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PRACTICA N3

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METABOLISMO BACTERIANO. ENZIMAS DE LOS
MICROORGANISMOS. FERMENTACIBACTERIANA
I. EXPERIMENTO N 1: HIDRLISIS DEL ALMIDN
1. OBJETIVO:
Hacer conocer al alumno que existen microorganismos que producen
exoenzimas y que atacan substratos importantes como carbohidratos y
protenas.
El almidn es un polmero de glucosa, se encuentra como material de
reserva. Es hidrolizado por las enzimas: Alfa Amilasa y Beta Amilasa.
Tambin puede ser hidrolizado por los cidos minerales.
La primera desdobla las macromolculas de la amilosa y la amilopectina,
de las cuales se compone el almidn, en unidades de 6-7moleculas de
Glucosa. Con ms tiempo de exposicin, esa enzima logra desdoblar a
estos oligosacridos llevndolos a maltosa, punto en el que la enzima
maltasa se encarga de desdoblar esta molcula hasta Glucosa.
La -amilasa puede desdoblar las molculas de amilosa y amilopectina
pero solo a partir de los extremos no reductores de estas molculas. Cada
vez son escindidas dos unidades de glucosa en forma de maltosa, punto
en el que la maltasa entra en juego. Las molculas de amilasa son
desdobladas de esta forma pero las de amilopectina son solo desdobladas
en un 50% ya que la enzima no puede desdoblar las ramificaciones propias
de esta macromolcula, se hace necesaria entonces la intervencin de la
a-amilasa para desdoblarla por completo.
-amilasa + Almidn Dextrina + -maltosa
-amilasa + Almidn -maltosa
Las amilasas son enzimas extracelulares.
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2. MATERIALES:
Solucin de yodo (lugol)
Cepas de Bacillus subtilis y Escherichia coli
1 Placa de Agar Almidn
3. PROCEDIMIENTO:
Dividir en dos sectores la placa de Agar almidn.
Inocular en estras cada sector con las cepas de B. subtilis y E. coli.
Incubarlo a 37C por 24 h
4. RESULTADOS:
Empleando la solucin de Lugol para evidenciar la hidrlisis, se obtiene:












Escherichia coli : La muestra
presenta color azulado, a partir de lo
cual se concluye que la E. coli
hidroliza totalmente al almidn.
Bacillus subtilis : al presentar la
muestra color pardo marrn, se
concluye que el B subtilis hidroliza
parcialmente al almidn (poco
hidroltico)
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5. CONCLUSION:
Ambas son capaces de utilizar al almidn como nutriente; sin
embargo, la E. coli requiere de ms nutrientes que el B. subtilis.
6. IMPORTANCIA:
Conocer el grado de hidrlisis de las bacterias Gram + y Gram como
evidencia de su actividad enzimtica y sus requerimientos energticos.

II. EXPERIMENTO N2: HIDROLISIS DE LA GELATINA
La gelatina es una protena dotada de la propiedad de tomar gel cuando se
disuelve en agua caliente. Por tratarse de una protena puede ser atacada
por alguna bacteria que la prive de su propiedad gelatinizante.
La hidrolisis de la gelatina es una reaccin enzimtica y a la enzima
encargada de ello se le llama gelatinasa.
1. OBJETIVO:
Conocer y estudiar a la enzima encargada de hidrolizar la gelatina
2. MATERIALES:
Cepa de S. Aureus
Cepa de B. Subtilis
Cepa de E. Coli
Asa de kolle en aguja
Tres tubos de gelatina nutriente estril
3. PROCEDIMIENTOS:
Inocule cada uno de los organismos en un tubo de gelatina
nutriente por puntura hasta el fondo del tubo, una sola vez
Llevar a temperatura ambiente por 2 a 7 das.
4. RESULTADO:
Gelatina + S. Aureus: prueba positiva, se observ hidrolisis parcial
de la gelatina
Gelatina + B. Subtilis: prueba positiva, se observ hidrolisis total de
la gelatina
Gelatina + E. Coli: prueba negativa, no se observ hidrolisis.
5. CONCLUSIN:
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Podemos afirmar que dentro de los diferentes microorganismos los
bacilos tiene la propiedad de hidrolizar la gelatina y con ello afirmar
que poseen la enzima gelatinasa.

