Helicobacter pylori: 15 aos de investigacin en el Eje cafetero

Investigadores principales:
Jos Ignacio Moncayo Ortiz
Jorge Javier Santacruz Ibarra
Adalucy lvarez Aldana
UNIVERSIDAD TECNOLGICA DE PEREIRA
FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD
PROGRAMA DE MEDICINA - DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BSICAS
CENTRO DE BIOLOGA MOLECULAR Y BIOTECNOLOGA
LABORATORIO DE MICROBIOLOGA Y PARASITOLOGA
INTRODUCCIN

RESULTADOS DE INVESTIGACIN

GRUPO DE INVESTIGACIN

INTEGRANTES



CONTENIDO
El principal avance de la gastroenterologa la
etiologa de las enfermedades gastroduodenales

Helicobacter pylori causa:
Gastritis
lcera gstrica
lcera duodenal
Barry Marshall Robin Warren
1984
Asociado con el desarrollo de:

Adenocarcinoma del estmago y Linfoma de tejido linfoide asociado a
mucosas (MALT)
INTRODUCCIN
Clinical Microbiology Reviews, 20(2): 280322,2007.
The Nobel Prize in Physiology or Medicine 2005
"for their discovery of the bacterium Helicobacter pylori and its role
in gastritis and peptic ulcer disease"
Barry J. Marshall J. Robin Warren
1/2 of the prize 1/2 of the prize
Australia Australia
NHMRC Helicobacter pylori Research Laboratory,
QEII Medical Centre; University of Western
Australia Nedlands, Australia
Perth, Australia
1951 1937
Titles, data and places given above refer to the time of the award.
Photos: Copyright The Nobel Foundation
INTRODUCCIN
Helicobacter
pylori
Dominio Bacteria Proteobacterias subdivisin
Orden Campylobacterales Familia Helicobacteraceae

Gnero Helicobacter
20 especies: gstricas y no
gstricas (enterohepticas)
Especies gstricas: H. pylori, H. felis, H. Mustelae, H. acinonychis, H. heilmannii
Especie no gstrica: H.hepaticus
Clin Microbiol Rev 2006; 19:449.
INTRODUCCIN
H. pylori en biopsia gstrica. 1000X. Foto Laboratorio
Morfologa del bacilo:
Bacilo Gram negativo
Espiral o curvado
4 - 6 Flagelos polares
Ureasa+
Catalasa +
Oxidasa +
Caractersticas bioqumicas:
Atmsfera microaeroflica
Medio selectivo/enriquecido
Incubacin de 3 7 das a 37C
Condiciones del cultivo:
INTRODUCCIN
Clinical Microbiology Reviews. 2007; 20(2):280
H. pylori a partir de cultivo. Tincin de Gram. 1000X. Foto Carlos alexis
Dos copias de los genes 16S, 23S y 5S del ARN ribosomal.
En algunas cepas, se han descrito plsmidos (crpticos).

Cepa 26695 1667.867 pb 1.587 genes 2001
Cepa J 99 1643.831 pb 1.491 genes 2001
Cepa HPAG1 1596.366 pb 1.536 genes 2006
Cepa Shi470 1608.548 pb 1.647 genes 2008
Cepa G27 1652.982 pb 1.570 genes 2008
Cepa P12 1673.813 pb 1.624 genes 2008
Cepa B38 1576.758 pb 1.576 genes 2009
Cepa B8 1673.997 pb 1.744 genes 2010
INTRODUCCIN
Helicobacter 2004; 9:1.
Am. J. Epidemiol 1996; 144: 290
Colombia Mdica 2003;34:124.
Baillire's Clinical Gastroenterology 2007; 21: 205. 35.


INTRODUCCIN
Pases en desarrollo
Helicobacter pylori
J. Clin. Invest 2004; 113:321
Clin Microbiol Rev 2006; 19:449.

INTRODUCCIN
oCo-evolucionado con los humanos
oEquilibrio Respuesta : Persistencia - Salud
oGastritis histolgica Sntomas
oRiesgo 10%-20% enfermedad ulcero pptica EUP
oRiesgo 1% - 2% cncer gstrico distal.
oPatologas Factores genticos, respuesta inmune, factores
ambientales y virulencia de la cepa.
Gen cagA (cytotoxin-associated gene A)

Citotoxina vacuolizante
50% cepas
Protena de 87 KDa
Variantes s1 s2
m1 m2
Protena de 120-140KDa
Asociada a Citotoxina
50-60% cepas



