Mthodes danalyse

morphologique des
tissus
Aurlie PAGNON-MINOT, phD
Novotec _ 13, 15 rue Jacques Monod 69007 LYON
apagnon@novotec-labs.com
Certificat RB8 Biotechnologie et Ingnierie biomdicale
Master M1 Recherche Biomdicale
HISTOLOGIE :
Association des cellules pour former des tissus
Un tissu se dfinit par la structure
lagencement des cellules
la prsence ou non de matriel extracellulaire

Ensemble coopratif de cellules diffrencies formant une association
territoriale, fonctionnelle et biologique
Histologie cellulaire Histologie tissulaire
5 !m
K
F
F
50 !m
1 mm 10 !m 1 !m 10 nm 1 nm
Macroscopie
Microscopie
photonique
Microscopie
lectronique
Microscopie
force atomique
! Rsolution de lanalyse structurale
HISTOLOGIE :
Association des cellules pour former des tissus
Que faire dun prlvement tissulaire ?
Analyse qualitative ou
semi-quantitative
Analyse quantitative
Tissus
Hybridation in situ
Immunohistochimie
Immunofluorescence
Coloration
Analyse structurale
Analyse ultrastructurale
MEB
MET
RT-PCR
PCR quantitative
Western-Blot
ELISA
Structure
gnrale
gnes
protines
protines
gnes
protines
protines
gnes
Prlvement
Tissulaire
(biopsies / pices dexrses)
Immunohistochimie/
Immunofluorescence
Colorations histologiques
standards
Hybridation in situ
Examen Microscopie
lectronique

Microscopie optique
standard
Organigramme de traitement des prlvements tissulaires
Fixation
Microtomie
conglation
Microtome
Inclusion
Inclusion ou non en OCT
Ultramicrotomie

Chimique
Rsines
plastiques
Physique
Physique
paraffine
! La dure minimale de la technique est de deux trois
jours, mais elle est en fait trs variable selon :
- la taille des prlvements : certaines pices opratoires ncessitent 2
3 jours de fixation.

- la nature des prlvements : osseux ou calcifis ncessite une
dcalcification pralable (qq heures plusieurs semaines)

- les colorations spciales, ncessaires de nombreux diagnostics,
peuvent durer plusieurs jours.

- l'urgence de certains diagnostics, qui impose de raccourcir au
maximum les diffrentes tapes des techniques.
Traitement des prlvements tissulaires
. Prlvements tissulaires

" La biopsie est le prlvement dun fragment de tissu. Elle permet lexamen
dune partie (partielle) ou de la totalit (exrse) dune lsion. Elle est faite :
! Sous contrle de la vue, au bistouri ou avec diverses pinces
! A laiguille ou trocard dans les organes profonds.


" La pice opratoire est le rsultat dun acte chirurgical avec rsection dun ou
plusieurs organes. Son tude comporte un bilan macroscopique des lsions
(nombre, sige, aspect), qui peuvent faire l'objet de photographies
macroscopiques, et la ralisation des prlvements ncessaires lexamen.




" Lautopsie (ou ncropsie) est un examen fait sur un individu/animal dcd
pour prciser les lsions responsables des symptmes observs, tablir les
causes mdicales et/ou juger ventuellement des effets de traitements appliqus.



. Fixation : accs des anticorps lantigne 1/3

" Evite :
. La dcomposition post-mortem
. La digestion enzymatique
" Prserve larchitecture des tissus/cellules
" Immobilise les tissus/cellules dans un tat aussi proche que possible de ltat initial.


Points critiques :
La fixation doit se faire aussi vite que possible :
. Immdiatement pour les biopsies
. # 2h pour les pices opratoires



. Fixation : accs des anticorps lantigne 2/3

1. Fixation physique : conglation

Tissu plong dans un liquide refroidissant (isopentane 130C) ou dans de la
carboglace

! Avantages :
- maintien de la ractivit de l Ag (fixation idale)
- tat proche du vivant
- maintien en place des constituants solubles
_ prservation dorganites sensibles la pression osmotique
! Inconvnients :
_ peu pratique (azote liquide)
_ moins bonne morphologie




. Fixation : accs des anticorps lantigne 3/3

2. Fixation chimique :

! Les agents prcipitants : Alcool thylique, actone
Modification structure tertiaire des protines : effet dnaturant

! Avantage : - Antignicit prserv
! Inconvnients : - Altrations morphologiques
- Dshydratation simultane

! Les agents pontants : Formol, liquide de Bouin
Immobilisation par des liens intra et intermolculaires
! Avantages : - Structures mieux prserves: bonne morphologie
- Meilleure immobilisation des protines
! Inconvnients : - Dnaturation + svre des Ag
- Masquage des Ag
Points critiques :
Dure de fixation : minimum 24h ( temprature ambiante ou 4C selon le fixateur)
Volume de fixateur : 10 fois le volume de la biopsie/pice opratoire.