III. EXPERIMENTO N3: PRODUCCIN DE HEMMOLISINAS
1. OBEJTIVOS:
Conocer que microorganismos tienen la capacidad de secretar exoenzimas
que causar lisis en los glbulos rojos.
2. MATERIALES:
Cepa de S. Aureus y B. subtilis
Agar sangre

3. PROCEDIMIENTO:
-Dividir en dos placas Petri

















Inocular en estras las cepas en cada uno de los lados.
Incubar a 37C por 24-28 h.





4. RESULTADOS:
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En ambos sectores se observ la presencia de hemolisinas.
En el cultivo de S. Aureus se vio halos en todo el borde; este debido
a que este microorganismo es un gran positivo y productor de
hemolisina beta la cual produce una hemolisis completa , la
destruccin y decoloracin total de la hemoglobina , y por eso la
presencia de una zona hemoltica clara alrededor de la colonia.
En el cultivo de B. Subtilis se observ cambio en la coloracin a un
tono verdoso esto debido a que este microorganismo elabora un
pigmento llamado biliverdina













5. CONCLUSION:
-Este experimento nos demuestra que en los diferentes
microorganismos producen distintos tipos de hemolisis; el grado de
hemolisis se relaciona con su grado de patogeneidad, especialmente
los betas hemolticos.


IV. EXPERIMENTO N 5 : FERMENTACIN DE CARBOHIDRATOS
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La fermentacin es un proceso catablico de oxidacin incompleta, que no
requiere oxgeno, y el producto final es un compuesto orgnico. Segn los
productos finales, existen diversos tipos de fermentaciones.
Hay fermentacin natural, cuando las condiciones ambientales permiten
la interaccin de los microorganismos y los sustratos orgnicos
susceptibles, y artificial, cuando el ser humano propicia condiciones y el
contacto referido.
La prueba contendr lo siguiente:
Agar TSI (3 azucares y hierro) favorece el crecimiento de la mayora
de bacterias.
Azucares qumicamente definidos: Lactosa, sacarosa y glucosa.
Un indicador de pH.

NC : no cambio de pH.
A : cido.
AG : cido y gas.
B : bsico.
Cuando no hay carbohidratos utilizables en el medio la energa necesaria
la obtiene la bacteria de protena y su producto final es gas de amoniaco.

1. MATERIALES:
Cultivo de Escherichia coli, Staphilococcus aureus, Y Bacillus S.
3 tubos con TSI en plano inclinado.

2. PROCEDIMIENTO:
Sembrar por estra y puntura:
o E. coli - TSI
o S. aureus - TSI
o B. subtilis - TSI
Incubar por 24 h. a 37 C

3. RESULTADOS:
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E. coli: Se observa que el fondo
y la superficie han cambiado.




Ants. De la seimbra Desp. De la siembra



Staphilococcus aureus: se observa que tanto la
superficie como el fondo han cambiado, esto
debido al medio acido.



Ants. De la seimbra Despus





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Bacillus subtilis: Se observa que la superficie
mantuvo su color esto debido al medio alcalino, con
esto se demuestra que no hubo fermentacin de
carbohidratos en la superficie.
Mientras que al fondo del tubo se muestra
claramente la fermentacin de carbohidratos, por la
accin del medio acido.


Ants. De la seimbra Desp. De la siembra

Mediante estos experimentos se llega a conocer la accin fermentadora
de los microorganismos en un determinado medio.
En los cultivo de S. aureus y E. coli. Se demostr que si hubo fermentacin
por el pH que mantienen.


V. EXPERIMENTO N 7: REDUCCIN DE CIDO SULFHDRICO

1. OBJETIVO:
Determinar la capacidad bacteriana para producir HS (cido sulfhdrico)
Mecanismo: Cuando se realiza la fermentacin de las protenas obtiene
como producto cido sulfhdrico, ya que las protenas contienen
aminocidos sulfurados, algunas bacterias tienen enzimas que desprenden
el cido de azufre de estos aminocidos, el cual es reducido con hidrogeno
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del sustrato para formar cido sulfhdrico, por lo tanto el azufre funciona
como aceptor de H +.
H
2
S + FeO
3
FeS + H
2
SO
4


2. MATERIALES:
Cultivo de E. Coli y Proteus Vulgaris
Tubos de TSI con superficie inclinada (2)
3. PROCEDIMIENTO:
Inocular a cada tubo de TSI, las cepas de E. Coli y Proteus
respectivamente, por estra y puntura.
Incubara 37OC por 24Hrs y observar la formacin de FeS color
negro.
4. RESULRADOS:

Ants. De la seimbra Desp. De la siembra
E. coli: Se observa que no se produce cido sulfhdrico (no reduce) ni
tampoco se produce gas.



