Facultad de Qumica y Biologa

Bioqumica y Licenciatura en Bioqumica

Laboratorio de Inmunologa




Laboratorio N4:
Western blot





Integrantes:

Profesora :



Introduccin:
El western blot es una tcnica de biloga molecular/inmunologa/bioqumica que
permite detectar y separar de manera relativamente simple antgenos de inters
de una muestra problema o extracto celular; para esto se utilizan las condiciones
del SDS PAGE para separar las protenas presentes en la muestra en base a su
tamao molecular y un par de anticuerpos para detectar con alta especificidad los
antgenos proteicos de inters. El anticuerpo primario utilizado reconocer de
manera especifica la protena de inters o una parte de ella - y el anticuerpo
secundario reconocer a su vez al anticuerpo primario y permitir la fcil deteccin
visual al poseer algn marcador - como fluorescencia en cierto rango de luz o la
asociacin con una enzima que permita obtener un sustrato coloreado como la
HRP- lo que permitir el reconocimiento especfico y fcil de la protena de inters
en condiciones in-vitro [1,2].
Esta tcnica permite obtener imgenes con bandas asociadas a la presencia de la
protena de inters, el anlisis de las mismas por densitometra permite que esta
tcnica sea cuantitativa en trminos de aproximacin-, por otro lado la presencia
de modificaciones post-traduccionales en la protena de inters como las
escisiones proteolticas y las glicosilaciones- pueden ser vistas en algunos casos
en las imgenes obtenidas mediante esta tcnica, lo que tambin aporta
informacin acerca de la protena de inters.
En el trabajo practico realizado y descrito en este informe se dar cuenta de la
experiencia de western blot, realizada con un extracto celular de salmn
infectado con ISAV un ortomixovirus que posee un genoma de ssRNA con 8
segmentos genticos diferentes a los cuales se encuentra asociado un complejo
de polimerasa-.
.Objetivo:
Utilizar la tcnica de western blot para determinar la presencia de la protena acida
(PA), protena de fusion y protena bsica (PB2) en extracto de celulas de salmn
infectadas con ISAV.
Metodologa

Siguiendo las instrucciones de la gua de trabajos prcticos de inmunologa en la
seccin de western blot [1] se bloque con leche (5%) la membrana de
nitrocelulosa preparada previamente por el ayudante de laboratorio en la cual se
haba traspasado el producto de un SDS PAGE cargado con extractos celulares
de salmn infectado con ISAV y usando como estndar de tamao molecular
Page Ruler Prestained Protein Ladder # 26616 -, posterior al bloqueo se lav 3
veces con TBS durante 5 minutos y se incub con los anticuerpos primarios -3 mL
de anticuerpo diluido en TBS en las relaciones 1:1000 (anti-PB2), 1:2000 (anti-PA)
y 1:5000 anti-fusin - durante 45 minutos en agitacin constante, tras este paso
se repiti una ronda de 3 lavados con TBS de 5 minutos cada uno. Como todos los
anticuerpos primarios utilizados haban sido previamente biotinilados se ocup
como anticuerpo secundario estreptaviridina/HRP (estreptaviridina fusionada a
peroxidasa de rbano) diluida en TBS (1:4000) y un anticuerpo anti-mouse/ HRP
(1:5000), se realiz la incubacin con el anticuerpo secundario de la misma forma
que la primera incubacin y tras repetir los lavado con TBS se incubo con el
sustrato para la peroxidasa en solucin, revelando posteriormente la membrana.
*Se hicieron en conjunto controles negativos incubando en ausencia del
anticuerpo secundario en un caso en un caso.