Bouin
Formol tamponn
Ethanol
MET MEB
IMAGERIE CELLULAIRE & TISSULAIRE :
INFLUENCE DU FIXATEUR
Bouin
Formol
tamponn
Ethanol
MO MET MEB
Liquide de Bouin
Dure darchivage ! 20 ans
Liquide de Bouin
Dure darchivage ! 6 mois
IMAGERIE CELLULAIRE & TISSULAIRE :
Influence de la dure de fixation
13
Type dantigne Tissu fix Tissu
congel
Ag extra
cellulaire
+/- +
Ag membranaire Svt - +
Ag intra cellulaire + +
IMAGERIE CELLULAIRE & TISSULAIRE :
Influence de la fixation
. Inclusion :
" Donne aux pices anatomiques fixes, la consistance ferme, ncessaire la
coupe.
! Imprgnation des tissus par une substance qui durcit secondairement :
paraffine, epon, spurr, mthacrylate.
Les rsines tant hydrophobes, le prlvement doit pralablement tre dshydrats
(immersion dans des bains dalcool). Les tissus fixs suivant cette mthode ne peuvent pas
tres utiliss pour dtecter les antignes labiles

! Fixation et inclusion peuvent tre remplaces par la conglation (examens
extemporans, tudes de structures qui peuvent tre altres par une fixation). Les tissus
frais peuvent tre inclus dans un compos dO.C.T. . Cette technique solidifie les tissus
permettant des coupes trs minces. Les tissus non fixs et congels ont une antignicit
excellente, mais une prservation morphologique mdiocre.
Points critiques :
La temprature de ltape denrobage ne doit pas tre suprieure 58C $ risque de sous
valuation du marquage






Prparations tissulaires (histologiques)
1. Coupes :
" Microtome : coupes de 3 8 %m dpaisseur.
" Cryostat : coupes de 3 20 %m dpaisseur. Permet dobtenir un diagnostic
rapide ou de pallier aux problmes de fixation menaant lintgrit des
constituants cellulaires. Morphologie des tissus non-optimale.
" Ultra- ou cryo-microtome : coupes de 0.02 0.1 %m dpaisseur.







2. Dpt des coupes sur une lame de verre ou sur des grilles
(ME)

3. Coloration/IHC/IF/ISH/Imprgnation mtallique

4. Montage des lames






! Les colorations : premires tapes du processus permettant lexamen
microscopique des tissus pour mieux identifier certains constituants de la cellule.

! Les diffrentes tapes de la coloration :
! Dparaffinage (xylne ou OTTIX ; xylne-thanol)
La paraffine est insoluble dans leau et lalcool, mais soluble dans les
hydrocarbures tels que le xylne
! Hydratation
! Coloration proprement dit (routine ou spciale)
! Dshydratation (thanol)
! claircissement (tolune / xylne).



Aperu des diffrentes colorations histologiques et
intrts

! Les colorations classiques : permettent de mettre en vidence la structure gnrale
des tissus.
" Hmatoxyline/Eosine (HE)





" Hmatoxyline/Eosine/Safran
Aperu des diffrentes colorations histologiques et
intrts

collagne...................................................roseple
muscle..................................................... rose fonc
Cytoplasme acidophile...............................rouge
basophiles.................................................pourpre
noyaux......................................................bleu
rythrocytes.......................................... Rouge cerise

collagne............................................jaune orang
muscle................................................rose
cytoplasme..........................rose
noyaux................................................bleu
rythrocytes.........................................rouge

! Les colorations spciales : sont ralises pour prciser des structures, des
substances, des constituants (lipides, glucides, protines, acides nucliques,
mtaux, etc).








Aperu des diffrentes colorations histologiques et
intrts
Gordon Sweet
Trichrome de Goldner
Bleu de Toluidine
! Mise en vidence des fibres conjonctives : Trichrome de Masson

Cette coloration met en vidence
les fibres de collagne. Cette
mthode est trs populaire. Utile
dans ltude de la pathologie du
coeur (infarctus), foie (cirrhose ) , rein
(fibrose glomrulaire)

Rsultats :
Noyau , chromatine et nuclole....bleu fonc noir
Cytoplasme rouge
Globule rouge rouge
Collagne bleu ou verte
(Variante Goldner)

Coloration habituellement utilise pour observer la
structure de los (inclusion en rsine MMA) : coloration
verte de los.
Aperu des diffrentes colorations histologiques et
intrts
! Mise en vidence des fibres de collagne et rticuline : Rouge de picroSirius

Cette coloration met en vidence
les fibres de collagnes.

Rsultats :
Noyau , cytoplasmetransparent/rose ple
Collagne rouge


Aperu des diffrentes colorations histologiques et
intrts
! Mise en vidence des fibres lastiques : Verhoeff

Elle met en vidence le rseau de fibres lastiques. Cette
coloration est utile dans le cadre des diagnostics de lsions
dgnratives congnitales ou acquises (vergetures, lastose
solaire), de vascularite (peut tre demande pour mettre en
vidence la limitante lastique des
vaisseaux), dartrite temporale.

