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REPUBLIQUE ALGRIENNE DMOCRATIQUE ET POPULAIRE

MINISTERE DE L'ENSEIGNEMENT SUPERIEUR ET DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE



UNIVERSIT MENTOURI CONSTANTINE
FACULT DES SCIENCES Exactes
DPARTEMENT DE CHIMIE

N dordre.
Srie
MEMOI RE

PRESENTE POUR OBTENIR LE DIPLOME DE MAGISTER
EN CHIMIE ORGANIQUE

OPTION
Phytochimie

Investigation phytochimique de la phase n-butanol de
lextrait hydroalcoolique des parties ariennes de
Centaurea parviflora (Compositae).

: Sous la direction du professeur AR P
Mme BELKACEM Souada Mme.

BENAYACHE
Fadila
Epouse MAIMOUR
: Devant le jury
Constantine Univ. Mentouri Prof S. BENAYACHE Prsident
Constantine Univ. Mentouri Prof F. BENAYACHE Rapporteur
Constantine Univ. Mentouri M. C. A. BENTAMENE
Constantine Univ. Mentouri M. C. C. BEHLOUL
Constantine
Univ. Mentouri M. C.
N. BEGHIDJA
Examinateurs
Soutenu en 2009


Ce travail a t ralis au laboratoire de Phytochimie et Analyses Physico-
Chimiques et Biologiques, Universit Mentouri Constantine, sous la direction de Madame
Fadila BENAYACHE, Professeur lUniversit Mentouri Constantine. Jaimerais tout
dabord la remercier pour mavoir accepte dans son groupe, et pour mavoir permis
deffectuer cette thse en acceptant la lourde tche dtre ma directrice. Je la remercie
galement pour ses prcieux conseils en Phytochimie, nos nombreuses discussions
scientifiques, sa collaboration enrichissante, et sa grande patience qui ont permis la
ralisation de ce travail.
Jexprime toute ma gratitude Monsieur Samir BENAYACHE, professeur
lUniversit Mentouri Constantine, pour sa disponibilit et sa comptence qui ont t des
atouts prcieux pour la ralisation de ces travaux. Je le remercie galement pour
lhonneur quil me fait en acceptant de prsider le jury de soutenance.
Je remercie galement messieurs: Ali BENTAMENE, Noureddine BEGHIDJA et
Cherif BEHLOUL, Matres de Confrences lUniversit Mentouri Constantine, davoir
accept de faire partie du jury.
Je remercie vivement madame le professeur A. LOBSTEIN et le docteur M. CHAABI
de la facult de pharmacie de Strasbourg, pour lenregistrement des spectres de RMN du
compos F03.
Jaimerais remercier certaines personnes, trop nombreuses pour les citer, qui nont
pas particip scientifiquement ce travail, mais qui ont partag une grande partie de ma
vie durant ces trois annes : les membres de ma famille pour leur gentillesse, leur soutien
moral et financier.
Je remercie galement mes amis pour mavoir aide dans certaines manipulations et
soutenue par leur sympathie : Zahia, Hanne, Chawki, Ameur, Kaouther, Ouahiba,
Sabrina, El hadj..
J'adresse mes plus sincres remerciements mes frres: Soufiene, Fateh, Bilel,
Islem, mes parents surtout pour leur prsence de tous les instants, pour le soutien qu'ils
m'ont apport, avec toute mon affection et ma reconnaissance sans lesquels je n'aurais

certainement pas pu venir bout de cette thse.

Je remercie galement Messieurs SEGHIRI, BOUHEROUM, BENTAMENE,
Matres de Confrences lUniversit Mentouri Constantine, pour leurs prcieux
conseils.
J'exprime toute ma gratitude mon mari Mohamed, pour sa disponibilit.
Je remercie madame BENSIALI ne CHANDARLI BRAHIM Dalila pour son aide
et ses conseils prcieux, un grand merci pour elle ainsi qu tous ceux qui liront cette thse
et la fairont vivre.
Et finalement, je remercie toutes les personnes que j'aurais malencontreusement oublies
mais qui je tmoigne toute mon affection.












Je ddie ce modeste travail
mes chers parents
mes frres
mes amies
mon fils Zakaria,

pour leur prsence de tous les instants, pour le soutien quils
mont apport, avec toute mon affection et ma reconnaissance.

On ne devrait pas tre oblig de toujours donner les noms, ce quil
faudrait, ce nest pas quuntel a fait ceci, mais quil a t possible de
le faire .
KARL KRAUS.





AcOH Acide actique
MeOH Mthanol
EtOH Ethanol
H
2
O Eau
H
2
SO4 Acide sulfurique
AlCl
3
Chlorure dalimunium
NaOH Hydroxyle de sodium
NaOAc Actate de sodium
H
3
BO
3
Acide borique
HCl Acide chlorhydrique
Ep Ether de ptrole
EtOAc Actate dthyle
CHCl
3
Chloroforme (trichloromthane)
CDCl
3
Chloroforme deutri
MeOH-d
4
Mthanol deutri
CCM Chromatographie sur Couches Minces
R
f
Facteur de Retardement
UV Lumire ultraviolette
SMIE Spectromtrie de Masse en mode Impact Electronique
RMN Rsonance Magntique Nuclaire
13
C Carbone 13
1
H Proton
HMBC Heteronuclear Multiple Bonding Connectivity
HSQC Heteronuclear Single Quantum Coherence
COSY Correlation SpectroscopY
DEPT Distortionless Enhancement by Polarization Transfert
(ppm) Dplacement chimique en parties par millions
J (Hz) Constante de couplage exprime en hertz
s Singulet
d Doublet

dd Doublet de doublets
t Triplet
q Quadruplet
m Multiplet
C Temprature en degrs Celsius
g Gramme
Hz Hertz
mg Milligramme
min Minute
ml Millilitre


Tabledes matires

Table des figures et tableaux et schmas et
spectres.
i
Abrviations utilises ...... iii
Introduction gnrale iv
Introduction .... 1
Chapitre 1 : Les flavonodes
I-1-Gnralits 5
I-2-Dcouverte des flavonodes..
5
I-3-Diversit des composs phnoliques.
5
I-3-1-Dfinition... 5
I-3-2-Nomenclature ..... 6
I-3-3-Sources 7
I-3-4-La distribution dans la nature.
8
I-4-La biosynthse des flavonodes. 8
I-4-1-Importance de la voie mtabolique du shikimate.. 8
I-4-2-La voie de biosynthse des flavonodes. 8
I-5-Les diffrentes types de flavonodes. 11
I-5-1-Les flavonodes glycosyls 13
I-5-1-1 Nature des substituants sucrs 13
I-5-1-2 Nature des gnines...... 16
I-6-La synthse des flavonodes.. 17

I-7-Les activits biologiques des flavonodes et leurs effets sur la sant 18
I-7-1-Les flavonodes et la sant. 18
I-7-2-Activit biologique des flavonodes............. 19
I-8-Propriets des flavonodes. 20
I-8-1-Proprits anti-inflammatoires des flavonodes et effets sur le systme immunitaire.. 20
I-8-2-Proprits antivirale et antibactrienne........................ 21
I-8-3-Biodisponibilit des flavonodes.. 21
Chapitre II :Les mthodes danalyse physico-chimiques danalyse structurale
des flavonodes ..

II -Les mthodes physico-chimiques danalyse structurale des flavonodes.. 23
II-1-Introduction.............................................. 23
II-2-Matriel vgtal .. 23
II-3-Extraction..................... 23
II-4-Sparation chromatographique.. 24
II-4-1-Dfinition.. 24
II-4-2-Chromatographie sur colonne... 24
II-4-2-1-Description et principe.. 24
II-4-3-Chromatographie sur papier. 25
II-4-3-1- Principe de la technique et applications... 25
II-4-3-2-Papier.... 26
II-4-4-Chromatographie sur couche mince. 26

II-4-4-1-Dfinition et appareillage.............................................. 26
II-4-4-2-Principe de la technique.... 27
II-5-Rvlation 27
II-6-Calcul de R
f
(retarding factor ou rapport frontal).... 27
II-7-Filtration et purification sur gel de sephadex LH 20... 28
II-7-1-Sparation par permation selon le poids molculaire. 29
II-8-Les techniques didentification structurale.. 29
II-8-1-Dfinition..................................................................... 29
II-8-2-L a rsonance magntique nuclaire (RMN) 29
II-8-3-La spectroscopie UV-Vis.. 30
II-8-4-Spectre UV-Vis avec addition de ractifs (srie spectrale UV-Vis) 32
II-8-4-1-Spectre en prsence de NaOH....... 32
II-8-4-2-Spectre en prsence de NaOAc ................... 33
II-8-4-3-Spectre en prsence de NaOAc+H
3
BO
3
33
II-8-4-4-Spectre en prsence de AlCl
3
et AlCl
3
+HCl 34
II-8-5-Lhydrolyse acide des htrosides........ 37
II-8-6-La spectromtrie de masse.:.......................................... 37
Chapitre III : Partie exprimentale
III-1-Etude phytochimique de Centaura parviflora 39
III-1-1-Place dans la systmatique.. 39
III-1-2-Description de lespce C-parviflora.............................................. 39

III-2-Travaux antrieurs.. 41
III-3-Travaux personnels. 42
III-3-1-Extraction de Centaura parviflora ............. 42
III-4-Les mthodes de sparation chromatographique 44
III-4-1-Sur papier Wattman..... 44
III-4-2-Sparation par chromatographique sur colonne...... 46
III-4-3-Sparation chromatographique sur plaques prparatives........................ 49
Chapitre IV : Rsultats et Discussions :
IV-Identification structurale des composs
isols..
53
IV-1-Identification structurale du compos F
20-2
. 53
IV-2-Identification structurale du compos F
14-3
..... 60
IV-3-Identification structurale du compos F
12
.... 66
IV-4-Identification structurale du compos F
03
... 71
Conclusion 84
Conclusion gnrale
85
Rfrences Bibliographiques. 86
Rsum
Abstract



Table des figures et tableaux

Liste des Figures

Figure 1 : Voie gnrale des phnylpropanoides.....................................................................2
Figure 2 : Plaque chromatographique lue permettant le calcul de R
f.
..................................28
Figure 3 : Les 2 bandes caractristiques dun squelette flavonique........................................30
Figure 4 : Formation de complexe aprs addition de H
3
BO
3
.................................................33
Figure 5 : Centauria parviflora Desf.....................................................................................40
Figure 6 : Rcapitulatif du protocoledextraction des feuilles deC. parviflora.....................43
Figure 7-1 : Carte phnolique sur papier Wattman de lextrait n-butanol des feuilles . ..........45
Figure 7-2: Chromatogramme sur papier Wattman dans le systme (B. A. W) de lextrait
n-butanol des fleurs45
Figure 7-3: Chromatogramme sur papier Wattman dans le systme acide actique 15% de
lextrait n-butanol des fleurs.46
Figure 7-4 : Chromatogramme de comparaison des extraits n-butanol des feuilles et des fleurs
dans le systme CHCl
3
/ MeOH / H
2
O (6,5 / 4,5 / 1,2) obtenu aprs
rvlation..46
Figure 8 : Rsum des travaux chromatographiques effectus51
Figure9 : Structure partielle du compos F
20-2
.......................................................................55
Figure 10 : Co-chromatographie de la phase aqueuse avec des chantillons de rfrence aprs
hydrolyse acide du composF
20-2
..................................................................................59
Figure 11: Structure finale du compos F20-2, nicotiflorine. ..............................................60
Figure 12 Co-chromatographie de la phase aqueuse avec des chantillons de rfrence aprs
hydrolyse acide du compos F
14-3
..................................................................................64
Figure 13: Structure du compos F14- 3 . 3-(4-O--D-glucopyranosyl-3,5-dimethoxy)-
phenyl-2E-propenol......................................................................................................66
Figure 14 Co-chromatographie de la phase aqueuse avec des chantillons de rfrence aprs
hydrolyse acide du compos F
12
...68
Figure 15: Structure du compos F12 , O--D-arabinofuranosyl thane..............................70
Figure 16: Structure du compos F
03
(aglycone plane) ....75
Figure 17: Structure finale du compos F03 (cornicinine)
769
Liste des Tableaux

Tableau 1:Liste des enzymes conduisant aux diffrentes classes de flavonodes......................9
Tableau 2: Hexoses les plus communs..................................................................................15
Tableau 3 : Quelques activits biologiques des composs phnoliques..................................20
Tableau 4 : Intervalle du maximum dabsorption des bandes I et II dans le MeOH de quelques
types de flavonodes......................................................................................................31
Tableau 5 : Relation entre la couleur de la fluorescence sous la lumire de Wood et les
structures flavoniques...................................................................................................36
Tableau 6 : Rsultats des sries spectrales UV aprs addition de ractifs...............................41

Tableau 7: Flavonodes isols de Centaurea parviflora ........................................................46
Tableau 8 : Les rsultats de la colonne .................................................................................49
Tableau 9: Donnes de la srie spectrale UV (
max
nm) du compos F
20-2
.............................56
Tableau 10: Donnes du spectre de RMN
1
H (MeOH-d
4
, 250 MHz) du compos F
20-2
..........58
Tableau 11: Donnes du spectre de RMN
13
C (MeOH-d
4
, 62,9 MHz) du compos F
14-3
........65
Tableau 12 : Donnes des spectres RMN
1
H (MeOH-d
4
, 250 MHz) du compos F
14-3
...........66
Tableau 13 : Donnes des spectres RMN
1
H (MeOH-d
4
, 250 MHz) et RMN
13
C, squence
12
du compos F ) MHz ,9 62 ,
4
d - MeOH ( mod J
68
Tableau 14 : Donnes du spectre de RMN
13
C (MeOH-d
4
, 75 MHz) du compos F
03
............76
Tableau 15: Donnes du spectre de RMN
1
H (MeOH-d
4
, 300 MHz) du compos F
03
.. .77

Table des schmas et spectres
Liste des schmas

Schma 1 : Flavane .. ...................................................................................................6
Schma 2 : Flavone ...........................................................................................................6
Schma 3 : Structure gnrale des flavonodes........................................................................6
Schma 4 : Mcanisme gnral de biosynthse des flavonodes ...........................................10
Schma 5 :Les diffrents types de flavonodes .....................................................................12
Schma 6 :Structure chimique de deux flavonodes glycosyls. ............................................13
Schma 7 : Classification des glucides ................................................................................14
Schma 8 : Quelques flavonodes glycosyls .......................................................................17
Schma 9 : La rtro synthse des flavonodes .....................................................................18
Schma 10 : Formation des diffrents types de complexes aprs addition de AlCl
3
et en
prsence de AlCl
3
+HCl .............................................................................................35

Liste des Spectres

Spectre 1, 2-1 et 2-2 : Spectres dabsorption ultraviolette du compos F
20-2
dans le MeOH et
en prsence de NaOH ..........................................................................................................54
Spectre 3 et 4 : Spectres dabsorption ultraviolette du compos F
20-2
dans le MeOH en
prsence de AlCl
3
et AlCl
3
+HCl .................................................................................54
Spectre 5 : Spectres dabsorption ultraviolette du compos F
20-2
dans le MeOH et en prsence
de NaOAc ....................................................................................................................55
Spectre 6: RMN
1
H (MeOH-d
4
, 250 MHz) du compos F
20-2
...............................................57
Spectre 6-1 : RMN
1
H (MeOH-d
4
, 250 MHz) du compos F
20-2
, talement ..........................57
Spectre 7 : RMN
13
C (MeOH-d
4
, 62,9 MHz) du compos F14-3.............................................62
Spectre 7-1 : RMN
13
C (MeOH-d
4
, 62,9 MHz) du compos F
14-3
talement..........................62
Spectre 8 : RMN
1
H(,MeOH-d
4
, 250 MHz) du compos F
14-3
.............................................63
Spectre 8-1 : RMN
1
H (MeOH-d
4
, 250 MHz) du compos F14-3 talement..........................63
Spectre 8-2 : RMN
1
H (MeOH-d
4
, 250 MHz) du compos F
14-3
talement...........................64
Spectre 9 : RMN
1
H (MeOH-d
4
, 250 MHz) du compos F12.................................................69
Spectre 9-1, 9-2 : RMN 1H (MeOH-d
4
, 250 MHz) du compos F
12
talement ......................69
Spectre 10: Jmod (MeOH-d
4
, 62,9 MHz) du compos F12.....................................................70

