Red de Revistas Cientficas de Amrica Latina, el Caribe, Espaa y Portugal

Sistema de Informacin Cientfica

S. Augusto Hernndez Rivera, Jos Martnez Gndara Aislamiento y caracterizacin de bacterias del gnero Vibrio de aguas contaminadas por hidrocarburos Foresta Veracruzana, vol. 3, nm. 1, enero-agosto, 2001, pp. 17-21, Recursos Genticos Forestales Mxico
Disponible en: http://www.redalyc.org/articulo.oa?id=49730103

Foresta Veracruzana, ISSN (Versin impresa): 1405-7247 lmendizabal@uv.mx Recursos Genticos Forestales Mxico

Cmo citar?

Fascculo completo

Ms informacin del artculo

Pgina de la revista

www.redalyc.org
Proyecto acadmico sin fines de lucro, desarrollado bajo la iniciativa de acceso abierto

Foresta Veracruzana 3(1):17-21. 2001. AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIN DE BACTERIAS DEL GNERO Vibrio DE AGUAS CONTAMINADAS POR HIDROCARBUROS S. Augusto Hernndez Rivera y Jos Martnez Gndara Resumen

17

Se colectaron y analizaron cinco muestras de agua de un rea contaminada por aceites, utilizados por motores de autotransporte, con la finalidad de determinar e identificar bacterias degradadoras de hidrocarburos. Las muestras fueron sembradas en cajas petri con medio Bushnell-Haas enriquecido, previamente esterilizado e incubadas a 30 C por 24 a 48 horas, para obtener crecimiento. Se repiti la operacin hasta por tres veces para obtener la purificacin de las colonias seleccionadas. Una vez crecidas las cepas fueron inoculadas en matraces con 75 ml de caldo de Bushnell-Haas y crecidas en bao de agitacin continua a 120 rpm a 30 C durante 48 horas. Posteriormente se les agreg 3% de hidrocarburo de muestra (aceite de motor previamente usado) y se les regresa al bao de agitacin continua hasta completar 14 das. En todas las muestras se determin la presencia de bacterias del gnero Vibrio. Abstract Water samples of a polluted site with oils from mechanized vehicles were analyzed in order to determine and identifying the presence of native oil degrading bacteria. Samples taken were inoculating in previously sterilized Agar Bushnell-Haas Media plates. Following inoculation, the samples are incubated at 30 C for 24 at 48 hours to observe growth of bacteria. Later, growing bacteria samples were inoculated in 75 ml Bushnell-Haas broth Erlenmeyer flasks in shaker bath at 120 rpm, 30 C for 48 hours. Subsequently, 3% of sample hydrocarbon was aggregate in flasks maintained in shaker bath for 14 days. Bacteria were identify belong to genus Vibrio in all samples.

Palabras clave: Bacterias, Vibrio, hidrocarburos, biodegradacin. Introduccin Durante las ltimas dcadas, los constantes derrames de hidrocarburos tanto en aguas como en suelos, ya sean stos naturales o bien causados por el hombre, han obligado a los investigadores a realizar un esfuerzo extra, para buscar alternativas que ayuden a contrarrestar los efectos nocivos causados por la contaminacin por hidrocarburos (Sirvins & Tramier, 1986). Es sin duda alguna a partir de accidentes como el del Exxon Valdez (Harayama et al., 1999) o del Torrey Canyon (Sirvins & Tramier, op cit.) cuando se manifiesta con urgencia la necesidad de acelerar los trabajos relacionados con el combate a la contaminacin causada por hidrocarburos, sobre todo por las consecuencias desastrosas del impacto sobre la biodiversidad en esas reas, destruyendo gran parte de la flora y fauna marina. De igual manera, derrames tan o ms impresionante que los anteriores fue el del pozo petrolero Ixtoc en 1979, en el Golfo de Mxico, que se mantuvo fuera de control durante un largo periodo, con