Rsultats :
Noyaux gris noir
Fibres lastiques noir
Cytoplasme..selon contre-coloration
Globules rouges selon contre-coloration
Collagneselon contre-coloration


Aperu des diffrentes colorations histologiques et
intrts
! Mise en vidence des glucides : Periodic Acid Schiff (PAS)

L a c o l o r a t i o n P A S me t e n v i d e n c e l e s
mucines (pith. bordures en brosse), les membranes
basales, le glycogne ainsi que les filaments et spores
mycliens.
Dans les tumeurs indiffrencies, cette
coloration est utile pour orienter le diagnostic vers
une origine glandulaire (adnocarcinome). Elle est
demande dans le diagnostic de pathologies
du foie et rein.


Rsultats :
Noyauxbleu
Glycogne violet


Aperu des diffrentes colorations histologiques et
intrts
! Mise en vidence des lipides : Red Oil

La coloration Red Oil se fait sur des
coupes congeles avec un montage
aqueux. Elle est surtout demande pour
observer la statose (microvsicules ou
macrovsicules de statose).


Rsultats
Lipides rouge
Noyauxbleu


Aperu des diffrentes colorations histologiques et
intrts
! Mise en vidence des dpts de calcium

Von Kossa : Les sels de calcium sont transforms en
sels dargent rduits ensuite en forme mtallique,
indiquant les sites de calcification.

Rsultats :
Sels de calcium: noir
Noyaux: bleu
Rouge alizarin: Met en vidence le calcium tissulaire.

Rsultats :
Sels calcium: orange-rouge
Fond: vert
Aperu des diffrentes colorations histologiques et
intrts
! Mise en vidence des pigments et prcipits

La coloration de Perls: Elle tudie le mtabolisme du
fer. Elle est utile dans certaines pathologies
hpatiques. Caractrise danciennes cicatrices.

Rsultats :
Sels ferriquesBleu
Noyaux et cytoplasmeRos

Aperu des diffrentes colorations histologiques et
intrts
! Objectif:
Mettre en vidence et localiser lchelon tissulaire, cellulaire ou sub-
cellulaire toutes sortes dantignes, rvls par leurs anticorps spcifiques.

! Principe :
Le complexe antigne-anticorps est rvl par ladjonction de molcules
enzymatiques sur lesquelles on fait agir un substrat spcifique (microscopie en
lumire blanche) ou de fluochromes (microscopie en lumire ultra-violette) ou
de corps opaques aux lectrons (microscopie lectronique). transmission
Immuno-(cyto)-histochimie et Immunofluorescence
L'immunohistochimie est ne la fin des annes 1930 - dbut des annes 1940 : pour la premire
fois en effet des anticorps marqus avec un traceur fluorescent, la fluorescine, taient utiliss pour
rvler des antignes cellulaires (Coons et coll., 1941). Depuis, limmunohistochimie a connu un
immense essor.
Immuno-(cyto)-histochimie et Immunofluorescence :
mthodes
Une immunoraction est compose de trois lments principaux :

1. l' chantillon marquer (tissu, cellule, organite subcellulaire, virus ...) contenant
l'antigne tudier ;
2. un anticorps dirig contre l'antigne recherch : il reconnait un motif (pitope) de cet
antigne ;
3. le systme rvlateur qui permet de visualiser l'immunoraction.




Les diffrents composants
d'une immunoraction





La qualit des rsultats dpend de l'utilisation judicieuse de ces trois lments.
. Immunofluorescence

! sur tissus congels
! observations : - Microscope photonique (filtres spcifiques)
- Microscope confocal

Immunoenzymologie :
! sur tissus congels et/ou fixs
! observations : - Microscope photonique (lumire blanche)
- Microscope confocal
- Microscope lectronique transmission
Immuno-(cyto)-histochimie et Immunofluorescence :
mthodes
Immuno-(cyto)-histochimie et Immunofluorescence :
mthodes
! ATTENTION !!
Immuno-(cyto)-histochimie et Immunofluorescence :
diffrents tapes
Dparaffinage
Prtraitement :
dmasquage antignique
Anticorps primaire
Anticorps
secondaire
Inhibition des
proxydases
Contre-coloration
Rvlation
IHC
IF
Accs des anticorps lantigne : dmasquage
antignique , permabilisation des membranes
. Dmasquage enzymatique

! Hyaluronidase (protine de la matrice extracellulaire)
! Trypsine
! Pronase
! Pepsine

. Dmasquage la chaleur
! tampon citrate/four micro-onde
! tampon EDTA
! bain-marie ++
! tuve

. Permabilisation des membranes :
! dtergent non ionique : Triton X-100





Les anticorps primaires polyclonaux et monoclonaux
. Anticorps polyclonaux

! Avantages
Plusieurs anticorps contre un seul antigne
Plus sensible
Fixation moins critique
! Inconvnients
Spcificit moindre : reconnait diffrents dterminants dun mme antigne
Affinit et spcificit variable en fonction des lots.