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Ants. De la seimbra Desp. De la siembra

Proteus Vulgaris: se observan los cambios por la aparicin de un
precipitado negro (FeS) a lo largo de la picadura, tornndose alcalino en la
superficie y acido en el fondo. Se produce la reduccin, hay formacin de
cido sulfhdrico, utilizndose al azufre del medio como aceptor final de
H+.

5. APLICACIN: Es til para la identificacin de bacterias de los gneros
Salmonella, Campylobacter y Brucella y permite diferenciar entr
especies de Proteus.

VI. EXPERIMENTO N 8 : DEMOSTRACION DE LA PRODUCCION
DEL INDOL
1. FUNDAMENTO
El Indol es un compuesto que se genera mediante la desanimacin
reductiva del triptfano y esta reaccin es llevada a cabo por algunas
bacterias que poseen las enzimas denominadas en su conjunto
triptofanasas.

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Para detectar la produccin de indol se utiliza el medio Caldo triptfano y
la lectura de la prueba se realiza con el reactivo de Kovacs; el
indol producido reacciona generando una coloracin rosa intensa.

2. MATERIALES:
Cultivo de E.Coli y Bucillus Subtilis
Caldo Triptfano 2 tubos con 3cc cada uno
Solucin de Kovacs
Pipeta de 1cc

3. PROCEDIMIENTO:
Se incuba a 37C durante 24 horas y tras la incubacin, aadimos unas
gotas de reactivo de Kovacs.
Si se ha producido Indol aparecer un anillo rosa fucsia en la superficie del
caldo de cultivo.



Indol negativo Indol positivo
4. RESULTADOS
E.Coli (+) Bacteria que si produce indol al agregar gotas de
solucin Kovacs

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Es una propiedad de algunas bacterias que degradan el aminocido
triptfano formando Indol.

B.Subtilis () Bacteria que no produce indol a pesar de agregar
gotas de solucin Kovacs.


EXPERIMENTO N 9: DETECCION DE LA CATALASA
La catalasa es una enzima que est relacionada con la capacidad de una
bacteria para utilizar el oxgeno Le falta de esta enzima en los organismos
anaerobios es la causa de que el O2 les sea perjudicial. Cuando hay
oxigeno estos organismos lo emplean como aceptor final de Hidrogeno
para formar Agua Oxigenada, pero esta no puede desdoblarse en H2O y
O2 porque falta la Catalasa; por lo tanto el agua oxigenada se acumula y
mata a la bacteria.
1. MATERIALES:
- Cultivo d E.coli y S. aureus
- Tubos de Triptosa Caldo (2)
- Agua Oxigenda 3,0 %
2. OBJETIVO:
Identificar cules son los microorganismos anaerbicos que producen
catalasa, exponindolos a un medio donde que contenga agua oxigenada.
3. PROCEDIMIENTO:
- Incubar en cada tubo una de las cepas
- Incubar a 37 C por 24 horas
- Cubrir la superficie del caldo con agua oxigenada y observar la
presencia de burbujas en el tubo donde hay catalasa.




4. RESULTADOS:
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1.- Tubo con E.coli: Negativo


2.- Tubo con S.Aureus: Positivo (Presencia de burbujas)






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5. CONCLUSIONES:
- La presencia de burbujas en el tubo que contiene S.Aureus se debe
a que este microorganismo produce la enzima catalasa, y por lo
tanto el agua oxigenada contenida en el medio trmino siendo
disociada en oxigeno (burbujas) y agua.

- El tubo que contena E.Coli no sufri ningn cambio a simple vista
ya que este microorganismo no produce catalasa, por lo tanto se
asume que estando en este medio la E.Coli no pudo sobrevivir.

Existen bacterias que pueden vivir estando en un medio que contiene
H202

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