HPV HCR Screen-Titre-Frt Traducido

NDICE
1. USO ............................................................................................................ 3
2. PRINCIPIOS DE DETECCIN DE PCR .......................................................................... 3
3. CONTENIDO.............................................................................................4
4. REQUERIMIENTOS ADICIONALES ............................................................................ 5
Slo Para El Uso Profesional 5. PRECAUCIONES GENERALES .................................................................................. 6
6. MUESTREO Y MANIPULACIN ............................................................................... 7
7. CONDICIONES DE TRABAJO .................................................................................. 8
8. PROTOCOLO...................................................................................................8
9. ANALISIS DE DATOS ..........................................................................................17
10. DIAGNSTICO DE AVERAS ................................................................................18
11. TRANSPORTE ................................................................................................18
12. ESTABILIDAD Y ALMACENAMIENTO ......................................................................18
13. ESPECIFICACIONES .........................................................................................18
14. REFERENCIAS ...............................................................................................19
15. CONTROL DE CALIDAD .....................................................................................19
16. LEYENDA PARA SIMBOLOS UTILIZADOS ..................................................................20

AmpliSens HPV HCR screen-titre-FRT

PCR kit

Manual de Instrucciones

AmpliSens

Ecoli s.r.o., Studenohorsk 12 Instituto Cientfico Federal del Estado
841 03 Bratislava 47 Instituto Central de Investigacin de Epidemiologa
Repblica Eslovaca Calle 3A Novogireevskaya
Tel.: +421 2 6478 9336 Mosc 111123 Rusia
Fax: +421 2 6478 9040
ecoli@ecoli.sk
www.ecoli.sk www.pcrdiagnostics.eu
REF R-V31-T-2x(RG,iQ,SC)-CE, R-V31-T-4x(RG,iQ,Mx)-CE / VER : 24.08.0922.06.11/Pgina 2 de 20

1. USO

El AmpliSens HPV HCR screen-titre-FRT PCR kit es una prueba de amplificacin de cido nucleico in vitro
para la deteccin y cuantificacin de los tipos 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 del virus del papiloma
humano (HPV) de alto riesgo carcinognico (HCR) en el material clnico utilizando la deteccin por hibridacin
fluorescente en tiempo real.
El AmpliSens HPV HCR screen-titre-FRT PCR kit tiene la capacidad de detectar (sin genotipificar) ADN del
HPV de 2 grupos filognicos principales, A7 y A9, que incluyen 10 tipos (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 52, 58, y 59),
como tambin ADN del HPV tipo 51 (grupo A5) y HPV tipo 56 (grupo A6). Estos tipos exhiben una alta actividad
transformante y son responsables de ms del 94 % de casos de displasia cervical y cncer cervical uterino.

El AmpliSens HPV HCR screen-titre-FRT PCR kit est adaptado para aparatos de 2 canales, por ejemplo,
Rotor-Gene 3000/6000 (Corbett Research, Australia), iCycler iQ (Bio-Rad, USA) con filtros para canales FAM y
HEX/JOE, SmartCycler II (Cepheid, USA), o para aparatos de 4 canales, por ejemplo, Rotor-Gene 3000/6000
(Corbett Research, Australia), Mx3000P (Stratagene, USA), iCycler iQ5 (Bio-Rad, USA).

Los resultados del anlisis de PCR se toman en cuenta en diagnsticos complejos de enfermedades.

2. PRINCIPIOS DE DETECCIN PCR

El mtodo se basa en simultneas amplificaciones en tiempo real (multiplex PCR) y deteccin, en
tiempo real, de fragmentos de ADN de los genes E1-E2 del HPV y un fragmento de ADN del gen -globina,
el cual se usa como un control interno endgeno. El anlisis PCR para la presencia de ADN de 12 tipos de
HPV se realiza en 2 tubos (PCR kit variant screen-titre-FRT 2x) o en un tubo (PCR kit variant screen-titre-FRT
4x).

El resultado de la amplificacin de ADN del HPV es detectado en el canal fluorescente
JOE/Yellow/HEX/TET para un instrumento PCR de 2 canales. Los genotipos que pertenecen al grupo
filognico A9 (16, 31, 33, 35, 52, y 58) son detectados en un tubo, mientras que los pertenecientes al grupo
filognico A7 (18, 39, 45, y 59) como tambin los genotipos 51 y 56 son detectados en el otro tubo.

En el caso de instrumentos de PCR de 4 canales, el resultado de la amplificacin de ADN de cada grupo
filognico del HPV es detectado en canales fluorescentes separados (grupo 9 HPV, en JOE/Yellow; grupo
A7 HPV, en ROX/Orange; y los tipos 51 y 56 del HPV, en el canal Cy5/Red).

La deteccin de grupos filognicos en diferentes tubos no est considerada como una genotipificacin
del virus porque cada grupo consiste de diferentes genotipos de HPV.