. Anticorps monoclonaux

! Avantages
Mono-spcifique (1 pitope)
Affinit homogne

! Inconvnients
Ralisation plus difficile
Plus grande sensibilit la fixation






Les anticorps sont les ractifs essentiels des ractions immunohistochimiques : sans bons
anticorps, pas d'immunoraction.
33
Production danticorps par des animaux
hyper-immuniss
ANTICORPS POLYCLONAUX
34
Technique des hybridomes
ANTICORPS
MONOCLONAUX
35
Milieu HAT
Hypoxanthine
Aminoptrine
Thymidine
Laminoptrine bloque
une voie mtabolique qui
peut tre contourne par
lutilisation
dhypoxanthine et de
thymidine sauf par les
cellules du mylome

Les anticorps secondaires

. Immunofluorescence

Utilisation dAc anti-Ig de lapin ou souris coupls un chromogne fluorescent
(Fluorescine, Rhodamine, Rouge Texas.).
Avantages : - permet facilement les doubles marquages
- vite les problmes lis aux peroxydases endognes
Inconvnients : - fadding ou photobleaching (dcroissance plus ou moins rapide
de la fluorescence en fonction du temps). Des milieux de montages spciaux
permettent d'liminer l'effacement du marquage
- recouvrement des spectres des fluorochromes

. Immunohistochimie

Utilisation dAc anti-Ig de lapin ou souris coupls des enzymes :
- la peroxydase
- la phosphatase alcaline






Novotec
Aggrcan
Les rvlateurs
1. La fluorescence














Principe dabsorption -Emission
Avantages : - Protocoles rapides
- Grande sensibilit
- Colocalisations possibles
- Confocal

Inconvnients : - Montage aqueux # disparait au cours du temps
- Sensibilit la lumire : stockage 4C
- Extinction du signal sous UV
- Microscope spcialement quip, chambre noire
- Marche mal en paraffine
Substances fluorescentes : Fluoresceine (FITC), Rhodamine, Texas Red, Alexa ,

Couleur $ Absorption de la lumire par une molcule aromatique (benzme et
drivs)

Coloration visible observe correspondant la couleur complmentaire de la couleur
absorbe :
! Vert 510 570nm = rouge
! Jaune 570 600nm = bleu
! Orang-rouge 600 _ 750 nm =bleu-vert
Les rvlateurs
1. La fluorescence
Les rvlateurs
2. Les Marqueurs enzymatiques
. Les enzymes :

! HRP : peroxydase de raifort
! Phosphatase alcaline
! Plus rarement : -galactosidase

. Les substrats = chromogne




Les rvlateurs
2. Les Marqueurs enzymatiques
. Les avantages:

! Visualisation aise, microscopie optique
! Grande sensibilit
! Diffrentes couleurs et contre-colorations
! Stables si dshydrats
! Double marquage avec vision simultane (sauf si [Ag1] >> [Ag2]
et colocalisation)

. Les inconvnients

! Protocoles longs
! Pas de colocalisation
! Contraste insuffisant si [Ag] faible
! Substrats potentiellement carcinognes
! Diffusion du prcipit (prcision)





Anticorps spcifiques de la matrice extracellulaire :
Collagne de type IV
Magnification : x20
Y
X
IHC
IF
Anticorps dirigs contre des protines intracellulaires
Keratin 6
Novotec
Ki67
Novotec
biotine
anticorps II biotinyl
avidine
complexe ABC
ABC
chromogne
anticorps I
biotine
tissu
anticorps II
phosphatase
anticorps anti-
phosphatase
APAAP
AG
tissu
chromogne
anticorps I
Couplage de lanticorps secondaire avec un complexe :
peroxydase-anticorps anti-peroxydase (PAP),
enzymatique (Alcalin Phosphatase Anti Alcalin Phosphatase, dite technique APAAP)
avidine-biotine conjugu un systme de rvlation
AG
PAP
tissu
anticorps I
anticorps II
proxydase
chromogne
AG
Immuno-(cyto)-histochimie et Immunofluorescence :
Amplification du signal
. Avantages :

- Liaison biotine-streptavidine irrversible (covalente)
_ Amplification considrable possible

. Inconvnients :

_ Augmentation du bruit de fond
_ Biotines endognes

Immuno-(cyto)-histochimie et Immunofluorescence :
Amplification du signal
! Sassurer que la technique a fonctionn " Importance des contrles
1. Spcificit du marquage, bruit de fond ?

Fixation non spcifique de lanticorps primaire ou secondaire
Immuno-(cyto)-histochimie et Immunofluorescence :
Analyse de la technique
Solutions :
- Blocage des sites aspcifiques : BSA
- Pr-incubation avec un srum isotypique de lanticorps secondaire
- Utilisation de dtergents (Tween) # enlve les interactions non spcifiques
! Sassurer que la technique a fonctionn " Importance des contrles
2. Chromogne = substrat denzymes endognes : proxydase
Immuno-(cyto)-histochimie et Immunofluorescence :
Analyse de la technique
Solutions :
- Pr-incubation avec un inhibiteur de proxydase endognes " H
2
O
2.

Immuno-(cyto)-histochimie et Immunofluorescence :
Les contrles
1. Les contrles positifs

! Incubation de lAc sur un tissu renfermant obligatoirement lAg.
! Utilisation dun autre anticorps primaire fonctionnant sur le mme
tissu.

2. Les contrles ngatifs

! sans incubation avec lAc spcifique : omission
! Incubation avec le srum correspondant lanticorps primaire
! Incubation de lAc sur un tissu ne renfermant pas lAg.