Spectre 11 : Spectre ESI MS du compos F
03
..72
Spectre 12 : RMN
13
C (MeOH-d
4
, 75 MHz) du compos F03................................................78
Spectre 12-1: RMN
13
C (MeOH-d
4
, 75 MHz) du compos F03 talement ..........................78
Spectre 13 : RMN
1
H (MeOH-d
4
, 300 MHz) du compos F03...............................................79
Spectre 13-1: RMN
1
H (MeOH-d
4
, 300 MHz) du compos F03 talement ..........................79
Spectre 14: DEPT-135 (MeOH-d
4
, 300 MHz) du compos F03 .............................................80
Spectre 14-1 DEPT-135 (MeOH-d
4
, 300 MHz) du compos F03 talement .......................80
Spectre 15: Spectre COSY (MeOH-d
4
, 300 MHz) du compos F0381
Spectre 16 : Spectre HSQC (MeOH-d
4
, 300 MHz) du compos F03....82
Spectre 17 : Spectre HMBC (MeOH-d
4
, 300 MHz) du compos F03...82
Spectre 18 : Spectre NOESY (MeOH-d
4
, 300 MHz) du compos F03.83







19

I ntroduction Gnrale
La mdecine par les plantes est l'une des plus vieilles mdecines du monde. Elle reprsente
une alternative intressante pour traiter et soigner sans crer de nouvelles maladies. Malgr le
dveloppement phnomnal de lindustrie pharmaceutique et chimique, lintrt populaire
pour la mdecine par les plantes na jamais cess dvoluer. De nos jours ces deux types de
mdication se retrouvent intimement lis puisque le modle molculaire de la plupart des
mdicaments mis sur le march, ont pour origine la plante. Dans ce contexte, notre laboratoire
a, depuis une vingtaine dannes, dvelopp un axe de recherche consacr principalement la
phytochimie et lvaluation biologique des plantes algriennes reconnues mdicinales, la
recherche de nouveaux modles.
Cet axe de recherche est privilgi par notre laboratoire o plusieurs molcules nouvelles ont
t isoles et dtermines notamment despces du genre Centaurea (Compositae). Dans cette
tude, nous nous sommes intresss lespce Centaurea parviflora notamment
linvestigation de la phase n-butanol de lextrait hydroalcoolique des parties ariennes.
Notre travail sarticule autour de quatre chapitres :
le premier propose une mise au point bibliographique sur les flavonodes.
le deuxime traite de ltude bibliographique des mthodes danalyse structurale des
flavonodes par les mthodes physico-chimiques.
le troisime reporte ltude botanique de Centaurea parviflora Desf. et la description
des travaux exprimentaux portant sur ltude phytochimique mene, notamment
lextraction, la sparation et la purification des mtabolites secondaires de la phase n-
butanol des parties ariennes de cette espce.
Le quatrime est consacr lanalyse structurale des composs obtenus.

20


Les mtabolites secondaires de type flavonode
Chapitre 1 21
I- LES FLAVONOIDES :
I-1-Gnralits :
Les flavonodes sont des substances naturelles issues de plantes, prsentes dans tout le rgne
vgtal. Ce sont des pigments responsables de la coloration des fleurs, des fruits et des
feuilles. Ils sont universellement prsents dans la cuticule foliaire et dans les cellules
pidermiques des feuilles, et sont susceptibles dassurer la protection des tissus contre les
effets nocifs du rayonnement UV [3]; ce qui explique une grande part de leur intrt
commercial dans lindustrie alimentaire et des colorants. Ils possdent en autre un intrt
mdical considrable [8].
I-2-Dcouverte des flavonodes :
Lintrt nutritionnel pour les flavonodes date de la dcouverte de la vitamine C, la suite
des travaux de Szent Gyorgi en 1938. Le scorbut exprimental cde lingestion de jus
dagrumes mais rsiste la seule administration dacide ascorbique. Plus pratiquement, les
symptmes hmorragiques du scorbut lis la fragilit des vaisseaux sont guris par des
extraits de paprika et du jus de citron alors que lacide ascorbique seul est inefficace. Les
analyses chimiques ont montr que la fraction active tait de nature flavonoque. Cette action
des flavonodes sur la permabilit vasculaire a t appele proprit vitaminique p (p tant la
premire lettre du mot permabilit). Cette notion de vitamine p nexiste plus lheure
actuelle puisquelle ne correspond pas la dfinition classique des vitamines; par contre, les
flavonodes sont considrs comme des micros nutriments importants puisquils peuvent jouer
des rles antioxydants ou possder des proprits biologiques [3].
I-3-Diversit des composs phnoliques:
Les composs phnoliques des vgtaux constituent un groupe dune extrme diversit dont
les flavonodes font partie. Plusieurs milliers de molcules ont t identifies ce jour. Ainsi,
nous en absorbons chaque fois que nous consommons un aliment dorigine vgtale.
I-3-1- Dfinition:
22
Les flavonodes sont des drivs du noyau flavone (Schma 1), ou 2-phenyl chromoneportant
des hydroxyles libres, thers ou glycosides.
O
O
A C
B

Schma 1 : Flavone
Le noyau flavone est lui mme un driv du noyau flavane (Schma 2).
O
A
C
B

Schma 2 : Flavane
Les flavonodes sont donc des polyphnols complexes dont la structure est constitue de deux
noyaux aromatiques (cycles A et B) et dun htrocycle oxygn (cycle C) comme report
dans le (schma 3).
O
1
2
3
4 5
6
7
8
6'
5'
4'
3'
2'
1'
A
C
B
HO
OH
O

Schma 3 : Structure gnral des flavonodes
I-3-2- Nomenclature :
Chapitre 1 23
En gnral, il y a deux systmes parallles pour la nomenclature des flavonodes, le premier
est bas sur des noms insignifiants, tels que la flavane et la chalcone, comme structure
parente; lautre est bas sur la nomenclature chimique systmatique, tel que 3,4-dihydro-2-
phenyl-2H-1-benzopyran (nomenclature IUPAC) pour des flavanes et 2-phenyl-4-oxo-4H-1-
benzopyran pour la flavone.
Le dernier systme devient encombrant et facile dtre erron dans les cas de polysubstitution
cest pourquoi il est rarement employ.
Il y a galement deux systmes pour indiquer les substituants autour des noyaux flavane ou
flavone.
-Un dans lequel des substituants prcis sont placs en des positions prcises des trois cycles
comme par exemple 3, 5, 7,3,4-pentahydroxyflavone qui est attribu le nom de querctine,
lautre utilise la nature et la position des substituants suivies du nom du noyau en question.
Des noms insignifiants sont utiliss intensivement dans la littrature pour la nomenclature des
flavonodes. Certains indiquent la classe du compos comme par exemple la fin inidine
qui dnote une anthocyanidine comme la plargonidine alors que la fin tine dnote un
flavonol comme la querctine. Lvolution des noms a fait que certains glycosides ont des
noms particuliers notamment certains drivs de la querctine comme la quercitrine qui
dsigne la 3-rhamnosylquerctine, lisoquercitrine qui dsigne la 3-glucosylquerctine ou la
quercimetrine qui dsigne la 7-glucosylquerctine.
Cependant, il y a peu duniformit dans lappellation des flavonodes et beaucoup de noms
sont drivs du nom gnrique ou spcifique de la source comme tricine de triticum ou
hypolatinede hypoleana) [9].
I-3-3-Sources :
Les flavonodes sont largement rencontrs dans le rgne vgtal. Ils sont cependant rares chez
les vgtaux infrieurs, par contre, on les trouve en abondance dans les familles suivantes :
rutaces, lgumineuses, apiaces ou ombellifres, astraces ou composes.
24
En effet, les flavonodes se rpartissent volontiers dans les organes ariens jeunes (jeunes
feuilles, boutons floraux) o ils sont localiss dans les tissus superficiels (assise palissadique).
Ils se rpartissent galement dans les racines. Au niveau cellulaire, on a observ que les
flavonodes, sous forme dhtrosides, sont dissous dans le suc vacuolaire ou localiss dans
les chloroplastes et les membranes des vgtaux.
De plus, leur localisation au sein de la plante est caractristique[3].
I-3-4-La distribution dans la nature :
En gnral, les flavonodes sont universellement distribus chez les plantes suprieures.
Ils se produisent galement dans beaucoup de groupes de plantes infrieures, notamment dans
les mousses et des liverworts. Cependant ils sont rarement prsents dans les myctes. En
raison de lintrt rsultant en particulier des couleurs vives, belles et remarquables que ces
colorants donnent diverses parties de la plante, des flavonodes ont t extraits partir des
fleurs, du nectar, du pollen, des feuilles, des racines, du bois, de lcorce, de la peau des fruits
et des graines. Ils ont galement t dtects pendant la fermentation du th, et la fabrication
du cacao [9].
I-4-La biosynthse des flavonodes :
I-4-1- Importance de la voie mtabolique du shikimate :
La voie du shikimate est prsente uniquement chez les bactries, les champignons et les
plantes, les animaux ne possdent pas cette voie mtabolique, ceci ayant pour consquence
que les acides amins aromatiques doivent faire partie intgrante de leur alimentation. La
spcificit de ce mtabolisme aux micros organismes et aux plantes suprieures a conduit la
recherche et lobtention de nouveaux antibiotiques et herbicides ayant pour cibles
molculaires des enzymes intervenant dans cette voie [10].
Dans les conditions normales de croissances, 20% du carbone fix par les plantes passe
par la voie du shikimate, cette dernire lie le mtabolisme de lhydrate de carbone la
voie de biosynthse des composes aromatiques en conduisant la synthse de la
structure de base, le noyau aromatique[2] .
Chapitre 1 25
I-4-2-La voie de biosynthse des flavonodes :
Les connaissances actuelles sur la biosynthse et l'enzymologie de la production des
proanthocyanidines dans les plantes proviennent dune tude dtaille ralise par Stafford. Il
a galement dcrit les relations entre lignine et proanthocyanidines, mais n'a pas pu montrer
de rle structural pour les proanthocyanidines contrairement la lignine. Stafford suggre que
la lignine et les proanthocyanidines ont des rles similaires de dfense.
La biosynthse des proanthocyanidines est rsume dans le schma 4, et la liste des enzymes
qu'elle implique est prsente dans le tableau 1. Les tapes ractionnelles conduisant aux
prcurseurs de flavonodes et leurs diffrentes classes impliquent des intermdiaires 4-
hydroxyls (sur le noyau B), les flavonodes obtenus sont ensuite hydroxyls (ou
fonctionnaliss) sur les noyaux A et B pour conduire aux autres classes de flavonodes.
La voie de biosynthse des flavonodes et plus particulirement celle des anthocyanes a t
bien tudie chez les fleurs, permettant la dtermination des diffrentes tapes ainsi que des
enzymes relies ces tapes.
La premire tape est la condensation entre le 4-coumaroyl-CoA (A) et trois units malonyl-
CoA (B) conduisant la formation du squelette flavonodes en C
15
, cette tape est catalyse
par lenzyme chalcone synthse (CHS) et conduit la formation du 2,4,6,4-
ttrahydrochalcone (C).
La cyclisation strospcifique de cette chalcone conduit la formation du cycle C du
squelette flavonode. Cette cyclisation est catalyse par la chalcone isomrase (CHI) qui
conduit la formation de la naringenine (D), qui fait partie de la famille des flavanones.
La chalcone (C) peut galement conduire la formation des aurones. La naringenine (D)
obtenue par cyclisation est le prcurseur de nombreuses sous familles de flavonodes comme
les flavones, les isoflavones et les flavan - 4 - ols qui peuvent conduire aux 3-
deoxycyanidines. La naringenine (D) peut galement tre hydrolyse en position 3 par la
flavanone 3-hydroxylase (F3H) pour conduire au dihydrokaemphrol (E), qui fait partie de la
famille des flavanols. Le dihydrokaempfrol (E) peut aussi aprs dshydrognation du noyau
C et fonctionnarisation du noyau B former les flavanols [10], comme report dans le schma
4.
26








Tableau 1 : Liste des enzymes conduisant aux diffrentes classes de flavonodes

Numro Enzyme Acronyme
Prcurseurs non flavonodes
I
II
III
Acetyl-CoA carboxylase
Phnylalanine ammonialyase
Cinnamate 4-hydroxylase
ACC
PAL
C4H
Classes de flavonodes
1
2
3
4
Chalcone synthse
Polyketide rductase
Chalcone isomrase
2-Hydroxyisoflavone synthase
CHS
PKR
CHI
IFS
Chapitre 1 27
HYDRATES DE CARBONES
Shikimate
Penylalanine
HO
O
Cinnamate
II
HO
O
OH
4-Coumarate
III
OH
O
CoSA
4-Coumaroyl-CoA
A
Acetyl-CoA
H
2
C
COOH
COSCoA
3
Malonyl-CoA
B 1
1
1+2
O OH
OH HO
4,2',4',6'-tetrahydroxychalcone
C
O
O OH
HO
OH
3
D
Naringenine
I
O HO
OH O
OH
OH
E
Dihydrokaempferol
4
OH HO
OH
O
Isoliquiritigenine
3
O HO
O
OH
Liquiritigenine
Flavonols Leucoanthocyanidines
Aurones
Flavones
Isoflavones
Flavan-4-ols
OH

Schma 4 : Mcanisme gnral de biosynthse des flavonodes





I-5- Les diffrents types de flavonodes :
28
Cest un des groupes de substances naturelles les plus varis, contenant plus de 4000
structures, il comprend comme son nom lindique des composs jaunes mais aussi dautres
couleurs ou incolores. Ils sont universels chez les angiospermes et les gymnospermes. Ils ont
tous en commun la structure de la flavane, 3 cycles dont un htrocycle dont la configuration
varie permet la classification en sous groupe Schma 5: flavones, flavanones et flavonols,
flavanediols et la chalcone dont lhtrocycle nest pas form et qui reprsente un
intermdiaire caractristique de la synthse des divers flavonodes.
Le noyau flavonode est souvent li un sucre pour former un glycoside hydrosoluble [11].

Chapitre 1 29
O
O
AURONE
O
O
ISOFLAVONE
O
CHALCONE
O
O
H
FLAVANONE
O
O
FLAVONE
O
OH
O
FLAVONOL
O
O
H
OH
H
FLAVANON-3-OL
O
OH
ANTHOCYANIDINE
O
OH
FLAVAN-3-OL
O
OH
O
OH
PROANTHOCYANIDINE
O
H
FLAVANE
O
OH
OH
FLAVAN-3,4-DIOL
O
DIHYDROCHALCONE


Schma 5 : les diffrents types de flavonodes



30
I-5-1-Les flavonodes glycosyls :
Ce sont des htrosides, cest--dire des drivs de GENINE-OSE sur lesquelles un ou
plusieurs OSES sont greffs.
La liaison GENINE-OSE existe grce la runion, soit dun hydroxyle phnolique, soit dun
hydroxyle de lhtrocycle oxygn, soit dun CH avec lhydroxyle hemiactalique du ou
des ose(s), on obtient alors des O-Htrosides ou des C-Htrosides (Schma 6).