Gen vacA (vacuolating toxin A)
Invasivos No invasivos
Directos
Cultivo
Diferente muestra (Jugo
gstrico, saliva, heces)
Histologa
Tcnicas Moleculares Antgeno en heces
Indirectos Ureasa rpida
Prueba del aliento
Serologa
PCR - ureC en biopsia gstrica, positivas y negativa
para H. pylori. Foto laboratorio.
Cultivo de biopsia gstrica. Positivo para H. pylori. Foto laboratorio
Exmen histolgico de biopsia gstrica. Positivo para H. pylori.
Foto laboratorio
PRU, prueba de ureasa rpida en biopsia
gstrica. Positivo y negativo para H. pylori.
Clinical Microbiology Reviews. 2007; 20(2):280.
INTRODUCCIN
Pacientes H. pylori positivos con: lcera duodenal o lcera gstrica,
linfoma tipo MALT, gastritis con cambios micro y macroscpicos severos y
despus de reseccin de cncer gstrico temprano.
Terapia triple: inhibidor de bomba de
protones (IBP), claritromicina y
amoxicilina.
Tratamiento
de eleccin
Antimicrobianos
ms usados
Claritromicina (CLA, 57%); amoxicilina
(AMO, 73%); metronidazol (MTZ, 37%) y
tetraciclina (TET).
INTRODUCCIN
Rev Col Gastroenterol 2007; 22: 7-16.
Comparacin entre la PCR y los mtodos de rutina
en la infeccin con H. pylori y deteccin del gen
cagA en pacientes con enfermedad ulcero pptica
en Risaralda.
Finalizado en 1999 - Financiado por Colciencias
Publicaciones:
Revista Mdica de Risaralda. 5(2):10-14,1999.
MEDUNAB. 3(8):69-75, 2000.
Revista Mdica de Risaralda. 8(1):4-10, 2002.
RESULTADOS DE INVESTIGACIN
RESULTADOS DE INVESTIGACIN
73 pacientes con Enfermedad Ulcero Pptica
Nmero de biopsias por paciente

RESULTADOS DE INVESTIGACIN
Antro Cuerpo
Incubacin microaerfila,
37C, 4 -12 das
Tincin con
azul de toluidina
Antro Cuerpo
Antro
Incubacin de 1 a
24horas, consultorio.
Antro
Extraccin de ADN
y PCR-ureC
RESULTADOS DE INVESTIGACIN
CULTIVO UREASA HISTOLGICO PCR
33%
69%
89%
82%
100%
RESULTADOS DE INVESTIGACIN

Cultivo es la regla de
oro

Histolgico y PCR

PRU, tcnica de rutina
unidad de endoscopia

Un nico mtodo


86% de los pacientes

Baja sensibilidad
microorganismo exigente
Mayor nmero de casos
Sensibilidad y especificidad
debe ser evaluada
No cubre todos los casos
Cultivo o dos mtodos positivos
Infectados con H. pylori
RESULTADOS DE INVESTIGACIN

21 aislamientos tipificados para el gen cagA y las variantes de los
genes vacA.

Extraccin de ADN
PCR-cagA y vacA
Aislamientos de H. pylori
Resultados

Gen cagA 90.5%
Variantes vacAs1m1 81.0%


Correlaciona con lo descrito en
aislamientos de H. pylori en pacientes
con EUP, ya que en estos pacientes
estn las cepas ms virulentas
RESULTADOS DE INVESTIGACIN

18 aislamientos, con cinco repiques de colonias nicas sometidas
a RAPD

Pool
Subcultivos de cinco
colonias nicas de cada
aislamiento
Extraccin de
ADN
RAPDs
Solo uno de los 18 aislados de los pacientes presentaba dos patrones
Estudio comparativo de dos pruebas rpidas de
ureasa elaboradas en el laboratorio de
Microbiologa de la Universidad Tecnolgica de
Pereira frente a una comercial para la deteccin
de H. pylori en biopsia gstrica.
Finalizado en 2002 - Financiado por premio
Universidad El Bosque

Publicaciones:
Revista Mdica de Risaralda. Pereira,13(1):5-13. 2007.


RESULTADOS DE INVESTIGACIN
RESULTADOS DE INVESTIGACIN
Determinar la sensibilidad y especificidad de dos pruebas de
ureasa fabricadas en el laboratorio.
RESULTADOS DE INVESTIGACIN
53 pacientes con sntomas disppticos

Tres biopsias antrales

22 pacientes con la prueba comercial positiva.
PRU Lquida PRU Slida
Tiempo de Lectura Sensibilidad Especificidad Sensibilidad Especificidad
24 horas 100% 100% 100% 100%
5 horas 91% 100% 100% 100%
1 hora 77% 100% 82% 100%
RESULTADOS DE INVESTIGACIN
Buen resultado:
rango de lectura mnimo de 5 horas.

Las pruebas fabricadas localmente:
deben ser primero evaluadas en su
sensibilidad y especificidad y definir con exactitud el
tiempo de lectura necesaria para que el resultado sea
confiable.

