PRCTICA INTEGRADORA Inoculacin de Lactobacillus casei en gelatina de mamey METODOLOGA GENERAL ETAPA 1- Obtencin del microorganismo a partir del

Yakult a) Aislamiento 1. Hacer 6 microdiluciones 1/10, 1/100, 1/1000, 1/10,000, 1/100,000 (Tubos eppendorf) con 900l de diluyente (agua peptona 0.1%) y 100l de Yakult. 2. Hacer siembra por extensin (6 placas) con agar LS- Diferencial. Agregar 100l de cada dilucin. 3. Llevar a incubacin a 35 C por 3 das en condiciones de aerobiosis. ETAPA 2- Purificacin del microorganismo, preparacin medios de cultivo e identificacin. b) Purificacin por estras

1. Se prepara medio de cultivo MRS (Man, Rogosa y Sharpe). 2. Se vuelca en caja de Petri y se deja solidificar. 3. Con el asa previamente esterilizada se toma material de un cultivo heterogneo y se descarga sobre la superficie del medio formando estras.

c) Identificacin

Tincin de Gram

1. Se extiende una colonia bacteriana sobre un cubreobjetos con una gota de agua y se fija en la llama. 2. Se realiza la tincin con el primer colorante (violeta de genciana) y se deja en contacto 2 minutos. 3. Se lava con agua, eliminando el exceso de colorante. 4. Se aade lugol y se mantiene en contacto durante 1 minuto.

5. Se lava nuevamente con agua y se trata con alcohol-acetona. 6. Posteriormente se aade safranina durante 1 minuto (colorante de contraste). 7. Se seca a calor suave y se procede a la observacin bajo microscopio ptico.

Prueba de catalasa

1. Tomar 0.1 ml de inoculo de la cada microdilucion. 2. Colocarlo en un portaobjetos. 3. Agregar 1 gota de Perxido de hidrogeno (H2O2). 4. Dejar reposar. Si se observa presencia de burbuja se considera prueba positiva.

Prueba de fermentacin de carbohidratos

1. Se prepara 10 ml de base rojo de fenol con carbohidratos (lactosa, sacarosa, dextrosa, manitol) en tubos de ensaye con campanas Durham. 2. Se incubaran con un asa en condiciones estriles dentro de la campana de extraccin. 3. Se incubaran durante 24 horas a 37C. ETAPA 3- Conservacin del microorganismo d) Congelacin 1. Se toma una colonia pura de cada microorganismo y se siembra en un tubo con 5 ml de caldo MRS, se incuban a 37 C a 150 rpm por 24 horas. 2. Despus de la incubacin tomar 1 ml de la suspensin del microorganismo y depositarlo en un tubo Eppendorf estril. 3. Posteriormente centrifugar a 10,000 rpm, por 10 minutos a 4C. 4. Decantar (conservar el precipitado) y aadir 1 ml de caldo MRS con glicerol al 20%. 5. Homogenizar en un vortex y etiquetar. 6. Conservar en congelacin a -20C.

ETAPA 4- Cintica de crecimiento y cuantificacin del microorganismo e) Mtodo de Miles and Misra 1. Preparar una solucin madre de 10% de muestra con agua peptonada al 0.1 % 2. Mantener en agitacin durante 45 minutos 3. Preparar diluciones seriadas de 1/10, 1/ 100, 1/ 1.000, 1/ 10.000 y 1/ 100.000 de la suspensin anterior respetando un volumen final de 5 ml. 4. Se rotulan 6 placas y se dividen en sectores numerados. 5. La dilucin se coloca en forma de gotas (0.02ml) desde una altura de 2.5 cm; sta se dispersar aproximadamente en un rea de 1.5 a 2.0 cm de dimetro. 6. Cada una de las 6 placas tendr una gota de cada dilucin en el sector correspondiente (numerado) 7. Se incubaran durante un periodo de 18-24 horas. Posteriormente, se observa su crecimiento.

f) Conteo directo con la cmara de Neubauer

1. Se coloca sobre la cmara de Neubauer el cubreobjetos, cubriendo las dos cmaras de conteo. 2. Con la ayuda de la micropipeta de 10L, se coloca la muestra del cultivo entre la cmara y el cubreobjetos. 3. Se enfoca con el objetivo de 40X y se contabilizan las clulas que se observaron en toda la cuadricula central, la cual a su vez se encontraba subdividida en 25 cuadros, cada uno dividido en 16 cuadros. 4. Calcular el nmero de clulas totales por ml de cultivo. 5. Se retira el cubreobjetos 6. Se limpia la cmara con cuidado para evitar rayar la superficie.

