LABORATORIO DE BIOTECNOLOGA MOLECULAR

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PRCTICA No. 8 DETERMINACIN DE LA CONCENTRACIN DE PROTENAS

OBJETIVO Realizar una curva estndar y determinar la concentracin de protena de muestras problema. FUNDAMENTO TERICO

Mtodo de Lowry. Es una tcnica ampliamente conocida y empleada para la determinacin de la concentracin de protenas. Es un mtodo colorimtrico de valoracin cuantitativa, la cual consta de dos reacciones:

A) En un medio alcalino, los iones cobre, se unen a la protenas formando complejos con los tomos de nitrgeno de los enlaces peptdicos. A este complejo se le conoce como cromforo de Biuret y es comnmente estabilizado por la adicin de tartrato. El complejo provoca el desdoblamiento de la estructura tridimensional de la protena, exponindose los residuos fenlicos de tirosina y triptfano que participarn en la segunda etapa de la reaccin (Figura 1). B) La segunda reaccin es la reduccin del reactivo Folin-Ciocalteu

(fosfomolibdato y fosfotungstato), principalmente por el complejo cobre-protena reducido as como por los residuos de tirosina y triptfano. El reactivo Folin-Ciocalteu presenta una coloracin amarilla y al ser reducido cambia a una coloracin azul, de esta manera puede medirse en un espectrofotmetro en el rango de 500 a 750 nm. La sensibilidad puede ser incrementada leyendo las muestras a 750 nm.

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LABORATORIO DE BIOTECNOLOGA MOLECULAR El ensayo es lineal en el rango de 1 a 100 g de protena. La intensidad de color ser proporcional a la concentracin de protenas, segn la ley de Lambert-Beer A= E.l.c

Figura 1. Reacciones que se llevan a cabo en el mtodo de Lowry (en presencia de cobre y con el reactivo de Folin).

Mtodo de Bradford.

El reactivo Bradford (Brilliant Blue G en cido fosfrico y metanol), es usado para determinar la concentracin de protenas en solucin. El procedimiento se basa en la formacin de un complejo entre el colorante Brilliant Blue G, y las protenas en solucin. El complejo formado causa un cambio en la absorcin mxima del colorante de 465 a 595 nm. La cantidad de absorcin es proporcional a la cantidad de protena presente.

Los agentes reductores a menudo son utilizados para estabilizar protenas en solucin. El reactivo Bradford es compatible con dichos agentes a diferencia del ensayo Lowry; por lo que el mtodo Bradford puede ser utilizado si la muestra a analizar los presenta. Una desventaja del uso del reactivo Bradford, es que slo es compatible con bajas concentraciones de detergentes.

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REACTIVOS (por equipo)* 1.- NaOH 1 N (4 ml) RL 2.- Na2CO3 al 2% (40 ml) RL 3.- CuSO4 al 0.5% en citrato de sodio al 1% (1 ml) RL 4.- Reactivo de Folin-Ciocalteau (2 ml) RL 5.- Agua destilada (50 ml) 6.- Stock de albmina (1 mg/mL) (500 l) 7.- Reactivo de Bradford (12 ml)

MATERIAL (por equipo) 1.- Ocho tubos de ensayo con tapn 2.- Gradillas para tubos de vidrio 3.- Pipeta serolgica de 5 mL 4.- Pipeteador 5.- Probeta de 100 ml 6.- Vaso de precipitado 250 mL 7.- Dos vasos de precipitado 100 mL 8.- Espectrofotmetro 9.- Diez celdas para espectrofotmetro 10.- Vortex 11.- Puntas de 2-20l, de 20-200l y de 100-1000l 12.- Micropipetas de 2-20l, de 20-200l y de 100-1000l

RL: Reactivo para Lowry * La mitad de los equipos del grupo, realizarn la metodologa de Bradford y el resto la metodologa de Lowry.

13.- Mquina de hielo PRENDIDA (por grupo) 14.- Hielera

METODOLOGA Cada equipo realizar: Un blanco Una curva estndar de albmina Determinacin de la concentracin de protenas de una muestra problema por triplicado.

Los tres puntos arriba mencionados se realizarn al mismo tiempo.

