Reporte 5: Ratones transgenicos

Olga Leticia Ramirez Ramirez

Laboratorio de Biofisica
El ratn (GM)
Tras la publicacin de la secuencia y el anlisis de una variedad de ratn en
diciembre de 22! el ratn se convirti en el modelo de animal preferido
para la mayor"a de los e#perimentos de laboratorio$ %l potencial de los
ratones para la manipulacin gen&tica a'ora 'ace (ue se prefieran estos a
las ratas y a otros roedores) tanto en las pruebas de seguridad como en la
investigacin fundamental$ Los ratones gen&ticamente modificados *+,-)
transg&nicos y .noc./out) son a'ora valiosas 'erramientas en la mayor"a de
los campos de la investigacin m&dica$
%l ratn representa un e#celente modelo para la enfermedad 'umana)
por(ue la organizacin de su 012 y la forma en la (ue se e#presan sus
genes son muy similares a las de los seres 'umanos$ 3us sistemas
reproductores y nerviosos son como los de los 'umanos y padecen muc'as
de las mismas enfermedades) como el cncer) la diabetes e incluso la
ansiedad$ La manipulacin de sus genes puede llevarlos a desarrollar otras
enfermedades (ue naturalmente no les afectan y) como resultado) la
investigacin con ratones 'a ayudado a comprender tanto la fisiolog"a
'umana como las causas de la enfermedad$
2ntes de la tecnolog"a gen&tica) los ratones se somet"an a cr"a
consangu"nea para producir variedades de laboratorio con caracter"sticas
particulares$ %stas variedades consangu"neas eran gen&ticamente muy
similares) lo (ue 'ace (ue resulten ideales para estudiar los cambios
producidos por la modificacin gen&tica$
Qu es un ratn transgnico?
4n ratn transg&nico es a(uel cuyos cromosomas 'an sido alterados) de
forma (ue sus genes contienen 201 e#tra5o$ %stos genes se encuentran en
el n6cleo de todas las c&lulas del cuerpo) por lo (ue todas las c&lulas del
ratn contienen el nuevo 201$ %l 201 e#tra5o puede proceder de cual(uier
fuente y puede ser 'umano) de otro animal o de otro ratn$
%l cambio del 201 normalmente 'ace (ue las c&lulas ad(uieran una
funcin) como la produccin de una nueva prote"na$ 7or e8emplo) algunos
ratones transg&nicos producen prote"nas reconocidas por las c&lulas
inmunolgicas 'umanas y se pueden utilizar para modelizar determinados
aspectos de una enfermedad$ %n ocasiones el 201 e#tra5o puede significar
una p&rdida) en lugar de la ad(uisicin) de una funcin) dado (ue el nuevo
201 podr"a interferir en una v"a bio(u"mica o impedir la produccin de una
determinada prote"na$
Los ratones transg&nicos son modelos 6tiles para entender cmo los genes
regulan los procesos en el cuerpo) por(ue el efecto (ue cambia un
determinado gen se puede ver en todo el organismo$ Tambi&n se utilizan
para estudiar enfermedades 'umanas (ue son causadas por 9errores9 en la
forma en (ue el organismo produce determinadas prote"nas$ 7or e8emplo)
en la 'emofilia 2) el gen crucial codifica una prote"na conocida como factor
:;;;) necesaria para la coagulacin de la sangre$
Produccin de ratones transgnicos
Las dos t&cnicas principales para introducir el 201 e#tra5o en el ratn son
a trav&s de la inyeccin pronuclear o mediante el uso de c&lulas madre
embrinicas$
%n la inyeccin pronuclear) el 201 e#tra5o es inyectado en el pron6cleo de
un ovocito de ratn) (ue se forma inmediatamente despu&s de (ue 'aya
sido fertilizado$ %l 201 e#tra5o se integra en el genoma en una posicin
aleatoria) normalmente despu&s de (ue se 'aya producido la primera o la
segunda divisin celular$ %sto significa (ue el ratn no portar 201
transg&nico en todas sus c&lulas y) por lo tanto) solamente ser
parcialmente transg&nico$ %l esperma o los ovocitos transg&nicos de estos
