( Autor de correspondencio

FvoIuocn deI mrodo de sembro en pIoco

"rrozo de Io dIucn" en eI conrroI de coIdod de boncos
de muronres de Escherichio coli K12
Diliono C Frez keytor, veldris Domnguez Vzquez, ( ngelo E Soso Espinoso
Loborolorio Coloccin Conlrol oo Microorqonismos. Doorlomonlo oo Soqoriooo y /mbionlo.
Conlro oo lnqoniorio Conolico y 8iolocnoloqio. /vo 31 o/ 158 y 1C. Ployo, Cioooo oo Lo Hobono,
/P 12, CP 1CCC, Cobo. Tol.. [53-7} 2718C7C, Fox. [53-7} 33CC8, E-moil. onqolo.soso_ciqb.ooo.co
kF50MFN
El mtodo que ms se uso poro lo enumerocin de microorgonismos viobles requiere de diluciones seriodos de lo
muestro seguido de lo dispersin de 50 o 100 L de codo dilucin en medio slido. En generol poro olconzor uno
bueno exoctitud los diluciones se hocen por triplicodo. Despus de un tiempo de incubocin, los colonios se cuenton
y se estimo lo concentrocin bocteriono en lo muestro originol. Esto tcnico es relotivomente exocto pero tiene lo
desvento|o de implicor el uso de uno gron contidod de moterioles y de tiempo. kecientemente se desorroll un
mtodo olternotivo poro lo cuontiIicocin de microorgonismos viobles llomodo mtodo de lo trozo de lo dilucin
que reduce el tiempo y lo contidod de moterioles. Con esto tcnico lo muestro con un numero de bocterios
desconocidos se siembro en uno solo ploco con ogor nutriente. En este trobo|o se oplic el mtodo trozo de lo
dilucin ol control de colidod de boncos de ocho cepos mutontes de E. col K12 con el ob|etivo de reducir los costos
y observor si no hoy oIectocin en lo colidod de los resultodos. Adems de los vento|os en cuonto o costo y
simplicidod, se encontr que en el coso de lo veriIicocin de cepos este mtodo permiti uno me|or corocterizocin
de los mismos ol poder comporor en uno mismo ploco el comportomiento Ienotpico de diIerentes cepos. El
mtodo propici odems tener un criterio ocerco de lo purezo de los boncos debido o que crecen todos los
diluciones que se hocen del cultivo.
olobros cloves: chequeo E. col, enumerocin de bocterios, Ienotipo E. col, mtodo simpliIicodo
8otecnologio Aplcodo 2002,J:J-J73
A5IkACI
Evoluolion ol lhe lrock dilulion ploling melhod in lhe quolily conlrol ol mulonl bonks ol Fschercho coI K12.
The most used method Ior bocteriol enumerotion requires successive dilutions Iollowed by dispersion oI 50-100 L
oI eoch dilution in plotes thot contoin solid medium. n generol, in order to ochieve o good occurocy in the determinotion,
the dilution is mode Ior triplicote. AIter o time oI incubotion, the colonies ore counted ond the concentrotion oI vioble
cells in the originol somple is esteemed. This technique is relotively exoct but hos the disodvontoge oI implying
the use oI o greot omount oI moteriols ond time. kecently, reseorchers unIolded on olternotive method Ior counting
vioble cells, which reduces time ond the omount oI moteriols used. This method wos termed method oI trock
dilution. n this method oll the dilutions oI unknown bocterio ore inoculoted in o single plote. n the Center Ior
Genetic Engineering ond iotechnology, in Hovono, Cubo, the method oI trock dilution wos opplied to veriIy eight
stroins oI E. col K12, mutonts with the oim oI reducing the costs ond observe iI the quolity oI the results is not
oIIected. We Iound thot besides the well-known odvontoges os Ior cost ond simplicity, in the cose oI stroin veriIicotion
this method permitted o better phenotypic chorocterizotion oI severol stroins in o some plote. The method ollowed
olso to hove on opprooch oI the purity.
Ke,words: bocteriol enumerotion, E. col phenotype, single method, E. col veriIicotion
lntroduccin
Muchas aplicaciones microbiolgicas requieren de una
determinacin del nmero de bacterias presentes en
una muestra. En un laboratorio especializado del Cen-