O
OH
OH
OH
HO
O
O
OH
OH O
O
HO
HO
OH
OH
Rutine
O
OH
O
OH
OH
O
OH
OH
HO
OH
O
OH
OH
OH
OH
O
Saponarine
O


Schma 6 : structure chimique de deux flavonodes glycosyls
I-5-1- 1 Nature des substituants sucres
- Classification des glucides:
Dans le schma 7, nous reportons la classification en catgories de quelques glucides
naturels.






Chapitre 1 31








Monosaccharides
Pentoses Hexoses (C
6
H
12
O
6
) Heptoses (C
7
H
14
O
7
)
L-arabinose D-glucose D-sedoheptulose
D-ribose D-fructose
D-xylose D-galactose
Mannose



Oligosaccharides
Disaccharides Trisaccharides
Saccharose (D-glucose+D-fructose) raffinose (D-glucose+D-fructose+D-galactose)
Maltose (D-glucose+D-glucose)
Lactose (D-galactose+D-glucose)

Polysaccharides


Vgtaux Animaux
Amidon glycogne
Gomme arabique
Agar-agar
Cellulose

Schma 7 : classification des glucides

32
Les sucres six atomes de carbones (hexoses) les plus communs sont le D-glucose, le D-
fructose, le D-galactose et le D-mannose. Ce sont tous des aldohexoses, lexception du D-
fructose qui est un ctohexose. La structure de ces hexoses est indique au tableau 2.




Hexose
Structure chane ouverte
Structure hmiactal
cyclique
D-glucose
CHO
CH
2
OH
OH
OH
H
OH
H
H
HO
H

O
H
HO
H
HO
H
OH
OH
H
H
OH

D-fructose ltat libre dans
le miel et le jus de fruits ;
ltat combin dans le
saccharose et les
polysaccharides

CH
2
OH
CH
2
OH
OH
OH
H
O
H
H
HO

H
CH
2
OH
HOH
2
C
HO
H
OH
HO H
O

D-mannose constituant de
polysaccharides
CHO
CH
2
OH
OH
OH
H
H
H
H
HO
HO

O
H
HO
H
HO
HO
OH
H
H
H
OH

D-galactose constituant
doligosaccharides (lactone,
mlibiose, raffinose) et de
polysaccharides (gommes)

CHO
CH
2
OH
OH
H
H
OH H
HO
HO
H

O
OH
H
H
HO
H
OH
OH
H
H
OH


Tableau 2 : Hexoses les plus communs
Le terme oligosaccharide sapplique des polymres de condensation de bas poids
molculaires, forms de deux neuf units monosaccharides (le plus souvent des hexoses).
Chapitre 1 33
De nombreux disaccharides, qui sont forms de deux units monosaccharides, sont connus ;
lun des plus importants est le saccharose.
(C
6
H
11
O
5
) O (C
6
H
11
O
5
) +H
2
O C
6
H
12
O
6
+C
6
H
12
O
6

Saccharose D-glucose+ D-fructose
Les polysaccharides sont des polymres de haut poids molculaire forms par la condensation
rpte de monosaccharides, exemples: les amidons, le glycogne, la cellulose et certaines
gommes vgtales, les relations entre les diverses classes de glucosides sont rsumes dans le
tableau 2.
On trouve aussi dans la nature des sucres combins avec dautres composs tels que des
produits hydroxyls ou des bases azotes, les drivs glucidiques de ce type sont appels
glucosides [12]. Ce type de composs communment connus sous le nom dhtrosides
rsulte de la combinaison Gnine-Oses.
I-5-1- 2 Nature des gnines
Dans la classe des flavonodes diffrents types de gnines sont rencontrs, leur squelette de
base peut tre entre autre celui de :
flavone (2-phenyl-chromone)
O
O
A C
B

isoflavone (3-phnyl-chromone)
34
O
O
A C
B

La plupart des flavonodes se produisent naturellement associs des sucres sous la forme
conjugue et dans nimporte quelle classe peut tre caractrise au tant que
monoglycosidique, diglycosidique, etc. La complexit glycosidique est considrable. Les
monosaccharides lis aux flavonodes comme le glucose, le galactose, lapiose, lallose,
larabinose, le rhamnose, le xylose, le mannose, lacide galacturonique et lacide
glucuronique, les mono-, les di-, et les tri-saccharides peuvent tre lis par un hydroxyle
phnolique simple ou peuvent tre diffremment lis des groupes (deux ou plus)
phnoliques [9] (Schma 8).


Chapitre 1 35
O
O
naringine
OH
O
O
OH
O
OH
CH
2
OH
O
OH
OH OH
CH
3
O
O
naringenine
OH
HO
O
O
narirutine
OH
O
O
OH
OH
OH
CH
2
O
O
OH
OH OH
CH
3
OH
OH
OH
O
O
OH
O
O
OH
O
OH
CH
2
OH
O
OH
OH OH
CH
3
O
O
rhifoline
OH
O
O
OH
OH
OH
CH
2
O
O
OH
OH OH
CH
3
OH
OH
isorhifoline
O
O
OH
O
O
OH
OH
OH
CH
2
OH
OH
luteolin-7-glucoside
OH
O
O
OH
HO
OH
astragenine (kaempferol-3-O-gluccoside
O
O
OH
OH
OH
CH
2
OH
O
O
OH
HO
OH
querctrine (quercetin-3-O-rhamnoside)
O
O
OH
OH
OH
CH
3
OH
O
O
OH
HO
OH
rutine
O
OH
O
OH
OH
OH
CH
2
O
O
OH
OH OH
CH
3

Schma 8 : Quelques flavonodes glycosyls [13]
I-6-La synthse des flavonodes
Les Flavonodes ont t un sujet de recherche pendant plus d'un sicle. De nombreuses
molcules de cette famille de substances naturelles ont t isoles dextraits de plantes grce
auxquelles de nombreuses proprits biologiques intressantes leur ont t attribues. Dans ce
36
contexte, la synthse organique a apport sa contribution par notamment, la constitution du
squelette flavonique [13], par deux voies de synthse (Schma 10). Ces chemins ractionnels
consistent en :
la substitution d'un phnol avec un chlorure de lacyle.
la substitution d'une actophnone avec un benzaldhyde, un anhydride de benzoyle,
ou un chlorure de benzoyle.



Schma 9 : La rtro synthse des flavonodes
I-7- Les activits biologiques des flavonodes et leurs effets sur la sant :
I-7-1- Les flavonodes et la sant :
Les composs phnoliques en gnral seraient utiliss comme composs de dfense [14].
Ils sont actuellement lobjet de nombreuses tudes cause de leur action bnfique sur la
sant. Lune de leurs proprits est de former des complexes avec les protines, la
complexation tanin-protine pouvant tre la base de nombreux effets biologiques des poly
phnols [15]. Elle pourrait galement tre la base du mcanisme de certaines des proprits
biologiques majeures quon leur dcouvre in vitro (expression gntique, inhibition
Chapitre 1 37
enzymatique) [16]. Des tudes conduites in vitro, rvlent les nombreuses activits
biologiques des polyphnols telles que les proprits anti inflammatoire, anti agrgante
plaquettaire, vasorelaxante), antioxydante, anticancreuse. Ces substances sont supposes
exercer un effet bnfique sur la sant humaine, et particulirement envers les maladies
cardiovasculaires [17].
Ces dernires annes, les pidmiologues ont attir lattention sur le rle des antioxydants
prsents dans lalimentation et leur implication dans la prvention de certaines maladies telles
que les maladies cardiovasculaires, et les maladies neurodgnratives (maladie dAlzheimer)
ou encore certains types de cancer.
I-7-2- Activit biologique des flavonodes :
Les flavonodes sont des mtabolites secondaires des plantes dont la principale raison de leur
biosynthse est de lutter contre les agressions de leur environnement extrieur. Les proprits
antibactriennes et antifongiques de nombreux flavonodes sont galement utilises par les
plantes pour lutter contre toute invasion par microorganisme, ils jouent galement un rle
dans la protection des plantes contre les insectes et les animaux herbivores. Ils sont galement
utiliss dans une autre interaction entre le rgne vgtal et animal, cette fois pour attirer les
insectes afin de raliser la pollinisation des fleurs car leur absorption dans le visible ou dans
lultraviolet proche du visible attire alors certains insectes tels que les abeilles qui distinguent
ces longueurs dondes [10].
Par ailleurs, des recherches ont montr que loxydation incontrle dans les cellules joue un
rle important dans le vieillissement ainsi que dans le dveloppement de certaines
pathologies, ainsi les polyphnols, puissants anti-oxydants [1], et capteurs de radicaux libres
[17], sont probablement une des familles des molcules les plus actives vis--vis de ces
dsordres physiologiques. Ils sont prsents dans la plupart des fruits et lgumes, et en
particulier dans le th, le vin et le cacao comme report dans le tableau 3 [18].




38



Polyphnols
Activits

Acides phnols (cinnamiques et
benzoques)
Antibactrienne
Antifongique
Antioxydante
Coumarines
Protectrice vasculaire et
anti dmateuse
Flavonodes Anti tumorale
Anti carcinogne
Anti-inflammatoire
Hypotenseurs et diurtiques.
antioxydant
Anthocyanes Protectrice capillaro-veineux.
Pro anthocyanidines
Effet stabilisant sur le collagne.
Antioxydante
Anti tumorale
Antifongique
Anti inflammatoire
Tannins galliques et Catchiques Antioxydant
Tableau 3: Quelques activits biologiques de composs phnoliques
I-8- Proprits des flavonodes :
I-8-1- Proprits anti-inflammatoires des flavonodes et effets sur le systme
immunitaire :
De nombreux travaux semblent indiquer que les flavonodes possdent des proprits anti-
inflammatoires et quils sont capables de moduler le fonctionnement du systme immunitaire.
Les flavonodes sont de puissants inhibiteurs de la prolifration des lymphocytes B et T. Cet
effet des flavonodes sur ces lymphocytes B et T peut tre variable. En effet, les flavones
Chapitre 1 39
(apignine, lutoline et 7,3,4-hydroxyflavone) et les flavonols (kaempfrol, querctine et
myrictine) inhibent la prolifration des lymphocytes T alors que la myrictine est active sur
les lymphocytes B.
I-8-2- Proprits antivirale et antibactrienne :
Thoriquement, les flavonodes pourraient exercer des effets antibactriens puisquils sont de
puissants inhibiteurs in vitro de lADN gyrase. Une tude rcente a montr leffet bactricide
de diffrentes flavanones sur staphylococcus aureus.
Le mcanisme des effets antimicrobiens des polyphnols est sans doute trs complexe. Parmi
les hypothses avances, il faut citer :
linhibition des enzymes extracellulaires microbiennes.
la squestration de substrat ncessaire la croissance microbienne ou la chlation de
mtaux tels que le fer.
linhibition du mtabolisme microbien [3].
I-8-3- Biodisponibilit des flavonodes :
Les flavonodes prsentent des proprits bnfiques biologiques et antioxydantes.
Cependant la qualit nutritionnelle et les effets des flavonodes dpendent de leur absorption
au niveau du tractus digestif.
Peu dtudes systmatiques ont t menes sur la pharmacocintique des flavonodes chez
lhomme. Toutefois, daprs des expriences menes sur des flavonodes provenant de
lalimentation, il apparat que leur absorption est faible et implique des mcanismes encore
mal connus. Seuls les aglycones sont supposes tre absorbables, alors que les glycosides,
comme la rutine, doivent subir lhydrolyse de leur liaison osidique par laction de la
microflore intestinale pour leur permettre dtre absorbs au niveau du colon [3].




Chapitre

53




























Les mthodes danalyse physico-chimiques
Danalyse structurale des flavonodes

2
54

II-LES METHODES PHYSICO-CHIMIQUES DANALYSE STRUCTURALE
DES FLAVONOIDES :
II-1- Introduction :
Pour faire une investigation phytochimique qui consiste principalement en lisolement et
lidentification structurale de produits naturels partir de vgtaux, il est ncessaire, voir
mme indispensable de bien choisir la partie du matriel vgtal et en fonction de la nature
des produits recherchs, adapter et optimiser les techniques ou les mthodes physico-
chimiques ncessaires [19].
: Matriel Vgtal - 2 - II
Le choix du matriel vgtal nest en aucun cas fait dune manire alatoire. Mme si
lobjectif est prablement fix, il faut toujours vrifier tout au dbut que le vgtal choisi
contient bien les produits quon se propose de rechercher. Ce dernier point consiste faire des
sreening permettant dvaluer et dapprcier sa juste valeur ou la limite dune manire plus
ou moins qualitative que quantitative la composition du matriel vgtal tudier.
La priode et le lieu des rcoltes doivent tre bien choisis. Les rcoltes sont effectues au
moment de la floraison, et se situent en ce qui nous concerne gnralement entre les mois
davril et juillet selon le lieu de la station de rcolte.
Les produits que lon se propose dtudier ne sont pas rpartis de la mme faon dans les
diffrentes parties du vgtal. Ainsi les diffrents organes de la plante sont souvent spars
aprs la rcolte puis sche labri des rayons solaires et de lhumidit et pess [19].
: Extraction - 3 - II
Lobtention dune substance naturelle partir des vgtaux ncessite souvent une extraction
avec des solvants appropris. Elle peut tre de nature discontinue et consiste laisser macrer
le vgtal dans un solvant ou un systme de solvant, temprature ambiante, chaud ou
mme parfois porter le tout bullition pour extraire les constituants solubles. Un extrait est
ainsi obtenu aprs bien videment lvaporation totale du solvant.
Chapitre

55
Lextraction est souvent suivie par une ou plusieurs autres, la diffrence de la premire, ce
sont des extractions liquide-liquide effectues dans des ampoules dcanter. Ces dernires
consistent transfrer qualitativement et quantitativement le ou les produits recherchs en
vitant au maximum dy transfrer des produits autres que ceux recherchs. Le choix du
solvant dextraction devient ds lors impratif [19].
: Sparations chromatographiques - 4 - II
: Dfinition - 1 - 4 - II
La chromatographie est une mthode physique de sparation base sur les diffrences
daffinit des substances analyser lgard de deux phases, lune stationnaire ou fixe,
lautre mobile. Selon la technique chromatographique mise en jeu, la sparation des
composants entrans par la phase mobile, rsulte soit de leur adsorption et leur dsorption sur
la phase stationnaire, soit de leur solubilit diffrente dans chaque phase.
On peut classer les mthodes chromatographiques daprs la nature des phases utilises ou
celle des phnomnes mis en uvre dans la sparation.
II-4-2- Chromatographie sur colonne :
La chromatographie sur colonne peut tre une mthode prparative ; elle permet en effet la
sparation des constituants dun mlange et leur isolement, partir dchantillons dont la
masse peut atteindre plusieurs grammes.
Elle prsente cependant plusieurs inconvnients :
de grandes quantits de solvant sont ncessaires llution
la dure de llution est gnralement trs grande
la dtection des composs exige une attention constante
Elle est adapte la purification de quantits importantes de produits, lorsque les conditions
opratoires sont au point. Cependant, la mthode tant trs empirique, sa mise au point
ncessite souvent de nombreux essais.
2
56
: Description et principe - 1 - 2 - 4 - II
Cest une technique base sur des phnomnes dadsorption. La phase solide, le plus souvent
lalumine ou la silice, remplit une colonne de longueur et de section variables : lchantillon,
en solution concentre, est dpos en haut de la colonne et la sparation des composants
rsulte de lcoulement continu dun luant, traversant la colonne par gravit ou sous leffet
dune faible pression. On peut utiliser comme luant un solvant unique ou bien accrotre
progressivement la polarit de lluant de faon acclrer le dplacement des composs.
Les molcules sont entranes vers le bas des vitesses variables selon leur affinit
pour ladsorbant et leur solubilit dans lluant. Le chromatogramme se dveloppe en
formant une succession de zones cylindriques qui se sparent en migrant vers le bas. A
mesure que chaque zone scoule de la colonne, on la recueille.
: Chromatographie sur papier - 3 - 4 - II
: Principe de la technique et applications - 1 - 3 - 4 - II
La phase mobile est le plus souvent un solvant organique et leau ; la phase stationnaire est
constitue par elle mme absorbe sur la cellulose du papier ou lie chimiquement elle.
Comme en chromatographie sur couche mince, lchantillon mis en solution, et dpos en un
point repre du papier et le solvant, qui se dplace par capillarit, fait migrer les composants
de lchantillon des vitesses variables selon leur solubilit.
Gnralement, les composs les plus solubles dans leau ou ceux qui forment facilement des
associations par liaisons hydrogne sont fortement retenus par la phase stationnaire et migrent
donc lentement.
Lorsque leau est un des solvants de la phase mobile, le ou les solvants organiques doivent y
tre assez solubles. Des produits comme lacide thanoque, le propanol, le phnol ou la
pyridine sont les solvants les plus frquemment utiliss en mlange avec de leau pour
dvelopper un chromatogramme.
La chromatographie sur papier est employe principalement pour lanalyse de composs trs
polaires, tels que les acides amins, les sucres et les composs polyfonctionnels.
Chapitre

57
Ses plus grands inconvnients par rapport la CCM sont :
une dure de dveloppements beaucoup plus longue.
une sparation gnralement moins bonne.