consecuencias negativas para el hbitat, derramando aproximadamente 30 000 barriles al da (Weddle, 1999). Numerosos son los trabajos que se han venido realizando en el campo de la biorremediacin, utilizando plantas y microorganismos para el combate a la contaminacin causada por la presencia de metales pesados e hidrocarburos (Biorremediation of Polluted Areas, 1998); as tambin lo demuestran los resultados del uso de microorganismos autctonos de reas que se han visto contaminadas por hidrocarburos y que han podido sobrevivir a esa situacin, demostrando capacidad para biodegradar hidrocarburos de cadenas largas (Bouchez et al., 1999), o bien investigaciones que se han realizado con microflora autctona y que se ha sometido a contacto con gasolinas, mostrando capacidad degradativa para un determinado compuesto hidrocarbonado (Solano-Serena et al., 1999). Se ha probado que la microflora que proviene de aguas urbanas sucias muestra capacidad para degradar gasolinas

Investigadores del Instituto de Investigaciones Biolgicas, Universidad Veracruzana. Km 2.5 Carr. Ver-Xal. Xalapa, Ver., Mex. Correo electrnico: arivera@bugs.invest.uv.mx

18

Hernndez y Martnez. Aislamiento y caracterizacin de bacterias del gnero Vibrio de aguas

cuando ha sido utilizada en cultivos lquidos (Solano-Serena et al., op. cit.); algunos investigadores han realizado trabajos utilizando cultivos mixtos de Pseudomonas aeruginosa y Rhodococcus equi obtenindose resultados satisfactorios para la degradacin de cicloalcanos (Ko & Lebeault, 1999). As tambin, se ha logrado conocer la degradacin de hexadecanos por bacterias aisladas de suelos contaminados y no contaminados, pertenecientes a los gneros Corynebacterium, Mycobacterium y Nocardia, que demostraron degradar cadenas largas de alcanos, segn la distribucin relativa de los modos de atacar el hidrocarburo; el primer modo sera tomando gotas del hidrocarburo directamente y en el segundo, la bacteria segrega una sustancia biosurfactante la cual emulsifica el hidrocarburo (Bouchez et al., 1999). Se han logrado aislar bacterias provenientes de sedimentos de la costa atlntica de los Estados Unidos, cuyas poblaciones tienen una diversa actividad metablica. La importancia de estas bacterias es su potencial para la biodegradacin in situ de aguas contaminadas con hidrocarburos (Balkwill et al., 1997) y uno de estos aislados obtenidos de los sedimentos es mencionado por su capacidad para degradar un rango amplio de compuestos aromticos (Fredrickson et al., 1991). El presente trabajo est enfocado a la obtencin, aislamiento, purificacin y caracterizacin de las cepas bacterianas que fueron obtenidas de muestras de agua, contaminadas por hidrocarburos, a travs de diferentes pruebas bioqumicas. Material y Mtodos Se colectaron cinco muestras directamente de un rea contaminada por hidrocarburos (aceite usado de automotores) de aproximadamente 10 m2, localizada en la estacin de Ferrocarriles Nacionales de la ciudad de Xalapa, Veracruz, Mxico. De las muestras colectadas se sembr una alcuota con un asa bacteriolgica en placas de agar Bushnell-Haas, previamente esterilizadas a 121 C durante 15 minutos en autoclave y llevadas a incubacin a 30 C durante 24 horas para comprobar su esterilidad. Despus de sembradas, las placas de agar fueron devueltas a incubacin a 30 C, durante un periodo de 24-48 horas, hasta obtener crecimiento de las cepas inoculadas. Se repiti la operacin hasta por tres veces para obtener la purificacin de las colonias