tro de Ingeniera Gentica y Biotecnologa (CIGB) de
La Habana, Cuba, como parte del control de calidad de
los bancos que conforman la coleccin, se verifica la
viabilidad y el fenotipo de mutantes auxotrficos y
fermentativos de E. coli. Este tipo de prueba es muy
influenciado por la pureza de la muestra y cualquier
contaminacin puede alterar el resultado.
Existen diferentes criterios para el clculo de los
viables [1, 2]. El nmero ms probable (NMP) [3] es
usado particularmente para muestras con bajas con-
centraciones de microorganismos, especialmente para
leche y aguas. Slo los organismos viables son enume-
rados por la determinacin del NMP. Las bacterias en
la muestra en cuestin pueden estar unidas formando
cadenas que no son separadas por la preparacin, por
tanto, el NMP es considerado como un estimado de la
densidad de unidades de crecimiento microbiano por
mililitro de muestra. La experiencia indica que cuando
para este tipo de chequeo se utilizan diluciones seriadas
que permiten el aislamiento de las colonias sobre la
superficie de un medio con agar, el resultado es ms
confiable.
Existen diferentes mtodos de siembra sobre medios
slidos para el conteo total de aerobios, los ms conoci-
dos son extensin en placa y verter en placa [4].
En los ltimos aos la literatura ha publicado pocos
estudios acerca de mtodos de enumeracin bacteriana
por lo que la cuantificacin se realiza en muchos casos
por los mtodos tradicionales [4, 5]. En los mtodos
convencionales se utilizan un gran nmero de placas
para lograr homogeneidad en los datos pero ya se han
1. Koch AL. octeriol growth ond Iorm.
Mew York. Chopmon ond Holl; 15
2. Modigon MT, Mortinko 1M, Forker 1.
iology oI Microorgonisms. OxIord (En-
glond}. lockwell ScientiIic Fublicotions;
17.
3. Woomer F, ennet 1, Yost k. Overcom-
ing the inIlexibility oI most-proboble-num-
ber procedures. Agron 1 10;82.34-53.
4. Sombrook 1, Fritsch EF, Moniotis T. Mo-
leculor cloning. A loborotory monuol.
Cold Spring Horbor University. Cods
Spring Horbor University Fress; 12.
5. 1ett D, Hotter KL, Huycke MM, Gilmore
MS. SimpliIied ogor plote method Ior quon-
tiIying vioble bocterio. iotechniques
17;23.48-50.
Diliono C Frez keytor y cols. Evoluocin del mtodo trozo de lo dilucin
8otecnologio Aplcodo 2002, vol.J, Nos. 3 , 4 170
desarrollado mtodos de siembra simplificados con el
objetivo de reducir la manipulacin [5-8].
El mtodo ms usado para la enumeracin de uni-
dades formadoras de colonias (ufc) incluye diluciones
seriadas del cultivo seguidas de la dispersin de
50-100 L de cada dilucin sobre la superficie de un
medio con agar. Para alcanzar una buena exactitud en
la determinacin, la dilucin se realiza por triplicado
[4]. Despus de un tiempo de incubacin, las colonias
se cuentan y se estima la concentracin bacteriana
para la muestra original. Esta tcnica es relativamente
exacta pero tiene la desventaja de implicar el uso de
una gran cantidad de materiales y de tiempo. Para
eliminar esta desventaja Miles y Misra describieron
en 1938 un mtodo donde se inocula sobre la superfi-
cie de la placa una sola gota de cada dilucin la cual
tiene un volumen aproximado de 50 L de la suspen-
sin celular; de esta forma en una placa se siembran
cuatro diluciones [6].
Otro mtodo desarrollado es el de conteo de pla-
cas en espiral [7, 8] donde se usa un dispensador
mecnico que inocula una muestra lquida sobre la
superficie de agar en placas de 100-150 mm siguien-
do una distribucin en espiral. En el mtodo el vo-
lumen de muestra dispensado decrece a partir del
centro hasta los extremos a medida que ocurre la
rotacin de la placa sin hacer diluciones previas de
la muestra. La concentracin microbiana es deter-
minada por el conteo de las colonias en la parte de
la placa donde stas sean ms fcilmente contables,