ratones son posteriormente utilizados para crear la siguiente generacin de
ratones completamente transg&nicos$
<uando se introduce el 201 en las c&lulas madre embrinicas)
normalmente se integra aleatoriamente en el genoma) pero si tiene una
estructura similar a una parte e#istente del genoma puede ser
=reconocido> por el 201 *de forma (ue se somete a una recombinacin
'omloga- y se integra una 6nica copia en el genoma) en una ubicacin
espec"fica$ 2 continuacin) estas c&lulas embrinicas necesitan crecer y son
inyectadas en un embrin 'ospedador) convirti&ndose en parte del ratn
(ue crece a partir de ese embrin$ %l ratn crecido del embrin 'ospedador
es conocido como (uimera y se forma de las c&lulas embrinicas de dos
ratones diferentes$ 7arte del esperma producido por la (uimera ser
transg&nico *conteniendo el 201 e#tra5o- y cuando ese esperma fertilice
un ovocito normal) el ratn (ue crecer del mismo ser completamente
transg&nico) con 201 e#tra5o en todas las c&lulas$
Ratn knock-out
%l desarrollo ms reciente de las variedades de ratn .noc./out *o .noc./in-
durante la d&cada de los oc'enta supuso un importante avance para la
gen&tica$ %sta tecnolog"a permite alterar determinados genes de la cadena
de 201) normalmente retirados) aun(ue tambi&n pueden ser inactivados o
insertados$ %sto permite a los investigadores determinar la funcin e#acta
de un determinado gen y estos ratones +, 'an proporcionado e#celentes
modelos para numerosas enfermedades 'umanas) (ue no se podr"an 'aber
estudiado con animales anteriormente$ La secuenciacin y el anlisis del
genoma del ratn 'an permitido seleccionar y estudiar muc'os genes
empleando esta tecnolog"a$ Los creadores del primer ratn .noc.out
obtuvieron el 7remio 1obel de ,edicina en 2?$
Creacin del ratn knock-out
Los ratones .noc./out y .noc./in se producen mediante la seleccin de
genes$ %sta t&cnica permite alterar un determinado gen del genoma del
ratn) sustituy&ndolo por una secuencia gen&tica similar (ue 'a sido
modificada para (ue contenga una mutacin$ 2 mutacin a menudo evita
(ue el gen funcione$ <uando los genes estn =inactivados> *.noc.ed/in-) un
gen de ratn normalmente se sustituye por un gen similar del genoma
'umano$
%l gen mutante se crea en un plsmido bacteriano) (ue se inyecta en las
c&lulas madre embrinicas del ratn) normalmente de un ratn mac'o$
%stas c&lulas son de un embrin de ratn muy temprano y se dividirn para
formar todos los tipos de c&lulas en el organismo$ %l ob8etivo es (ue el
material gen&tico mutante del plsmido forme 201 en el esperma del ratn
cuando &ste se 'aya desarrollado por completo$ 4na vez (ue el plsmido se
encuentra en el interior de una c&lula madre) las dos secuencias de 201
similares intercambian material gen&tico mediante la recombinacin
'omloga) (ue cambia el nuevo gen mutante en el genoma del ratn$ %stas
c&lulas madre son despu&s implantadas en un embrin 'ospedador para
(ue se desarrollen$ 1ormalmente se seleccionan ratones con el pela8e de
diferentes colores como 'ospedadores) para (ue est& claro (u& ratn es el
(ue tiene los genes mutantes$
<uando nace el ratn es una (uimera) dado (ue solamente algunas de sus
c&lulas estarn modificadas$ %ste ratn tendr el pelo de ambos colores$
<uando el esperma del ratn (uimera fertilice un ovocito normal) parte de
su descendencia portar una 6nica copia del gen mutante$ %stos ratones
tendrn el pela8e del mismo color (ue el ratn cuyo 201 fue alterado
originalmente$
Knock-in
%n clonacin molecular y biolog"a) un @noc./in se refiere a un m&todo de
ingenier"a gen&tica (ue involucra la introduccin de un 012 en un locus