Resultados
En estos experimentos, se obtuvieron Western Blots para diferentes
protenas del virus de la anemia infecciosa del salmn (ISAV). En la Figura 1, se
muestra el revelado del Western Blot para la protena de fusin del virus por
duplicado en el cual, se observan bandas a los 58 KDa aproximada y a 48 KDa.
Esta ltima banda se observa con mayor intensidad en la muestra, esta protena
estara predominando ante la otra. En la Figura 2, se muestra el revelado del
Westen Plot para la protena cida de la polimerasa del virus ISA por duplicado.
En esta figura se observa 3 bandas, una aproximadamente a los 75 KDa, 60 KDa
y a los 48KDa. Al igual que el anterior la banda de 48KDa estara en mayor
proporcin en la muestra analizada que las otras dos, observndose estas dos
ltimas en parecida proporcin. Finalmente, la figura 3 se observa el revelado del
Western Blot por duplicado para la Protena Bsica 2 de la polimerasa de ISAV.
Se observa una sola banda muy tenue aproximadamente a los 100KDa, esta
banda no es tan marcada como las bandas obtenidas en los resultados anteriores.












Figura 1. Western blots para la
protena de Fusin del virus ISA.
Se realiza por duplicado y se
obtienen dos bandas.









Discusin
Se observ en el ensayo de western blot para subunidad PB2 (figura 3) de la
protena polimerasa bsica de ISAV una banda entre 100 y 75 KDa, se us como
anticuerpo primario anti-PB2 y como secundario estreptaviridina HRP, el control
realizado solo con este ltimo no muestra ninguna banda (datos no mostrados). La
banda correspondera a PB2, ya que esta tiene un tamao molecular de 79,5KDa
[3] la cual coincidira con la banda observada en el gel. Se pueden observan tres
bandas en la deteccin de PA (figura 2) se sugiere que la banda correspondiente a
la protena PA sin modificar es la que se ubica entre 75 y 63 KDa, ya que esta
subunidad de la polimerasa tiene un tamao molecular de 65,3 KDa, las dems
bandas mostradas podran ser isoformas de protena producidas por
modificaciones post-traduccionales asociadas a escisiones proteolticas
probablemente. En cuanto al ensayo para la deteccin de la protena fusin (F)
(figura 1.) mediante el anticuerpo anti-fusin, se observan dos bandas, entre 63 y
48 KDa, se sugiere que la banda ms cercana a los 48kDa correspondera a la
protena F sin modificar, ya que esta protena tiene una masa molecular de 50KDa
[3], la otra banda superior correspondera igualmente a otra isoforma producidas
por modificaciones post-traduccionales de la protena, en este caso
probablemente glicosilaciones. [3,4]
Figura 3. Western blots para la
Protena Bsica 2 (PB2) del virus
ISA. Se realiza por duplicado y se
obtienen solo una banda tenue.

Conclusiones:

Se concluye que se logr el obtuvo del practico el aislamiento de la las protenas
PB2, PA y protena de fusin de la muestra problema, y que esta tcnica
permiti adems obtener informacin como la presencia de sitios de
reconocimiento para modificaciones traduccionales en el caso de las protenas PA
y fusin. Siendo ms usual en la muestra la isoforma de PA escindida que la forma
sin modificar mientras que en el caso de la protena de fusin la forma modificada
probablemente por glicosilaion- sea la ms frecuente en el contexto estudiado.


Referencias:

[1] D. Toro Ascuy. Trabajos prcticos inmunologa, segundo semestre 2013.
Universidad de Santiago de Chile, Facultad de Qumica y Biologa. (2013).
[2] D. J. King. Applications and Engineering of Monoclonal Antibodies. Captulo 3,
Monoclonal Antibodies in Research and Diagnostic Applications. Pginas 100-102.
[3] Alicia Teresa. Purificacin y caracterizacin de IgY anti-virus de la anemia
infecciosa del salmn, obtenidas desde yema de huevo de gallinas. 2011.
Disponible en:http://cybertesis.uach.cl/tesis/uach/2011/fcm722p/doc/fcm722p.pdf
[4]Adriana Vega. Western blot. Introduccin y optimizacin. 2013.
Disponible en: http://docs.abcam.com/pdf/events/spanish-wb-webinar.pdf