y se divide por el volumen dispensado en ese sector
de la placa en que se cuenta. Este mtodo tiene ven-
taja slo si la concentracin celular no excede de
5 x 10
6
ufc/mL ya que a estas concentraciones es
necesario realizar diluciones adicionales que permi-
tan el conteo. Este mtodo es utilizado para la eva-
luacin de pureza en muestras con bajo contenido
de microorganismos como en leche, alimentos y cos-
mticos [7, 8].
En 1997 Jett y colaboradores [5] desarrollaron un
mtodo para el conteo de las clulas viables en mues-
tras gastrointestinales de roedores, al que llamaron tra-
za de la dilucin. Este mtodo es similar al de Miles y
Misra [6] pero se diferencia en que una gota de cada
dilucin se deja correr por la superficie del agar.
En este trabajo se modific el mtodo de la traza de
la dilucin en dos aspectos: el tipo de placa de siembra
empleado y en que la tcnica se aplic no slo para el
recuento de grmenes como describieron sus autores
sino tambin a la verificacin de mutantes auxotrficos
y metablicos de E. coli [5].
El objetivo de este trabajo es aplicar el mtodo de
siembra traza de la dilucinen las determinaciones
de control de la calidad de los bancos de cepas que
tienen un nmero de 10
9
ufc/mL y que se realizan de
rutina en el laboratorio de la coleccin central de
microorganismos del CIGB. La verificacin de ocho
mutantes sirvi para evaluar los resultados.
A pesar de que para las determinaciones del control
de la calidad la concentracin de la muestra que se
emplea es superior en tres o cuatro rdenes de magni-
tud con relacin a las muestras para la cual el mtodo
que se aplica fue descrito, el inters de lograr reduc-
cin de los costos y una mayor simplicidad en las
determinaciones sin afectar la calidad, motiv a los
autores a la realizacin de esta investigacin.
Moterioles y Mtodos
Todas las cepas que constituyen la coleccin del la-
boratorio y que se utilizaron en este trabajo son
mutantes derivados de E. coli K12 que se encontra-
ban conservadas por ultracongelacin en glicerol a
-70 C. Sus caractersticas genticas y fenotpicas se
describen en la Tabla 1.
ConIeccin de los boncos de trobo|o
En todos los casos las cepas provinieron de un banco
primario conservado en medio Luria-Bertani (LB) [4]
suplementado con glicerol al 15% conservado a -70 C.
Se inocularon 100 L de cada cepa en erlenmeyers con
100 mL de medio LB y se mantuvieron a 37 C y
250 rpm de agitacin durante 6 h para propiciar el
crecimiento. Los cultivos se centrifugaron a 3 200 rpm
durante 10 min. El sobrenadante se decant en condi-
ciones estriles y el precipitado se disolvi en 50 mL
de medio LB con la adicin de glicerol al 15%. La
. Miles AA, Misro SS. The estimotion oI
the bocteriocidol power oI the blood. 1 Hyg
138.38.732-4.
7. Americon Fublic Heolth Associotion
(EE.UU.}. Stondord methods Ior the exomi-
notion oI diory products. Woshington. The
Americon Fublic Heolth Associotion; 13.
8. Associotion oI OIIiciol Anolyticol
Chemists (VA}. OIIiciol methods oI onoly-
sis. Arlinton. The Associotion; 10.
. Hill CW, Hornish W. Tronsposition oI
o chromosomol segment bounded by re-
dundont rkMA genes in Escbercbo col. 1
octeriology 182;14.44-57.
10. Yonish-Ferron, Viero 1, Messing 1. m-
proved M13 phoge cloning vectors ond
host stroins nucleotide sequences oI the
M13mp18 ond pUC1 vectors. Gene
185;33. 103-.
11. Corlioz A, Touoti D. solotion oI super-
oxide dimutose mutonts in Escbercbo col
is superoxide dimutose necesory Ior oero-
bic liIe EMO 1 18;5.23-30.
Toblo 1. Descripcin de los coroctersticos genticos y los Ienotipos que se veriIicoron de los cepos de E. col K12
utilizodos en este trobo|o.
Cepo Genotipo Fenotipo* keIerencio
W3110 trpC F
-
, trpC, mcrA, mcr8 n (rrnD-r
,
rnE} Mo crece en ousencio de triptIono
XL-1 lue
(F
,