: Papier - 2 - 3 - 4 - II
On peut utiliser du papier ordinaire, mais il est prfrable de se procurer du papier conu pour
cet usage, ayant un faible taux dimpurets et dont les caractristiques sont uniformes. Les
marques principales sont Wattman, Schleider et Shull, Durieux et Arches. Il existe huit
Catgories de papier Wattman, classes selon leur paisseur, la texture de leur surface et la
vitesse avec laquelle leau y diffuse. par exemple le papier Wattman n1 est le plus utilis,
mais si lon dsire une grande vitesse dcoulement modre on utilisera le n3 ou le n4 ; le
papier n20 est trs lent, mais il permet une meilleure sparation, donnant des taches trs
denses et uniformes.
La description de lanalyse par chromatographie sur papier est identique celle sur couche
mince.
): CCM ( Chromatographie sur couche mince - 4 - 4 - II
: Dfinition et appareillage - 1 - 4 - 4 - II
La chromatographie sur couche mince (CCM) repose principalement sur des phnomnes dadsorption ;
la phase mobile est un solvant ou un mlange de solvants, qui progresse le long dune phase stationnaire
fixe sur une plaque de verre ou sur une feuille semi-rigide de matire plastique ou daluminium. Aprs
que lchantillon ait t dpos sur la phase stationnaire, les substances migrent une vitesse qui dpend
de leur nature et celle du solvant.
Les principaux lments dune sparation chromatographique sur couche mince sont :
la cuve chromatographique ; un rcipient habituellement en verre, de forme variable, ferm par
un couvercle tanche.
2
58
La phase stationnaire : une couche denviron 0,25 mm de gel de silice ou dun autre adsorbant est
fixe sur une plaque de verre laide dun liant comme le sulfate de calcium hydrat (pltre de
Paris), lamidon ou un polymre organique.
lchantillon : Environ un micro litre de solution dilue (2 5%) du mlange analyser, est
dpos en un point repre situ un cm au moins au dessus de la surface de lluant.
lluant : un solvant pur ou un mlange de solvants; il migre lentement le long de la plaque en
entranant les composants de lchantillon.
: Principe de la technique - 2 - 4 - 4 - II
Lorsque la plaque sur laquelle est dpos lchantillon est place dans la cuve, lluant monte travers la
phase stationnaire, essentiellement par capillarit. Chaque composant de lchantillon se dplace sa
propre vitesse derrire le front du solvant.
Cette vitesse dpend dune part, des forces lectrostatiques retenant le composant sur la phase
stationnaire et, dautre part, de sa solubilit dans la phase mobile. La plaque est place en position
verticale dans la cuve et le solvant qui en recouvre le front monte par capillarit [20].
: lation Rv - 5 - II
La rvlation des substances isoles se fait selon diffrentes mthodes (valable galement pour la
chromatographie sur papier) :
directement si les substances sont colores.
laide de rvlateurs si elles sont incolores afin de les transformer en taches colores ; les
produits sont souvent dcels par leurs ractions fonctionnelles classiques : les acides amins par
la ninhydrine qui donne avec la plupart une couleur bleu violet, les acides organiques par des
indicateurs colors, les sucres par le ractif de Molish qui utilise le pouvoir rducteur des sucres.
quelques ractifs comme liode ou le permanganate donnent des colorations non spcifiques avec
la plupart des composs organiques.
toutes les substances ayant une absorption dans la rgion au dessus de 230 nm sont tudies sur
des supports additionnes de corps fluorescents par irradiation la lumire UV (254 et 366nm)
par suite de la fluorescence propre ces composs.
dans tous les cas, il faut noter les positions des taches colores juste la fin de la chromatographie
en les cerclant car certains produits disparaissent avec le temps.
: ) retarding factor ou rapport frontal (
f
R Calcul de - 6 - II
Chapitre

59
Si ncessaire, les taches du chromatogramme sont rvles par pulvrisation de ractifs appropris. On
dtermine alors, pour chaque constituant, le rapport frontal



Distance parcourue par le constituant
R
f
=
Distance parcourue par le front de solvant

Le R
f
est caractristique dune substance donne pour un luant dtermin sur un support (phase
stationnaire) donn.
Le R
f
est peu prs le mme, que le constituant soit pur ou dans un mlange.
Le R
f
ne dpend pas de la concentration du constituant dans le mlange (Figure 2).



Figure 2 : Plaque chromatographique lue permettant le calcul du R
f
20 Filtration et purification sur gel Sephadex LH - 7 - II
Le sephadex LH 20 est un gel de sparation qui possde des proprits lipophile et
hydrophile. Le caractre lipophile de ce gel rticul de dextrane revient la prsence des
60
groupements isopropyles obtenus par hydroxypropylation du sephadex G-25. Son caractre
hydrophile est d aux nombreuses fonctions hydroxyles prsentes. En raison de cette nature,
le sephadex LH 20 gonfle non seulement dans les solvants de faible et moyenne polarit mais
galement dans les solvants trs polaires. A ces deux proprits sajoute la rcupration
presque totale des chantillons au cours des expriences de sparation.
Selon la nature des composs sparer et de la nature de lluant utilis, diffrents
mcanismes sont susceptibles dintervenir en mme temps tout au long du processus
de sparation [21].
: laire Sparation par permation selon le poids molcu - 1 - 7 - II
Les substances sont lues par ordre dcroissant par rapport leur poids molculaire. Les
solvants les plus utiliss sont le mthanol et lthanol, associs ou non au dichloromethane ou
au chloroforme.
: urale Les techniques didentification struct - 8 - II
: Dfinition - 1 - 8 - II
Lidentification des structures molculaires organiques se fait gnralement par lutilisation
combine de plusieurs techniques spectroscopiques, la spectromtrie de masse, la
spectroscopie infrarouge, la spectroscopie de rsonance magntique nuclaire du proton et du
carbone.
Ces techniques permettent dans un temps rduit davoir des donnes importantes conduisant
la llucidation structurale.
Les plus utilises au cours de notre travail ont t : La spectroscopie de rsonance magntique
nuclaire, la spectroscopie dabsorption ultraviolette.
: ) RMN ( magntique nuclaire La rsonance - 2 - 8 - II
La rsonance magntique nuclaire ou RMN est une technique utilise pour lanalyse des
structures de nombreuses molcules chimiques. Elle sert principalement la dtermination
structurale des composs organiques. Les principaux noyaux tudis sont le proton ou
1
H, le
carbone treize ou
13
C, le phosphore ou
31
P, le fluor
19
F, lazote
15
N
Chapitre

61
Depuis son dveloppement extrme durant ces dernires dcennies, elle est devenue la
mthode de choix de la rsolution structurale, grce notamment, aux expriences multi
impulsionnelles et bidimensionnelles homo et htronuclaires qui permettent non seulement
darriver la structure mais de rsoudre les problmes de strochimie. Il faut galement
souligner un avantage prcieux de cette technique mme si elle nest pas trs sensible par
rapport aux autres (la spectromtrie de masse par exemple et les sries spectrales UV) cest
que lchantillon est rcupr intact aprs vaporation du solvant.
: Vis UV La spectroscopie - 3 - 8 - II
Les techniques de spectroscopie UV-Vis sont des mthodes simples et rapides qui fournissent
des informations sur la nature chimique, les proprits structurales et les caractristiques
optiques des composs.
Cest une mthode quantitative et qualitative de grande utilit pour les analyses chimiques.
Dans les composs, chaque chromophore absorbe une longueur donde bien dtermine.
Ceci permet de caractriser les molcules.
La mesure de labsorption UV permet galement de connatre ou dterminer la composition
chimique dun mlange, par comparaison avec des tmoins.
Dans notre tude, cette technique a t utilise dans llucidation structurale des composs
isols par comparaison des spectres dabsorption avec des tmoins disponibles au laboratoire.
Cest la mthode la plus importante pour lidentification des structures flavoniques, Elle est
base sur lenregistrement dun spectre dans un milieu alcoolique (mthanol ou thanol) qui
sera caractris par deux bandes dabsorption principales (Figure 3) [22].

O
O
A
B
C
Absorption de la partie
benzoyle Bande II
Absorption de la partie
cinnamoyle Bande I

Figure 3 : Les 2 bandes caractristiques dun squelette flavonique
2
62

elle est attribue , nm 400 - 300 pressente un maximum dabsorption entre : I Bande
labsorption du systme cinnamoylequi rsulte de la conjugaison du groupement carbonyle
avec la double liaison(C
2
-C
3
) et le noyau B, elle donne , alors des renseignements sur les
variations structurales du cycle B et lhtrocycle C.
elle est attribue , nm 280 - 240 prsentant un maximum dabsorption entre : II Bande
labsorption du systme benzoylequi drive de la conjugaison du groupement carbonyleavec
le noyau A est nous informe sur les variations structurales du cycle A Lintervalle du
maximum dabsorption des deux bandes en milieu mthanolique pour quelques types de
flavonodes est donn sur le tableau suivant:
Type de compos
flavonique
Bande I Bande II
Flavone
320-350 250-270
Flavonol
352-385 250-280
Flavanone
300-330 245-275
Isoflavone
300-330 245-275
Tableau 4 : Intervalle du maximum dabsorption des bandes I et II dans le MeOH De
quelques types de flavonode

Linterprtation des spectres dans le mthanol et/ou en prsence de ractifs spcifiques
sappuie sur des rgles trs connues pour les flavonodes ; rgles dcrites par Jur et al, (1962)
reprises par Mabry et al. (1970) et compltes par Voirin (1983) [23].
En gnral, une bonne exploitation des donnes de cette technique additionne aux valeurs
des R
f
dans les systmes de solvant appropris

conduit une approche structurale qui
pourrait tre complte si lon tient compte de la couleur de la fluorescence de ce type de
composs une fois expos la lumire de Wood ( =366 nm). Cette dernire donne est
galement trs utile car elle permet de faire la distinction entre les diffrentes classes de
flavonodes trs rapidement. Cest le cas par exemple des deux aglycones de flavonede base
en loccurrence lapignine (5, 7,4-trihydroxyflavone) et de la lutoline (5, 7,3,4-
Chapitre

63
tetrahydroxyflavone) et leurs homologues flavonols qui ont des fluorescences noir-violette et
jaune respectivement. Le tableau 5 reporte la relation entre la couleur de la fluorescence sous
la lumire de Wood et les structures flavoniques :



Fluorescence Structures flavoniques
Noir- violette

-flavones
-5, 6,7 ou 5, 7,8 trihydroxyflavone
-flavonol avec 3-OH substitu
Bleu -flavone ou flavonol sans OH en 5
-flavanone avec OH en 3 ou flavanol
-flavonol avec 3-OH substitu ou sans 5-
OH
Jaune ou jaune terne
-flavonol avec 3-OH, et avec ou sans 5-OH
Orange fluorescente -isoflavones
Jaune verte -aurones
Verte -chalcones
Bleu verte -flavanone sans 5-OH
Tableau 5: Relation entre la couleur de la fluorescence sous la lumire De Woodet les
structures flavoniques
: s Vi - srie spectrale UV ( Vis avec addition de ractifs - Spectres UV - 4 - 8 - II
Le spectre mthanolique dun compos flavonique sera modifi par addition dun certain nombre de
ractifs tels que NaOH, NaOAc, H
3
BO
3
et HCl. Ces derniers ragissent avec les groupements
hydroxyles en formant des complexes qui se traduiront sur le spectre UV par des dplacements
bathochromiques ou hypsochromiques des bandes dabsorption, permettant la localisation des
hydroxyles libres sur le squelette flavonique (Tableau 6).
: Spectre en prsence de NaOH - 1 - 4 - 8 - II
2
64
NaOH ou (NaOMe), une base forte, ionise tous les hydroxyles phnoliques du squelette flavonique. Il
en rsulte un effet bathochrome sur les deux bandes I et II. Cet effet est plus important sur la bande I.
Les flavonodes trs hydroxyls sont instables en prsence de ce ractif, particulirement pour les
flavonols ayant un hydroxyle libre en 4.
Ce dplacement bathochromesuivi dune variation de lintensit lumineuse de la bande I renseigne sur
le nombre et la position des hydroxyles libres [23]. Lapparition dune nouvelle bande entre 320 et 350
nmpar rapport au spectre MeOH, indique lexistence dun OH libre en 7.
Cependant, leffet de NaOH sur les flavones et les flavonols est de dtecter les groupements
hydroxyles dans les positions 3 et/ou 4.
Dans le cas des isoflavones hydroxyles sur le noyau A, le spectre montre aprs addition de NaOH un
effet bathochrome des deux bandes I et II. Si lisoflavone est orthodihydroxyleen 3 et 4 le spectre
UV montre une rduction dintensit avec le temps [24].
: Spectre en prsence de NaOAc - 2 - 4 - 8 - II
Lactate de sodium, NaOAc, base faible ionise les hydroxyles phnoliques les plus acides de la
molcule, soit les groupes 7-OH, 4-OH et 3-OH.
Un faible dplacement bathochrome de la bande II des flavones, et des flavonols traduit la prsence
dun hydroxyle libre en 7. Cet effet peut tre perturb par la prsence dautres substituants en 6 ou en
8 [24].
Dans le cas des isoflavones, le NaOAc ionise spcialement lhydroxyle en position 7 [24], ceci se
traduit par un dplacement bathochrome de la bande II (6-20nm).
Si ce dplacement nest pas significatif cela veut dire que le carbone 6 est oxygn [24].
:
3
BO
3
H + Spectre en prsence de NaOAc - 3 - 4 - 8 - II
Pour raliser ce spectre, lacide borique (H
3
BO
3
), est additionn lchantillon en prsence de
NaOAc. Ce spectre renseigne sur la prsence ou labsence de systme orthodihydroxyle sur le cycle B
(3,4) ou sur le cycle A (6,7 ou 7,8) suite la formation de chlates dont leffet se manifeste par un
dplacement bathochromede la bande I [24] (Figure 5).
Chapitre

65
O
OH
O
OH
OH
OH
HO
O
O
O
O
OH
OH
HO
B
-
OH
OH
H
3
BO
3
CH
3
COONa

Figure 4 : Formation de complexe aprs addition de H
3
BO
3


: HCl +
3
et AlCl
3
Spectre en prsence dAlCl - 4 - 4 - 8 - II
La prsence du chlorure daluminium(AlCl
3
) dans la solution mthanolique mne la formation de
complexes entre les hydroxyles ortho du flavonode dune part et les hydroxyles des positions 3 et 5 et
la fonction carbonyle dautre part. La formation de ces complexes se traduit par un effet bathochrome
de la bande I par rapport au spectre pris dans le MeOH. Les complexes forms entre AlCl
3
et les
groupes ortho dihydroxyles des noyaux aromatiques A et B sont instables et se dcomposent en
prsence de HCl [25], par contre, ceux forms entre AlCl
3
et les hydroxyles 5-OH ou 3-OH et la
fonction carbonyle sont stables [26,27] (Schma 10). Ces effets se manifestent par un dplacement
hypsochrome de la bande I sur le spectre UV en presence dAlCl
3
+HCl par rapport au spectre aprs
addition dAlCl
3
et un dplacement bathochrome de la bande I du spectre en prsence dAlCl
3
moins
important par rapport au spectre dans le MeOH en cas doxygnation de la position 6 (Tableau 6).