. Objectif :
Dtecter une squence dacides nucliques (ARN) dintret dans une prparation
cellulaire ou tissulaire


HYBRIDATION IN SITU
Etude de la distribution histologique et cytologique
d un acide nuclique
. Principe :

Hybridation entre une sonde et un fragment dARN :
$ acide nuclique marqu : sonde
$ acide nuclique recherch : squence-cible
sonde
squence-
cible
AP
ARNm
Sonde ARN couple de la
digoxignine
Substrat (NBT/BCIP)
Prcipit color
Anticorps anti-DIG coupl la
phosphatase alcaline
1. Partie Biologie Molculaire :
Synthse des sondes

HYBRIDATION IN SITU
Les diffrentes sondes
. Nature des sondes :

! ADNc double brin
! ADNc simple brin
! ARN
! Oligonuclotides

. Spcificit : choix de la squence

Dterminer laide des banques de squences (Pubmed) et des logiciels
dalignements (ClustalW)

* Introns/Exons, homologie, squences codantes/non codantes
* Taille de la sonde : Compromis entre une bonne stabilit de lhybride
(taille suffisante) et une bonne pntration dans les tissus (petite taille).


ADNc dj clon dans un plasmide

Amplifies par PCR

Avantages :

- Stabilit, obtention en grande quantit possible
Inconvnients :

- Ncessite sa dnaturation avant utilisation
- Possibilit de rhybridation sur elle-mme
- Squence longue (prtraitements, Tm leve) donc bruit de fond
RT-PCR
(fibroblastes en culture)
Col I
GAPDH
Amorce spcifique / ARN
Col I (491pb) / GPDH (453pb)

HYBRIDATION IN SITU
Les sondes ADNc double brin

HYBRIDATION IN SITU
Les sondes ADNc simple brin
. Obtention par PCR asymtrique


Avantages:

- Stabilit des sondes ADN
- Ne ncessite pas de dnaturation
- Pas dhybridation intersonde
- Marquage lors de la synthse par PCR

HYBRIDATION IN SITU
Les sondes ARN
Produit PCR clon dans un plasmide contenant deux promoteurs viraux
dARN polymerases

Avantages :

- Grande quantit
- Marquage au cours de la synthse
- Sondes trs marques sens + anti-sens
- Hybridation trs stable (ARN-ARN)

Inconvnients :

- Hybridation haute temprature
- Grande taille de la sonde: pntration difficile
- Sensible aux Rnases: prparation et stockage plus dlicats

HYBRIDATION IN SITU
Les sondes
oligonuclotidiques
ADN monocatnaires de synthse dont la squence est complmentaire de
lacide nuclique cible.

Rgles pour choisir un oligo :
! Squence complmentaire de lacide nuclique recherch
! Choisir dans la squence codante
! Taille comprise entre 20 et 50 nuclotides
! Pourcentage de GC #50-55%
! Pas de squences rptes ni palindromiques
! Pas de G aux extrmits
! Pas de squence poly T

Avantages :
- Choix prcis de la squence hybrider : trs spcifique
- Stabilit
- Facilit dutilisation
- Bonne pntration dans les tissus
- Pas dassociation possible entre les molcules de sondes
- peu onreux
Inconvnients :
- Sondes peu marques
- Dtermination de la temprature dhybridation dlicate
- La squence choisie peut tre difficile daccs (structure secondaire, masquage par des protines)



Etude des gnes dintrt /
dtermination des amorces
Amplification par PCR des gnes
dintrt et purification
Ligation dans un vecteur de clonage et
transformation bactrienne
Extraction ADN plasmidique
Digestion plasmidique et
purification
Synthse des sondes et
purification
Etape 1
Etape 2
Etape 3
Etape 4
Etape 5
Step 6
Point cl
HYBRIDATION IN SITU
Etude de la distribution histologique et cytologique
d un acide nuclique : ralisation des sondes
Optionnel
selon les
sondes
utilises
# Find the sequences of interest genes in banks
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez/

! Homo sapiens collagen, type I, alpha 1 (COL1A1), mRNA (NM_000088, 5927 bp)

! Mus musculus collagen, type I, alpha 1 (Col1a1), mRNA (NM_007742, 4709 bp)

# Performed to alignment with a specific software :
ClustalW
http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_clustalwan.html


1
st
STEP : Primers design to specific gene amplification
(For example : human pro-"1(I))
2. Probes length between 300 and 800
bp (optimal ~ 500 bp).