El resultado de la amplificacin del Control Interno es detectado en el canal FAM/Green. El ADN blanco
seleccionado como un control interno endgeno es un fragmento de genoma humano. Siempre debe estar
presente en la muestra (hisopado cervical) en suficientes cantidades equivalente al nmero de clulas en el
hisopo (10
3
10
5
equivalentes genmicos). Entonces, el uso de un control interno endgeno hace posible

no solo el monitoreo de las etapas de prueba (extraccin de ADN y amplificacin de PCR) sino tambin la
evaluacin adecuacin del muestro y almacenamiento de material clnico. Si se tomara un hisopado
epitelial incorrectamente (el nmero de clulas epiteliales insuficientes), la seal de amplificacin del gen
de -globina sera subvalorado.
El anlisis cuantitativo de ADN de HPV se basa en la dependencia linear entre el umbral cclico (Ct) y la
concentracin inicial de ADN de HPV. El anlisis cuantitativo se realiza con la presencia de calibradores de
ADN (muestras con una concentracin conocida de ADN de HPV), los cuales son agregados durante la
amplificacin. Los resultados de la amplificacin de los calibradores de ADN se utilizan para construir una
curva de calibracin, para determinar la concentracin de ADN de HPV en las muestras determinadas. Para
minimizar el efecto de la variacin durante el muestreo del material, los resultados cuantitativos (las
concentraciones de ADN de HPV) son normalizados a la cantidad de ADN genmico.

El AmpliSens HPV HCR screen-titre-FRT PCR kit usa comienzo-caliente", que reduce en gran medida la
frecuencia de reacciones no especficamente cebadas. Comienzo-Caliente" se garantiza por la separacin de
nucletidos y Taq-polimerasa al usar una capa de cera o una polimerasa qumicamente modificada (TaqF). La cera
se derrite y los componentes de reaccin se mezclan solo a 95 C. La polimerasa qumicamente modificada (TaqF)
se activa al calentar a 95 C.

3. CONTENIDO

El AmpliSens HPV HCR screen-titre-FRT PCR kit se produce de 2 formas:

AmpliSens HPV HCR screen-titre -FRT PCR kit variant screen-titre-FRT 2x, REF R-V31-T-2x(RG,iQ,SC)-CE
(para el uso con RG, iQ, SC).

AmpliSens HPV HCR screen-titre -FRT PCR kit variant screen-titre-FRT 4x, REF R-V31-T-4x(RG,iQ,Mx)-CE (para
el uso con RG, iQ, Mx).

El AmpliSens HPV HCR screen-titre-FRT PCR kit variant screen-titre-FRT 2x incluye:

Reactivo Descripcin Volumen, ml Cantidad

PCR-mix-1-FRT HPV A9 Lquido transparente incoloro 0.14 6 tubos tapa azul

PCR-mix-1-FRT HPV A7+ Lquido transparente incoloro 0.14 6 tubos tapa verde

PCR-buffer-FRT Lquido transparente incoloro 0.30 6 tubos

Polimerasa (TaqF) Lquido transparente incoloro 0.02 6 tubos

DNA calibrator C1 HPV 16, 18 Lquido transparente incoloro 0.04 3 tubos



DNA-buffer Lquido transparente incoloro 0.5 1 tubo

Control Negativo (C) Lquido transparente incoloro 1.2 1 tubo

REF R-V31-T-2x(RG,iQ,SC)-CE, R-V31-T-4x(RG,iQ,Mx)-CE / VER : 24.08.0922.06.11/ Pgina 3 de 20 REF R-V31-T-2x(RG,iQ,SC)-CE, R-V31-T-4x(RG,iQ,Mx)-CE / VER : 24.08.0922.06.11/Pgina 4 de 20

El AmpliSens HPV HCR screen-titre-FRT PCR kit variant screen-titre-FRT 2x es para 216 reacciones
(108 pruebas), incluyendo los controles.

El AmpliSens HPV HCR screen-titre-FRT PCR kit variant screen-titre-FRT 4x incluye:

Reactivo Descripcin Volumen, ml Cantidad

PCR-mix-1-FRT HPV screen-titre Lquido transparente incoloro 0.28 3 tubos

PCR-buffer-FRT Lquido transparente incoloro 0.30 3 tubos

Polymerase (TaqF) Lquido transparente incoloro 0.02 3 tubos

DNA calibrator C1 HPV Lquido transparente incoloro 0.04 3 tubos



DNA-buffer Lquido transparente incoloro 0.5 1 tubo

Control Negativo (C) Lquido transparente incoloro 1.2 1 tubo

El AmpliSens HPV HCR screen-titre-FRT PCR kit variant screen-titre-FRT 4x es para 108 reacciones
(incluyendo los controles).

El kit de PCR tambin incluye:

1. Un Disco Compacto con:

- software (formato Microsoft
Excel) para la interpretacin de la data y obtencin del anlisis de

resultados

- archivo plantilla en formato del software Rotor-Gene para un experimento rpido;

- archivo plantilla en formato del software Mx3000P para un experimento rpido;

- archivo de programa de amplificacin para los software Rotor-Gene y iQ iCycler.

2. Manual de Instrucciones (documento).

3. Apndices, contienen descripcin detallada de la programacin y procesamiento de data.

4. Boletn, contiene valores de calibracin para lotes determinados del AmpliSens
HPV HCR screen-

titre-FRT PCR kit.

4. REQUERIMIENTOS ADICIONALES

Kit de aislamiento de ADN.

Guantes y guardapolvos descartables.

Pipetas (ajustable).

Tips estriles con barrera a aerosoles (hasta 200 l).

Rejilla para tubos.

Vortex mezclador.

Centrifugador con rotor para tubos de reaccin de 2-ml.
Caja PCR.

Refrigerador de 28 C.

Congelador de 16 C.

Descarte para tips.

Sistema de deteccin de amplificacin gnica en tiempo real de 2 canales: Rotor-Gene 3000/6000
(Corbett Research, Australia), iCycler iQ (Bio-Rad, USA) con canales para canales FAM y filtros
HEX/JOE; SmartCycler II (Cepheid, USA) o su equivalente para AmpliSens HPV HCR screen-titre-
FRT PCR kit variant screen-titre-FRT 2x.