2
66
O
OH
O
HO
OH
HCl aq
AlCl
3 O
O
O
HO
O
Al Cl
Complexe instable
O
OH
O
OH
OH
HO
O
O
O
O
O
HO
AlCl
3
Al
Cl Cl
Al
Cl
O
OH
O
OH
O
HO
Al
Cl Cl
HCl aq
O
OH
O
OH
HO
O
O
O
O
HO
AlCl
3
Al
Cl
O
OH
O
OH
HO
HCl aq
O
Al
Cl
Cl
O
Al
Cl
Cl
Ou bien
Complexe stable
Complexe stable
OH


Schma 10 : Formation des diffrents types de complexes aprs addition dAlCl
3
et en
prsence dAlCl
3
+HCl






Chapitre

67
Ractifs Dplacement (nm)
Bande Bande
Interprtation

MeOH
310-350
330-360
350-385
250-280
250-280
250-280
Flavone
Flavonol (3-OR)
Flavonol (3-OH)





NaOMe (NaOH)
+40 60 avec stabilit dintensit

+50 60 avec diminution dintensit
-Faible dplacement avec diminution
dintensit
-Apparition dune nouvelle bande
entre B et B
-Absence de bande entre 320-335
-Transformation de la bande en une
Inflexion.
4'-OH

3-OH et 4'OR
4'-OR

7-OH

7-OR
5-OH (seul hydroxyle
libre)
AlCl
3
/MeOH +20 45
+60
5-OH
3-OH
AlCl
3
+HCl/AlCl
3
-30 -40

-20 -25
-Ortho di OH sur le
noyau B
-Ortho di OH sur le
noyau A (en plus
ortho di OH sur le
noyau B



AlCl
3
+HCl/MeOH
+35 55
+17 20

+50 60
5-OH
5-OH (avec 6-
oxygnation)
3-OH ou 3-OH et 5-
OH




NaOAc/MeOH
+5
20
-Dplacement trs faible
-Diminution dintensit avec le temps
-Le spectre se dcompose avec le
temps
7-OH
7-OR
6,7; 7,8 ou 3',4'di OH
5, 6,7 ; 5, 7,8 ou3,
3,4
-tri OH

NaOAc+H
3
BO
3

+12 36
+5 10
3',4' di OH
6,7 ou 7,8 di OH

2
68
Tableau 6 : Rsultats des sries spectrales UV aprs addition de ractifs



II-8-5-Lhydrolyse acide des htrosides :
Cette manipulation concerne dans un premier temps les flavonodes O-glycosyls, elle renseigne sur la
nature du sucre qui peut tre tudi une fois dtach ainsi que celle de laglycone. Lidentification du
sucre se fait par co-chromatographieavec des chantillons authentiques.
Les htrosides C-glycosyls rsistent lhydrolyse acide, cette proprit permet de diffrencier ce
type de liaison dans les flavonodes glycosyls.
II-8-6- La spectromtrie de masse :

La spectromtrie de masse est une technique de dtection extrment sensible qui permet de dterminer
le poids molculaire dun produit pur ou de recueillir des informations structurales partir de la nature
des fragments obtenus.
Le principe de la spectromtrie de masse est bas sur lionisation des molcules introduites
dans lappareillage. Lion ainsi obtenu, appel ion molculaire, permet la dtermination de la
masse molaire du compos. Il peut y avoir rupture de liaisons chimiques au sein de lion
molculaire, avec formation dions fragments caractristiques puisque cette dissociation
ventuelle ne se fait pas au hasard mais selon des mcanismes bien dtermins. Lensemble de
ces ions constituent le spectre de masse dont la lecture permet lidentification de la structure
molculaire. Il existe plusieurs modes dionisation en spectromtrie de masse dont lionisation
par impact lectronique (IE) pour les molcules thermostables notamment les flavonodes
aglycones. Pour les molcules thermo instables comme les glycosides des techniques
dionisation douces sont utilises dont llectrospray ou ionisation par lectronbulisation
(ESI) et la Fast Atom Bombardment (FAB). Dans ces techniques en mode positif, lion
molculaire nest pas toujours observable. On observe gnralement, un ion
pseudomolculaire [M+H]
+
. Dautres ions adduits peuvent se former comme [M+Na]
+
par
addition de chlorure de sodium(NaCl). Ces informations permettent de dduire le poids
molculaire du compos tudi.




Chapitre

69



Ltude phytochimique de Centaurea parviflora
3
70
III - PARTIE EXPERIMENTALE :
III-1- ETUDE PHYTOCHIMIQUE DE CENTAUREA PARVIFLORA :
III-1-1- place dans la systmatique :
Embranchement Angiospermes
Classe Dicotyldones
Ordre Astrales
Famille Compositae
Sous-famille Tubiflores
Tribus Cynares
Genre Centaurea
Espce parviflora

III-1-2- Description de lespce C. parviflora :
Appendice des bractes sans partie scarieuse blanchtre ou partie scarieuse peu marque ; 8-
12 laciniures latrales. Plantes suffrutescentes la base, de 40-60cm, trs rameuses. Formant
des buissons serrs intriqus.
Feuilles suprieures non dcurrentes sur la tige. Petites capitules de 5mm de large sur 15mm
de long, solitaires. Appendices pine mdiane fortement rcurve.
Fleurs suprieures, aknes pubescents, ventrus, noirs, 4 stries marques, aigrette galement
le 1/3 de lakne (Figure 5).
Assez rare: en sol algrois, Oran et Tlemcen, Constantine, Hauts plateaux, elle existe en
Algrie et en Tunisie [36,37]
.
Chapitre

71
























Figure 5 :
Centaurea parviflora
3
72
III-3-Travaux antrieurs :
Les seuls travaux effectus sur Centaurea parviflora lont t au sein de notre laboratoire. Ces
travaux ont men lisolement et la dtermination de 7 flavonodes de types flavone,
rassembles dans le tableau 7 [28-35], dune lactone sesquiterpnique, la cnicine et dtect la
prsence dautres lactones sesquiterpniques [36,37].
O
O
R
3
R
4
OH
R
1
R
2

R
1
R
2
R
3
R
4
COMPOSS
OMe OMe OH OMe 5-3-dihydroxy-6, 7, 4-trimethoxyflavone.
Eupatorine [28].
OMe OH OMe OMe 5,7-dihydroxy-6, 3,4-trimethoxyflavone.
Eupatiline [29].
OMe OMe OMe OH 5,4-dihydroxy-6, 7, 3-trimethoxyflavone.
Cirsilineol [30].
OMe OH OMe OH 5, 7, 4-trihydroxy-6, 3-dimethoxyflavone.
Jacosidine[31].
OMe OMe OMe OMe 5-hydroxy-6, 7, 3, 4-ttramethoxyflavone
[33].
H OMe H OH 5,4-dihydroxy-7-mthoxyflavone.
Genkwanine [34].
H OH H OH 7,4-dihydroxy-5-mthoxyflavone [35].
Tableau 7 : Flavonodes isols de Centaurea parviflora
Chapitre

73
O
C
C
O OH
OH
16
17
18
19
20
O
HO
O
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
La cnicine

III-3-Travaux personnels:
III-3-1- Extraction de Centaurea Parviflora :
La plante a t rcolte au mois de juin de lanne 2000, de la rgion dOum el Bouaghi,
aprs schage dans un endroit sec et ar labri des rayons solaires, les feuilles broyes sont
peses (m=1815 g) et mises macrer dans un mlange de (EtOH/H
2
O) dans les proportions
70 :30.
Aprs filtration, concentration une temprature nexcdant pas 35C, cet extrait contenant
toujours de lEtOH, on ajoute H
2
O distille raison de 400ml pour 1kg de matire sche.
Llimination de la chlorophylle se fait par prcipitation par le ttra actate de plomb
(CH
3
COO)
4
Pb. Aprs quelques heures dagitation la solution devenue rouge-brune, est filtre.
Le filtrat est puis 3 fois par du chloroforme. La phase organique sche par (NaSO
4

anhydre), filtre et concentre sec une temprature nexcdant pas 35C, donnant un
extrait chloroforme de16g. La phase aqueuse est reprise et puise successivement avec
lactate dthyle, puis trois fois au n-butanol. Les trois phases n-butanol sont rassembles,
sches au sulfate de sodium anhydre (Na
2
SO
4
) filtres et concentres sec pour donner un
extrait de 28,2 g. La phase actate galement sche filtre et concentre sec, donne un
extrait 6,46g.
Les fleurs dun poids de 582,5 g subissent les tapes dextraction au chloroforme et au n-
butanol pour donner les extraits:
chloroforme (9,03 g).
n-butanol (17,31 g).
Ce protocole dextraction est rsum dans la Figure 6.
3
74




Actate dthyle(x3)
Dcantation.




Feuilles
Broyes
m=1815g
Extrait
hydrothanolique
Macration avec
(ETOH/H
2
O) 70 :30,

Filtrat
Concentration non sec t=35C,
Dilution par H
2
O (726 ml).
Prcipitation de la chlorophylle par
Le (CH
3
COO)
4
Pb, 3 H
2
O.
Filtration.
CHCl
3
(x3)
Phase
Organique
Extrait
Actate dthyle
*schage par Na
2
SO
4

anhydre.
*filtration.
Phase
Aqueuse
A jeter
Phase
Organique
*schage par Na
2
SO
4

anhydre.
*filtration.
Phase
Aqueuse
n-butanol (x3)
Dcantation
Phase
Organique
Phase
Aqueuse
Extrait
Chloroforme
*schage par Na
2
SO
4

anhydre.
*filtration.
Extrait
n-butanol
Chapitre

75
Figure 6 : Rcapitulatif du protocole dextraction des feuilles de C. parviflora
III-4- Les mthodes de Sparation chromatographique
III-4-1- Sur papier Wattman:
Lextrait n-butanol des feuilles a t soumis une investigation chromatographique
deux dimensions sur papier Wattman n 3 en utilisant pour la premire dimension le
systme Butanol /Acide actique /Eau (B A W) phase organique dans les proportions
4:1:5 et pour la deuxime dimension le systme Acide actique 15%.
Exposes lumire UV ( =365 nm), cet extrait montre une carte prsentant une
composante riche en composs phnoliques notamment htrosidiques (Figure 7-1).

Lextrait n-butanol des fleurs a t soumis deux investigations chromatographiques
monodimensionnelles sur papier Wattman n 3. La premire utilisant le systme : n-
butanol/acide actique/eau (B. A. W.), phase organique dans les proportions 4:1:5 (Figure
7-2) et la seconde utilisant le systme : acide actique 15% (Figure 7-3). Les deux
chromatogrammes obtenus montrent une richesse en composs phnoliques similaire
celle de lextrait n-butanol des feuilles.

3
76




Figure 7-2 : Chromatogramme sur papier Wattman n 3 dans le systme (B. A. W) de
lextrait n-butanol des fleurs

Figure 7-1 : Carte phnolique sur papier Wattman n 3 de lextrait n-butanol des feuilles
AcOH 15%
BAW
Chapitre

77

Figure 7-3 : Chromatogramme sur papier Wattman n 3 dans le systme acide actique 15%
de lextrait n-butanol des fleurs
III-4-2- Sparation par chromatographie sur colonne :
Plusieurs systmes de solvants ont t essays sur lextrait brut des phases n-butanol en
utilisant des plaques analytiques recouvertes de gel de silice 60 F254. La meilleure sparation
a t obtenue avec lesystme: CHCl
3
/ MeOH / H
2
O dans les proportions 6,5 / 4,5 / 1,2
(Figure 7-4). Cette analyse confirme la similitude de ces deux extraits n-butanol des feuilles et
des fleurs et confirme galement leur richesse en composs phnoliques en montrant sous
lumire de Wood des spots de couleur jaunes, bleus et noir-violets (Figure 7-4).

Figure 7-4 : Chromatogramme de comparaison des extraits n-butanol des feuilles et des fleurs
dans le systme CHCl
3
/ MeOH / H
2
O (6,5 / 4,5 / 1,2) obtenu aprs rvlation
Sur la base des rsultats de ces tests, nous avons opt pour ltude de la composante chimique
3
78
de lextrait n-butanol des feuilles do 23g ont t dposs sur une colonne de gel de silice 60
prpare dans le chloroforme. Llution a t faite par du chloroformeavec un gradient de
mthanol, introduction deau vers la fin de llution et un fractionnement tous les 25ml.
Le suivi de la composition des fractions est effectu par chromatographie sur couche mince de
gel de silice sur support aluminium. Les plaques sont visualises sous lumire UV visible
(254 et 365 nm), puis rvles par une solution dacide sulfurique (H
2
O / ACO
2
H / H
2
SO
4
:
8/1/1) et chauffes 100 C pendant 3min. Les pots de mme composition sont rassembls,
donnant ainsi 31 fractions. Le tableau 8 rassemble les rsultats de cette colonne.















Chapitre

79

Pots Fractions Eluant Observations
1-48 F1 CHCl
3
100% Graisses
49-75 F2 Graisses
76-93 F3 1 tache majoritaire
94-96 F4
CHCl
3
/MeOH
98 / 2
Mlange complexe
97-100 F5 1 tache majoritaire
101-110 F6
CHCl
3
/MeOH
95 / 5
1 tache majoritaire
111-141 F7 2 taches spares
142-147 F8
CHCl
3
/MeOH
93 / 7
2 taches majoritaires
148-188 F9 3 taches majoritaires
189-190 F10 1 tache majoritaire
191-196 F11 Mlange complexe
197-232 F12
CHCl
3
/MeOH
92 / 8
Produit pur
233-244 F13
CHCl
3
/MeOH
90 / 10
3 taches majoritaires.
245-276 F14 3 taches majoritaires
277-296 F15
CHCl
3
/MeOH
88 / 12 5 taches majoritaires
297-324 F16
325-375 F17
CHCl
3
/MeOH
85 / 15
Mlange complexe
376-383 F18
CHCl
3
/MeOH
80 / 20
3 taches majoritaires
384-398 F19
399-423 F20
424-438 F21
439-449 F22
CHCl
3
/MeOH
75 / 25
3 taches majoritaires

Tableau 8 : Les rsultats de la colonne

3
80


Tableau 8 : Les rsultats de la colonne (suite)

III-4-3- Sparation chromatographique sur plaques prparatives :

-Les fractions F6 et F12
Les tests prliminaires des fractions issues directement de la colonne de gel de silice 60, ont
montr que ces fractions montraient un spot unique aprs dpt et lution sur plaque
analytique de gel de silice 60. Ainsi aprs purification sur colonnes de gel de Sephadex LH 20
lues par du mthanol, les produits F6 (8 ,4mg) et F12 (30,9mg) ont t obtenus de ces deux
fractions.