3. Primers with a hybridization temperature
(50C<Tm<70C), a percentage of GC > 50,
a length between 18 to 25 pb.
http://www.basic.northwestern.edu/biotools/oligocalc.html

# Standart to respect :
1. Discrimination mice and human Col1a1 (70.49%
Identity).
Procedures of RNA probes
synthesis :
HYBRIDATION IN SITU
Etude de la distribution histologique et cytologique
d un acide nuclique :dtermination des amorces spcifiques dune gne

HYBRIDATION IN SITU
Techniques de marquage des sondes
Agent de marquage :

! marquage radioactif 32P, 35S, 3H " sondes chaudes

Attention : les sondes radioactives prsentent de nombreux inconvnients :
1. ncessit de se protger contre le rayonnement mis, maniement des sondes inconfortable
2. dcroissance rapide du 32P, d'o besoin de marquer les sondes frquemment
Avantage : grande sensibilit

! marquage froid : Le nuclotide portant le marqueur est incorpor directement, au
cours de la synthse du fragment dADN.
- direct : nuclotide modifi par un fluorophore : Fluoresceine, Cy5, Cy3,
Rhodamine, Texas red,

- indirect : nuclotide marque par un reporter qui sera repr par une
molcule affine : la digoxygnine

Selon la nature de la sonde :

* ADNc : random priming ou PCR

* ARN : transcription in vitro

* Oligonuclotide : 3 tailing

HYBRIDATION IN SITU
Techniques de marquage des sondes :Random priming
(longation damorce au hasard)

HYBRIDATION IN SITU
Techniques de marquage des sondes : PCR
+ nuclotide(s) marqu(s)

HYBRIDATION IN SITU
Techniques de marquage des sondes :ARN
transcription
Produit PCR du gne dintrt clon dans un plasmide contenant deux
promoteurs viraux
Aprs squenage et linarisation du plasmide, T7/T3 RNA
transcription avec nuclotides marqus
1. Partie Histologie :
La technique dhybridation in situ

HYBRIDATION IN SITU proprement dit
Les principales tapes
Prtraitement tissulaire
Accs de la sonde : protinase K
Pr-hybridation
Diminution de laccrochage non
spcifique

Hybridation
entre la sonde et la squence
nuclotidique dintrt
Lavages
(supprimer lhybridation non
spcifique)
Rvlation
Facteurs influenant lhybridation : nature des
acides nucliques, composition en base GC,
longeur de la sonde, force ionique, pH de la
solution, prsence dagent stabilisant comme
le formamide, quantit de cibles en prsence,
dure de la raction.
Fixation des tissus
Conservation de la morphologie
Fixateurs prcipitants ou fixateurs aldhydiques
Tissu frais
Conglation rapide
Efficacit de lhybridation
Coupes des tissus
Paraffine : prservation des structures morphologiques
Cryostat : sensibilit

HYBRIDATION IN SITU proprement dit
La prparation du matriel biologique
La prparation des tissus la technique dhybridation in situ est
essentielle. Elle doit seffectuer obligatoirement en condition RNAse
free : matriels autoclaver, port de gants, tampon strile,
Tampon dHybridation :

pH compris entre 5 et 7

Temprature dhybridation :

Pour les sondes ADNc : hybrider entre 37C et 42C (50% formamide)
Pour les sondes ARNs : hybrider entre 50C et 70C

Limitation du bruit de fond :

Sperme de saumon
ARNt
Denhardt

Augmentation de lefficacit dhybridation : sulfate de dextran





HYBRIDATION IN SITU proprement dit
Lhybridation
Dilution de la sonde :

Sonde radioactive : 1nM
Sonde non radioactive : 10 mM

Incubation :

La nuit , en chambre humide






HYBRIDATION IN SITU proprement dit
Lhybridation
Lavages :

Elimination de la sonde non hybride, dure et stringence adapter


Reprage des hybrides :

Sondes radioactives : autoradiographie
Sondes non radioactives : ractions ICC








HYBRIDATION IN SITU proprement dit
Lavages et reprage des hybrides
- les ARNs faiblement concentrs dans le cytoplasme des cellules
ne sont pas dtects.
- les ARNs peuvent tre masqus par des protines qui leur sont
associes.


HYBRIDATION IN SITU proprement dit
Problmes lis lHIS
Problmes techniques :

- choix du tampon et de la temprature de dnaturation.
- choix de la temprature dhybridation
- travailler en condition RNAse free

Problmes de visualisation :

-sondes sur un plan focal diffrent : utilisation du
microscope confocal
contrle de la qualit de la sonde : tissu + et tissu

contrle du matriel : hybridation avec sonde htrologue

hybridation avec sonde sens


HYBRIDATION IN SITU proprement dit
Contrle de la spcificit dhybridation

HYBRIDATION IN SITU proprement dit
Hybridation in situ in toto
In toto sur des
embryons de
poissons zbre
(PAGNON-MINOT et al., 2008)
Sur coupes congeles
dembryons de poissons zbre
(PAGNON-MINOT et al., 2008)
Peau humaine
Magnification : x63

HYBRIDATION IN SITU proprement dit
Hybridation in situ sur coupe paraffine
Collagne de type I
ISH
X
d
e
Col1a1
IF
X
d
e
d
e
X
Collagen I Collagen I
IHC

HYBRIDATION IN SITU proprement dit
Hybridation in situ sur coupes paraffine
$ Technique sensible et semi-quantitative.
$ Qui rpond aux questions : O, quand et comment ?
$ Hybridation in situ + IHC = techniques complmentaires:

- HIS : localisation des ARNs transcrits
- IHC: localisation des protines traduites

$ Hybridation in situ + PCR quantitative = Techniques complmentaires
- HIS : localisation des ARNs transcrits = semi-quantitative
- PCRq : Expression des ARNs transcrits = quantitative


HYBRIDATION IN SITU
Conclusions
! Les marquages peuvent tre observs de nombreuses faons :


" Microscope photonique/optique : 3 systmes de lentilles (condenseur, objectif,
oculaire) ; grandissement maximum x1500.

