LABORATORIO BSICO DE BIOQUMICA

BIOQUMICA I












NIVEL: 4 A N de Equipo: 2


FECHA DE REALIZACION DE LA PRCTICA
12/MARZO/2014

NDICE


I. Introduccin
II. Marco terico
III. Desarrollo de la prctica
IV. Observaciones
V. Resultados obtenidos
VI. Bibliografa
VII. Anexos











I.- Introduccin
Estas enzimas pertenecen al grupo denominado xido reductasas presentes en la
mayora de las plantas y de los microorganismos aunque resulta difcil diferenciar
la actividad de ambas enzimas puesto que usan sustratos similares, se diferencian
en su velocidad ya que la peroxidasa es ms activa que la polifenoloxidasa.
Se ha observado que las funciones principales en el cuerpo humano depende de
las reacciones de oxidacin, que a su vez producen especies reactivas de oxgeno
(ERO) como producto intermedio del metabolismo (Nickavar et al. 2008). En las
que incluyen al anin radical superxido, perxido de hidrgeno y el in hidroxilo
(Rodrguez et al. 2009).
Las especies reactivas de oxigeno no solo estn fuertemente asociados con la
peroxidacin de lpidos y el consecuente deterioro de alimentos, sino que tambin
estn involucradas en el desarrollo de enfermedades cancergenas (Rodrguez et
al. 2010), por lo que el consumo de alimento con alto contenido de antioxidantes
es importante en la prevencin de estas (Vargas et al. 2005, Erdemoglu et al.
2006), debido a que son compuestos que pueden retrasar o inhibir la oxidacin de
lpidos y otras molculas mediante la inhibicin de la propagacin de ERO
(Velioglu et al. 1998).









II.- Marco Terico
Definiciones
Catalasa: Es una enzima (hemoprotena) que descompone el perxido de
hidrgeno (H
2
O
2
) en agua y oxgeno.
Peroxidasa: Es una enzima que descompone el perxido de hidrgeno en
presencia de un compuesto oxidable al que transfiere un tomo de oxgeno.
Fenoloxidasa: Enzima de la clase de las oxidorreductasas, que cataliza la
reaccin entre L-tirosina, L-dopa y oxgeno, para dar lugar a L-dopa, dopaquinona
y agua. Es una protena de cobre que acta en los catecoles, catalizando algunas
de las mismas reacciones que la CATECOL OXIDASA.
xido reductasas: es una enzima que cataliza la transferencia de electrones
desde una molcula donante (el agente reductor) a otra aceptora (el agente
oxidante).
Polifenoloxidasa: La enzima cataliza la O-hidroxilacin de Monofenoles (fenoles
en los cuales el anillo bencnico contiene un nico sustituyente hidroxilo) para
convertirlos en O-difenoles (fenoles con dos sustituyentes hidroxilo).
Inhibidor: son molculas que se unen a enzimas y disminuyen su actividad.
Puesto que el bloqueo de una enzima puede matar a un organismo patgeno o
corregir un desequilibrio metablico.
Enzimas: Una sola clase de monosacrido.






Los microcuerpos comprenden un grupo de orgnulos del tamao de los
lisosomas. Son estructuras de membrana sencilla y de unos de dimetro.
En las micrografas electrnicas la matriz del microcuerpo tiene a menudo un
centro denso debido a hieleras cristalinas de enzimas contenidos en los orgnulos.
Estas enzimas catalizan reacciones en la que participa el perxido de hidrogeno
(H
2
0
2
), por ejemplo, urato oxidasa y catalasa. Por esta razn los microcuerpos
han sido rebautizados peroxisomas. La dotacin enzimtica de los peroxisomas
vara en los diferentes tipos de clulas. La catalasa es quizs la nica enzima que
se encuentra en todos los peroxisomas. Las funciones fisiolgicas de la serie de
peroxisomas conocidos no estn todava claras. Sin embargo, la actividad
catalasa es esencial para la eliminacin del perxido de hidrogeno (que es toxico)
generado por las enzimas de los peroxisomas y por otros compuestos
metablicos. Se cree que los peroxisomas juegan un papel en el metabolismo
energtico y oxidativo y en otras rutas metablicas especficas.

