser rpido e da lmina permanecer como referncia futura e a desvantagem o fato de poder ser aplicado somente em alimentos que contm altas populaes microbianas. 3.1.3 Contagem a partir de microscopia de fluorescncia. Consiste na tcnica onde, pela epi-iluminao (fonte de luz colocada entre a lente ocular e a objetiva) e microscopia de fluorescncia, foi possvel criar o mtodo da epifluorescncia. Esta uma tcnica rpida para contagem de microrganismos que no depende de seu cultivo e conseqente formao de colnias. Nesta tcnica, microrganismos viveis e no viveis so enumerados por microscopia, sendo, com certeza, uma das tcnicas que mais rapidamente oferece resultados. Na sua realizao, a amostra devidamente homogeneizada e tratada com enzimas e tensoativos se necessrio, filtrada atravs de uma membrana de policarbonato que retm os microrganismos. Essa membrana ento corada com um fluorocromo nucleoflico (alaranjado de acridina) e observada em um microscpio de fluorescncia. O corante permite a diferenciao das clulas viveis das no viveis, pois DNA e RNA corados apresentam fluorescncia de colorao diferente em funo da fase do crescimento microbiano. Assim, clulas viveis apresentam fluorescncia laranjaavermelhada, enquanto clulas mortas tem fluorescncia verde. A epifluorescncia tem boa sensibilidade, resultante da concentrao das clulas na superfcie da membrana filtrante. Essa tcnica tem sido utilizada satisfatoriamente para contagem de clulas viveis e no viveis em leite, mas sua utilizao tem sido recomendada para outros produtos tambm. Alguns autores consideram esta tcnica muito cansativa, o que pode prejudicar sua correlao com os mtodos convencionais de contagem. Alm disso, alguns fatores, como injria das bactrias, causada principalmente pelo calor, podem alterar a fluorescncia das clulas. A contagem no microscpio de fluorescncia pode ser automatizada, atravs da utilizao de um processador de imagem acoplado a um contador computadorizado. H

no mercado instrumentos que executam automaticamente todas as etapas (filtrao, colorao, lavagem, secagem e contagem) da tcnica de epifluorescncia. H tambm aparelhos altamente especializados que associam a tcnica de epifluorescncia tcnica de citometria de fluxo, destinados, principalmente, anlise de leite e laticnios. O custo elevado destes equipamentos, no entanto, torna o seu uso limitado a laboratrios de grande porte (FRANCO, 1995). 3.2 MTODOS DE CONTAGEM DE COLNIAS A introduo dos meios a base de gar, por volta de 1800, permitiu o desenvolvimento de mtodos de quantificao microbiana, atravs da contagem de colnias. Esses mtodos tm sido utilizados de forma extensiva na determinao da populao de microrganismos viveis em alimentos. Esses mtodos de contagem so baseados no fato de que, cada clula microbiana presente em um alimento pode formar uma colnia visvel quando misturada a um meio slido que lhe permita o crescimento. A contagem de aerbios em placa uma das maiores aplicaes da tcnica de contagem de colnias. O nmero de microrganismos tem sido um dos indicadores microbiolgicos da qualidade das guas e alimentos mais comumente utilizados. Inicialmente esta contagem era denominada contagem total, termo que foi abandonado, utilizando-se com mais propriedade contagem padro, tendo-se em vista que o termo total muito amplo e abrangeria, teoricamente, todos os microrganismos contidos em determinado alimento, o que praticamente impossvel ao levarmos em conta os diferentes nutrientes e condies ambientais que cada um necessitaria. Para isto seria necessrio um meio nutritivo universal em primeiro lugar, no qual todas as exigncias nutritivas dos microrganismos ali semeados fossem satisfeitas, porm as condies ambientais peculiares a cada grupo no seriam resolvidas. A tcnica de contagem de colnias uma tcnica geral, que pode ser utilizada tanto para a contagem de grandes grupos microbianos, como os aerbios ou facultativos mesfilos, psicrotrficos e termfilos, os bolores e leveduras e os clostrdios sulfito redutores, como tambm para a contagem de gneros e espcies em particular, como Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Clostridium perfringens, por exemplo (SILVA e cols., 1997). Variando o tipo de meio (meio de enriquecimento, meio seletivo, meio seletivo diferencial) e as condies de incubao (temperatura e atmosfera), possvel selecionar o grupo, gnero ou espcie que se deseja contar. Como as clulas microbianas muitas vezes ocorrem em agrupamentos (pares, ttrades, cachos, cadeias, etc.), no possvel estabelecer uma relao direta entre o nmero de colnias e o nmero de clulas. A relao correta feita entre o nmero de