proA8 locl
q
ZMJ5, Tn10} endA
J
, bsdk
J7
(r
k
-
,
m
k
+
}, supE
44
, tb-J,
-
, recA
J
, g,rA

, relA
J
,
Mo crece en ousencio de tiomino. Mo degrodo
lo loctoso
4
GC3 (F

proA8 locl
q
ZMJ5 } donJ3::Tn (loc-proA8}
Mo degrodo lo loctoso y es resistente ol
cloroIenicol
11
LE32
F
-
, bsdk
20
(r
KJ2
-
, m
KJ2
+
}, supE, supF, locY, golK
2
,
met8
J
, trpk, tonA
Mo crece en ousencio de metionino. Mo
degrodo lo loctoso, ni lo goloctoso
10
MC101
F
-
, oroD
J3
, (oro-leu}
7
, golE
J5
, golK
J
,
(loc}
74,
, rpsL, bsdk
2
, mcrA, mcr8
J

Mo crece en ousencio de leucino. Mo degrodo
lo loctoso, lo goloctoso, ni lo orobinoso y es
resistente o lo estreptomicino
4
kk
F
-
, bsdS
20
(r
8
-
, m
8
-
}, oroJ4, proA
2
, locY
J
, golK
2
,
rpsL
20
, x,l5, mtlJ, supE
44
, mcrA
+
, mcr8
-

Mo crece en ousencio de leucino y prolino. Mo
degrodo lo loctoso, orobinoso, goloctoso,
xyloso y monitol y es resistente o lo
estreptomicino
4
H101
F
-
, bsdS
20
(r
8
-
, m
8
-
}, recA
J3
, oroJ4, proA
2
, locY
J
,
golK
2
, rpsL
20
, x,l5, mtlJ, supE
44
, mcrA
+
, mcr8
-