Catalasa
La catalasa es una enzima perteneciente a la categora de las oxidorreductasas
que cataliza la descomposicin del perxido de hidrgeno (H
2
0
2
) en oxgeno y
agua. Esta enzima utiliza como cofactor al grupo hemo y al manganeso.

El perxido de hidrgeno es un residuo del metabolismo celular de muchos
organismos vivos y tiene entre otras una funcin protectora contra
microorganismos patgenos, principalmente anaerobios, pero dada su toxicidad
debe transformarse rpidamente en compuestos menos peligrosos. Esta funcin la
efecta esta enzima que cataliza su descomposicin en agua y oxgeno. Adems
la catalasa se usa en la industria textil para la eliminacin del perxido de
hidrgeno, as como en menor medida se emplea en la limpieza de lentes de
contacto que se han esterilizado en una solucin de perxido de hidrgeno. La
ausencia congnita de catalasa es causante de una acatalasemia (o acatalasia), la
enfermedad de Takahara que se manifiesta por la ausencia de actividad de la
catalasa en los glbulos rojos y con severas infecciones gangrenosas de la boca,
pudiendo producir la prdida de los dientes y graves destrucciones de los
maxilares y regiones blandas que los cubre. Enfermedad congnita del Japn (2
de 100.00 habitantes sufren de este trastorno).
El mecanismo completo de la catalasa no se conoce, an as la reaccin qumica
se produce en dos etapas:
H
2
O
2
+ Fe (III)-E H
2
O + O=Fe (IV)-E
H
2
O
2
+ O=Fe (IV)-E H
2
O + Fe (III)-E + O
2

Donde Fe-E representa el ncleo de hierro del grupo hemo unido a la enzima que
actan como cofactores.
La enzima se presenta en forma de homotetrmero y se localiza en los
peroxisomas.
Esta enzima puede actuar como una peroxidasa para mucha sustancias
orgnicas, especialmente para el etanol que acta como donante de hidrgeno.
Las enzimas de muchos microorganismos, como el Pencillium simplicissimum,
que exhiben actividad de catalasa y peroxidasa, son frecuentemente llamadas
catalasas-peroxidasas.






Estructura cuaternaria de la catalasa.

Peroxidasa
Es una enzima que cataliza la oxidacin de un amplio nmero de sustratos
orgnicos e inorgnicos, utilizando el poder oxidante del perxido de hidrgeno.
Donante + H
2
O
2
Donante oxidado + H
2
O
Esta enzima utiliza como cofactor el grupo hemo.

Pertenecen a la categora de las oxidorreductasas. Es utilizada ampliamente en
bioqumica clnica. As, los ensayos para la determinacin y cuantificacin de
metabolitos como glucosa, cido rico, colesterol o triglicridos en fluidos
biolgicos usan peroxidasa como enzima acoplada. Tambin se utiliza en
inmunoensayos para la deteccin de virus tan conocidos como el virus de la
inmunodeficiencia humana (VIH) causante del SIDA o el herpes virus. La
peroxidasa tambin se utiliza como biocatalizador para la generacin de productos
de inters biotecnolgico e industrial como resinas fenlicas, adhesivos,
antioxidantes, antiestticos y protectores de radiacin magntica, colorantes
alimentarios y componentes bioactivos de detergentes.
En vegetales, es de destacar a la peroxidasa del rbano, que tiene grandes
aplicaciones en tcnicas inmunoqumicas y de diagnstico clnico debido a su gran
estabilidad, facilidad de conjugacin con las inmunoglobulinas y sencillez para
detectarla por mtodos colorimtricos utilizando un gran nmero de reactivos. En
animales, existen peroxidasas con una funcin predominantemente defensiva en
la saliva, la leche o los leucocitos, donde se aprovecha el carcter oxidante con
fines germicidas y bactericidas del perxido que se genera de forma endgena
mediante otras reacciones (glucosa oxidasa, amino cido oxidasa etc.). No todas
las peroxidasas son defensivas, y por ejemplo una peroxidasa (yoduro peroxidasa)
es tambin la responsable de la sntesis de las hormonas tiroideas, oxidando en
este caso el yoduro a yodo para que ste se adicione a algunos de los anillos
fenlicos de los residuos de tirosina de la tiroglobulina. Otras peroxidasas, como la
glutationa peroxidasa, estn ampliamente distribuidas en diversos tejidos con fines
diferentes, pero relacionados con una funcin antioxidante.