particular del cromosoma del organismo$ 1ormalmente) ese es 'ec'o
usando un ratn modelo ya (ue son fciles de criar y muestran un corto
desarrollo$ 0e esta manera un ratn .noc./in es a(uel al (ue se le 'a
sustituido una secuencia g&nica por otra diferente o modificada$ %s una
t&cnica en la cual los cient"ficos pueden estudiar el funcionamiento de la
ma(uinaria regulatoria *un e8emplo ser"a el promotor- (ue gobierna la
e#presin del gen natural siendo remplazado$ %sto es logrado observando
el nuevo fenotipo del organismo en cuestin$ %sta t&cnica es bsicamente
lo opuesto de un @noc.out de genes
Knockouts condicionales
Los .noc.out son ratones a los (ue se 'a inactivado o eliminado
e#perimentalmente uno o ms genes$ %stos .noc.out son valiosos aliados
para averiguar la funcin del gen (ue les falta$ 3in embargo) cuando el
investigador AtocaA un gen especialmente importante para el desarrollo o el
metabolismo del organismo) a veces acaba consiguiendo ratones (ue
mueren antes de nacer o tras unos pocos d"as de vida$ 7ara el investigador
esto es bueno a priori) ya (ue este resultado le indica (ue el gen es
esencial) uno de esos (ue se encuentran una vez en la vidaB pero al
mismo tiempo) su modelo animal no le permite ir muc'o ms all) ya (ue
se (ueda sin material con el (ue seguir estudiando los efectos del gen (ue
acaba de descubrir$
7ara lograr salvar este inconveniente fueron desarrollados los .noc.out
condicionales$ %ste tipo de ratones poseen una modificacin en el gen de
inter&s (ue podr"amos denominar silenciosa$ 0ic'a modificacin consiste
en un mecanismo interruptor (ue provoca la inactivacin del gen (ue se
est estudiando slo en un te8ido o en un tipo celular concreto$ 0e esta
forma) el investigador puede mantener el gen funcional en el resto del
animal) al mismo tiempo (ue puede estudiar su funcin de manera muc'o
ms espec"fica$
%n la actualidad los sistemas de .noc.out condicional estn basados en la
recombinacin espec"fica de sitio) (ue en realidad no es sino una forma
ms por la (ue el material gen&tico se las arregla para reordenarse en
muc'os organismos de forma natural$ %n el caso de los .noc.outs
condicionales) el sistema de recombinacin ms conocido y utilizado es el
llamado <reClo#7$
%ste sistema de recombinacin procede de un virus (ue infecta bacterias)
en este caso el bacterifago 7!$ La belleza del sistema radica *como casi
siempre suele ocurrir- en su simplicidad: una recombinasa llamada <re) (ue
reconoce dos secuencias cortas iguales (ue flan(uean el fragmento
gen&tico a recombinar) llamadas sitios lo#7$ 4tilizando un s"mil familiar) la
recombinasa ser"a el e(uivalente a una ti8era y un pegamento al mismo
tiempo) mientras (ue los sitios lo#7 ser"an las se5ales donde 'ay (ue cortar
y pegar en la secuencia gen&tica) algo asi como Acorte a(u" y a(u" y pegue
los e#tremos) desec'ando el trozo intermedioA$
%l sistema no necesita re(uerimientos especiales ni otros factores (ue
deban incluirse en la reaccin$ %sta es la razn por la cual un sistema
evolucionado en procariotas pudo adaptarse sin problemas a eucariotas y
ms concretamente a animales superiores$
La estrategia (ue sigue nuestro investigador es doble: por un lado)
mediante tecnicas de biolog"a molecular sit6a el gen (ue codifica la
recombinasa <re ba8o el control de un promotor especifico de te8ido y utiliza
esta construccin para generar un ratn transg&nico$ O sea) (ue
continuando con nuestro e8emplo) este ratn e#presa las ti8eras y el
pegamento en el te8ido elegido$
7ara la segunda parte de la t&cnica genera otra construccin) esta vez una