Sistema de deteccin de amplificacin gnica en tiempo real de 4 canales: Rotor-Gene 3000/6000
(Corbett Research, Australia), Mx3000P (Stratagene, USA), iCycler iQ5 (Bio-Rad, USA) o su
equivalente para AmpliSens HPV HCR screen-titre-FRT PCR kit variant screen-titre-FRT 4x

Rotor-Gene: microtubos descartables de polipropileno de tapa aplanada de 0.2-ml para PCR (por
ejemplo, Axygen, USA) para un rotor de 36 pocillos o microtubos de 0.1 ml (Corbett Research,
Australia) para un rotor de 72 pocillos.

iCycler iQ o iQ5: microtubos descartables de polipropileno en forma de domo de 0.2-ml para PCR
(for instance, Axygen, USA), tubos en forma de domo en tiras o una placa de 96 pocillos para PCR
equipado con transparencias pticas de conservacin trmica (Bio-Rad, USA).

Mx3000P: microtubos descartable de polipropileno en forma de domo de 0.2-ml en
tiras/individuales para PCR (por ejemplo, Axygen, USA) para un rotor de 36 pocillos una placa de 96
pocillos para PCR equipado con transparencias pticas de conservacin trmica (Bio-Rad, USA).

SmartCycler II: microtubos descartables de polipropileno para PCR para SmartCycler II para el uso
de mezcla reactiva de 25 l (Cepheid, USA). Centrifuga MiniSpin y rejilla de tubos (Cepheid, USA).

5. PRECAUCIONES GENERALES

El usuario siempre debe prestarle atencin a lo siguiente:

Use tips estriles con barrera a aerosoles y use nuevos tips por cada procedimiento.

Almacenar y manipular amplicones lejos de otros reactivos.

Descongelar todos los componentes minuciosamente a temperatura de ambiente antes de
empezar la deteccin.

Ya descongelado, mezclar los componentes y centrifugar brevemente.

Use guantes, guarda polvo, proteja los ojos mientras se manipulen muestras y reactivos. Lavarse las
manos minuciosamente al terminar.

No comer, beber, fumar, aplicar cosmticos, o manipular lentes de contacto en el laboratorio.

No utilizar kit despus de su fecha de expiracin.

Descartar todas las muestras y reactivos sin usar de acuerdo a los requerimiento de autoridades
locales.

Las muestras deben considerarse potencialmente infecciosas y deben ser manipulados en una
cabina biolgica de acuerdo a las prcticas apropiadas de bioseguridad.

REF R-V31-T-2x(RG,iQ,SC)-CE, R-V31-T-4x(RG,iQ,Mx)-CE / VER : 24.08.0922.06.11/Pgina 5 de 20 REF R-V31-T-2x(RG,iQ,SC)-CE, R-V31-T-4x(RG,iQ,Mx)-CE / VER : 24.08.0922.06.11/Pgina 6 de 20

Limpiar y desinfectar todo lquido derramado de muestra o reactive usando un desinfectante como
0,5% de hipoclorito de sodio, u otro desinfectante adecuado.

Evitar contacto con la piel, ojos, y mucosa. Si hay contacto con la piel, ojos y mucosa
inmediatamente lavar con agua y buscar atencin mdica.

Fichas de Datos de Seguridad (MSDS) estn disponibles por pedido.

El uso de este producto debe ser limitado al personal entrenado en las tcnicas de amplificacin de
ADN.

El proceso del laboratorio debe ser unidireccional; debera comenzar en el rea de Extraccin y
luego seguir en las reas de Amplificacin y Deteccin. No devolver muestras, materiales, y
reactivos al rea donde se realiz el paso anterior.

Algunos componentes de este kit contienen azida de sodio como un persevante. No utilizar
tubos de metal para la transferencia de reactivos.

6. MUESTREO Y MANIPULACIN

AmpliSens HPV HCR screen-titre-FRT PCR kit variant screen-titre-FRT se usa para el anlisis de
ADN extrado con los kits de:

Raspado cervical o de la uretra

6.1. Raspado cervical o de uretra

Para mujeres: las muestras epiteliales se toman de la misma manera como para los anlisis citolgicos:

Mtodo 1. El kit de muestro consiste de 1 o 2 cepillos citolgicos cervicales y un tubo de 2-ml con 0.5

ml de Medio de Transporte con Mucoltico REF 953-CE.

Colocar el hisopado epitelial cervical (endocervix) tomado con el primer citocepillo cervical y/o el
hisopado de la superficie cervical (ectocervix) tomado con el segundo citocepillo en el tubo con el
medio de transporte. La parte de toma de muestra del citocepillo se debe romper y dejar en el tubo
con medio de transporte.

Mtodo 2. El kit de muestreo (Digene, USA) consiste de un citocepillo cervical y un tubo con 1.0 ml de
medio de transporte Digene.

Colocar el hisopado epitelial cervical (canal cervical) tomado con el citocepillo cervical en el tubo con
medio de transporte Digene.

Mtodo 3. El kit de muestreo consiste de una sonda ginecolgica combinada para tomar muestras
simultaneas de epitelio del endocervix y ectocervix y un tubo de 5-ml con 2.0 ml Medio de Transporte
con Mucoltico REF 953-CE.

Colocar el hisopado epitelial cervical (endocervix) y el hisopado de la superficie cervical (ectocervix) en
el tubo con el medio de transporte. La parte de toma de muestra del citocepillo se debe romper y dejar
en el tubo con medio de transporte.