Prcticamente todas las peroxidasas son hemoprotena (excepcin notable es la
glutationa peroxidasa, que es una selenoprotena) y tienen como sustrato comn
el perxido de hidrgeno. La gran afinidad por este sustrato hace que se pueda
unir al hierro del grupo hemo por los dos planos del centro activo, el superior y el
inferior, dando lugar a una inhibicin por exceso de sustrato ya que cuando ambas
posiciones estn ocupadas por el perxido de hidrgeno no es posible la unin del
otro sustrato.

Enzima peroxidasa verstil
La enzima peroxidasa verstil (VP)
Donante + H
2
O
2
Donante oxidado + H
2
O
Es producida por el hongo ligninoltico Pleurotus eryngii y tiene la misma
especificad que las otras dos enzimas peroxidasas lignolticas, la manganeso
peroxidasa y la lignina peroxidasa. Para esta enzima son necesarios como
cofactores 1 grupo hemo B (hierro-protoporfirina IX) y 2 iones calcio por
subunidad.
Existen tres tipos de esta protena:
Peroxidasa verstil de fase lquida 1 (VPL1).
Peroxidasa verstil de fase lquida 2 (VPL2).
Peroxidasa verstil de fase slida 1 (VPS1).

Se aplican la peroxidasa se emplea para el tratamiento industrial de aguas
contaminadas: por ejemplo, los fenoles pueden eliminarse mediante su
polimerizacin catalizada mediante la peroxidasa de Armoracia rusticana.


Fenol oxidasa
Enzima de la clase de las oxidorreductasas, que cataliza la reaccin entre L-
tirosina, L-dopa y oxgeno, para dar lugar a L-dopa, dopaquinona y agua. Es una
protena de cobre que acta en los catecoles, catalizando algunas de las mismas
reacciones que la CATECOL OXIDASA.
La Polifenoloxidasa recibe muchos nombres debido a la gran diversidad de
sustratos que emplea. Tcnicamente es una o-difenol: oxigeno reductasa. Su
reaccin se puede describir de la siguiente manera:

Esta enzima puede llevar a cabo la oxidacin directa aerobia de compuestos mono
y difenoles (tirosina, fenol, p-cresol, 3, a-dimetil fenol, 4-terbutilfenol). Tambin
puede atacar a o-difenoles y a la adrenalina. Es una enzima de peso molecular
120.00, con un centro de cobre.
La polifenoloxidasa de la papa ataca a los siguientes compuestos en orden de
mayor a menor actividad: cido clorhdrico, Catecol, quercitina, piragalol, cido
cafeico, 3,4-dihidroxifenilalanina, p-creso, tirosina entre otros. Las quinonas
resultantes de la reaccin de la polifenol oxidasa pueden continuar oxidndose y
polimerizndose, para dar compuestos finales que son muy complejos y coloridos.
Es difcil distinguir las actividades de las dos enzimas a partir de la misma fuente,
ya que pueden atacar a los mismos substratos.
III.- Desarrollo de la Prctica
PRCTICA: Obtencin y estimacin de la actividad de la catalasa,
peroxidasa y la fenol oxidasa.

Objetivo: Aislar las enzimas mencionadas y poder estimar su actividad cataltica.

MATERIALES REACTIVOS
1 Cuchillos AGUA DESTILADA
1 Licuadora Catecol al 1%
1 Pelador Goma de guayacol al 1.5%
1 Bao de hielo Tirosina 0.1%
1 Bao Mara NaCN al 5%
2 Vaso de precipitado de 150 ml. Tolueno
3 Matraz Erlenmeyer de 125 ml. Perxido de hidrgeno
12 tubos de ensaye
1 gradilla
1. Algodn
1. Extracto de papa

Procedimiento:
Lave, pele y muela 5 papas pequeas. Coloque la papa ya molida en 100 ml. de
agua en un bao de hielo, deje reposar por 15 minutos agitando ocasionalmente.
Filtre la mezcla a travs de algodn (doblado 4 veces) exprima y colecte el lquido
en un vaso de precipitado o en un vidrio de reloj. Decante el lquido del almidn, el
cual se encuentra en el fondo y regrselo al bao de hielo. Use esta preparacin
como una fuente de ambas enzimas (extracto de papa).