colnias e o nmero de unidades formadoras de colnias (UFC), que podem ser tanto clulas individuais como agrupamentos caractersticos de certos microrganismos. A tcnica de contagem de colnias pode ser utilizada atravs de diferentes metodologias, sendo algumas tradicionalmente conhecidas e outras denominadas, atualmente, como novos mtodos de anlise microbiolgica de alimentos. Dentre as tcnicas tradicionalmente conhecidas tem-se: Contagem pelo mtodo de plaqueamento em profundidade; Contagem pelo mtodo de plaqueamento em superfcie; Contagem pelo mtodo de plaqueamento em gotas calibradas; Contagem pelo mtodo da membrana filtrante Dentre os mtodos ditos modernos tem-se como os mais comuns: Mtodo de contagem pelo plaqueamento em espiral; Mtodo de contagem atravs de petrifilm; Mtodo de contagem em filtro-membrana com grade hidrofbica (HGMF) 3.2.1 Mtodo da contagem atravs de plaqueamento em profundidade. Este mtodo, tambm denominado de pour plate, consiste na inoculao de 1,0 ml de diluies adequadas em placas de Petri separadas, esterilizadas e vazias, abrindo a placa apenas o suficiente para inserir a pipeta, prximo a bico de Bunsen. O inculo deve ser depositado fora do centro da placa, para facilitar a posterior homogeneizao com o meio de cultura. As diluies devem ser selecionadas em funo do nvel de contaminao estimado da amostra, de forma a obter placas com 25 a 250 colnias. O recomendado que sejam inoculadas no mnimo trs diluies, em duplicata ou triplicata, no sentido de aumentar a preciso das contagens. Quando no for possvel estimar previamente o nvel de contaminao da amostra, recomenda-se ento inocular mais do que trs diluies, partindo da diluio inicial. Quando as contagens iniciais forem muito baixas pode-se inocular 10 ml da menor diluio em cinco placas (2 ml/placa). Na anlise de espessantes, em funo da viscosidade, e de condimentos, em funo da presena de inibidores, pode ser necessrio inocular diluies mais elevadas. Nesses casos, quando as populaes esperadas forem muito baixas, deve-se plaquear 10,0 ml da diluio 10-2, distribudos em 5 placas. Aps a colocao da amostra diluda nas placas, deve-se verter 15 a 20 ml do meio slido, o que vai variar com o grupo microbiano estudado, previamente fundido e resfriado a 45oC. Misturar o inculo com o meio de cultura movimentando suavemente as placas, em uma superfcie plana, em movimentos na forma de oito ou em crculos, 8 a 10 vezes no sentido horrio e anti-horrio. A forma de movimentar as placas para a mistura

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do inculo deve ser mantida pelo analista durante toda a anlise, no se devendo alternar ora uma prtica, ora outra. A mistura do meio de cultura com o inculo deve ser feita imediatamente aps a adio do meio, para no haver risco de solidificao do gar. A movimentao das placas deve ser feita cuidadosamente, para evitar respingos de meio nas bordas ou nas tampas das placas. O tempo decorrido entre a preparao da amostra e a inoculao do gar no deve ultrapassar a 20 minutos, para evitar a multiplicao microbiana ou a aderncia do inculo no vidro das placas. Aps a solidificao do gar, inverter as placas e incubar. As condies de incubao sero variveis de acordo com o grupo microbiano pesquisado, assunto que ser discutido individualmente para cada um deles. Esta metodologia utilizada de forma rotineira na contagem padro de microrganismos heterotrficos mesfilos, psicrotrficos e termfilos viveis, contagem de bolores e leveduras e contagem de clostrdios sulfito redutores. 3.2.1.1 Aplicaes mais comuns do mtodo de contagem em profundidade Muito embora a contagem em profundidade seja utilizada de forma rotineira na determinao da populao microrganismos psicrotrficos e bolores e leveduras, na contagem dos mesfilos e de clostrdios sulfito redutores que ela tem sua maior aplicao. Os psicrotrficos podem ser afetados pela temperatura do gar utilizado no plaqueamento, enquanto que os bolores e leveduras se desenvolvem melhor na superfcie do gar, pela necessidade de oxignio. Nos dois casos recomendado a utilizao da tcnica de semeadura em superfcie (SILVA e cols., 1997). a- Material requerido para a anlise Preparao da amostra e diluies seriadas Diluente: 225 ml de gua peptonada a 0,1% (H2Op). Tubos de diluio: 3 a 5 com 9,0 ml de H2Op. Pipetas: 3 a 5 de 1,0 ou 2,0 ml. Contagem padro em placas de microrganismos heterotrficos mesfilos, psicrotrficos e termfilos viveis Placas de Petri: esterilizadas e vazias. Meio de cultura: gar padro para contagem (PCA)fundido e resfriado a 45oC. Estufa bacteriolgica: duas, reguladas a 35 e 55oC. Incubadora: tipo BOD, regulada a 7oC.