Mtodo 4. El kit de muestreo consiste de una sonda ginecolgica combinada para tomar muestras
simultneas de epitelio del endocervix y ectocervix y un frasco con medio de transporte y fijacin para
fluido citolgico comprado de CytoScreen (Italia) o PreservCyt (USA).

Colocar el hisopado epitelial cervical (endocervix) y el hisopado de la superficie cervical (ectocervix) en
el tubo con el medio de transporte y fijacin. La parte de toma de muestra del citocepillo se debe
romper y dejar en el tubo con medio de transporte.

Para hombres: Colocar la hisopado epitelial de la uretra tomado con una sonda universal en un tubo
de 2.0-ml con 0.5 ml de Medio de Transporte con Mucoltico REF 953-CE.

Solo se permite un ciclo de congelacin y descongelacin para el material clnico.

7. CONDICIONES DE TRABAJO

El AmpliSens HPV HCR screen-titre-FRT PCR kit debe usarse de 1825 C.

8. PROTOCOLO

8.1. Aislamiento de ADN

Es recomendable los siguientes kits para la extraccin de cido nucleico:

DNA-sorb-AM, REF K1-12-100-CE (para material clnico obtenido por el 1er, 2do o 3er mtodo).

DNA-sorb-, REF K1-2-100-CE (para material clnico obtenido por el 1er, 2do o 3er mtodo).

DNA-sorb-C, REF K1-6-50-CE (para muestras de biopsia).

Extraer ADN de acuerdo a las instrucciones del fabricador.

Notar que ni el Control Positivo ni el Control Interno se usa en el procedimiento de
extraccin.

8.2. Preparando PCR

El volumen total de reaccin es de 23 l, el volumen de muestra de ADN es 10 l.

8.2.1. Preparacin de tubos para PCR usando HPV HCR screen-titre-FRT PCR kit variant screen-titre-
FRT 2x.

1. Preparacin de la mezcla de reaccin para el nmero requerido de muestras (Tablas 2 y 3). En los
clculos, debera tomarse en cuenta que cada corrida requiere al menos 4 muestras control (control
negativo y 3 calibradores). En adicin, Es necesario tomar ms reactivos para una reaccin extra.
Una reaccin de amplificacin requiere:

- 7. l de PCR-mix-1-FRT HPV A9 o PCR-mix-1-FRT HPV A7+;

- 7.5 l de PCR-buffer-FRT;

- .5 l de polimerasa (TaqF).


Tabla 2

Adicin de reactivos a los tubos

Si se tienen que analizar 14 muestras Si se tienen que analizar 14 muestras (por
mas es el control ejemplo, N) mas 8 controles
Toma un tubo de cada uno de los Mezclar en otro tubo 15*(N+5) l de
siguientes reactivos: polimerasa (TaqF), PCR-buffer-FRT y 1.0*(N+5) l de polimerasa
PCR-buffer-FRT, PCR-mix-1-FRT HPV A9 (TaqF). Con cuidado poner tubo en vortex a
y PCR-mix-1-FRT HPV A7+. velocidad min. y luego centrifugar en vortex 1s.
Transferir todo el volumen (20 l) de Adicionar 7 *(N+5) de PCR-mix-1-FRT HPV A9 y
polimerasa (TaqF) en el tubo con PCR-mix-1-FRT HPV A7+ a 2 tubos
PCR-buffer-FRT (300 l). Con cuidado distintos.
poner tubo en vortex a una velocidad Transferir la mitad (8*(N+5) l) de la mezcla
mnima y luego centrifugar en el vortex preparada de PCR-buffer-FRT con
por 1 s. Evitar formacin de espuma. polimerasa (TaqF) al tubo que contiene PCR-
Agregar 160 l de mezcla preparada en mix-1-FRT HPV A9; transferir la otra mitad
cada tubo con PCR-mix-1FRT HPV (8*(N+5) l) de la mezcla preparada al tubo
A9 (140 l) y PCR-mix-1-FRT A7+ con PCR-mix-1-FRT HPV A7+. (Referirse a la
(140 l) Tabla 2 para consejos de clculos).

- Cuidadosamente usar vortex para las mezclas preparadas a velocidad mnima y luego
centrifugar por 1 s. Evitar la formacin de espuma.

- Preparar (N*2 +8) tubos PCR (2 tubos por
- Preparar 36 tubos PCR. cada muestra clnica ms 8 tubos para
controles).

Las mezclas de polimerasa (TaqF) y PCR-buffer-FRT pueden almacenarse a 28 C por 3
meses. La mezcla de polimerasa (TaqF), PCR-buffer-FRT, y PCR-mix-1-FRT HPV A9 como
tambin la mezcla de polimerasa (TaqF), PCR-buffer-FRT, y PCR-mix-1-FRT HPV A7+ deben
ser usadas dentro de las 2 h despus de la preparacin.

Tabla 3
Esquema de preparacin para N muestras analizadas, control negativo, y 3 calibradores

Mezclar en otro tubo.

Numero de muestras, N 1 2 3 4 5 6 7

PCR-buffer-FRT, l 90 105 120 135 150 165 180

Polimerasa (TaqF), l 6 7 8 9 10 11 12


PCR-buffer-FRT, l 195

210

225 240

255

270
Todo el

tubo

Polimerasa (TaqF), l 13

14

15 16

17

18
Todo el

tubo

- Mezclar en otro tubo la parte de la mezcla preparada de PCR-buffer-FRT y polimerasa (TaqF) con
PCR-mix-1-FRT HPV A9 (tapa azul).