Comparacin de mtodos diagnsticos en la
infeccin por H. pylori en el Departamento del
Quindo.
RESULTADOS DE INVESTIGACIN
Finalizado en 2003 - Financiado por Vicerrectora de
Investigacin, Innovacin y Extensin, UTP.

Publicaciones:
Colombia Mdica. 37:203-212. 2006
RESULTADOS DE INVESTIGACIN
Nmero de biopsias por paciente:

73 pacientes con sntomas disppticos
RESULTADOS DE INVESTIGACIN
Una prevalencia de la infeccin de 97.3 % (71/73) por definicin de caso
Histolgico
Cultivo
PRU
PCR
RESULTADOS DE INVESTIGACIN
El examen histolgico mostr diferencias significativas
frente a los otros mtodos.

Por lo que, si no es posible emplear el concepto de
definicin de caso se recomienda el examen histolgico por
lo menos en dos biopsias (antral y cuerpo).

Prevalencia de H. pylori en estudiantes con
sntomas disppticos de la Universidad
Tecnolgica de Pereira
RESULTADOS DE INVESTIGACIN
Finalizado en 2005 - Financiado por Vicerrectora de
Investigacin, Innovacin y Extensin, UTP.

Publicaciones:
Revista Mdica de Risaralda 11(1):17-25, 2005
RESULTADOS DE INVESTIGACIN
Una prevalencia de la infeccin de 88 % por definicin de caso
Correlacionado con la prevalencia en adultos jvenes en pases en desarrollo
comparado con 20 al 50% en los pases industrializados.
94,3% con la patologa mas frecuente que fue la gastritis.
Susceptibilidad antimicrobiana en aislamientos de
H. pylori de pacientes disppticos de las ciudades
de Pereira y Armenia
RESULTADOS DE INVESTIGACIN
Finalizado en 2007 - Financiado por Vicerrectora de
Investigacin, Innovacin y Extensin, UTP.

Publicaciones:
Revista Mdica de Chile 2009; 137: 1309-1314
RESULTADOS DE INVESTIGACIN
Las fallas en la terapia se relacionan a un incumplimiento
del rgimen teraputico por parte del paciente y al
desarrollo de resistencia antimicrobiana.

Las tasas de resistencia a los antimicrobianos en H. pylori
difieren entre pases e incluso entre las distintas reas de
un pas.

88 aislamientos de la coleccin obtenida desde 1999 al ao
2003.
RESULTADOS DE INVESTIGACIN
Detectar la resistencia in vitro a los antimicrobianos
metronidazol, claritromicina, amoxicilina y tetraciclina en
los aislamientos de Helicobacter pylori.


Detectar las mutaciones A2142G y A2143G en el ADN
ribosomal 23S, que confieren resistencia a claritromicina,
en los aislamientos de Helicobacter pylori.
A partir del vial a 70C
Incubacin microaerfila,
37C, 3 - 5 das
DETECCIN DE RESISTENCIA EN CADA UNO DE LOS AISLAMIENTOS DE H. pylori
1. Mtodo E-test
MTZ
CLA
AMO TET
Patrn de
Turbidez
McFarland 3:
Aislamiento y
Cepa control
ATCC 43504
Incubacin microaerofila,
37C, 3 das
Lectura del MIC
RESULTADOS DE INVESTIGACIN
2.1 Purificacin del producto
de PCR HPYS-HPYA
2. Mtodo molecular
PCR-RFLP
Extraccin ADN
PCR: HPYS-HPYA
2.2 Corte con endonucleasa
de restriccin
BsaI MboII o BbsI
Incubacin O.N
2.3 Corrido de la restriccin:
observacin de las mutaciones
3. Confirmacin de las mutaciones
observadas en PCR-RFLP por secuenciacin
RESULTADOS DE INVESTIGACIN
RESULTADOS DE INVESTIGACIN
De los 88 aislamientos ninguno fue resistente a tetraciclina o
amoxicilina, el 2,2% (2/88) fueron resistentes a claritromicina y
el 88% (68/88) fueron resistentes a metronidazol.

Los aislamientos resistentes a claritromicina presentaban la
mutacin A2143G. No se encontraron mutaciones en los 86
aislamientos sensibles a claritromicina.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
60
300
RESULTADOS DE INVESTIGACIN
La primera vez que se hace un reporte de aislamientos
resistentes en estas ciudades.

La alta tasa de resistencia a metronidazol encontrada en este
estudio, precluye el uso de este antimicrobiano en el
tratamiento emprico de la infeccin por H. pylori en esta
poblacin.