" Microscope optique avec systme additionnel :
- microscope contraste de phase,
- polarisant,
- pipolarisation

" Microscope fluorescence ou confocal

" Microscope lectronique

Gnralits :
Sources lumineuses : lumire visible, ultra-violette, rayon X ou faisceau dlectrons

Pouvoir sparateur : il = 0.1mm ; lumire visible = 0.2 %m ; lumire ultra-violette =
0.1 %m ; lectrons = 0.1 nm
La Microscopie : observation des marquages
Le microscope optique simple et systmes
additionnels
Principe : Le microscope optique est un instrument d' optique muni
d'un objectif (lentille 1) et d'un oculaire (lentille 2) qui permet de grossir l'image d'un
objet de petites dimensions (ce qui caractrise son grossissement) et de sparer les
dtails de cette image (et son pouvoir de rsolution) afin qu'il soit observable par
l'il humain.
Le microscope optique simple et systmes
additionnels

Les dpts colors des ractions immunoenzymatiques ou les dpts rouges, verts ou
noirs, d'or et d'argent collodaux s'observent l'aide d'un microscope optique ordinaire
(microscope en fond clair).

Des systmes additionnels permettent de mieux voir les ractions de faible intensit ou
faiblement contrastes :
& contraste de phase et contraste interfrentiel
& vido-microscopie : le signal est amplifi lectroniquement.
& pi-polarisation, utilise dans le cas de faibles marquages l'or et l'argent. La
prparation est claire travers l'objectif par une lumire polarise : le mtal rflchit
et dpolarise la lumire. Lobservation se fait travers un filtre polariseur crois ; le
marquage apparait sous forme de points brillants comme on peut le voir
sur la figure ci-dessous :
Cellules vgtales marques par un
anticorps anti-tubuline ; rvlation
par un anticorps secondaire
marqu lor collodal et amplifi
largent. A gauche, observation en
fond clair, droite mme champ
observ en pipolarisation.
Le microscope fluorescence
Principes :

La fluorescence est la proprit que possdent certains corps d'mettre de
la lumire aprs avoir absorb des photons de plus haute nergie. La
microscopie en fluorescence repose sur la formation d'une image par dtection
de cette lumire mise.

Le microscope fluorescence

Ce sont des microscopes prvus pour tre quips d'une ou plusieurs sources
de lumire (lampe arc, lampe au xnon, laser, LED) et de filtres permettant de
slectionner les longueurs d'onde d'excitation et dmission des traceurs
fluorescents utiliss.
Ce type de microscope la faveur des immunohistochimistes pour plusieurs raisons :

! la simplicit et la rapidit des marquages fluorescents : pas dtape de rvlation ou
d'intensification ncessaire comme dans les techniques immunoenzymatiques ou l'or
collodal ;

! la grande sensibilit de nombreux traceurs fluorescents, bien meilleure que les
traceurs enzymatiques ;

! le contraste lev des images ;

! un vaste choix de traceurs de couleurs diffrentes ;


Le microscope fluorescence
Les inconvnients :

! un prix dachat et un cot de fonctionnement plus levs

! la difficult que l'on avait d'obtenir de bonnes photographies
argentiques noir et blanc (N&B) ou en couleur cause de la luminosit souvent
faible du signal.

! l'affaiblissement du marquage fluorescent au cours du temps. Les
pathologistes qui ont l'obligation d'archiver les rsultats de leurs analyses
prfrent utiliser des marqueurs enzymatiques donnant des dpts colors
stables dans le temps.
Le microscopie confocal
Principes :

Le microscope confocal, ou microscope balayage laser, est un microscope
fluorescence particulier

Un microscope confocal est un systme pour lequel l'illumination et la dtection
sont limites un mme volume de taille rduite.
L'image confocale (ou coupe optique) est ensuite obtenue par le dplacement de
ce point de focalisation de la lumire d'excitation dans les trois dimensions de
l'chantillon XYZ.
Fibroblaste
Le microscopie confocal
Marquage des fibres musculaires rapides dans
des embryons de poisson-zbre
Principe :

Analyser la structure dune cellule ou dun tissu grce un microscope lectronique
Analyser la structure et lorganisation cellulaire au sein dun tissu ...
Avantage :
Augmentation de la rsolution
Limites :
Trs fortes contraintes techniques
Taille des chantillons :
biais dchantillonnage +++
Choix du fixateur :
analyse structurale : glutaraldhyde
analyse molculaire in situ : paraformaldhyde
Choix du milieu dinclusion :
rsines plastiques : rduction de lextractibilit +++
Colorations :
Mtaux lourds (citrate de plomb et actate duranyle)


Le microscope lectronique transmission
Le microscope lectronique transmission
Analyse des rsultats : analyse qualitative
Analyse des rsultats : analyse semi-
quantitative
- Comptage de structures marques par units de
surface

- Apprciation de lintensit de marquage
Foie subnormal Foie cirrhotique
Analyse des rsultats : analyse semi-
quantitative
- Compteur + grille (quadrillage) : comptage cellule/cellule