Mezcla de PCR-buffer-FRT y
48

56

64

72 80

88

96

polimerasa (TaqF), l

PCR-mix-1-FRT 9, l (tapa azul) 42 49 56 63 70 77 84

104 112 120 128 136 142 150


PCR-mix-1-FRT 9, l (tapa azul) 91 98 105 112 119 126
Todo el

tubo

Transferir una parte de la mezcla preparada de PCR-mix-FRT y polimerasa (TaqF) a otro tubo y agregar

PCR-mix-1-FRT HPV A7+ (tapa verde).

48 56 64 72 80 88 96


PCR-mix-1-FRT 7+, l (tapa
42 49 56 63 70 77 84

verde)

104

112

120

128 136

142

150


PCR-mix-1-FRT 7+, l (tapa
91

98

105

112 119

126
Todo el

verde)

tubo

2. Agregar 15 l de la mezcla preparada de HPV FRT A9 (por cada tubo) a la mitad de los tubos y 15 l
de la mezcla preparada de HPV FRT A7+ (por cada tubo) a la otra mitad de tubos.

3. Agregar 10 l de muestras de ADN, obtenidas de muestras clnicas o de control en la etapa de
extraccin de ADN, a los tubos preparados para PCR usando tips con barrera a aerosoles. Agregar
muestras de ADN primero a los tubos con la mezcla preparada de HPV FRT A9 y luego a los tubos
con la mezcla preparada de HPV

FRT A7+ (Esquema 1).

Asegurarse de que el sorbente no sea transferido a la mezcla de reaccin PCR
mientras se agregan las muestras de ADN.

4. Llevar a cabo las reacciones de amplificacin del control:

NCA - Agregar 10 l de DNA-buffer en vez de la muestra de ADN al tubo con la mezcla
HPV FRT A9 preparada y al tubo con HPV FRT A7+
HPV DNA - Agregar 10 l de cada calibrador de ADN de HPV (C1 HPV 16, 18, C2 HPV 16, 18, C3 HPV
Calibradores 16, 18) a cada uno de los 3 tubos con la mezcla preparada de HPV FRT A9 y 10 l de
(C1, C2, C3) cada calibrador de ADN de HPV (C1 HPV 16, 18, C2 HPV 16, 18, C3 HPV 16, 18) a cada uno
de los 3 tubos con la mezcla preparada HPV FRT A7+.

Esquema 1

Orden de colocacin de tubos y adicin de reactivos (solo si se tiene que usar los tubos)
1
.

2 tubos por 1
muestra clnica
K2 HPV

HPV FRT 9 MIX tapa azul
HPV FRT 7+mix tapa verde
C3 HPV
1 14 muestras
C2 HPV
C1 HPV Controles Negativos

8.2.2. Amplificacin

1. Colocar los tubos en la cmara de reaccin.

Para Rotor-Gene, ejecutar uno de los 2 programas siguientes (para detalles, ver Apndice 1).

Tabla 4

Programa de amplificacin de ADN para los tipos de HCR HPV 16, 18, 31, 33, 35; 39, 45, 51, 52, 56, 58, y 59

Paso

Temperatura, C

Tiempo
Deteccin
Ciclos

fluorescente

Choque trmico 95 15 min 1

Choque trmico2 65 2 min 1

95 20 s

64
Anotacin:

Ciclar 1 grd. por ciclo / 25 s 5

Bajar temperatura en

cada paso por 1 C

65 55 s

95 15 s

Ciclar2
60 25 s
40

65

40 s

FAM/Green,

JOE/Yellow

El programa universal AmpliSens-1 RG" para la amplificacin y deteccin de ADN tambin
se puede usar (ver Tabla 5). Este programa permite la realizacin simultnea de cualquier
combinacin de pruebas en un instrumento (por ejemplo, combinado con pruebas para la
deteccin de ADN del patgeno STI).

Las caractersticas del desempeo analtico del kit reactivo no cambian cuando se usa el programa

de amplificacin universal.

Tabla 5

Programa de amplificaci Aplies- RG

Paso

Temperatura, C

Tiempo
Deteccin
Ciclos

fluorescente


95 5 s

Ciclar 60 20 s 5

72 15 s

95 5 s

FAM/Green,

Ciclar2 60

20 s
JOE/Yellow,
40

ROX/Orange,

Cy5/Red

72 15 s

Para iCycler iQ, ejecutar uno de los 2 programas siguientes (para detalles, ver Apndice 2).

Tabla 6


Paso

Temp

Tiempo
Deteccin
Ciclos

fluorescente

1 95 C 15 min 1

2 65 C 2 min 1

95 C 20 s

64 C

3 Temp -: 25 s 5

1.0 para un ciclo

63 55 s

93 20 s

4 60 25 s 42

63 55 s FAM, HEX

El programa universal Aplies- iQ para la amplificacin y deteccin de ADN tambin se
puede usar (ver Tabla 8). Este programa permite la realizacin simultnea de cualquier



Tabla 7

Programa de amplificaci Aplies- iQ

Paso

Temp

Tiempo
Deteccin
Ciclos

fluorescente

1 95 C 15 min 1

95 C 5 s

2 60 C 20 s 5

72 15 s

93 5 s

3 60 30 s FAM, HEX, ROX, Cy5 40

72 15 s

Para el SmartCycler, ejecutar los siguientes programas (para detalles, ver Apndice 3).