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Contagem de bolores e leveduras Placas de Petri Meio de cultura: gar padro para contagem, gar batata dextrose ou gar extrato de malte, acidificados a pH 3,5 ou acrescentados de cloranfenicol na proporo de 100 mg/litro, fundido e resfriado a 45oC. Incubadora: tipo BOD, regulada a 22-25oC. Contagem de clostrdios sulfito redutores Placas de Petri Meio de cultura: gar sulfito polimixina sulfadiazina (SPS), fundido e resfriado a 45oc. Sistema gerador de anaerobiose. b- Procedimento As condutas utilizadas nas determinaes dos grupos microbianos foram apresentadas na descrio do mtodo. Como particularidade, na determinao de clostrdios sulfito redutores deve ser acrescentado uma segunda camada de gar, aps a solidificao do gar homogeneizado com a amostra, com a finalidade de aumentar as condies de anaerobiose. c- Incubao Aps a solidificao completa do meio de cultura utilizado, inverter as placas e incubar em temperatura e tempo adequados aos diferentes grupos microbianos estudados, quais sejam: Mesfilos: 35-37oC/24 a 48 horas. No caso de produtos lcteos recomenda-se a incubao a 32oC/48 horas. Psicrotrficos: 7oC/10 dias. Termfilos: 55oC/48 horas. Bolores e leveduras: 22-25oC/3 a 5 dias. Clostrdios sulfito redutores: 35-37oC/18 a 24 horas. Algumas literaturas recomendam a incubao a 46oC/18 a 24 horas. Nos dois casos em anaerobiose, que pode ser obtida em estufa prpria, aps a exausto do ar e introduo de 90% de gs nitrognio e 10% de CO2 ou em jarras com o uso de GasPak Anaerobic System (BBL) ou Anaerocult A (Merck). d- Contagem das colnias e clculo dos resultados Para a leitura dos resultados devem ser selecionadas placas que contenham entre 25 e 250 colnias na contagem padro de microrganismos mesfilos, psicrotrficos e termfilos, entre 20 e 200 colnias na contagem de clostrdios sulfito redutores e de 10 a 150 colnias na contagem de bolores e leveduras.