ETAPA 4- Preparacin de las gelatinas con el microorganismo Jugo de Mamey

1. Extraer el jugo de mamey y colarlo. 2. Tratamiento trmico 90 C, 30 min. Inculo de L. casei 1. Preparar el inculo de L. casei 2. Utilizar la escala de Mc Farland para obtener 1 x 109 UFC/L jugo de mamey. Grenetina 1. Hidratar la grenetina durante 15 minutos 2. Adicionar el azcar al 12% y el agua. 3. Esterilizar la mezcla a 120 C durante 15 minutos. 4. Enfriar la mezcla. Gelatina 1. Se prepararan 6 gelatinas por triplicado cada una con las siguientes concentraciones: 15, 30, 45, 60, 75 y 90 %. 2. Agregar el jugo de mamey (40 C) a la grenetina antes hidratada. 3. Adicionar el inoculo (30 C). 4. Mezclar y refrigerar las gelatinas durante 3 das a 5 C. ETAPA 5- Activacin y viabilidad de las gelatinas 1. Se toma 1 g de gelatina de las diferentes formulaciones de jugo de mamey y se adicionaron 9 ml de agua peptonada al 0.1%. 2. Homogeneizar con ayuda del vortex. 3. Se toma una alcuota de 0.5 ml que se transfiri a un tubo con 4.5 ml de agua peptonada al 0.1%. 4. Se realizaron diluciones decimales hasta 10-6 5. De cada dilucin se toma 0.1 ml y se inoculan en placas de agar MRS, se incuban a 35 C durante 48 horas y se cuentan las cajas que tienen entre 25-250. Los

resultados se informan como UFC/g de gelatina de Mamey.

ANEXOS Medio de cultivo agar LS Differential Frmula (en gramos por litro) Agar Extracto de carne Hidrolizado de casena enzimtica Hidrocloruro de L-cistena Dextrosa Papaico digesto de harina de soja Cloruro de sodio Extracto de levadura pH final: 6.1 0.2 (25C) 5 5 0.3 20 5 15 5 10

Medio de cultivo MRS Se preparara el medio agar MRS con las siguientes caractersticas: Frmula (en gramos por litro) Proteosa peptona N 3 Extracto de carne Extracto de levadura Glucosa Monoleato de sorbitn Fosfato dipotsico Acetato de sodio Citrato de amonio Sulfato de magnesio Sulfato de manganeso 10.0 8.0 4.0 20.0 1 mL 2.0 5.0 2.0 0.2 0.05

Agar pH final: 6.4 0.2

13.0

Preparacin del agar: Se pesan cada uno de los ingredientes de la frmula para preparar 1 L de caldo MRS, se agregan 15g de agar bacteriolgico y se diluyen en un 990 mL de agua destilada. La mezcla se esteriliza a 110 C durante 10 minutos. Se deja enfriar a 45-50 C, se mezcla y se vaca en cajas petri estriles. Escala de macfarland. Relacin entre precipitacin qumica y turbidez de concentracin de microrganismos. Se necesitaran 10 tubos de ensaye con capacidad para 10 mL en total y se leern absorbancias a 580 nm, las soluciones de cloruro de vario y de cido sulfrico debe ser al 1 % p/v o v/v segn sea el caso del reactivo. Tubo 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 BaCl2 (mL) 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1 H2SO4 (mL) 9.9 9.8 9.7 9.6 9.5 9.4 9.3 9.2 9.1 9 UFC/mL 3.0x108 6.0x108 9.0x108 1.2x109 1.5x109 1.8x109 2.1x109 2.4x109 2.7x109 3.0x109