1
Si una placa de PCR se usa (iCycler iQ), inserte las muestras de acuerdo orden de colocacin de tubos (ver Apndice 2).


Tabla 8

Programa de amplificacin de ADN para los tipos de HCR HPV 16, 18, 31, 33, 35; 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59

Paso

Temperatura, C

Tiempo
Deteccin
Ciclo

fluorescente

Etapa 1. Choque trmico 95 900 s 1

Etapa 2. Choque trmico 65 120 s 1

Etapa 3. Ciclo 95 20 s

3 Temperaturas 63 30 s 5

65 60 s

Etapa 4. Ciclo 95 25 s

3 Temperaturas 60 30 s 42

65 60 s Prendido

8.2.3. Preparacin de tubos para PCR usando el HPV HCR screen-titre-FRT PCR kit variant screen-
titre-FRT 4x.

1. Primero, preparar la mezcla de PCR-buffer-FRT y polimerasa (TaqF). Transferir los contenidos de
un tubo con polimerasa (TaqF) (0.02 ml) al tubo con PCR-buffer FRT (0.3 ml). Cuidadosamente
realizar el vortex al tubo. Evitar formacin. Rotular cada tubo con la fecha de preparacin de la
mezcla. Para preparar la mezcla, usar solo tipos estriles con barreras de aerosol.

La mezcla preparada es para 40 reacciones. La mezcla puede almacenarse a 28 C por 3
meses. Puede ser usado cuando necesario.

2. Agregar los reactivos a los tubos de acuerdo a la Tabla 9.

Tabla 9

Mtodos de adicin de reactivos a los tubos

1
er
mtodo 2
do
mtodo

1. Agregar 7 l ode PCR-mix-1-FRT HPV
screen-titre a los tubos
2. Agregar 8 l de la mezcla preparada de
PCR-buffer-FRT y polimerasa
(TaqF)
1. Preparar mezcla de reaccin para la cantidad

necesaria de reaccin- mezclar en otro tubo

el PCR-mix-1-FRT HPV screen-titre y la

mezcla preparada de PCR-buffer FRT y

polimerasa (TaqF). Las siguientes cantidades
de reactivos son necesarias por reaccin:

- 7 l de PCR-mix-1-FRT HPV screen-titre

- 8 l de la mezcla de PCR-buffer-FRT

y polimerasa (TaqF)

En los clculos, se debe tener en cuenta

que cada corrida requiere por lo menos

4 muestras control (control negativo y

3 calibradores). Adicionalmente, es

necesario tener reactivos para una reaccin

extra (ver Tabla 10).

2. Agregar 15 l de mezcla preparada a los tubos

La mezcla de polimerasa (TaqF), PCR-buffer-FRT, y PCR-mix-1-FRT HPV A9 como tambin la
mezcla de polimerasa (TaqF), PCR-buffer-FRT, y PCR-mix-1-FRT HPV A7+ debe ser usado
dentro de las 2 h despus de la preparacin.
Tabla 10

Esquema de preparacin para N muestras analizadas, control negativo, y 3 calibradores

Numero de muestras, N 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
PCR-mix-1-FRT HPV screen-
56 63 70 77 84 91 98 105 112 119

titre, l

PCR-buffer-FRT y mezcla
64 72 80 88 96 104 112 120 128 136


126

133

140 147

154

161

168

175 182 189

titre, l

144

152

160 168

176

184

192

200 208 216


196

203

210 217

224

231

238

245 252 259

titre, l

224

232

240 248

256

264

272

280 288 296


3. Agregar 10 l de muestra de ADN obtenida de muestra clnica o control en la etapa de extraccin a
los tubos preparados para PCR usando tips con barrera de aerosol.

Asegurarse de que el sorbente no sea transferido a la mezcla de reaccin PCR
mientras se agregan las muestras de ADN.

4. Realizar la reaccin de amplificacin de control:

NCA -Agregar 10 l de DNA-buffer
Calibradores
-Agregar a tres 10 l de cada uno de los calibradores HPV DNA (C1 HPV, C2 HPV,
C3 HPV)
HPV ADN (C1,
C2, C3)

8.2.4. Amplificacin

1. Insertar los tubos a la cmara de reaccin.

Para el instrumento Rotor-Gene, ejecutar uno de los 2 siguientes programas (para detalles, ver Apndice
4).

Tabla 11

Programa de amplificacin de ADN para los tipos de HCR HPV 16, 18, 31, 33, 35; 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59

Paso

Temperatura, C

Tiempo
Deteccin
Ciclos

fluorescente


Choque trmico2 65 2 min 1

95 20 s

64
Anotacin:

Ciclar 1 grd. por ciclo / 25 s 5

Bajar temperatura en

cada paso por 1 C

65 55 s

95 15 s

60 25 s

Ciclar2
FAM/Green,
40

JOE/Yellow,

65

40 s

ROX/Orange,

Cy5/Red

El programa universal AmpliSens-1 RG" para la ampllflcacln y deLeccln de Aun Lamblen
se puede usar (ver Tabla 12). Este programa permite la realizacin simultnea de cualquier



Tabla 12
Programa de amplificaci Aplies- RG

Paso

Temperatura, C

Tiempo
Deteccin
Ciclos

fluorescente


95 5 s

Ciclar 60 20 s 5

72 15 s

95 5 s

FAM/Green,

Ciclar2 60

20 s
JOE/Yellow,
40

ROX/Orange,

Cy5/Red

72 15 s

Para iCycler iQ, ejecutar uno de los 2 programas siguientes (para detalles, ver Apndice 5).