copia casi e#acta del gen (ue (uiere estudiar) pero en la (ue una parte o
toda su secuencia est flan(ueada por dos sitios lo#7$ %sta construccin es
tambi&n utilizada para generar otro ratn transg&nico) seleccionado para
llevar esta modalidad del gen de inter&s en lugar de la original$ 0igamos
(ue en nuestro ratn) el gen incluye las dos marcas donde cortar) puestas
all" de manera (ue no interfieran con la e#presin del gen$ 2 este ratn se
le llama en la 8erga cient"fica Aflo#edA) (ue podr"amos traducir *bastante
libremente- como Aflo#eadoA$
%n resumen) disponemos de dos l"neas de transg&nicos (ue a'ora podemos
cruzar para obtener lo (ue se llama un doble transg&nico) o sea un ratn
(ue lleva las dos construcciones insertadas en su genoma$ 7ero) D(u&
ocurre en el te8ido (ue e#presa la recombinasaE 7ues (ue esta Ati8era
molecularA a'ora puede reconocer las marcas (ue pusimos en nuestro gen)
efectuar los cortes y realizar el empalme$ <omo resultado) en ese te8ido *y
slo en &se-) el gen perder un trozo de su secuencia y la prote"na (ue
codifica no podr e#presarse$
%l sistema <reClo#7 no solo puede controlarse en un te8ido) sino (ue el
control puede refinarse mediante el uso de promotores inducibles (ue por
e8emplo) permitan la e#presin de <re 6nicamente cuando se suministra un
determinado compuesto (u"mico o una 'ormona$ 2s") en la actualidad es
posible controlar espaciotemporalmente cual(uier modificacin gen&tica
e#perimental$
El uso de recominasas sitio-es!ec"#icas !ara generar ratones K$ condicionales
La llegada de las recombinasas sitio/espec"ficas 'a dado un giro drstico en
la manipula/ cin e#perimental del genoma del ratn gracias a la
posibilidad de crear ratones @O en for/ ma condicionada a un te8ido *@O
condicional/tisular-) o a un momento del desarrollo es/ pec"fico *@O
condicional/temporal-$ Los traba8os de B$ 3auer y 3$ OF+orman a fines de la
d&cada de !GH y principios de !GG) fueron cardinales para el desarrollo
de este sistema$ %n particular) estamos 'ablando de las enzimas <re *del
virus bacterifago 7!- y Ilp *obte/ nida de un plsmido de la levadura
3acc'aromyces cerevisiae-$ 2mbas reconocen una se/ cuencia espec"fica de
JK pb) conocida como lo#7 *en el caso de <re- y frt *en el caso de la enzima
Ilp-$ %stas recombinasas realizan un traba8o de Lcorte y pegadoM siempre
(ue se encuentren con estas secuencias espec"ficas$ %s por eso (ue se
pens en incorporarlas a las construcciones de ratones @O como Lti8eras
molecularesM espec"ficas de te8ido y con la po/ sibilidad de activarlas a
voluntad *el sistema <re/lo#7 se encuentra patentado por la empre/ sa
0u7ont-$
Bsicamente) el tipo de recombinacin depender de la orientacin y
localizacin de los sitios lo#7 o frt: *i- <uando ambas secuencias se
encuentran en la misma mol&cula lineal de 201 y con la misma orientacin)
el segmento de 201 entre los sitios ser eliminado$ *ii- 3i los sitios
espec"ficos de corte estn en la misma mol&cula pero con orientacin
invertida) se produce una inversin del segmento intermedio$ *iii- <uando
las secuencias se encuentran en mol&cu/ las de 201 separadas el resultado
es una translocacin *Iigura H$!-$ Todas estas reacciones enzimticas son
reversibles y las recombinasas funcionan tanto in vitro como in vivo *y no
re/ (uieren de ning6n co/factor para activarse-$
La estrategia para crear @O condicionales est fundada en el control
espacial yCo temporal de las recombinasas sitio/espec"ficas$ %sto es posible
gracias a la insercin de la secuencia espec"fica *generalmente lo#7- en las
regiones flan(ueantes No en los intronesN del gen (ue (ueremos no(uear$