seleccionadas. Una vez crecidas las muestras, se seleccionaron las diez cepas que se desarrollaron abundantemente y fueron inoculadas en matraces con 75 ml de caldo de Bushnell-Haas y crecidas en bao de agitacin continua a 120 rpm a 30 C durante 48 horas. Posteriormente se les agreg 3% de hidrocarburo de muestra (aceite de motor previamente usado) y se les regresa al bao de agitacin continua hasta completar 14 das. La identificacin de las bacterias se llev a cabo en dos etapas. En la primera, para determinar el grupo al que pertenecen los aislados, fueron sometidos a las siguientes pruebas: a) tincin de gram; b) crecimiento en agar MacConkey; c) prueba de movilidad en medio SIM; d) crecimiento aerbico y anaerbico en tubos de ensayo con medio Hugh-Leifson, con y sin sello de nujol; f) prueba de catalasa, mediante la adicin de 2 gotas de perxido de hidrgeno al 3%; g) prueba de oxidasa, con dihidrocloruro de tetrametil-pdifenilendiamina; h) produccin de acidez en medio gelificado con glucosa; i) prueba de oxidacin/fermentacin (O/F) de carbohidratos con glucosa en base Hugh-Leifson, en tubos de ensayo con y sin sello de nujol. En la segunda etapa se siguieron los criterios de Cowan & Steel (1993) para la identificacin del gnero al que pertenecen las bacterias aplicando las siguientes pruebas: a) crecimiento en agar Hierro-Lisina; b) prueba de indol, mediante la adicin de 2 gotas de reactivo de Kovac; c) crecimiento en carbohidratos utilizando 10 g/l de cada uno de ellos para cada prueba (lactosa, sacarosa, manitol e inositol); d) desarrollo en peptona con cloruro de sodio a diferentes concentraciones que van de 0%, 7% y 11%. Las pruebas anteriores se llevaron a cabo, siguiendo las tcnicas sealadas por el Manual de Bergey (Holt, 1984); Koneman et al. (1988), Joklik et al. (1987) y Brock (1978). Resultados En cuanto a la morfologa, las diez colonias obtenidas presentaron un aspecto liso, de color blanco grisceo de contorno bien definido, de consistencia cremosa, bacilos gram negativos, de forma recta y curvados, realizndose observaciones en crecimiento en caldo en su etapa estacionaria, para determinar, presuntamente, mediante su observacin microscpica y de colonias, su identificacin (Koneman et. al., op.cit.; Brock, op.cit.; Joklik, op.cit.)

Foresta Veracruzana 3(1):17-21. 2001.

19

Las pruebas de tipo bioqumico de la primera etapa, cuyos resultados se muestran en la tabla 1, indican que las diez sepas presentaron crecimiento en Agar MacConkey que es altamente selectivo para bacterias gram negativas. Presentaron movilidad en medio SIM. Fueron aerbicofacultativas, al crecer en Medio Hugh-Leifson con y sin sello de nujol. La prueba de la catalasa fue positiva ya que existi efervescencia al agregarle perxido de hidrgeno a la muestra. Los resultados de oxidasa realizados con dihidrocloruro de tetrametil-p-difenilendiamina resultaron positivos al ennegrecerse la muestra en papel para cada uno de los aislados. En medio gelificado con glucosa,
Tabla 1. Pruebas para determinar grupo bacteriano.

hubo produccin de exudado que vir la coloracin del medio a color amarillo, lo que indica la produccin de cido. De los tubos de ensayo que contenan glucosa en base Hugh-Leifson con y sin sello de nujol, los aislados sembrados por picadura presentaron crecimiento con viraje de coloracin por la produccin de cido especficamente en los tubos de ensayo con sello de nujol, lo que seala la utilizacin de la glucosa por medio de fermentacin de carbohidratos. Estos resultados permiten ubicar a las bacterias como Gram negativas y de la familia Enterobacteriaceae.

CEPAS
PRUEBAS Tincin Gram Forma Crecimiento en agar MacConkey Movilidad Crec. Aerbico Crec. Anaerbico Catalasa Oxidasa Prod. Acid. (Glucosa) Carbohid. Gluc. [ O/F/-]
IIBUV DH-1 IIBUV DH-2 IIBUV DH-3 IIBUV DH-4 IIBUV DH-6 IIBUV DH-8 IIBUV DH-9 IIBUV DH-10 IIBUV DH-11 IIBUV DH-23

R + + + + + + + F

R + + + + + + + F

R + + + + + + + F

R + + + + + + + F

R + + + + + + + F

R + + + + + + + F

R + + + + + + + F

R + + + + + + + F

R + + + + + + + F

R + + + + + + + F

R=Bacilos

O/F/- = Oxidacin/Fermentacin/no reaccin. crecimiento, pero si las sembradas en los medios que tuvieron sacarosa, manitol e inositol. Por lo que se refiere al crecimiento de los aislados bacterianos en peptona con 0% de NaCl, stos presentaron crecimiento abundante; en tanto que las sembradas en peptona enriquecida con NaCl al 7 y 11% no mostraron crecimiento. Estos resultados nos permiten deducir que los aislados bacterianos obtenidos pertenecen al gnero Vibrio, de acuerdo con Koneman et al. (1988).