Tabla 13


Paso

Temp

Tiempo
Deteccin
Ciclos

fluorescente

1 95 C 15 min 1

95 C 15 s

65 C
2 Temp -: 55 s 6

1.0 para un ciclo

63 25 s

93 15 s

3 60 55 s Tiempo real 41

63 25 s

El prograa uiversal Aplies- iQ para la amplificacin y deteccin de ADN tambin se
puede usar (ver Tabla 14). Este programa permite la realizacin simultnea de cualquier



Tabla 14
Programa de amplificacin Aplies- iQ

Paso

Temp

Tiempo
Deteccin
Ciclos

fluorescente

1 95 C 15 min 1

95 C 5 s

2 60 C 20 s 5

72 15 s

93 5 s

3 60 30 s FAM, HEX, ROX, Cy5 40

72 15 s

Para el instrumento Mx3000P, ejecutar los siguientes programas (para detalles, ver Apndice 6).

Table 15

Programa de amplificacin de ADN para los tipos de HCR HPV 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, y 59

Paso

Temperatura, C

Tiempo
Deteccin
Ciclos

fluorescente

1 95 15 s 1

2 65 2 min 1

95 20 s

3
64

Anotacin:

25 s

5

(Ciclar)

1 grd. por ciclo

65 55 s

4
95 20 s

60

25 s

40

(Ciclar)

65

55 s

Cy5, FAM, HEX, ROX


El programa universal AmpliSens-1 Mx" para la ampllflcacln y deLeccln de Aun
tambin se puede usar (ver Tabla 16). Este programa permite la realizacin simultnea de
cualquier combinacin de pruebas en un instrumento (por ejemplo, combinado con
pruebas para la deteccin de ADN del patgeno STI).

Las caractersticas del desempeo analtico del kit reactivo no cambian cuando se usa el programa de
amplificacin universal.

Tabla 16
Programa de amplificaci Aplies- Mx

Paso

Temp

Tiempo
Deteccin
Ciclos

fluorescente

Segmento 1. 95 C 15 min 1

Segmento 2.
95 C 5 s

60 C

20 s 5

(Ciclar)

72

15 s

Segmento 3.
93 5 s

60

30 s FAM, HEX, ROX, Cy5 40

(Ciclar)

72

15 s

9. ANALISIS DE DATOS

Para el procesamiento de datos, ver Apndice 1 (para el instrumento Rotor-Gene de 2 canales), Apndice
2 (para el instrumento iCycler iQ), Apndice 3 (para el instrumento SmartCycler), Apndice 4 (para el
instrumento Rotor-Gene de 4 canales), Apndice 5 (para el instrumento iCycler iQ5), y Apndice 6 (para el
instrumento Mx3000P).

La seal en el tubo en el canal es considerado positivo, si es que las correspondientes curvas de
acumulacin fluorescente cruzan la lnea umbral. La seal es caracterizada por el ciclo (umbral Ct), el ciclo
correspondiente a la interseccin de la curva de fluorescencia y lnea umbral. El programa de grabacin
automtica de los resultados del anlisis determina el valor Ct. La curva de calibracin es graficada
automticamente en base a estos valores, y las concentraciones de ADN humano y de HPV son calculados.
Para obtener el ultimo resultado, se normaliza la concentracin de ADN HPV al nmero de genoma humano
equivalentes de acuerdo a la frmula:

log (copias de ADN HPV / copias ADN humano) 200000) = log (HPV en 100 000 clulas)

Cada lote del kit de reactivos viene con las concentraciones de los calibradores. Estos valores estn
especificados en el Apndice 4 y deben ser registradas en las celdas correspondientes del software para el
anlisis automtico de los resultados.

La reaccin es valida si

Los controles negativos no tienen seal en los canales (FAM/Green, JOE/Yellow/HEX/TET);

Todos los calibradores tienen seal en los canales (FAM/Green, JOE/Yellow/HEX/TET);
El coeficiente de correlacin para las curvas de calibracin de todos los canales no es
menor que 0.98.
El resultado de la deteccin de una muestra de ADN HPV se considera

Negativo, si la seal del Control Interno (IC; FAM/canal Verde) es detectado en ambos tubos para la
muestra y si la cantidad equivalente de genoma de ADN humano por reaccin excede a 10
3
.

Positivo, si una seal en el canal JOE/Yellow/HEX/TET es detectado en al menos uno de los 2 tubos.

Resultado:

Uno o varios tipos pertenecen al grupo filogentico A9 (si la seal es detectada en el tubo con la
mezcla HPV FRT A9);

Uno o varios tipos pertenecen al grupo filogentico A7 o a los tipos 51/56 (si la seal es detectada en
el tubo con la mezcla HPV FRT A7+).

10. DIAGNSTICO DE AVERAS

Los resultados del anlisis no se toman en cuenta en los siguientes casos:

- Si ninguna seal positiva en el canal JOE/Yellow/HEX/TET (A9, A7, A5/A6) se detecta en ninguno de
los 2 tubos y la seal del Control Interno (IC; canal FAM/Green) no es detectado o nmero de
equivalentes genmico de ADN humano por reaccin no excede a 10
3
. En este caso, los resultados
del anlisis se consideran invlidos para todas las muestras. Es necesario repetir el anlisis para
tales muestras y tomar medidas para detectar y eliminar la fuente de contaminacin.

- Seal(es) dbil(es) positiva(s) es/son detectadas en el canal JOE/Yellow/HEX/TET pero la seal del
Control Interno (IC) en el canal FAM/Green no se detecta y el nmero de equivalentes genmicos
de ADN humano por reaccin no exceda a 10
3
.