Mo crece en ousencio de leucino y prolino. Mo
degrodo lo loctoso, orobinoso, goloctoso,
xyloso y monitol y es resistente o lo
estreptomicino
4
1M101
(F troD
3
proA8 loclqZMJ5} (loc, proA8}, tb,,
supE
Mo crece en ousencio de tiomino. Mo degrodo
lo loctoso
10
*Fenotipo veriIicoble por crecimiento en plocos que contienen medios ogorizodos.
Diliono C Frez keytor y cols. Evoluocin del mtodo trozo de lo dilucin
8otecnologio Aplcodo 2002, vol.J, Nos. 3 , 4 171
mezcla se dispens en volmenes de 1 mL en viales de
2 mL y se conserv a -70 C hasta su uso.
VeriIicocin de lo viobilidod por el mtodo
de extensin en ploco
De los bancos de trabajo de todas las cepas se hicie-
ron diluciones seriadas desde 10
-1
hasta 10
-6
en solu-
cin salina (NaCl 0,9%), se tomaron 100 L de cada
dilucin. Las diluciones 10
-3
, 10
-4
, 10
-5
y 10
-6
se sem-
braron en placas con ATS y se diseminaron con una
esptula de drygalsky hasta que se secaron. Las pla-
cas se incubaron a 37 C durante 18 h, despus de
este tiempo las colonias se contaron. El nmero de
viables se defini como la media de las ufc contadas
en cada placa multiplicado por 10 por la dilucin y
se expresaron en ufc/mL
Este chequeo se realiz de rutina cada seis meses a
todas las cepas de la coleccin para evaluar su estabi-
lidad a la conservacin en tiempo real.
VeriIicocin de lo viobilidod por el mtodo
de Miles y Misro
Para la verificacin de la viabilidad se utiliz el mto-
do descrito por Miles y Misra [6]. De los bancos de
trabajo de todas las cepas se hicieron diluciones
seriadas desde 10
-1
hasta 10
-6
con solucin salina (NaCl
0,9%). Con una pipeta Pasteur se aplic una gota de
cada dilucin sobre la superficie del medio LB. En
cada placa se aplicaron 4 diluciones. Las placas se
secaron y se incubaron a 37 C durante 18 h, despus
de este tiempo las colonias se contaron.
VeriIicocin de lo viobilidod por el mtodo
de lo trozo de lo dilucin
Para la verificacin de la viabilidad se utiliz el mto-
do descrito por Jett y colaboradores [5] con las modi-
ficaciones hechas en el laboratorio del CIGB.
Para la siembra, el tipo de placa empleado por los
autores de este trabajo fueron redondas de 100 mm de
dimetro en lugar de las placas Falcon
R
Integrid
TM
100-15 mm con 13 mm (Becton Dickinson Labware.
Bedford. MA, EE.UU.) utilizada por los autores que
describieron el mtodo.
De la dilucin de 10
-6
se aplicaron 10 L seis veces
en una placa de medio ATS; despus de gotear la pla-
ca, se inclin en un ngulo de 90 de forma que la gota
corri verticalmente hasta el otro extremo. Las placas
se secaron y se incubaron a 37 C durante 18 h, des-
pus de este tiempo las colonias se contaron. El n-
mero de viables se defini como las ufc contadas en
cada traza multiplicado por 100 por la dilucin y se
expresaron en ufc/mL.
VeriIicocin de Ienotipos de vos sintticos,
degrodotivos y resistencio o ontibiticos
De los bancos de trabajo de todas las cepas se hicieron
diluciones seriadas de 10
-1
hasta 10
-6
en solucin salina
(NaCl 0,9%) y se sembraron por el mtodo traza de la
dilucin en el medio LB con la adicin de cloranfenicol
o estreptomicina a 25 g/mL y medio M9 [4] que con-
tiene, en el caso de los chequeos auxotrficos, glucosa a