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3.2.2 Contagem pelo mtodo de plaqueamento em superfcie Para o plaqueamento em superfcie as placas devem ser previamente preparadas, com 15 a 20 ml do meio adequado ao grupo microbiano que se objetiva quantificar. Antes da utilizao a superfcie do meio deve ser secada, o que pode ser feito em estufa (50oC/2 horas ou 30-35oC/1 noite) ou em cmara de fluxo laminar (0,5 a 1 hora, com as tampas parcialmente abertas). Devem ser inoculadas diluies adequadas da amostra, que devem ser escolhidas no sentido de permitir a contagem no momento da leitura, conforme j explicado, em quantidade de 0,1 ml. A inoculao realizada na superfcie das placas previamente preparadas e o inculo deve ser espalhado atravs da utilizao de uma ala de Drigalski ou um basto em forma de L. Nesta tcnica algumas cuidados devem ser tomados, entre os quais: Usar pipetas de, no mximo, 1,0 ml para a transferncia do inculo de 0,1 ml. No assoprar a pipeta nem mudar de posio para liberar a ltima gota. Fazer o espalhamento da placa de maior diluio para a placa de menor diluio. Como o volume de inculo utilizado no plaqueamento em superfcie de 10 vezes menor do que o usado no plaqueamento em profundidade, o limite de deteco do mtodo passa para 100 UFC/g, para amostras slidas, ou 10 UFC/ml no caso de amostras lquidas. Caso o nvel de contaminao esperado esteja abaixo dessa faixa, deve-se inocular um volume maior da primeira diluio, distribuindo esse volume por vrias placas. A distribuio mais comumente utilizada trs placas com 0,3 ml e uma placa com 0,1 ml. 3.2.2.1 Aplicaes mais comuns do mtodo de plaqueamento em superfcie O mtodo de semeadura em superfcie tem sua maior aplicao, dentro da pesquisa de microrganismos indicadores, na contagem de Staphylococcus sp. ou Staphylococcus aureus. Este mtodo tambm utilizado na contagem de Bacillus cereus e tem sido recomendado tambm na contagem de microrganismos psicrotrficos e de bolores e leveduras. A seguir, a ttulo de exemplo, ser descrito a utilizao deste mtodo na contagem de Staphylococcus sp.. a- Material requerido para a anlise Preparao da amostra e diluies seriadas Diluente: 225 ml de gua peptonada a 0,1% (H2Op). Tubos de diluio: 3 a 5 tubos com 9 ml de H2Op.

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Pipetas: 3 a 5 de 1,0 ou 2,0 ml. Contagem em placa 3 a 6 placas com gar de Baird-Parker. Estufa incubadora regulada a 35oC. Tubos com caldo infuso de crebro e corao. Tubos com gar tripticase soja. Plasma de coelho para a realizao da prova da coagulase. b- Procedimento Selecionar trs diluies adequadas da amostra, no sentido de se obter placas que contenham 20 e 200 colnias, e inocular 0,1 ml de cada uma delas em superfcie de placas com gar de Baird-Parker, previamente preparadas e secas. Espalhar o inculo com uma ala de Drigalsky, das placas de maior para as placas de menor diluio, at que todo o excesso de lquido seja absorvido. Se as contagens estimadas de estafilococos na amostra forem menores que 100/g ou ml, inocular 1,0 ml da primeira diluio, distribuindo o volume por quatro placas, 3 com 0,3 ml e uma com 0,1 ml. c- Incubao Aguardar que as placas sequem completamente e incubar invertidas, a 35oc por 48 horas. d- Contagem das colnias presuntivas Selecionar placas com 20 a 200 colnias e contar colnias tpicas de estafilococos quais sejam: colnias circulares, negras, pequenas, lisas, convexas, com bordas perfeitas, rodeadas por uma zona opaca e/ou um halo transparente se estendendo para alm da zona opaca. Eventualmente, colnias atpicas podem apresentar-se negras ou cinzentas, sem um ou ambos os halos tpicos. 3.2.3 Contagem pelo mtodo de plaqueamento em gotas calibradas Neste mtodo, prepara-se e seca-se as placas com o meio prprio ao grupo em estudo e deposita-se sobre a superfcie gotas calibradas (micropipetas) de 0,01 ou 0,02 ml da amostra diluda. Cada placa pode ser dividida em quatro partes, de tal modo que podem ser inoculadas duas gotas de cada diluio em cada uma das partes. Desta maneira, com apenas 2 placas pode-se semear oito diluies em duplicata. Aps a inoculao as placas devem ser mantidas durante 15 minutos temperatura ambiente, para que as gotas sejam absorvidas e somente aps este tempo que as placas devem ser invertidas e submetidas incubao. Esta deve ser pelo tempo e na temperatura adequada ao grupo estudado.