Prepare una serie de tubos como se muestra a continuacin:
T U B O S
Sustancia 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Catecol al 1% 0.5 0.5 0.5 0.5 --- ---- ---- --- --- --- 0.5 ---
Guayacol 1.5% --- --- --- --- 0.5 0.5 0.5 0.5 --- --- --- 0.5
Tirosina 0.1% --- --- --- --- --- --- --- --- 2 2 --- ---
H
2
O
2
al 3% --- 0.5 --- 0.5 --- 0.5 --- 0.5 --- 0.5 0.5 0.5
NaCN al 5% --- --- --- --- --- --- 1
gota
--- --- --- --- ---
Extracto de
papa
5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 --- ---
= calentar a ebullicin en bao Mara por 10 minutos y enfriar a temperatura ambiente, observar.
Solo se realizaron las pruebas de los tubos N 5, 6, 8, 9, 10 y 12, debido a la falta de reactivos
(Catecol y NaCN).

Mezclar y dejar reposar los tubos a temperatura ambiente, observar los cambios
de color despus de una hora, Dejar los tubos 9 y 10 conteniendo tirosina con
unas gotas de Tolueno hasta dos das despus para realizar una observacin
final.
Anotar los resultados y observaciones.

IV.- Observaciones
N Guayac
ol 1.5%
Tirosin
a 0.1%
H
2
O
2

3%
Extracto
de papa
Observaciones Una hora despus


5


0.5


----------


-------


5
Al instante se
produjo
efervescencia lenta
originando un color
blanquecino
Presento color
blanquecino.


6


0.5


----------


0.5


5
Al instante se
produjo mucha
efervescencia
originando un color
guinda.
Presento un color
entre morado y rojo
oscuro y
efervescencia
(espuma).


8


0.5


----------


0.5


5
Se produjo
efervescencia
rpida, originando
un color caf
obscuro.
Color morado o rojo
sangre con espuma
en la superficie.



9



----------



2



-------



5
Al instante se
produjo
efervescencia ,
dando la presencia
de un color ligero
blanquecino

Presento el color
blanquecino, pero al
ponerle tolueno se
le hizo un anillo de
color cafecito en la
superficie.

10

----------

2

0.5

5
Efervescencia
rpida, dando como
color meln tenue
con espuma y en el






Resultados
Tubos Guayacol 1.5% Tirosina 0.1% H
2
O
2
3%

5
Polifenoloxidasa no
actu libremente

-----------

-----------

6
La peroxidasa actu libremente sobre el
guayacol

-----------

8
La peroxidasa actu
libremente sobre el
guayacol

-----------
La peroxidasa actu
libremente sobre el
guayacol

9

-----------
Polifenoloxidasa
actu libremente
sobre la tirosina

-----------

10

-----------
La peroxidasa actu libremente sobre la
tirosina


12
No hay enzima, los
compuestos se
oxidan por el
oxgeno atmosfrico


-----------
No hay enzima, los
compuestos se
oxidan por el oxgeno
atmosfrico




producto final un
color meln.
fondo se form un
precipitado
12 0.5 ---------- 0.5 ---------- No hubo reaccin
(transparente)
Sigui transparente
Conclusin
Se demostr las dos actividades enzimticas de la peroxidasa y polifenoloxidasa
partir de la misma fuente, el extracto de la papa. En base a los resultados la
peroxidasa es mucho ms rpida en actuar que la Polifenoloxidasa.
Cuestionario:
1.- Cmo acta la peroxidasa, difiere de la catalasa?
La catalasa se detecta con facilidad por su accin sobre el perxido de hidrogeno.
Cuando se agrega una gota de perxido de hidrogeno a la papa que producen
catalasa, se liberan burbujas de oxgeno.
Cualquiera que haya colocado perxido de hidrogeno sobre una herida reconocer
que las clulas de los tejidos humanos tambin contienen catalasa. La otra enzima
que degrada el perxido de hidrogeno es la peroxidasa, que difiere de la catalasa
en que su reaccin no produce oxigeno:

2.- Hay alguna evidencia de la actividad de la catalasa en la papa en este
experimento?, explique.
Si, por que hubo desprendimiento de oxgeno en los tubos 5, 6, 8, y 10

3.- Qu pasara si se adicionara un exceso de peroxidasa en la reaccin de la
polifenoloxidasa?
Provoca que la reaccin de polifenoloxidasa se lleve a cabo rpidamente oxidando
a los compuestos polifenoles

4.- Cmo se podra distinguir la peroxidasa de la polifenoloxidasa usando este
mismo extracto crudo?
Se puede distinguir mediante el tipo de substrato que se le aadir. Como se sabe
que la polifenoloxidasa cataliza la oxidacin de difenoles en presencia de oxigeno
molcular. Tales fenoles son catequinas (3-hidroxiflavanes), steres de cido
cinmico, cido clorgenico (3- O-cafeoyl-D-cido quinico) el cual, es el sustrato
ms encontrado en la naturaleza, el 3,4-dihidroxipenilalanina (L-DOPA) que es el
producto de la hidroxilacin de tirosina; y la Tirosina la cual siendo un fenol y al
mismo tiempo un aminocido constituyente de protenas, se encuentra en cada
tejido de las plantas.
En cambio en la peroxidasa es similar a la polifenoloxidasa, ya que pertenecen al
grupo de oxidoreductasas. Las cuales descomponen perxido de hidrgeno en
presencia de un donador de hidrgeno.
Una gran variedad de compuestos pueden actuar como donadores de hidrogeno,
incluyendo fenoles (p-cresol, guayacol, resorcinol) aminas aromticas (anililina,
bencidina, o-fenildiamina, o-dianisedina) nicotinamida-adenina dinucleotida
reducida y nicotinamida-adenina dinucleotida fosfato reducida

5.- Acta el cianuro como un inhibidor de ambas enzimas? Explique.
El cianuro acta un inhibidor de tipo no competitivo, la catalasa es un
hidroxiperoxidasa; y como tal, contiene hierro en su ncleo porfirnico, este hierro
puede ser afectado por el cianuro.
No se observ si el cianuro acta como inhibidor para la peroxidasa y
polifenoloxidasa ya que esta prueba no se realiz (falta de reactivos).

6.- Cul es el propsito de los tubos 11 y 12?
Observa la presencia de peroxidasa (tubo 12) ya que esta cataliza, una
deshidrogenacin directa en presencia de perxidos; en este caso el guayacol es
oxidado dando una quinona coloreada. El cual no se presenci en el tubo N 12

V.- Bibliografa
PDF (2013). Actividad enzimtica y capacidad antioxidante. Fecha de consulta:
abril 03, 2014 desde http://www.mag.go.cr/rev_meso/v24n01_057.pdf
Allen, Janda. Koneman, Woods (2008). Diagnostico microbiolgico. Pg.
consultada 1383. Editorial Mdica panamericana S.A. 6 edicin
Gutirrez, Jos Mira (1973). El diagnostico bioqumico de las micobacterias. Pg.
consultada 39. Editorial Universidad de Sevilla. Serie medicina, No 16.
Polifenol oxidasa. (2014, 8 de marzo). Wikipedia, La enciclopedia libre. Fecha de
consulta: 14:00, abril 4, 2014
desde http://es.wikipedia.org/w/index.php?title=Polifenol_oxidasa&oldid=73056805
Oxidoreductasas. (2013, 21 de diciembre). Wikipedia, La enciclopedia libre. Fecha
de consulta: 13:00, abril 5, 2014 desde
http://es.wikipedia.org/w/index.php?title=Oxidorreductasa&oldid=71504146.
Catalasa. (2013, 22 de diciembre). Wikipedia, La enciclopedia libre. Fecha de
consulta: 18:36, abril 5, 2014 desde
http://es.wikipedia.org/w/index.php?title=Catalasa&oldid=71520787.
Peroxidasa. (2014, 10 de marzo). Wikipedia, La enciclopedia libre. Fecha de
consulta: 18:58, abril 5, 2014 desde
http://es.wikipedia.org/w/index.php?title=Peroxidasa&oldid=73100364.











VI.- Anexos
















Despus de una hora
























Tres das transcurridos