una concentracin de 0,2% y metionina, leucina, prolina,
tiamina o triptfano a una concentracin de 25 g/mL.
Para el chequeo de los marcadores catablicos se utiliz
el medio M9 con los aminocidos anteriores segn la
cepa a verificar y galactosa, arabinosa, xilosa o manitol
a una concentracin final de 0,2%. Los medios disea-
dos para cada chequeo y las cepas sembradas en cada
medio se describen en la Tabla 2.
Todos los experimentos se replicaron tres veces.
Se evaluaron los mtodos de Miles y Misra y el de
la traza de la dilucin y se compararon con el conven-
cional de extensin en placa.
Frocesomiento de los dotos
Para la comparacin estadstica de los datos, viabili-
dad y fenotipo de los mutantes, expresados en ufc/mL
y obtenidos por los tres mtodos de siembra, se utili-
z la prueba t de student.
kesultodos y Discusin
La verificacin de la estabilidad en tiempo real de los
bancos de cepas es parte del control de calidad de toda
coleccin. Los mtodos, la frecuencia de las verifica-
ciones y los criterios que se siguen dependen de los
objetivos de cada laboratorio.
Por lo general, una consideracin importante es que,
los diferentes mtodos de siembra descritos en la litera-
tura para el conteo de microorganismos son empleados
en el control de calidad aplicado a diferentes materiales
como alimentos, cosmticos, medicamentos o residuales
[4, 7, 8]. En todos estos casos el nmero de microorga-
nismos aerobios contables est por debajo de 10
6
ufc/mL.
Este no es el caso que se presenta en la verificacin de
bancos de cepas donde la concentracin celular puede
estar entre 10
8
y 10
10
ufc/mL. De esta manera es que de
los mtodos simplificados para la siembra de microor-
ganismos los ms factibles a utilizar en la evaluacin de
la calidad de bancos (10
9
ufc/mL) son el mtodo descri-
to por Miles y Misra en 1938 [6] y el descrito por Jett
y colaboradores en 1997 [5].
La aplicacin del mtodo descrito por Miles y Misra,
citado arriba, debido a la forma de inoculacin sola-
mente fue posible sembrar cuatro diluciones por pla-
ca, como ya se ha planteado, y el aislamiento de las
colonias fue mucho menor que cuando se utiliz cual-
quiera de las otras tcnicas comparadas. Esto dificult
el conteo debido a la agrupacin de las colonias.
La aplicacin del mtodo traza de la dilucin dio
mejores resultados, no obstante que se emplearon
las placas petri de 100 mm de dimetro las cuales
Toblo 2. Medios de cultivo poro lo veriIicocin Ienotpico y cepos sembrodos.
Medio* Cepos
M+glu W3110 trpC, XL-1 lue, GC3, LE32, MC101, kk, H101 y 1M101
M+glu+trp W3110 trpC, MC 101
M+glu+thi GC3, XL-1 lue y 1M101
M+glu+met GC3, LE32
M+glu+pro GC3, kk y H101
M+glu+pro+leu GC3, MC101, kk y H101
M+gol +met GC3 y LE32
M+gol+pro+leu GC3, MC101, kk y H101
M+oro+pro+leu GC3, MC101, kk y H101
M+xil+pro+leu GC3, kk y H101
M+mtl+pro+leu GC3, kk y H101
Agor McConkey W3110 trpC, XL-1 lue, GC3, LE32, MC101, kk, H101 y 1M101
L+Cm W3110 trpC y GC3
L+ Str W3110 trpC, MC101, kk y H101
*Glucoso (glu}, triptIono (trp}, tiomino (thi}, metionino (met}, prolino (pro}, goloctoso (gol}, orobinoso (oro},
xiloso (xil}, monitol (mtl}, cloroIenicol (com}, estreptoquinoso (str}.