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Contar todas as colnias nas diluies que apresentarem um nmero inferior a 20 colnias por gota. Para o resultado final em UFC/g ou ml da amostra multiplica-se a mdia do valor obtido na gota, por 50 ou 100, dependendo da quantidade inoculada e pelo fator de diluio. Como vantagens desse mtodo o fato de que at 10 diluies de uma ou mais amostras podem ser acomodadas em uma nica placa de Petri. Normalmente deve-se deixar a gota secar em repouso, porm, pode-se espalh-la, na rea circunvizinha a ela, imprimindo-se um leve movimento rotatrio placa. A grande vantagem do mtodo baseia-se na economia, particularmente naqueles casos em que no se tem idia da contagem de microrganismos em uma determinada amostra e pode-se utilizar muitas diluies para achar a que melhor possibilitaria a contagem. A maior desvantagem a sua pouca preciso, iniciando-se na calibragem da gota, que fundamental, na dificuldade de se contar mais que 20 UFC/gota e no fato de que os microrganismos podem estar se dividindo antes da gota ser totalmente absorvida pelo gar, o que possibilita que as contagens sejam superestimadas. Como desvantagem ainda tem-se o fato de que ele se aplica apenas a lquidos no viscosos com populao acima de 2500 UFC/ml ou para os viscosos ou alimentos slidos com populaes superiores a 25.000 UFC/ml. 3.2.4 Contagem pelo mtodo da membrana filtrante Este sistema tem como princpio a utilizao de uma membrana de ster de celulose, com poros capazes de permitir a passagem de substncias lquidas e de reter partculas, inclusive microrganismos em suspenso. O sistema utiliza um aparelho de filtrao, o qual retm a membrana filtrante, acoplado a uma bomba de vcuo que tem como objetivo forar a filtrao, no sentido de aumentar a eficincia. Este sistema tem grande utilidade na anlise de amostras de gua, particularmente naqueles casos em que o grupo microbiano encontra-se em nmero reduzido, j que permite a anlise de quantidades maiores (500 ml, 1 litro, etc.). As membranas utilizadas podem ter poros de diferentes dimetros, sendo o mais comum o dimetro de 0,22 micrmetros para a esterilizao de solues e o de 0,45 micrmetros para reteno e quantificao de microrganismos. Quando utilizada na quantificao de microrganismos estas membranas so colocadas diretamente na superfcie do meio de cultura especfico ao grupo estudado. 3.2.4.1 Aplicaes mais comuns da tcnica da membrana filtrante

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O uso mais comum da tcnica da membrana filtrante est na determinao de microrganismos indicadores em amostras de gua. Assim, ela vem sendo utilizada na determinao de coliformes totais, coliformes fecais, estreptococos fecais (enterococos) etc. 3.2.5 Mtodo de contagem pelo plaqueamento em espiral Consiste em um sistema em que um conhecido volume da amostra dispensado sobre uma placa de Petri, atravs de um instrumento denominado plaqueador em espiral, em movimento rotatrio na forma de uma espiral de Archimedes. A quantidade de amostra inoculada decresce medida que se aproxima da extremidade da placa. Um sistema quadriculado (molde no qual esta impresso o desenho de uma placa subdividida em segmentos), o qual relaciona a sua rea e a quantidade de amostra inoculada usado para a contagem das colnias em uma rea apropriada da placa. O plaqueador em espiral provido de uma cnula de teflon que, atravs de vcuo, succiona uma alquota da amostra em anlise, homogeneizada em diluente quando necessrio, transferindo-a para a superfcie de uma placa de Petri com o meio de cultura, posicionada sobre uma plataforma giratria. medida que a placa gira, a alquota escoa pela cnula. Durante o escoamento, a cnula se locomove do centro da placa para suas bordas, o que resulta em um plaqueamento segundo uma espiral (espiral de Archimedes). Forma-se um gradiente de concentrao (UFC/cm2) que maior no centro da placa e diminui medida que se aproxima das bordas. A contagem de colnias obtidas atravs do plaqueamento em espiral pode ser feita manualmente ou atravs de contadores automticos, que, computadorizados, permitem a obteno imediata do nmero de UFC por grama ou mililitro de produto. O inconveniente do sistema, alm do custo do equipamento, a necessidade de se ter um alimento bem homogeneizado e perfeitamente fluido para que a cnula no venha a entupir durante a semeadura. Esse problema pode ser evitado atravs da filtrao do produto homogeneizado ou de seu tratamento com enzimas e/ou tensoativos especialmente recomendados para este fim. Este mtodo tem sua maior utilizao na contagem de microrganismos heterotrficos, sendo considerado como um dos novos mtodos de anlise microbiolgica de alimentos. Deste forma, aps a sua incluso como novo mtodo em 1977, o mesmo recebeu recomendao oficial da AOAC (Association of Oficial Analytical Chemists) em 1981 (ADREWS, 1993). O Brasil somente admite como oficial os mtodos aprovados pela AOAC e FDA (Food and Drug Administration), compilados no Bacteriolgical Analytical Manual editado pelo FDA ou no Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods, editado pela APHA.