-Les fractions F14 et F15
Ces deux fractions ont t soumises des sparations par chromatographie sur plaques
prparatives de gel de silice 60 lues par le systme Ether de ptrole/AcOEt/MeOH dans les
proportions 2 : 7 :1. Aprs purifications sur gel de Sephadex LH20, ces deux fractions ont
men : F14-1, lequel aprs une autre purification sur gel de Sephadex LH20 a donn le
Pots Fractions Eluant Observations
450-476 F23
477-504 F24
3 taches majoritaires
505-517 F25 Mlange complexe
518-546 F26
CHCl
3
/MeOH
70 / 30
Mlange complexe
547-594 F27
CHCl
3
/MeOH
70 / 30
Mlange complexe
595-642 F28
CHCl
3
/MeOH
65 / 35
2 taches majoritaires
643-662 F29
CHCl
3
/MeOH
60 / 40
Des traces de
produits
663-702 F30 2 taches majoritaires
703-776 F31
CHCl
3
/MeOH/H
2
O
60 / 40 / 10
Des traces
Chapitre

81
compos F03 (57,8mg) ; F14-2 (23,2mg) et F14-3 (52,2mg) pour F14 et F15-1 (31,4mg) ;
F15-2 (29,7mg) ; F15-3 (22,1mg) et F15-4 (3,8mg). Soit trois produits pour F14 et 4 produits
pour F15.

-Les fractions F18 F22 :
Etant donne la similitude des profils chromatographiques de ces cinq fractions sur plaque
analytique de gel de silice 60 (3 taches), nous avons procd une analyse sur une plaque de
polyamide lue par le systme H
2
O / EtOH / Mthylthylctone / Actylactone dans les
proportions 13 / 3 / 3 / 1. Cette tude a galement donn des profils trs similaires, ce qui
nous permis de les rassembler et de les chromatographier sur plaques prparatives de gel de
silice lues par le systme Ether de ptrole / AcOEt / MeOH dans les proportions 2: 7: 1. Les
trois produits ainsi obtenus ont subi une purification sur colonne de gel de Sephadex LH20
pour donner les trois composs: F20-1 (10,2mg); F20-1 (3,4mg) et F20-2 (22,6mg).


Conclusion :
Ainsi la mise profit des techniques chromatographiques sur les fractions les moins
complexes issues de la colonne de gel de silice 60, de la phase n-butanol de lextrait
hydroalcoolique des parties ariennes de Centaurea parviflora Desf. a men la sparation et
la purification de 12 produits. Tous ces produits ont t co-chromatographis sur plaque
analytique de gel de silice lue par plusieurs systmes. Cette analyse ainsi que les spectres
enregistrs plus tard et que nous dvelopperons au cours du 4
me
chapitre, ont montr que
certains produits taient les mmes, notamment F14-3 F15-3 et F15-1 F03. Ce travail de
co-chromatographie a men ce stade de nos sparations, lisolement et la purification
ltat natif de 10 composs (Figure 8).

.
3
82

Figure 8 : Rsum des travaux chromatographiques effectus
A ce stade de nos travaux, nous navons soumis lanalyse structurale que quatre composs.
Il sagit de : F12, F14-3, F20-2 et F03 (Chapitre 4). Les structures des autres produits,
actuellement en cours dtablissement feront lobjet de rsultats part.

Extrait n-butanol de
Centaurea parviflora
F6
F
6
F18 22 F15 F14 F12
30 lots
F
12
F
14-3
F
14-2
F
14-1
F
15-2
F
15-3
F
15-1
F
20-2
F
20-1
F
20-1'
F
03
F
15-4
Chapitre 4

83

Rsultats et discussion
84
RESULTATS ET DISCUSSIONS

IDENTIFICATIONS STRUCTURALES DES COMPOSES ISOLES

IV-1- Identification du compos F
20-2
:



a) Fluorescence sous lumire de Wood :
La fluorescence sous la lumire UV (365nm) de ce compos est noir-violette, indiquant une
structure de type flavone ou flavonol substitu en position 3.
b) Rsultats de lanalyse par spectrophotomtrie UV-Vis :
Enregistr dans le mthanol, le spectre de ce compos (spectre 1) montre les deux bandes
caractristiques des flavonodes. La bande II
max
=267 nm et la bande I
max
=351 nm.
La valeur de la longueur donde dabsorption maximale de la bande I confirme la nature
flavone ou flavonol 3-OR de cette molcule.
Laddition du ractif NaOH (spectre 2-1), conduit un dplacement bathochrome (+53nm) de
la bande I avec un effet hyperchrome (augmentation de lintensit), indiquant que la position
1
2
3
4
5
6
7
8
1'
2'
3'
4'
5'
6'
1"
2"
3"
4"
5"
6"
1'''
2'''
3'''
4'''
5'''
6'''
Chapitre 4

85
4 est occupe par un OH libre, de plus lapparition dune nouvelle bande
max
=327 nm
oriente vers la prsence dun OH libre en position 7. Le spectre renregistr aprs 5 minutes
(spectre 2-2) reste stable, ce qui indique vu la prsence du OH en position 4, que la position 3
comporte soit un H, soit un OR.
La comparaison des spectres enregistrs dans la mthanol en prsence de AlCl
3
(spectre 3) et
en prsence de AlCl
3
+HCl (spectre 4), ne montre aucun changement notable (pas de
dplacement hypsochrome de la bande I) ce qui suppose labsence de systme ortho
dihydroxyle sur le noyau B.
Compar au spectre enregistr dans le mthanol, le spectre enregistr en prsence de AlCl
3
+
HCl montre un dplacement bathochrome de +45 nm de la bande I. Cette observation oriente
vers un OH libre en position 5.
Le spectre enregistr dans le mthanol en prsence de NaOAc (spectre 5) montre un
dplacement bathochrome de +13 nm de la bande II confirmant ainsi la prsence du OH libre
en position 7.
250 300 350 400 450 500
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
A
b
s
o
r
b
a
n
c
e
Long d'onde (nm)
S
S+NaOH
S+NaOH+5m
250 300 350 400 450 500
0,0
0,2
0,4
0,6
A
b
s
o
r
b
a
n
c
e
Long d'onde (nm)
s'
s'+AlCl3
s'+AlCl3+HCl

Spectres 1, 2-1 et 2-2 : Spectres dabsorption Spectres 3 et 4 : Spectres dabsorption
ultraviolette du compos F20-2 dans ultraviolette du compos F20-2 dans le MeOH
le MeOH et en prsence de NaOH et en prsence de AlCl
3
et AlCl
3
+HCl
86
200 250 300 350 400 450
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
1,6


A
b
s
o
r
b
a
n
c
e
Long d'onde (nm)
F20-2
F20-2+NaOAC
F20-2+NaOAC+H3BO3

Spectre 5: Spectres dabsorption ultraviolette
du compos F20-2 dans le MeOH et
en prsence de NaOAc
Les rsultats de la srie spectrale UV-Vis du compos F
20-2
rassembls dans le tableau 9
permettent ce stade de proposer la structure partielle reporte dans la figure 9.

O
O OH
O H
R
OH
R1
R2
R6
R5
R4
R3

Figure 9: Structure partielle du compos F20-2



Chapitre 4

87


ractifs bande I (nm) bande II (nm) autres bandes observations
MeOH 351 267 Flavone ou
flavonol 3-OR
NaOH 402 274 327 4-OH, 7-OH

NaOH aprs 5 mn 402 274 327 Pas de OH en C-3
NaOAc 360 272 299 7-OH
NaOAc+H
3
BO
3
350 271 299 Absence de
systme ortho di-
OH.
AlCl
3
350 273 397 5-OH
AlCl
3
+HCl 350 273 327 Absence de
systme ortho di-
OH
Tableau 9 : Donnes de la srie spectrale UV (
max
nm) du compos F20-2

Lexamen du spectre de RMN
1
H (Spectre 6) enregistr dans le MeOH-d
4
, montre la prsence
de:
-Deux doublets dintgration 2H chacun, formant un systme AM =8,15 et =6,85 ppm,
J =9,0 Hz caractristiques des protons H-6, H-2 et H-5, H-3 respectivement, du noyau B
parasubstitu dun flavonode.
-Deux doublets formant un systme AB =6,41 et =6,22 ppm, J =2,0 Hz
caractristiques des protons H-8 et H-6 respectivement, du noyau A dun flavonode.
-Un doublet =5,25 ppm, J= 7,5 Hz, attribuable au proton anomrique dun sucre reli
laglycone par un pont oxygne vu la valeur de son dplacement chimique. La valeur de la
constante de couplage de ce proton anomrique en faveur dune interaction 1-2 diaxiale entre
ce proton anomrique et le proton en C-2 du sucre, indique que le carbone anomrique de
cette entit sucre admet une configuration et exclut la possibilit que cette entit soit un
mannose ou un rhamnose.
88
-Un doublet =4,52 ppm (J =1,7 Hz) et un doublet =1,10 ppm (J =6,2 Hz)
caractristiques du proton anomrique et du CH
3
-6 dun groupement rhamnosyle de
configuration .
-Un ensemble de multiplets dans lintervalle 3,1 3,8 attribuables par consquent, aux autres
protons des deux glycosyles.


Spectre 6 : RMN
1
H (MeOH-d
4
, 250 MHz) du compos F20-2

H-1
H-6, H-2
H-5, H-3
H-8
H-6
H-1''
O
HO
OH
OH
O
O
OH
HO
HO
O
OH
OH
HO
O
O
1
2
3
4 5
6
7
8
1'
2'
3'
4'
5'
6'
5''
6''
1'''
2'''
3'''
4'''
5'''
6'''
2''
3''
4''
1''

Chapitre 4

89


Spectre 6-1 : RMN
1
H (MeOH-d
4
, 250 MHz) du compos F20-2, talement


Lensemble de ces donnes report dans le tableau 10, montre que dans la structure partielle
prcdemment signale figure 9 : R
1
=R
2
=R
3
=R
4
=R
5
=

R
6
=H et que R est soit un
groupement rhamnoglucosyle soit un groupement rhamnogalactosyle.


Attributions des
protons
Intgration Multiplicit Constante de
couplage (Hz)
Dplacement
chimique (ppm)
H-6, H-2 H doublet 9,0 8,15
H-5, H-3 H doublet 9,0 6,85
H-1glucose H doublet 7,5 5,25

H-1rhamnose H doublet 1,7 4,52

H-6 H doublet 2 6,22
H-8 H doublet 2 6,41
CH
3
-6 3H doublet 6,2 1,10
Tableau 10 : Donnes du spectre de RMN
1
H (MeOH-d
4
, 250 MHz) du compos F20-2

Pour trouver la nature exacte du 2
me
sucre et confirmer la position en C-3 du groupement
H-6, H-2 H-5, H-3 H-8 H-6 H-1
O
HO
OH
OH
O
O
OH
HO
HO
O
OH
OH
HO
O
O
1
2
3
4 5
6
7
8
1'
2'
3'
4'
5'
6'
5''
6''
1'''
2'''
3'''
4'''
5'''
6'''
2''
3''
4''
1''

90
dioside, nous avons procd lhydrolyse acide de ce compos. En effet, aprs chauffage de
lchantillon 100C en prsence de HCl, la solution refroidie est extraite par de lactate
dthyle. Aprs schage au sulfate de Sodium anhydre et filtration, la phase organique
concentre et dpose sur une plaque recouverte de polyamide, montre une fluorescence jaune
sous lumire de Wood. Cette observation oriente vers une structure de type flavonol de
laglycone et par consquent confirme la position du groupement dioside en C-3.
La phase aqueuse est galement concentre sous vide et co-chromatographie sur une plaque
de gel de terre siliceuse Merck F
254
lue par le systme actone-eau (9 :1) avec des sucres de
rfrence. Aprs rvlation et chauffage, cette plaque, reprsente sur la figure 10, montre
clairement la prsence du glucose et du rhamnose.

Figure 10 : Co-chromatographie de la phase aqueuse avec des chantillons de rfrence
aprs hydrolyse acide du compos F20-2
.

Le fait que les deux sucres se soient dtachs de laglycone et se soient spars confirme que
laglycone est reli au substituant sucre par un pont oxygne dune part et quils sont relis
entre eux galement par le biais dun atome doxygne.
La jonction entre le glucose et le rhamnose est en faveur du type 1(rhamnose) 6(glucose)
suite aux valeurs des dplacements chimiques des deux protons anomriques [38].Cette
observation mne un groupement rutinosyle.
Chapitre 4

91
Toutes ces observations mnent la structure du 3-rutinosylkaempfrol connue sous le nom
de nicotiflorine, reporte dans la figure 11. Cette molcule a t isole despces des genres
Nicotiana, Physalis et Leucophysalis (Solonaceae) ; Cassia (Leguminosae) ; Desmanthodium,
Clibadium, Carthamus et Montana (Compositae) ; Pitcairnia (Bromiliaceae) et de Calystegia
japonica (Convovulaceae), Leptarrhena pyrolifolia (Saxifragaceae), Limnanthes douglasii
(Limnanthaceae), Fumaria parviflora (Papaveraceae), Cistus ladadifer (Cistaceae), Abies
amabilis (Pinaceae), Equisetum silvatitum (Equisetaceae), Adiantum capillus-veneris
(Adiantaceae), Acalypha indica ( Euphorbiaceae) et Paesia anfractuosa (Pteridaceae) [39,
40] mais, notre connaissance concernant le genre Centaurea (Compositae), elle na t
isolee que de Centaurea lippii dans notre laboratoire.


Figure 11 : Structure finale du compos F20-2 , la nicotiflorine

IV-2- Identification du compos F
14-3







H
HO
OCH
3
OCH
3
H
O
H
OH
H
OH
H
H
OH
H
O
OH
1
2
6
4
5
3 1
2
3
4
5
6
3
2
1
92

2-a) Aspect chromatographique :

Dpos sur une plaque de polyamide DC-6-6, ce compos nabsorbe pas la lumire UV =
365 nm mais absorbe =254 nm. De cette observation, on en dduit que F
14-3
nest pas un
flavonode.
2-b) Analyse structurale
2-b-1) RMN :
Le spectre RMN
13
C (spectre 7) enregistr dans le MeOH-d
4
dont les donnes sont reportes
dans le tableau 11 montre la prsence de signaux relatifs un noyau aromatique, 2 CH
thylniques et une entit sucre de type hexose o la prsence dun groupement CH
2
OH
exclut le rhamnose. Le spectre RMN
1
H (spectre 8) enregistr dans le MeOH-d
4
dont les
donnes sont reportes dans le tableau 12, confirme ces donnes par la prsence des signaux :
-Un singulet =6,7 ppm dintgration 2H attribuable deux protons quivalents du noyau
aromatique (
C
=104,0) ce qui oriente vers une ttrasubstitution de ce cycle.
-Un doublet =6,56 ppm (J =15,5 Hz) dintgration 1H (
C
=129,8). Les valeurs du
dplacement chimique et de la constante de couplage orientent vers la prsence dune double
liaison thylnique de configuration trans dans cette molcule.
-Un doublet de triplet =6,30ppm (J =15,5 ; 5,5 Hz) dintgration 1H (
C
=128,6). La
multiplicit de ce signal et les valeurs du dplacement chimique et des constantes de couplage
confirment la prsence dune double liaison thylnique de configuration trans dans cette
molcule et placent un groupement CH
2
en

position vicinale par rapport ce CH thylnique
(spectre 8-1.).
-Un doublet de doublets =4,25 ppm (J =5,5 ; 1,1 Hz). Les valeurs des constantes de
couplage indiquent que ce groupement est voisin du CH thylnique prcdent. La valeur du
dplacement chimique indique que ce groupement CH
2
est oxygn (
C
=62,1) spectre (8-2).
-Un singulet =3,87 ppm dintgration 6H (
C
=55,6) attribuables deux groupements
methoxyles quivalents ports par consquent par deux carbones du noyau aromatique
(
C
=152,9), vu le nombre de carbones oxygns de ce noyau.
Chapitre 4

93
-Un retour vers le spectre de RMN
13
C permet de localiser un signal
c
=103,9 ppm
attribuable au carbone anomrique du sucre. La valeur du dplacement chimique de ce
carbone indique que ce sucre ne peut tre quun glucopyranose ou un galactopyranose de
configuration [42] reli par une jonction oxygne laglycone.
Daprs lensemble de ces donnes avec en particulier la valeur dplacement chimique du 6
me

atome de carbone du noyau aromatique (134,3ppm) qui oriente vers une oxygnation ce
niveau, laglycone ne peut tre que lalcool synapylique.