0e este modo) la funcin del gen blanco no se ve alterada) o sea (ue el gen
se e#presa normalmente a pesar de la integracin de la secuencia lo#7)
mientras no interaccione con la recombinasa <re$ 2 este nuevo alelo
artificial del gen diana *generado in vitro por recombinacin 'omloga en
c&lulas %3- se lo llama) en la 8erga del laboratorio) alelo Lflo#eadoM$
%l e8e de la t&cnica se encuentra en poder manipular el lugar *te8ido- y el
tiempo *momento del desarrollo- para la e#presin de la enzima <re$ %n el
primer caso) se producen ratones transg&nicos *por la t&cnica clsica de
microinyeccin pronuclear- (ue e#presan la enzima <re slo en un te8ido
predeterminado *por medio del uso de promotores espec"ficos de te8i/ do-$
%l paso final consiste en cruzar estos ratones transg&nicos <re *referidos en
ingl&s como ratones LdeletersM- con las l"neas de ratones (ue acarrean los
sitios lo#7 en el gen blanco *Ii/ gura H$!!-$ Luego de esta cruza)
obtendremos una determinada proporcin de ratones big&/ nicos *del
ingl&s) bigenic- o dobles mutantes *<re ms gen flo#eado-) dependiendo del
geno/ tipo de las l"neas parentales *si son ambas 'emicigotas) <reCO y lo#7C
O) obtendremos un 25P de ratones @O condicionales-$ La e#presin de la
enzima <re en el te8ido espec"fico *determi/ nado por el promotor elegido-
'ar (ue los sitios lo#7 realicen una recombinacin de8ando atrs una
delecin) y por lo tanto un alelo nulo *@O- del gen en cuestin$
%n el caso del @O condicional/temporal) se recurre al empleo de promotores
LinduciblesM$ %ntre los ms destacados se encuentran los promotores
inducibles por antibiticos *por e8emplo tetraciclina o su derivado
do#iciclina- y a(uellos inducidos por 'ormonas$ %n el pri/ mer caso) el
sistema de e#presin controlada por tetraciclina se conoce como T%T/
system y su uso se encuentra regulado por patentes comerciales$ %n el
segundo caso) se traba8a con prote"nas de fusin entre la enzima <re y un
receptor incompleto de estrgenos *slo la por/ cin %B0) estrogen binding
domain-$ %sta prote"na de fusin es inactiva) pero la administracin de la
droga tamo#ifeno *por v"a intraperitoneal- la libera y activa el sistema <re$
7or lo tanto) tendr como resultado la accin de la recombinasa sobre los
sitios espec"ficos y la consiguien/ te recombinacin de 201 con alteracin
del gen diana en los ratones <reClo#7 positivos$ %s lgico pensar (ue la
combinacin de estas dos t&cnicas de @O condicionales *tisular/tempo/ ral-
puede ser de gran provec'o) como lo 'an demostrado usando promotores
espec"ficos de linfocitos B$ %n este caso) cruzaron ratones con una alelo
flo#eado de la polimerasa Q con una l"nea de ratones transg&nicos para la
construccin <re/%B0 con un promotor espec"fico de linfocitos B$ %l
resultado es la e#presin de la prote"na de fusin slo en este lina8e celular$
%l agregado de la droga tamo#ifeno libera la enzima <re y produce la
consiguiente delecin del gen de la polimerasa Q en los linfocitos B$
%8emplo @noc.out
2ccelerated regeneration of t'e s.eletal muscle in R1I!J/.noc.out mice is
mediated by macrop'age/secreted ;L/KC;L/R$
7rote"na de dedo de 21;LLO !J * R1I!J - es una ligasa %J recientemente
identificado notificado a ser funcionalmente importante en la regulacin del
desarrollo del cncer ) el crecimiento de las c&lulas musculares ) y el
desarrollo neuronal $ %n este estudio) la funcin de R1I!J en la
regeneracin del m6sculo es(uel&tico inducida cardioto#ina / se investig el
uso de ratones .noc.out R1I!J / $ R1I!J / C / ratones mostraron una mayor
regeneracin muscular / (ue se caracteriza por la proliferacin acelerada de
c&lulas sat&lite / en comparacin con los ratones de tipo salva8e$ La