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3.2.6 Mtodo de contagem atravs de petrifilm O petrifilm uma modificao da contagem de clulas viveis em placas, composto por dois filmes estreis, reidratveis, impregnados pelo meio de cultura especfico ao grupo estudado e por substncias geleificantes solveis em gua. O filme inferior, composto de um papel quadriculado revestido de polietileno, recoberto de nutrientes desidratados e gis hidrossolveis a frio. Neste filme inoculado 1 ml das diluies da amostra e, em seguida, este coberto com o filme superior, de polipropileno, que na face voltada para o filme inferior revestido por gis e um corante indicador. O inculo deve ser espalhado com um espalhador, por leve presso manual. Este mtodo vem sendo utilizado na determinao de microrganismos aerbios mesfilos, bolores e leveduras, coliformes totais e Escherichia coli. Para cada um destes o meio de cultura e as condies de incubao e leitura so variveis. Contagem de mesfilos o meio utilizado similar ao gar padro para contagem e a incubao nas mesmas condies do mtodo tradicional. Coliformes totais e Escherichia coli o meio utilizado o violet red bile gar, com substrato cromognico para a ao da -glicuronidase. Os coliformes totais apresentam colnias vermelhas com bolhas de gs e a E. coli, colnias azuis com gs. Como vantagens do mtodo so citados a inexistncia de qualquer trabalho de preparao de meios, pode ser utilizado em trabalhos de campo, a inoculao extremamente rpida e simples, o espao ocupado para incubao mnimo e no exige equipamentos de leitura, alm de um contador tradicional de colnias. 4 TESTE DE PRESENA/AUSNCIA Este teste uma modificao simplificada da tcnica de tubos mltiplos (NMP). Na sua realizao usa-se um volume maior da amostra ou de suas diluies, em apenas um frasco com o meio de cultura favorvel ao microrganismo ou grupo estudado. Este teste tem sua aplicao na avaliao da presena de alguns microrganismos, principalmente em produtos processados, com populaes reduzidas e provvel incidncia de clulas injuriadas. Tem sido aplicado, por ex., na deteco de Staphylococcus aureus, salmonelas e outros tipos de microrganismos em alguns alimentos.

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6 BIBLIOGRAFIA CONSULTADA AMERICAN PUBLIC HEALTH ASSOCIATION Committee on microbiological methods for foods. Compendium of methods for the microbiological examination of foods. Washington: American Public Health Association, 1992. 701p. ANDREWS, W.H. Update on validation of microbiological methods by AOAC International. Journal of Association Official Analytical Chemists International, Arlington, v.77, n.4, p.925-931, 1993. BRASIL. Ministrio da Agricultura. Secretaria nacional de Defesa Agropecuria. Mtodos analticos oficiais para controle de produtos de origem animal e seus ingredientes. IMtodos microbiolgicos. Braslia: Laboratrio Nacional de Referncia Animal. Coordenadoria do Sistema de Laboratrios, 1981. FRANCO, B.D.G.M. Novas tcnicas de anlise microbiolgica de alimentos. Higiene Alimentar, v.9, n.40, p.9-12, 1995. INTERNATIONAL COMMITTEE ON MICROBIOLOGICAL SPECIFICATION FOR FOOD (ICMSF) Microrganisms in food. I- Their significance and methods of enumeration. 2ed., Toronto: University Press, 1978. 434p. KLOOS, W.E., SCHELEIFER, K.H. Bergeys manual of systematic bacteriology. 9ed. V.2 Baltimore: Williams & Wilkins, 1986. P.1013-1036. Mac FADDIN, J.F. Biochemical tests for identification of medical bacteria. Baltimore. The Williams & Wilkins Co., 1976. 312p. SILVA, N., JUNQUEIRA, V.C.A., SILVEIRA, N.F.A. Manual de mtodos de anlise microbiolgica de alimentos. So Paulo: Varela, 1997. 295p.