Diliono C Frez keytor y cols. Evoluocin del mtodo trozo de lo dilucin
8otecnologio Aplcodo 2002, vol.J, Nos. 3 , 4 172
son comunes en todos los laboratorios de microbio-
loga. La Figura compara la distribucin de ufc/mL
en placas con medio LB sembradas con la cepa
W3110 por los mtodos traza de la dilucin y de
extensin en placa. Se aprecia el mayor nmero de
diluciones que se pueden aplicar por placa y los
mejores resultados obtenidos con relacin al mtodo
de siembra convencional.
En cuanto a la viabilidad de los bancos, con este
mtodo, se encontr una mayor homogeneidad entre
las rplicas en todos los casos (Tabla 3).
Los criterios de estabilidad a la conservacin ms
frecuentes son la verificacin de la viabilidad y del
fenotipo de los mutantes. En este ltimo aspecto,
los diferentes mutantes expresan su fenotipo por la
capacidad de crecer o no en un medio de cultivo
determinado.
Como primera etapa se analiz el genotipo de
ocho mutantes de E. coli K12 de forma que se pu-
diera sembrar en un mismo tipo de placa ms de una
cepa (Tabla 2). De esta manera se planifica mejor la
preparacin de medios y soluciones a emplear por
grupo de cepas a verificar.
Debido a esto, el nmero de placas de cada chequeo
depende del nmero de caractersticas fenotpicas a
chequear ms que de la cantidad de cepas.
Por cada mutacin descrita en el genotipo se re-
quieren al menos dos tipos diferentes de medios
indicadores y tres rplicas por cada uno lo que repre-
senta un total de seis placas.
Otro aspecto a tener en cuenta antes de aplicar cual-
quier mtodo de conteo de viables es que la verifica-
cin de mutantes depende mucho de la pureza de la
muestra. Para mutantes auxotrficos la contaminacin
puede interpretarse como un crecimiento positivo
sobre un medio mnimo y por tanto puede dar un
criterio falso de rechazo o de aceptacin de un banco.
Debido a esto existe consenso en el criterio de que
mientras mayor sea el aislamiento de las colonias ma-
yor ser la probabilidad de observar contaminacin.
Esto hace que se requieran un gran nmero de placas
por cepas para cada chequeo.
En la aplicacin del mtodo de la traza de la dilucin
al chequeo de mutantes de vas sintticas, degradativas
y de resistencia a antibiticos fue posible verificar ocho
cepas de forma simultnea en un mismo experimento y
se consumieron slo quince placas.
No se encontraron diferencias significativas
(P>0,23) entre los tres mtodos de siembra compara-
dos. Sin embargo, se obtuvieron variaciones de la
varianza intra prueba mayores con el mtodo descrito
por Miles y Misra [6] que para los otros dos mtodos
cuando la concentracin de ufc est en el rango de 10
2
,
lo cual es explicable por la pequea rea donde se
aplica la muestra.
Si bien la concentracin de ufc/mL fue igual por los
tres mtodos, debido a la mayor dificultad en el conteo
de las colonias como a la mayor variabilidad de los
resultados, hicieron que el mtodo de Miles y Misra
se descartara en primera instancia.
En general, la aplicacin del mtodo traza de la
dilucin adems de disminuir la complejidad del che-
queo, aument la homogeneidad de las rplicas y sim-
plific el conteo de las colonias. Permiti tambin
tener un criterio sobre los contaminantes que no se