Si tiene preguntas o encuentra problemas, por favor contactar nuestro representante autorizado
en la Comunidad Europea.

11. TRANSPORTE

El AmpliSens HPV HCR screen-titre-FRT PCR kit debe ser transportado a 28 por no ms de 5 dias.

12. ESTABILIDAD Y ALMACENAMIENTO

Todos los componentes del AmpliSens
HPV HCR screen-titre-FRT PCR kit (excepto el PCR-mix-1-FRT

HPV A9, PCR-mix-1-FRT HPV A7+, PCR-mix-1-FRT HPV screen-titre, y la polimerasa (TaqF)) deben ser
almacenados a 2 8 C cuando no se usa. Todos los componentes del AmpliSens
HPV HCR screen-

titre-FRT PCR kit son estables hasta la fecha de expiracin. La fecha de caducidad de reactivos abiertos
es igual al de los reactive cerrados, a menos que haya otra indicacin.

Se deben almacenar el PCR-mix-1-FRT HPV A9, PCR-mix-1-FRT HPV A7+, PCR-mix-1-
FRT HPV screen-titre, y la polimerasa (TaqF) a 16 C.

Se deben almacenar el PCR-mix-1-FRT HPV A9, PCR-mix-1-FRT HPV A7+ y el PCR-mix -1-FRT
HPV screen-titre fuera de la luz.

13. ESPECIFICACIONES

13.1. Sensibilidad


La sensibilidad analtica del AmpliSens
HPV HCR screen-titre-FRT PCR kit es no menos que 5x10

3

equivalentes genmicos por 1 ml de muestra de los tipos HPV 16,18,31,35,39,45,51,52,56 y 59 y no
menos que 2.3 10
4
equivalentes genmicos por 1 ml de muestra de los tipos HPV 33 y 58.

Las caracterstica analticas del AmpliSens
HPV HCR screen-titre-FRT PCR kit se

garantizan siempre cuando se usan los kits de reactivos DNA-sorb-AM, DNA-sorb-B and
DNA-sorb-C (fabricados por el Presupuesto Federal del Instituto Cientfico Instituto de
Investigacin Central para Epidemiologa") adicionales.

13.2. Especificidad

La especificidad analtica del AmpliSens
HPV HCR screen-titre-FRT PCR kit se asegura por la seleccin

de primers especficos y de condiciones estrictas de reaccin. La especificidad clnica del AmpliSens

HPV HCR screen-titre-FRT PCR kit se confirm en prueba de laboratorio clnico.

14. REFERENCIAS

1. Pandbook ampllng, 1ransporLaLlon, and Lorage of Cllnlcal MaLerlal for C8 ulagnosLlcs",
developed by lederal 8udgeL lnsLlLuLlon of clence CenLral 8esearch lnsLlLuLe for Lpldemlology" of
lederal ervlce for urvelllance on Consumers 8lghLs roLection and Human Well-Being, Moscow,
2008.

15. CONTROL DE CALIDAD

De acuerdo Presupuesto Federal del Instituto Cientfico lnsLlLuLo de lnvesLlgacln CenLral para
Lpldemlologla") ISO 13485-Sistema de Certificacin de La Gestin de la Calidad Total, cada lote del
AmpliSens
HPV HCR screen-titre-FRT PCR kit es probado contra especificaciones predeterminadas

para asegurar la calidad consistente del producto.

16. LEYENDA PARA SIMBOLOS UTILIZADOS

Numero de catalogo

Cdigo de Lote

Instrumento medico

de diagnstico In vitro

Versin

Lmite de temperatura

Lmite mximo de
NCA

temperatura

Fabricador C

Fecha de fabricacin C+

Representante

autorizado en la IC

Comunidad Europea

Peligro

Suficiente para

Fecha de Expiracin

Consulte a las
instrucciones para el
uso

Mantener fuera
de la luz

Amplificacin del
Control Negativo

Control Negativo
de la extraccin

Control Positivo de
la amplificacin

Control Interno

Lista de Cambios Realizados en el Manual de Instrucciones

VER
Localizacin de los
cambios Esencia de los cambios

Los nombres de los calibradores de ADN fueron corregidos
(ejm., C1 HPV 16, 18 en vez de K1 HPV 16, 18 ) y escritos
completamente (ejm. Calibrador de ADN C1 HPV 16, 18)

Contenido
Se agregaron nuevas secciones Condlclones de 1raba[o" y
1ransporLe"

La seccin Lxplicacin de los Smbolos" se renombr
Leyenda para Smbolos Utilizados"

La informacin de fecha de caducidad para los reactivos
abiertos se agrego

Estabilidad y
Almacenamiento
La informacin de que el PCR-mixes-1-FRT debe ser
almacenado fuera de la luz se agrego

Leyenda para smbolos
usados
Se corrigi la explicacin de los smbolos

Texto 1lLre" se cambi a LlLre" en el nombre del PCR kit
22.06.11 Caratula, Texto
El nombre de la Institucin se cambi a Presupuesto Federal del
lnsLlLuLo ClenLlflco lnsLlLuLo de lnvesLlgacln CenLral para
Lpldemlologla"


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HPV HCR screen-

HPV HCR screen-titre-FRT PCR kit (excepto el PCR-mix-1-FRT

HPV HCR screen-

HPV HCR screen-titre-FRT PCR kit es no menos que 5x10

HPV HCR screen-titre-FRT PCR kit se

HPV HCR screen-titre-FRT PCR kit se asegura por la seleccin

HPV HCR screen-titre-FRT PCR kit es probado contra especificaciones predeterminadas

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