Spectre 7: RMN
13
C (MeOH-d
4
, 62,9 MHz) du compos F
14-3


CH
3
C-6
C-1
C-4
C-2
C-5
C-3
C-2 ; C-6 ; C-1
C-3
C-2
C-1
C-4
C-3 ; C-5
H
HO
OCH3
OCH
3
H
O
H
OH
H
OH
H
H
OH
H
O
OH
1
2
6
4
5
3 1
2
3
4
5
6
3
2
1
94

Spectre 7-1: RMN
13
C (MeOH-d
4
, 62,9 MHz) du compos F
14-3
talement



Spectre 8: RMN
1
H (MeOH-d
4,
250 MHz) du compos F14-3
C-2 ; C-6
C-1
H-2 ; H-6
H2
H-1
H-1
H-3
H
HO
OCH3
OCH3
H
O
H
OH
H
OH
H
H
OH
H
O
OH
1
2
6
4
5
3 1
2
3
4
5
6
3
2
1
H
HO
OCH3
OCH3
H
O
H
OH
H
OH
H
H
OH
H
O
OH
1
2
6
4
5
3 1
2
3
4
5
6
3
2
1

CH
Chapitre 4

95

Spectre 8-1: RMN
1
H (MeOH-d
4,
250 MHz) du compos F14-3 talement















Spectre 8-2: RMN
1
H (MeOH-d
4,
250 MHz) du compos F14-3 talement

2-b-2) Hydrolyse acide:
Pour trouver la nature exacte du sucre, nous avons procd lhydrolyse acide de ce compos.
H-3
H-2 ; H-6
H-2
H-1
H
HO
OCH3
OCH3
H
O
H
OH
H
OH
H
H
OH
H
O
OH
1
2
6
4
5
3 1
2
3
4
5
6
3
2
1

96
En effet, aprs chauffage de lchantillon 100C en prsence de HCl 2N, la solution
refroidie est extraite par de lactate dthyle. La phase aqueuse est concentre sous vide et
co-chromatographie sur une plaque de gel de terre siliceuse F
254
lue par le systme
actone-eau (9 :1), avec des sucres de rfrences. Aprs rvlation et chauffage, cette plaque
reprsente sur la figure 12 montre clairement la prsence du glucose.

Figure 12: Co-chromatographie de la phase aqueuse avec des chantillons de rfrence aprs
hydrolyse acide du compos F14-3

Pour placer le groupement O-glucosyle sur lalcool sinapylique (sur le groupement CH
2
ou
sur le C-4 du noyau aromatique), nous avons fait appel aux rsultats de la littrature qui
montrent en effet, un dplacement chimique du carbone du groupement CH
2
70,7 ppm dans
le cas o il porte le O-glucosyle. Dans le cas o le O-glucosyle est port par le C-4 du noyau
aromatique, le dplacement chimique du carbone du CH
2
qui, par consquent est porteur dun
groupement hydroxyle rsone 63,8 ppm. Dans notre cas, le dplacement chimique du
carbone du CH
2
est de 62,1 ppm. Cette valeur nous rapproche beaucoup plus de la position du
glucosyle en C-4 du noyau aromatique (
C
=134,3) [41]. Lensemble des donnes
spectroscopiques relatives ce compos, mne la structure reprsente dans la figure 13 soit
le 3-(4-O--D-glucopyranosyl-3,5-dimethoxy)-phenyl-2E-propnol. Cette molcule isole de
Zantedeschia aethiopica (Araceae) [41] est notre connaissance nouvelle pour le genre
Centaurea (Compositae).


F
-D (+) D (+) L (+)
D (+)
Chapitre 4

97

Carbones du noyau aromatique
Dplacements chimiques
C
(ppm)
C-1 133,8
C-2 & C-6 104,0

C-3 & C-5 152,9

C-4 134,3
Carbones du glucosyle Dplacements chimiques
C
(ppm)
C-1 103,9
C-2 74,2
C-3 76,9
C-4 70,1
C-5 76,7
C-6 61,0
Carbones de la chane Dplacements chimiques
C
(ppm)
C-3 129,8
C-2 128,6
C-1 62,1
Tableau 11 : Donnes du spectre de RMN
13
C (MeOH-d
4
, 62,9 MHz) du compos F
14-3


ATTRIBUTION
DES PROTONS
INTGRATION MULTIPLICIT CONSTANTE
DE
COUPLAGE
(HZ)
DPLACEMENT
CHIMIQUE
(PPM)
H-2 & H-6 2H singulet / 6,70
H-3 H doublet 15,50 6,56
H-2 H doublet de triplet (15,50; 5,50) 6,30
H-1 2H doublet de doublet (5,50; 1,10) 4,25
2CH
3
6H singulet / 3,87
H-1 H Recouvert par le
signal de leau de
contamination du
MeOH-d
4

/ 4,75-5,00
Tableau 12 : Donnes du spectre de RMN
1
H (MeOH-d
4
, 250 MHz) du compos F
14-3


98









Figure 13 : Structure du compos F
14-3
, 3-(4-O--D-glucopyranosyl-3,5-dimethoxy)-phenyl-2


E-propenol


IV-3-Identification du compos F
12
:




Le spectre proton (spectre 9) enregistr dans le mthanol deutri montre un signal
dintgration 3H =1,23 ppm sous forme dun triplet (J =7,1Hz), attribuable un mthyle
voisin dun groupement CH
2
. Ce groupement CH
2
apparat sous forme dun doublet de
quadruplets =3,50 ppm (J =9,7 ; 7,1 Hz) signifiant que les deux protons quil renferme
sont diasterotopiques et admettent fortuitement le mme dplacement chimique. La valeur du
dplacement chimique de ce groupement suppose son oxygnation.
-Ces donnes mnent lenchanement CH
3
-CH
2
-O substituant une entit chirale.
-Lexamen du spectre Jmod (spectre 10) confirme la prsence des groupements CH
3
et CH
2
H
HO
OCH
3
OCH
3
H
O
H
OH
H
OH
H
H
OH
H
O
OH
1
2
6
4
5
3 1
2
3
4
5
6
1
2
3
O
OH
HO
O
HO
1
2
1'
2'
3'
4'
5'
Chapitre 4

99
prcdents =14,0 ppm et =61,6 ppm respectivement et montre par ailleurs un autre
groupement CH
2
oxygn =62,9 ppm et 4 groupements CH =83,7 ; 82,1 ; 77,2 et 107,8
ppm. La valeur du dplacement chimique du dernier groupement CH indique quil est
doublement oxygn. Cette observation additionne la prsence des trois autres CH
oxygns, daprs la valeur de leur dplacement chimique, oriente vers la prsence dun sucre
de type pentose substitu par un groupement thyle attach par un pont oxygne la position
anomrique.
-La comparaison des dplacements chimiques de lensemble des atomes de carbone du sucre
avec les rsultats de la bibliographie oriente vers un pentose de type furanose. Lhydrolyse
acide de ce compos libre larabinose que nous avons identifi par co-chromatographie avec
des chantillons de rfrence (Figure 14). La configuration du carbone anomrique a t
tablie par rapport la valeur du dplacement chimique du carbone anomrique [42].
Lensemble de ces rsultats mne la structure reprsente dans la figure 15, soit lO--D-
arabinofuranosyl thane. Il est noter qu notre connaissance, cette molcule nest pas
dcrite dans la littrature [42, 43]. Les donnes spectroscopiques de ce compos sont
reportes dans le tableau 13.


Figure 14 : Co-chromatographie de la phase aqueuse avec des chantillons de rfrence aprs
hydrolyse acide du compos F
12.



100



Position
H
(ppm) Multiplicit J (Hz)
C
(ppm)
1 1,23 t 7,1 14,0
2 3,50 dq 9,7 ; 7,1 61,6
1 3,80 d 2,9 107,8
2 3,76 dd 4,9 ; 4,4 82,1
3 3,85 dd 5,9 ; 5,2 77,2
4 3,94 m / 83,7
5 3,65 dd 5,2 ; 2,0 62,9
Tableau 13 : Donnes des spectres RMN
1
H (MeOH-d
4
, 250 MHz) et
RMN
13
C, squence J mod (MeOH-d
4
, 62,9 MHz)


Spectre 9: RMN
1
H (MeOH-d
4
, 250 MHz) du compos F12
O
OH
HO
O
HO
1
2
1'
2' 3'
4' 5'

Chapitre 4

101

Spectre 9-1 et 9-2: RMN
1
H (MeOH-d
4
, 250 MHz) du compos F12, talements



Spectre 10: Jmod (MeOH-d
4
, 62,9 MHz) du compos F12

CH
CH
2
H-5
CH
H-2
H-2
H-1
H-3
H-4
C-1 C-4
C-2
C-3
C-5
C-1
C-2
O
OH
HO
O
HO
1
2
1'
2' 3'
4' 5'

102

O
OH
HO
O
HO
1
2
1'
2'
3'
4'
5'

Figure 15 : Structure du compos F
12
, O--D-arabinofuranosyl thane




IV-4- Identification du compos F
03
:




La dtermination de la structure du compos F
03,


a t effectue sur la base des spectres
RMN
1
H, RMN
13
C avec sa squence DEPT-135, la RMN bidimensionnelle homonuclaire
et htronuclaire (
1
H ,
1
H) COSY, NOESY, HMBC, et la spectroscopie de masse ESI.

Donnes de la spectromtrie de masse ESI :
-Le spectre ESI MS (spectre 11) montre des ions quasi-molculaires m/z=687,2 ; 371,1 et
333,1 correspondant [2M+Na]
+
, [M+Na]
+
et [M+H]
+
et montre galement un ion
O
O
H
3
C
O
H
Et
H
CH
3
O
OH
OH
OH
HO
1
2
3
4
5
6
3'
1'
2'
4'
5'
6'
Chapitre 4

103
m/z=171,1 correspondant [M-162]
+
. Ses rsultats orientent vers une molcule de masse 332
Da, de formule brute de C
15
H
24
O
8
et comportant un groupement glycosyle de type hexose. De
ce fait laglycone admet comme formule brute C
9
H
14
O
3
et renferme par consquent, trois
insaturations.


Spectre 11 : Spectre ESIMS du compos F
03

Donnes de spectres de RMN :
Lexamen des spectres de RMN
13
C (spectre 12),
1
H (spectre 13), DEPT-135 (spectre 14),
COSY (spectre 15), HSQC (spectre 16), HMBC (spectre 17) et NOESY (spectre 18) permet
de localiser les signaux relatifs au glycosyle notamment le groupement CH
2
OH
C
=61,6
ppm, (
H-6a
=3,87 ; dd ; J =12,3; 2,1 Hz)
H-6b
=3,63 ; dd ; J =12,3; 6,3 Hz ) ppm, les
groupements CH
C
=70,1; 73,7; 76,8; 77,4; 98,6 ppm Ce dernier, vu son dplacement
chimique est attribuable au carbone anomrique C-1' (
H
=4,96 ppm ; J =7,2 Hz) reli
laglycone par un pont oxygne. La valeur de la constante de couplage du proton anomrique
indiquant une interaction diaxiale avec le proton en C-2 de ce sucre est en faveur dun
galactosyle ou un glucosyle avec une configuration du carbone anomrique.
Les dplacements chimiques de lensemble des atomes de carbone des groupements CH
O
O
H
3
C
O
H
Et
H
CH
3
O
OH
OH
OH
HO
1
2
3
4
5
6
3'
1'
2'
4'
5'
6'

104
relatifs ce sucre compars ceux de la littrature [42], orientent vers un glucosyle tableau
14.
-Le spectre de RMN
13
C (Spectre 12), montre en plus des signaux relatifs au groupement
glucosyle, 9 autres signaux confirmant ainsi, les donnes de la spectromtrie de masse
concernant laglycone. Associs aux donnes des spectres relatifs aux expriences DEPT
(spectre14, 14-1) et HSQC (spectre16) et celles du spectre proton, les noyaux correspondant
ces signaux relatifs laglycone, peuvent tre rpartis comme suit :
-Trois carbones quaternaires dont :
*Un carbonyle dester ou de lactone -insature
C
=171,2 ppm
*Un carbone thylnique quaternaire
C
=104,7 ppm.
*Un carbone hybrid sp
2
quaternaire
C
=170,2 ppm. Ce carbone ne peut tre que celui
formant une double liaison avec le prcdent. Vu la valeur de son dplacement chimique et la
formule brute de cette molcule, il doit tre oxygn.
-2 groupements CH hybrids sp
3
dont :
*Un CH oxygn
C
=80,2 ppm (
H
=4,32 ; ddd ; J =8,7 ; 5,7 ; 2,7Hz), ce carbone ne peut
tre que celui reli loxygne de la fonction ester prcdemment signale. La valeur de son
dplacement chimique oriente vers un carbone de fermeture dun cycle lactonique. A ce stade
de notre analyse, les trois insaturations que renferme laglycone de cette molcule sont
donc un cycle lactonique comportant une double liaison dont lun des carbones est oxygn
(spectre 12-1).
*Un CH
C
=31,8 ppm (
H
=2, 81; m)
-1 groupement CH
2

C
=24,2 ppm (
H
=1,64; m ; et 1,78 ; m, partiellement recouvert par le
signal dun CH
3
), Cette inquivalence magntique de ces deux protons indique quils sont
voisins dun centre asymtrique.
-3 groupements CH
3
, dont :
*Un CH
3

C
=9,1 ppm (
H
=1,04 ppm ; triplet ; J =7,2 Hz) ; la multiplicit du signal des
Chapitre 4

105
protons de ce CH
3
indique quil est reli au groupement CH
2
prcdemment signal.
*Un CH
3

C
=10,0 ppm (
H
=1,12 ppm ; doublet ; J =7,0 Hz) ; la multiplicit du signal des
protons de ce CH
3
indique quil est reli un groupement CH et qui ne peut tre que le CH
rsonant
H
=2,81 ppm (
C
=31,8 ppm) prcdemment signal.
*Un CH
3

C
=8,4 ppm (
H
=1,78 ppm ; singulet) ; la multiplicit du signal des protons de ce
CH
3
indique quil est reli un carbone quaternaire qui ne peut que le carbone thylnique

C
=104,7 ppm.Spectres (13,13-1, 14,14-1)
Lexamen du spectre COSY (Spectre 15), confirme la prsence du groupement thyle par une
tache de corrlation entre les protons du groupement CH
2
et ceux du groupement CH
3

H
=1,04 ppm (
C
=9,1 ppm) et montre galement une corrlation entre le proton du CH
oxygn (CH de fermeture de la lactone) et ce groupement CH
2
. Cette donne permet de relier
ce CH au groupement thyle. Ce spectre qui, confirme la corrlation entre les protons du
mthyle
H
=1,12 ppm et le proton du groupement CH
H
=2,81 ppm, montre galement
une corrlation entre ce dernier proton et celui du CH de fermeture de la lactone. Ces donnes
mnent lenchanement : CH
3
-CH
2
-CH-CH-CH
3
dans cette molcule.
Lexamen du spectre relatif lexprience HMBC (Spectre 17), confirme la jonction du
groupement mthyle
C
=8,4 ppm (
H
=1,78 ppm) au carbone thylnique quaternaire