Los resultados de las pruebas de la segunda etapa indicaron que los aislados sembrados en Agar Hierro-Lisina, presentaron crecimiento con viraje del medio a color amarillo por la alcalinizacin del mismo, debido a la fermentacin inicial de la glucosa, lo que indica que es positiva. La prueba de Indol realizada con el reactivo de Kovac, hizo que hubiese viraje a color rosa, por lo que se considera positiva. En cuanto a las pruebas de carbohidratos realizadas, los aislados de las muestras sembradas en lactosa no presentaron
Tabla 2. Pruebas para la determinacin de gnero.

CEPAS PRUEBAS Agar Hierro-Lisina Indol Crecimiento en: Lactosa Sacarosa Manitol Inositol Peptona (NaCl 0 %) Peptona (NaCl 7 %) Peptona (NaCl 11 %)
IIBUV DH-1 + + + + + + IIBUVD H-2 + + + + + + IIBUVD H-3 + + + + + + IIBUVD H-4 + + + + + + IIBUVD H-6 + + + + + + IIBUVD H-8 + + + + + + IBUV DH-9 + + + + + + IIBUVD H-10 + + + + + + IIBUVD H-11 + + + + + + IIBUVD H-23 + + + + + + -

20

Hernndez y Martnez. Aislamiento y caracterizacin de bacterias del gnero Vibrio de aguas

Discusin Las evidencias obtenidas despus de haber realizado las pruebas mencionadas a las cepas aisladas de las muestras colectadas del rea contaminada con hidrocarburos, permitieron determinar la existencia de microorganismos que se han desarrollado en ese medio, utilizando como fuente de sustrato para su supervivencia el hidrocarburo existente y desarrollando habilidades degradadoras, como ya ha sido demostrado por diversos trabajos entre ellos Harayama et al. (1999), en los que se muestra que estos microorganismos tienen capacidad para atacar posiblemente las cadenas largas de los hidrocarburos, lo que sera coincidente con lo sealado por Bouchez (1999) y confirma los resultados que se han obtenido utilizando cultivos de microorganismos nativos que, al estar en contacto con gasolinas, han demostrado capacidad degradativa de este hidrocarburo (Solano-Serena, 2000), as tambin lo sealan resultados sobre el uso de cultivos mixtos de Pseudomona aeruginosa y Rhodococcus equi que han demostrado, al estar en contacto con hidrocarburos, capacidad para degradar los cicloalcanos (Ko & Lebeault, 1999). Son tambin coincidentes nuestros resultados con la factibilidad que existe de aislar microorganismos de sedimentos que se encuentran en contacto con contaminantes de hidrocarburos y que utilizan como fuente principal de energa este material orgnico, con los obtenidos con cepas del gnero Sphingomonas (Balkwill et al., 1997). Del mismo modo, se ha comprobado que el 20 por ciento de las poblaciones de microorganismos que se encuentran en suelos contaminados por hidrocarburos son capaces de degradarlos. Entre los microorganismos que han sido aislados se encuentran algunos como: Achrobacter, Acinetobacter, Aeromonas, Bacillus, Benekea, Pseudomonas, Vibrio (Britton, 1984). En la bibliografa consultada no se reporta este gnero de bacterias en reas urbanas contaminadas por hidrocarburos en Mxico. Literatura citada BALKWILL, D.L.; DRAKE, G.R.; REEVES, R.H.; FREDRICKSON, J.K.; WHITE, D.C.; RINGELBERG, D.B.; CHANDLER, D.P.; ROMINE, M.F.; KENNEDY, D.W. and SPADONI, C.M. 1997. Taxonomic Study of Aromatic-Degrading Bacteria from DeepTerrestrial-Subsurface Sediments and Description of Sphingomonas aromaticivorans sp. Nov., Sphingomonas subterranea sp. Nov., and Sphingomonas stygia sp nov. International Journal of Systematic Bacteriology Jan. 1997. pp. 191-201. BIORREMEDIATION of Polluted Areas. 1998. pp 13. [En lnea] <http://www.chemistry.about.com.> [Consultado: Noviembre 12, 2000]. BRITTON, L.N. 1984. Microbial degradation of Aliphatic hidrocarbons. In: D. T. Gibson (ed.), Microbial Degradation of Organic Compounds, Marcel Dekker, Inc. New York. pp. 89-129. BOUCHEZ, N.; RAKATOZAFY, M.H.; MARCHAL, R.; LEVEAU, J.Y. and VANDECASTEELE, J.P. 1999. Diversity of bacterial strains degrading hexadecane in relation to the mode of sustrate uptake. J. Applied Microbiology 86(3):421-428. BROCK, T.D. 1978. Biologa de los microorganismos. Edit. Omega, S.A. Barcelona, Espaa. pp 594-602. COWAN, S. T. and STEEL, K.J. 1993. Manual for Identification of Medical Bacteria. Cambridge University Press. Cambridge 3rd. de. G. I. Barrow. 351 p. FREDRICKSON, J. K.; BROCKMAN, F.J.; WORKMAN, D.J.; LI, S.W. and STEVENS, T.O. 1991. Isolation and characterization of a subsurface bacterium capable of growth on toluene, naphthalene, and other aromatic compounds. J. Applied Environmental Microbiology. 57:402-411. HARAYAMA, S.; KISHIRA, H.; KASAI and SHUTSUBO, K. 1999. Petroleum biodegradation in marine environments. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 1(1):63-70. HOLT, J.G. and KRIEG, N.R., (eds.). 1984. Bergeys Manual of Systematic Bacteriology.