A
1
2
3
4
5

Figuro. Distribucin de unidodes Iormodoros de colonios en dos plocos de medio L resultodo de lo oplicocin de los mtodos de
trozo de lo dilucin (A} diluciones 1} 10
-2
, 2} 10
-3
, 3} 10
-4
, 4} 10
-5
, 5} 10
-
y } 10
-7
y de extensin en ploco (} dilucin 10
-
.

Toblo 3. kesultodos de lo viobilidod de ocho boncos de trobo|o de cepos de E. col K12

medionte el mtodo trozo de lo dilucin.

W3110 trpC XL-1 lue GC 3 LE32 MC101 kk H101 1M101

82 2 30 48 37 2 2

77 30 23 47 30 44 71

82 13 25 27 55 2 33 72

71 12 24 23 58 28 27 1

71 11 22 2 4 25 18 83

8 11 31 2 51 20 2 7
Medio
78,7 10,83 2,83 2,83 50,83 27,7 2,50 7,33
DS
7,0 1,0 3, 3,13 4,7 5,8 8,4 10,82



Diliono C Frez keytor y cols. Evoluocin del mtodo trozo de lo dilucin
8otecnologio Aplcodo 2002, vol.J, Nos. 3 , 4 173
observaban en los chequeos de pureza, lo cual es un
resultado no esperado.
Generalmente, para la verificacin de bancos de
microorganismos se define un rango de dilucin donde
las colonias pueden ser contadas (en el caso de ban-
cos de E. coli 10
-5
a 10
-7
). A pesar de que en las
diluciones desde 10
-5
a 10
-7
no se observaron diferen-
cias en la morfologa de las colonias cuando se utili-
z el mtodo de siembra tradicional, en algunos
bancos se observ la presencia de contaminantes en
la dilucin de 10
-3
al utilizar el mtodo traza de la
dilucin.
Esto puede deberse a que en diluciones menores, la
produccin de cido por la E. coli debido al metabolis-
mo de la glucosa, inhibe el crecimiento de otras bacte-
rias contaminantes en el cultivo.
La posibilidad de que la contaminacin proviniera de
las soluciones o los materiales utilizados se descart
por verificacin de pureza de los mismos. No se des-
cart la posibilidad de revertantes en algunas cepas.
El mtodo traza de la dilucin permiti aumentar el
nmero de rplicas y es adecuado para la verificacin
de la homogeneidad de los bancos de microorganismos
ya que admite de seis a ocho inculos de diferentes
lotes de cultivo sobre una misma placa.
Se puede concluir que la aplicacin del mtodo traza
de la dilucin tiene ventajas adicionales a las de costo y
simplicidad en el caso de la verificacin de cepas.
El mtodo permiti una mejor caracterizacin de
los bancos, con menor tiempo de trabajo. Disminuy,
adems, la variabilidad entre experimentos en los che-
queos de homogeneidad al eliminar la heterogeneidad
proveniente del uso de placas diferentes para cada vial
ensayado. Esto evit el rechazo de bancos por errores
de manipulacin al dar un criterio diferencial entre
rechazo y repeticin de prueba.
kecbdo en dcembre del 200J. Aprobodo
en ogosto del 2002.
-BI -BI
5 + 1 - 6 1 ) - 5 + 1 - 6 1 ) -
CLItvcs tiaisgeiccs.
IecIcs yHesaIIcs
.1Jx11t.ss+1
CLItvcs tiaisgeiccs.
IecIcs yHesaIIcs
Alhert Suvvon
1+s 1+c+x1+s ._11x+1.s x+1s111+x1 1. 1.sx cx 1. .11:x11.x1+1 cx1 1+:11x 1+s .11:.1xs +x xs1x x:1x.
x1 1x1x11x1+ 1+1+. 11 s+1_1:1x11+ cx 1. 11_x11x11. _x1x11x. 1111+c+]+ 1. +s11111c.c
cx :.11+1.1 x+.11c.cxs cx 1.s 1.11.s cx +1. :.1x1. :.s .sx+111x .1. 1+c+s 1+s .1sxs x+1 +1
+1x1x1.1 1x.1:x11x 11s+sxx1.11x. 1. +11x1x1+1 cx 1.11.s 11.1s_x11x.s x+1 1+x\.s 1+1xc.cxs, .+1+x
xs 1.x1111x xx+1+:1x.:x11x, 1xsx11. c1\x1s+s 11xs_+s 11x1x 1:11x.x1+1xs x11x.s
cx 1x_+1.x1+1 +x cx1x1 sx1 .1.11..c.s x+1 x.+1x1..
.11x11 c.ss+1 .1+1c. .:11.:x11x, x+1 111+1:.x1+1 .x1+.11..c., 1.s xsxx1xs cx 1.11.s +x 1.1s1c+
:+c111x.c.s _x1x11x.:x11x 1.s 1x1cx1x1.s x1 xs1x x.:+, s+ x+11111+x1+1 .1 :x1x.c+ 111x11.x1+1.1
1+s .sxx1+s cx x1xxx1+1 +111x. cx 1+s 1+c+x1+s ._11x+1.s 11.1s_x11x+s, x1 +1 1111+ cx 1x1_+.]x x1.1+
sx1x111+ +x 11.1. +1 1x:. cx .:11+ cx1.1x 111x11.x1+1.1 x11. .x1+.11c.c. c11 c+c.s, xs1. :+1+_1.11. sx1.
cx _1.1 +1111c.c . 1+c+s 1+s 1+1xs1+1.1xs +x 11.1.].1 x1 x1 sxx1+1 ._1+xx+.11+
. .+x11+s +x 1.1+1.1 x1 1.s x111c.cxs 1x_+1.c+1.s +x \x1.1 +1 1. x+1sx1\.x1+1 cx 1. c1\x1s1c.c
11+1+_1x. x>1s1x11x.
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