C
=104,7 ppm par une tache de corrlation entre les protons de ce groupement et cet atome de
carbone et montre une tache de corrlation entre les protons de ce mme mthyle et le carbone
du carbonyle de la lactone. Cette observation permet de placer la double liaison en du
carbonyle. Ce spectre (HMBC) montre galement des taches de corrlation entre les protons
du mthyle
C
=10,0 ppm (
H
=1,12 ppm), le proton du groupement CH
C
=31,8 ppm
(
H
=2,81ppm), le proton anomrique du sucre
C
=98,6 ppm (
H
=4,96 ppm) et le carbone
thylnique oxygn
C
=170,2 ppm. Ces observations permettent de placer, dune part le
groupement O-glucosyle sur ce carbone thylnique et dautre part de relier ce dernier au
carbone porteur du mthyle
H
=1,12 ppm et du proton
H
=2,81 ppm.
La combinaison de lensemble de ces donnes montre que le compos F
03
est une -lactone
-insature, substitue par un groupement thyle, un groupement mthyle et un groupement
O-glucosyle comme report dans la figure16.
106

1 2
3
O
O
O
OH
OH O H
O
H
OH
5
6
4

Figure 16 : Structure du compos F
03
(aglyconeplane)
Lexamen du spectre NOESY (Spectre 18) montre une tache de corrlation entre les protons
du groupement mthyle en C-5 et le proton H-6, cette observation indique que les
groupements thyle et mthyle admettent une disposition trans. Ce spectre montre galement
une corrlation entre le proton anomrique du glucosyle et le proton H-5 ce qui leur confre
une disposition cis et les placerait daprs les modles molculaires comme reprsent dans la
figure 17.
Ainsi le compos F
03
est une delta lactone glucosyle connue sous le nom de cornicinine. Elle a
t isole de Nephrotoma cornicina (Linnaeus, 1758), un insecte o elle est prsente chez les
deux sexes, dans la tte, le thorax, labdomen, les pates et les ailes. Elle a t galement
synthtise ainsi que plusieurs de ses drivs car elle est doue dactivits biologiques
remarquables. Ces travaux ont fait lobjet dun brevet dpos en 2003 par une quipe de
chercheurs belges [44]. Il est noter que cette molcule na jamais t dcrite partir dune
espce vgtale. Par ailleurs, lespceNephrotoma cornicina (Linnaeus, 1758), trs distribue
en Europe et en Asie nest nullement signale en Afrique du Nord. Cette donne attenue
lventualit dun artefact introduit par la prsence ventuelle de cet insecte dans notre matriel
vgtal qui est dailleurs trs peu probable. Les donnes spectroscopiques relatives cette
molcule sont reportes dans les tableaux 14 et 15.


Chapitre 4

107
O
O
H
3
C
O
H
Et
H
CH
3
O
OH
OH
OH
HO
1
2
3
4
5
6
3'
1'
2'
4'
5'
6'


Figure 17 : Structure finale du compos F03 (cornicinine)




















Tableau 14: Donnes du spectre de RMN
13
C (MeOH-d
4
, 75 MHz) du compos F
03

CARBONES PPM (cd
3
od, 75 MHZ)
CH
3
(3) 9,1
CH
3
(6) 8,4
CH
3
(5) 10,0
CH
2
(thyle) 24,2
C-5 31,8
CH
2
(sucre) 61,6
C-4 70,1
C-3 73,7
C-5 77,4
C-2 76,8
C-6 80,2
C-1 98,6
C-3 104,7
C-4 170,2
C-2 171,2
108
Tableau 15: Donnes du spectre de RMN
1
H (MeOH-d
4
, 300 MHz) du compos F
03




PROTONS PPM MULTIPLICIT J (HZ)
CH
3
(6) 1,04 t
3
J
CH2-CH3
=7,2
CH
3
(5) 1,12 d
3
J
CH-CH3
=7,0
CH
2
(thyle) 1,64
1,78
m
m

CH
3
(3) 1,78 s
H-5 2,81 m
H-2+H-4 3,40 m
H-3+H-5 3,45 m
H-6a 3,87 dd
2
J
6a-6b
=12,3 ;
3
J
6a-5
=2,1
H-6b 3,63 dd
2
J
6b-6a
=12,3 ;
3
J
6b-5
=6,3
H-6 4,32 ddd
3
J
6-CH2a
=8,7 ;
3
J
6-CH2b
=5,7 ;
3
J
6-5
=2,7
H-1
4,96 d
3
J
1-2
=7,2
Chapitre 4 109


Spectre12: RMN
13
C (MeOH-d
4
, 75 MHz) du compos F03

Spectre 12-1: RMN
13
C (MeOH-d
4
, 75 MHz) du compos F03 talement
C6
C4 C3
C2
C5
C6
O
O
H
3
C
O
H
Et
H
CH
3
O
OH
OH
OH
HO
1
2
3
4
5
6
3'
1'
2'
4'
5'
6'

O
O
H
3
C
O
H
Et
H
CH
3
O
OH
OH
OH
HO
1
2
3
4
5
6
3'
1'
2'
4'
5'
6'
OH 2'
C6
C5
C2
C3C4 C6
C4 C2
C3
C1'
C5 CH
2
(6) CH
3
110


Spectre 13: RMN
1
H (MeOH-d
4
, 300 MHz) du compos F03


Spectre 13-1: RMN
1
H (MeOH-d
4
, 300 MHz) du compos F03 talement

H6b
H6a
H6
H1
H2+H4
H5+H3
H5
CH
2
CH
3
(3)
CH
3
(5)
CH
3
(6)
H2+H4
H5+H3
H6b H6a
O
O
H
3
C
O
H
Et
H
CH
3
O
OH
OH
OH
HO
1
2
3
4
5
6
3'
1'
2'
4'
5'
6'

O
O
H
3
C
O
H
Et
H
CH
3
O
OH
OH
OH
HO
1
2
3
4
5
6
3'
1'
2'
4'
5'
6'

Chapitre 4 111

Spectre14: DEPT-135 (MeOH-d
4
, 300 MHz) du compos F03

Spectre 14-1: DEPT-135
13
C (MeOH-d
4
, 300 MHz) du compos F03 talement
O
O
H
3
C
O
H
Et
H
CH
3
O
OH
OH
OH
HO
1
2
3
4
5
6
3'
1'
2'
4'
5'
6'
OH 2'
O
O
H
3
C
O
H
Et
H
CH
3
O
OH
OH
OH
HO
1
2
3
4
5
6
3'
1'
2'
4'
5'
6'


O
O
H
3
C
O
H
Et
CH
3
O
OH
OH
OH
HO
1
2
3
4
5
6
3'
1'
2'
4'
5'
6'
C1' C6C5'
C2'
C3' C4'
CH
2
(6') CH
2
(6)
C5
CH
3
(5)
CH
3
(3)
CH
3
(6)
C1' C6C5'C2' C3' C4'
CH
2
(6')
C5
CH
2
(6)
CH
3
(3)
CH
3
(5)
CH
3
(6)


Spectre 15: Spectre COSY (MeOH-d
4
, 300 MHz) du compos F03








O
O
H
3
C
O
H
Et
H
CH
3
O
OH
OH
OH
HO
1
2
3
4
5
6
3'
1'
2'
4'
5'
6'
OH 2'
H1
H1
H6
H6
H6'a
H6'b
H6'a
H6'b
H-5
H5
CH
CH




















2



Spectre 16: Spectre HSQC(MeOH-d
4
, 300 MHz) du compos F03


H1 H6
O
O
H
3
C
O
H
Et
H
CH
3
O
OH
OH
OH
HO
1
2
3
4
5
6
3'
1'
2'
4'
5'
6'

C5
H5
C1
C6
H5 H6'b H6'a H1'
C5
C6'
C6
C1'



H6
O
O
H
3
C
O
H
Et
H
CH
3
O
OH
OH
OH
HO
1
2
3
4
5
6
3'
1'
2'
4'
5'
6'

Chapitre 4 3

Spectre 17: Spectre HMBC (MeOH-d
4
, 300 MHz) du compos F03




Spectre 18: Spectre NOESY (MeOH-d
4
, 300 MHz) du compos F03












H5 H1 H6
CH (6)
CH (3)
CH (5)
H5
H6
H1
O
O
H
3
C
O
H
Et
H
CH
3
O
OH
OH
OH
HO
1
2
3
4
5
6
3'
1'
2'
4'
5'
6'

4
Conclusion

Ainsi cette tude phytochimique, que nous avons mene sur lisolement et la dtermination des
mtabolites secondaires de la phase n-butanol des parties ariennes de Centaurea parviflora a
permis lobtention et la dtermination structurale de quatre composs natifs dont :
- un flavonode diglycosyl de type flavonol isol du genre Centaurea uniquement dans
notre laboratoire: la nicotiflorine ou 3-rutinosyl kaempfrol
- un compos phnolique glucosyl driv de lalcool sinapyilique nouveau pour le genre
Centaurea : le 3- (4- O- - D- glucopyranosyl- 3,5- dimethoxy)- phenyl- 2E-propenol)
- un hydrocarbure glycosyl que nous reportons pour la premire fois dans la littrature : le O-
-D-arabinofuranosyl thane
- une -lactone ,-insature glucosyle nouvelle pour le rgne vgtal : la cornicinine






















Conclusion Gnrale

Ce travail caractre phytochimique et structural portant sur linvestigation de la phase n-
butanol de lextrait hydroalcoolique des parties ariennes de Centaurea parviflora desf.
(Compositae) effectu en complment dune tude ralise dans notre laboratoire sur la phase
chloroforme, a permis lisolement et ltablissement des structures de 4 composs dont :
- un nouveau pour le rgne vgtal (la cornicinine)
- un que nous dcrivons pour la premire fois dans la littrature (O--D-arabinofuranosyl
ethane)
- deux nouveaux pour le genre Centaurea (la nicotiflorine ou 3-rutinosyl kaempferol et le
3- (4- O- - D- glucopyranosyl- 3,5- dimethoxy)- phenyl- 2E-propenol)

Les structures ont t tablies par la combinaison des donnes de RMN
1
H, RMN
13
C, des
expriences de RMN bidimensionnelles, de la spectroscopie dabsorption ultraviolette et de la
spectromtrie de masse.



6
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Rsum
Notre but dans ce travail consiste en lisolement et la dtermination des mtabolites
secondaires contenus dans la phase n-butanol de lextrait hydrothanolique de des parties
ariennes de Centaurea parviflora (Compositae), une espce endmique de lAlgrie et de la
Tunisie.
Notre choix repose sur le fait que le genre Centaurea a montr dune part quil est dou
dactivits biologiques et dautre part que cest un excellent accumulateur de molcules de
type lactone sesquiterpnique et flavonique, des classes de substances naturelles qui ont
montr des activits biologiques diverses notamment cytotoxique pour la premire et
antioxydante pour la seconde.
Aprs macration du matriel vgtal dans une solution thanol-eau (7 :3 v/v),
filtration et concentration, la solution additionne deau distille subit des affrontements
successifs par des solvants de polarit croissante : chloroforme, actate dthyle et n-
butanol menant aux trois respectives. La phase n-butanol est soumise la sparation et la
purification par diverses mthodes de chromatographie liquide (colonne, papier, couche
mince) conduisant lisolement et la purification de 4 composs natifs qui sont:
1) L a nicotiflorine (3-rutinosyl kaempfrol)
2) Le 3- (4- O- - D- glucopyranosyl- 3,5- dimethoxy)- phenyl- 2E-propenol.
3) LeO--D-arabinofuranosyl thane
4) La cornicinine
Ltablissement des structures de ces composs a t ralis par la combinaison de leurs
donnes spectroscopiques, notamment les rsultats des tudes de leurs spectres UV, RMN-
1
H, RMN-
13
C, DEPT, HSQC, NOESY, HMBC et de lanalyse des spectres de masse en
mode ESI.
A notre meilleure connaissance tous ces produits sont nouveaux pour le genre Centaurea
dans la littrature. Le premier compos na t isol de ce genre que dans notre laboratoire.
Le dernier compos (la cornicinine) est nouveau pour tout le rgne vgtal. Il est noter
galement, que le troisime compos (O--D-arabinofuranosyl thane) nest pas signal dans
la littrature.
Mots cls : flavonodes, Composs phnoliques, -lactone glucosyle, Centaurea parviflora,
Compositae.


Abstract

The aim of this work is to isolate and determine secondary metabolites present in the n-
butanol soluble part of the aqueous-ethanol extract of the aerial parts of Centaurea parviflora
(Compositae). Centaurea parviflora is an endemic species to Algeria and Tunisia.
Our choice for this subject was guided by the fact that genus Centaurea shows various
biological activities and is an excellent accumulator of sesquiterpene lactones and flavonoids.
These classes of natural substances are well known for their various biological activities, in
particular cytotoxic and antioxidant, respectivdy.
After maceration of the plant parts with EtOH-H
2
O (7:3 v/v), filtration then concentration,
the remaining solution was diluted with distilled water and extracted repeatedly with CHCl
3
,
EtOAc and n-BuOH, to give the 3 respective extracts. The n-BuOH extract was separated the
following by various methods of liquid chromatography (column, paper, TLC) to give 4 pure and
native compounds:
1) nicotiflorin (kaempferol 3-rutinoside)
2) 3- (4- O- - D- glucopyranosyl- 3,5- dimethoxy)- phenyl- 2E-propenol.
3) ethaneO--D-arabinofuranoside
4) cornicinin
The structures of these compounds were established by the combination of their spectroscopic
data, notably the analysis of UV, RMN-
1
H, RMN-
13
C, DEPT, HSQC, NOESY, HMBC spectra
as well as by ESIMS.
To the best of our knowledge, all these compounds are new for the genus Centaurea. The first
compound was isolated from this genus only in our laboratory. The last compound cornicinin is
new for all the reign plant. It is also important to note that the third compound ethaneO--D-
arabinofuranoside has not been described in the literature.

Keywords: flavonoids, phenolic compounds, -lactone glucoside, Centaurea parviflora,
Compositae.





:
q Z o R A | g DA n A O O > Y t H o L Z A n t L Oq _ t A k GG A o b _ q k _ Go _ Y o B _ t O E q_ k o A a ) GG GY o H o (
. Centaurea parviflora
> Y GGA o C T q E n GE q_ Y o g A E A _ OE E E o g G E A a L I 8 o ? n GT D dn GT D dn
g E q_ Y A o . t _ A K o B _ Y | l t E o G E n T A n G n GE D_ o _ E G o T Oo On (Cytotoxique) r G E n o | t _ A Y o GGE A o
) Antioxydante ( D Z o t _ A Y o GGE A o G E D_ o _ E Go T E o H A G H GE q_ Y A o g G G > Y qA t H o L Z .
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( Z A r g E ) AcOEt ( B H o o _ q k _ Go ) n-BuOH ( GE o n _ Gq Y q > Y GA T A o :
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GE A k O 04 U L g G n :
1) L a nicotiflorine (3-rutinosyl kaempfrol)
2) Le 3- (4- O- - D- glucopyranosyl- 3,5- dimethoxy)- phenyl- 2E-propenol.
3) LeO--D-arabinofuranosyl thane
4) La cornicinine
GE A E o a o / Y U G _ c E O Z g G C L I A O ) GE DE A A Go a _ GH | GE E n UV U E E A 8 B _ A o k q o GE E n U : , RMN-
1
H, RMN-
13
C, DEPT, HSQC, NOESY, HMBC GY Oo E Y O / E ESIMS .
c q U A t Y g > Y > Y o _ O 2 > o g G o C L j > o g q A z 04 E A D U g A D
Centaurea K n | n q3 U U r E A a L U c Y O l A B o | j U (la cornicinine)
G E k GA o G OY t t Y o G GE A o A D . o R A E q t o Z o (O--D-arabinofuranosyl
thane) G E o D U C A B .

GE g O g t Y : U g E q_ Y A o U GE o _ A E A o g G - U Y A _ OE Y D Centaurea parviflora GG GY o H o U .