- Sur une zone pralablement choisie (la plus marque, ..)
- Sur lensemble de la prparation
Analyse des rsultats : analyseur dimage
- Standardisation :
- Mme paisseur de coupe
- Mme restauration antignique
- Mme condition de marquage : temprature, dilutions, temps
dincubation.
Quantification en analyse dimage :
Conclusions
- Bien rflchir ce qui doit tre mesur
- Russir sa coloration ou son marquage
- Calibrer lanalyseur dimages
Analyses macroscopiques
Chirurgie
Prlvements des chantillons / biopsies
10 15
jours
2 mois 2 ans
2 5 jours
Inflammation Epithlialisation
Novascularisation
/vascularisation
Remodelage
matriciel
Interaction
piderme/derme
1. Observations macroscopiques et analyses de la rtractation des implants
J0 Greffe
2M
3M prlvement
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
0d 7d 14d 28d 91d
S
u
r
f
a
c
e

a
r
e
a


Time after grafting (days)
Variation of the surface area of X and Y Bilayer Living
Construct during the healing
Substitut X
Substitut Y
Observations macroscopiques :
- Aspect gnral de la cicatrice : transparence, rgularit,
- Rtraction/contraction
- Vascularisation
- Tissu de granulation
!A. Pagnon-Minot et al.,, 2010 _ In situ hybridization to evaluate the wound healing process of a bilayered living cell-based construct (Apligraf) in a nude mice model. TERMIS-EU 2010 Meeting- 13th 17th june 2010- Galway
(Ireland). (abstract slectionn pour communication)
! A. Pagnon-Minot, C. F. Rousseau, F. Thillou, S. Guerret, D. J. Hartmann, V. Ronfard- In Situ Hybridization to evaluate the wound healing process of a bilayered living cell-based construct (Apligraf) in a nude mice model.
Organogenesis Inc. Meeting- 22th-26th August 2008- Canton, Massachussetts (US).

Comment seffectue la cicatrisation cutane ?
Analyses macroscopiques
Chirurgie
Prlvements des chantillons / biopsies
2 5 jours
Inflammation
2. Inflammation
Observations :
- Clot de fibrine
- Dgradation/ncrose
- Type de cellules inflammatoires :
. Polynuclaires
. Lymphocytes
. Macrophages/Cellules gantes
J7
J7
J7
HES HES
MTG
Comment seffectue la cicatrisation cutane ?
Analyses macroscopiques
Chirurgie
Prlvements des chantillons / biopsies
10 15
jours
2 5 jours
Inflammation Epithlialisation
3. Epithlialisation
X and Y epidermis size evolution
X
Y J0
J28
J14
6M
6M J7
Involucri
n
Involucri
n
K6 K6
K6 K6
3M
Couche
spineuse
Comment seffectue la cicatrisation cutane ?
Analyses macroscopiques
Chirurgie
Prlvements des chantillons / biopsies
10 15
jours
2 5 jours
Inflammation Epithlialisation
Interaction
piderme/derme
4. Jonction dermo-pidermique
JO
Collagne type VII
Collagne type IV
J14
3M
Observations :
- Continuit/discontinuit de la
lame basale
- Rseau matriciel sous
pidermique
- Composition :
" Utilisation de marqueurs
spcifiques des lames
basales (laminine, collagne
de type IV, collagne de
type VII)
" Utilisation de marqueurs
de la jonction dermo-
pidermique (collagne de
type V, fibronectine,
lastine)
Collagne type IV
Comment seffectue la cicatrisation cutane ?
Analyses macroscopiques
Chirurgie
Prlvements des chantillons / biopsies
10 15
jours
2 mois 2 ans
2 5 jours
Inflammation Epithlialisation
Novascularisation
/vascularisation
Interaction
piderme/derme
Exemple de cicatrisation cutane :

Etude cintique de la biocompatibilit, du remodelage , et de la

biodgradabilit de substituts cutans X et Y, obtenus par ingnierie
tissulaire.
5. Novascularisation/vascularisation
Observations :
- Rpartition des no-vaisseaux dans les
tissus.

- Expression de facteurs de croissance
par hybridation in situ : Qui, quand et
comment ?

MTG 'SM
A
Comment seffectue la cicatrisation cutane ?
Analyses macroscopiques
Chirurgie
Prlvements des chantillons /
biopsies
10 15
jours
2 mois 2 ans
2 5 jours
Inflammation
Epithlialisation
Novascularisation/
vascularisation
Remodelage
matriciel
Interaction
piderme/derme

Etude cintique de la biocompatibilit, du remodelage , et de la

biodgradabilit de substituts cutans X et Y, obtenus par ingnierie
tissulaire.
6. Remodelage matriciel
" Analyse structurale
" Analyse ultrastructurale
J7
3M
3M

Etude cintique de la biocompatibilit, du remodelage , et de la

biodgradabilit de substituts cutans X et Y, obtenus par ingnierie
tissulaire.
6. Remodelage matriciel
" Analyse gnique " Analyse protique
Collagne de type
III
J14
Collagne de type
III
J14
Elastine - Verhoeff