e#presin de R1I!J fue inducida en macrfagos notablemente ms (ue en
las c&lulas sat&lite de los ratones de tipo salva8e en la etapa muy temprana
del da5o muscular$ %ste resultado indic (ue las c&lulas inflamatorias son
importantes en las funciones celulares por sat&lite R1I!J / mediada $
Iueron analizados los niveles de cito(uinas en los m6sculos es(uel&ticos y
demostraron (ue R1I!J / C / ratones produce mayores cantidades de
diversas cito(uinas (ue los ratones de tipo salva8e$ %ntre &stos ) ;L / K e ;L /
R niveles aumentaron significativamente en R1I!J / C / ratones$ %l fenotipo
regeneracin muscular acelerada fue derogada mediante la in'ibicin de la
accin en ;L/KC;L/R R1I!J / C / ratones con anticuerpos blo(ueadores $ %stos
resultados indican (ue la deficiencia de R1I!J promueve la regeneracin
del m6sculo es(uel&tico a trav&s de los efectos sobre el nic'o de c&lulas
sat&lite mediada por ;L / K e ;L / R $
'ttp:CCSSS$ncbi$nlm$ni'$govCpubmedC2K5RJ2!R
%8emplo de .noc./in
T2L%1 construction via A4nit 2ssemblyA met'od and targeted genome
modifications in zebrafis'$
Transcripcin activador de nucleasas efectoras *Talens- estn dise5ados
endonucleasas compuestos por una transcripcin activador de efector
personalizado *T2L%- dominio de unin al 201 y un dominio de la divisin
del 201 Io.;$ Talens inducir roturas de doble 'ebra de 201 *03Bs- en sus
lugares de destino en el cromosoma y se 'an utilizado con &#ito para la
ingenier"a del genoma de muc'as especies y c&lulas cultivadas$ %l pez
cebra es un organismo modelo muy popular en la investigacin bsica y
cl"nica$ 2 continuacin) describimos los detalles de construccin de Talens
personalizado utilizando el Acon8unto de la unidadA *42- m&todo) as" como
tres aplicaciones de las manipulaciones del genoma pez cebra utilizando
Talens: genes .noc./out) gran delecin cromosmica) y el gen .noc./in por
'omlogos recombinacin$
'ttp:CCSSS$ncbi$nlm$ni'$govCpubmedC2K55R555
%8emplo del .noc.out O recombinasa <ree
Generation and anal%sis o# serine !rotease in&iitor ka'al t%!e (-cre dri)er mice*
;n'ibidor de serina proteasa de tipo @azal ! * 37;1@! T 'omlogo de ratn
37;1@J - se descubri inicialmente como un in'ibidor de tripsina espec"fica
en el pncreas $ 3in embargo ) estudios previos 'an sugerido (ue
37;1@!C3pin.J se e#presa en una amplia gama de te8idos normales y
tumores ) aun(ue la caracterizacin precisa de su e#presin g&nica no se
'a descrito en la edad adulta $ 2 fin de analizar la e#presin 37;1@J ) 'emos
generado dos l"neas de ratones en los (ue sea lacU o genes de
recombinasa <re se insertan en el locus 37;1@J por la tecnolog"a <re /lo#7 $
%n 37;1@J * lacU- de los ratones ) la actividad Q / galactosidasa se encontr
en las c&lulas acinares del pncreas y ri5n ) as" como c&lulas epiteliales de
los bron(uios en el pulmn ) pero no en el tracto gastrointestinal o del
'"gado $ 37;1@J * cre- .noc./ en ratones se cruzaron con el reportero
Rosa2R * R2RR - ratones para monitorizar la actividad del promotor 37;1@J $
%n 37;1@J * <R% - T ratones R2RR ) la actividad Q / galactosidasa se
encuentra en las c&lulas acinares del pncreas ) ri5n) pulmn) y una
pe(ue5a proporcin de c&lulas en el tracto gastrointestinal y el '"gado $
%stos datos sugieren (ue 37;1@J se e#presa ampliamente en te8idos
derivados del endodermo ) y (ue 37;1@J *<R%- ratones .noc. /in son una
'erramienta 6til para el establecimiento de un condicional ratones .noc.out
para analizar la funcin 37;1@J no slo en los te8idos normales ) sino
tambi&n en los tumores (ue e#presar 37;1@!C3pin.J
'ttp:CCSSS$ncbi$nlm$ni'$govCpubmedC2K52!HR2