Conclusin El conjunto de pruebas realizadas nos permiten determinar que las cepas aisladas se identifican como enterobacterias del gnero Vibrio, no reportadas para Mxico en estas situaciones.

Foresta Veracruzana 3(1):17-21. 2001.

21

Vol. 1, Baltimore, Maryland, U.S.A. Williams and Wilkins, Co. 485 p. JOKLIK, W.K.; WILLET, H.P. and AMOS, D.B. 1987. Zinsser Microbiologa. Edit. Mdica Panamericana, S.A. Buenos Aires, Argentina. pp. 718-727. KONEMAN, E.W.; ALLEN, S.D.; DOWELL, V.R.; JANDA, W.M.; SOMMERS, H.M. and WINN, W.C. 1988. Color Atlas and Textbook of Diagnostic Microbiology. J. B. Lippincott Company, Philadelphia, Pennsylvania, U.S.A. 909 p. KO, S.H. and LEBEAULT, J.M. 1999. Effect of a mixed culture on co-oxidation during the degradation of saturated hydrocarbon mixture. J. Applied Microbiology 87(1):72-79. SIRVINS, A. and TRAMIER, B. 1986. La biodegradacin de los hidrocarburos. Mundo Cientfico 54(6 ):46-54. SOLANO-SERENA, F.; MARCHAL, R.; ROPARS, M.; LEBEAULT, J.M. and VANDECASTEELE, J.P. 1999. Biodegradation of gasoline: Kinetics, mass balance and fate of individual

hydrocarbons. J. 86(6):1008-1016.

Applied

Microbiology

SOLANO-SERENA, F.; MARCHAL, R.; LEBEAULT, J.M. and VANDECASTEELE, J.P. 2000. Selection of microbial populations degrading recalcitrant hydrocarbons of gasoline by monitoring of culture-headspace composition. J. Applied Microbiology 30(1):19-22. WEDDLE, R.S. 1999. Gulf of Mexico. Handbook of Texas Online. The Texas State Historical Association. p. 1-11. [En lnea] <http://www.tsha.utexas.edu/handbook/online/ar ticles/view/GG/rrg7.html> [Consultado: Noviembre 12, 2000].

Recibido en diciembre de 2000 Aceptado en febrero de 2001