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LABORATORIO DE BIOTECNOLOGA MOLECULAR Mtodo de Lowry: 1.- En un tubo de ensaye adicionar el volumen indicado de muestra (albmina o muestra problema) (ver Tabla 1). 2.- Agregar 500 L de NaOH 1 N + agua destilada cbp 1 ml. Dejar a temperatura ambiente (protenas solubles, mnimo 0.5 h y protena membranal, mnimo 6 h). 3.- Adicionar 5 ml del reactivo C (49 ml de Na2CO3 al 2% + 1 ml de CuSO4 al 0.5 % en citrato de sodio al 1 %). 4.- Dejar 10 minutos a temperatura ambiente. 5.- Agregar 0.5 ml del reactivo de Folin (1 ml de Folin + 1ml de agua destilada). Agitar en vortex inmediatamente por 20 segundos. 6.- Dejar 20 minutos a temperatura ambiente. 7.- Leer a 750 nm (utilizando su correspondiente blanco).

Tabla 1. Volmenes a emplear para el ensayo de Lowry.

Nm. de tubo 1 2 3 4 5 6 Tipo de tubo Muestra problema Stock de albmina (1mg/ml) Blanco Curva de albmina Curva de albmina Curva de albmina Curva de albmina Muestra problema (repeticin 1) Muestra problema (repeticin 2) Muestra problema (repeticin 3) 50 l 20 l 40 l 80 l 120 l 500 l 500 l 500 l 500 l 500 l 500 l 500 l 480 l 460 l 420 l 380 l 450 l 5 ml 5 ml 5 ml 5 ml 5 ml 5 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml NaOH Agua destilada Reactivo C Folin diludo Abs. 750 nm

50 l

500 l

450 l

5 ml

0.5 ml

50 l

500 l

450 l

5 ml

0.5 ml

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Mtodo de Bradford: 1.- Mezclar gentilmente el reactivo de Bradford. 2.- En un tubo de ensaye adicionar el volumen indicado de muestra (albmina o muestra problema) y de Reactivo Bradford (ver Tabla 2). 3.- Incubar a temperatura ambiente de 5-45 min. 4.- Transferir las muestras a celdas limpias. 5.- Medir la absorbancia a 595 nm (utilizando su correspondiente blanco). Las muestras deben ser ledas hasta un mximo de 1 h. Con intervalos mximos de 10 minutos entre muestra.

Tabla 2. Volmenes a emplear en el ensayo de Bradford.

Nm. de tubo 1 2 3 4 5 Tipo de tubo Muestra problema Stock de albmina (1mg/ml) Blanco Curva de albmina Curva de albmina Curva de albmina Muestra problema (repeticin 1) Muestra problema (repeticin 2) Muestra problema (repeticin 3) 50 l 12.5 l 25 l 50 l 50 l 37.5 l 25 l 1.5 ml 1.5 ml 1.5 ml 1.5 ml 1.5 ml Agua destilada Reactivo de Bradford Abs. 595 nm

50 l

1.5 ml

50 l

1.5 ml

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RESULTADOS Para el mtodo de Lowry: Graficar la absorbancia contra la cantidad de protena de la curva estndar de albmina, obtener el factor de correlacin y la ecuacin del grfico. Determinar la concentracin de protenas de la muestra problema expresada en mg/ml. Para el mtodo de Bradford: Graficar la absorbancia contra la concentracin de protena de la curva estndar de albmina, obtener el factor de correlacin y la ecuacin del grfico. Determinar la concentracin de protenas de la muestra problema expresada en mg/ml. ANLISIS Y DISCUSION Analizar y discutir sus resultados con base a lo obtenido en la prctica y a la bibliografa consultada.

CONCLUSIONES Con los resultados obtenidos, el anlisis, la discusin, los objetivos y la bibliografa consultada, dar las conclusiones de la prctica.

CUESTIONARIO 1.- Menciona que rango de concentracin de protenas puedes detectar en el mtodo de Lowry, si la muestra se lee a una longitud de onda de 500, 660 y 750 nm. 2.- Menciona ventajas y desventajas en el uso del mtodo de Lowry. 3.- Escribe el fundamento del mtodo del cido bicinconnico (BCA) utilizado en la determinacin de la concentracin de protenas. 4.- Menciona que compuestos pueden interferir en el ensayo de Lowry y en el ensayo de Bradford.

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REFERENCIAS Bradley O. y Markwell, J. (2007). Current Protocols in Protein Science. Unit 3.4.1-3.4.29 Detection and Assay Methods. John Wiley &Sons, Inc. Fernndez, E. y Galvn, A. Mtodos para la cuantificacin de protenas. Departamento de Bioqumica y Biologa Molecular, Campus Universitario de Rabanales, Edificio Severo Ochoa, 14071-Crdoba. http://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/Bulletin/b6916bul.pdf Lowry, O.; Rosebrough, N.; Farr, A. y Randall, R. (1951). Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 193, 265-275. Smith, J. (1982). Plant constituents interfering with the Lowry method of protein determination. Proc. Okla. Acad. Sci. 62, 80-83.

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