Los otros tres antimicrobianos tamizados, no presentan
inconvenientes para su utilizacin debido a su baja o nula
resistencia.
Comparacin de dos protocolos de erradicacin
de H. pylori
RESULTADOS DE INVESTIGACIN
Finalizado en 2007 - Financiado por Vicerrectora de
Investigacin, Innovacin y extensin, UTP.

Publicaciones:
Revista Mdica de Risaralda 2007; 13(2) 1309-1314.
RESULTADOS DE INVESTIGACIN
41 pacientes disppticos H. pylori positivos.

Tratamiento durante una semana con 1gr/da de
claritromicina y 2gr/da de amoxicilina, ms uno de los
siguientes anti ulcerosos: 800mg/da de ranitidina bismuto
citrato (RBC) (n22) 40mg/da de omeprazol (n19).

La erradicacin de la infeccin, se consider cuando el test
de antgenos fecales de H. pylori fue negativo 4-6 semanas
despus del tratamiento.
RESULTADOS DE INVESTIGACIN
No hubo diferencias significativas entre los grupos respecto a
variables biolgicas y tolerabilidad del tratamiento.

Los dos regmenes, resultaron similares en sus tasas de
erradicacin (79% omeprazol vs 91% RBC, p0.39).

Las mutaciones en el ADNr 23S, se encontraron en tres de los
cuatro pacientes para quienes fracas el tratamiento.

En conclusin, los dos esquemas son comparables en
efectividad y seguridad para el tratamiento de la infeccin por
H. pylori. La resistencia de la bacteria a la claritromicina es la
principal causa del fracaso en su erradicacin.


Prevalencia de H. pylori en pacientes con
sntomas disppticos que consultan a unidades de
endoscopia de Manizales
Finalizado en 2009 - Financiado Vicerrectora de
Investigacin, Innovacin y Extensin, UTP.

Publicacin: Investigaciones Andina 2011, 13 (23):
297-311.

RESULTADOS DE INVESTIGACIN
RESULTADOS DE INVESTIGACIN
Se estudiaron 72 pacientes con sntomas disppticos.

Una prevalencia de la infeccin de 88,1 % por definicin de caso
Muy baja sensibilidad del cultivo, consumo de IBP?, Medio de cultivo?
Deteccin de susceptibilidad y resistencia en
aislamientos de H. pylori de pacientes del eje
cafetero
Finalizado en 2009 - Financiado Vicerrectora de
Investigacin, Innovacin y Extensin, UTP.

Publicaciones:
Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (9): 40224024, 2009.
RESULTADOS DE INVESTIGACIN
RESULTADOS DE INVESTIGACIN
La resistencia a metronidazol, claritromicina y amoxicilina se
encontr en el 82, 3,8, y 1,9% de 106 aislamientos de H. pylori,
respectivamente. Ningn aislamiento fue resistente a
tetraciclina.
Resistentes a metronidazol Resistentes a claritromicina
Ciudad Armenia Manizales Pereira Armenia Manizales Pereira
n/Total 38 (41) 12 (13) 38 (52) 1 (41) 2 (13) 1 (52)
Porcentaje 92 93 73 2,4 15,4 1,9
Ao 2003 2009 1998-2002 2003 2009 1998-2002
RESULTADOS DE INVESTIGACIN
En todos los aislamientos resistentes a la claritromicina, slo
una mutacin puntual estaba presente, la A2143G o la
A2142G.




Nativo,
aislamiento 2M
A2143G,
aislamiento 21EP
A2142G,
aislamiento 6M
RESULTADOS DE INVESTIGACIN
La concentracin inhibitoria mnima vara de acuerdo con el tipo de
mutacin, la mutacin A2142G se asocia con CIMs 64 mg/L y la mutacin
A2143G con CIMs 64 mg/L. La mutacin ms frecuente a nivel mundial es
la A2143G. Nuestros resultados fueron similares a lo previamente descrito.

El 71% de las CIM en los aislamientos resistentes a MTZ fue mayor a 256mg/L


RESULTADOS DE INVESTIGACIN
En conclusin, hemos detectado, aislamientos de H. pylori resistentes a
metronidazol, claritromicina y amoxicilina de pacientes con sntomas
disppticos en eje cafetero de Colombia.

Con base en estos resultados es necesario que en todo el pas se realice una
vigilancia epidemiolgica de la evolucin de la resistencia en este
microorganismo, ya que es necesario conocer qu ocurre en este aspecto en
cada lugar geogrfico del pas, para orientar los esquemas de tratamiento.
No utilizar metronidazol en el tratamiento.

Adems, los datos de un pas en desarrollo como Colombia, contribuyen al
conocimiento de las estadsticas epidemiolgicas mundiales de la resistencia
del H. pylori.
PROYECTO NIUEVO DE LA LINEA
CARACTERIZACION DEL FENOTIPO Y GENOTIPO DE PERFILES
ANTIMICROBIANOS EN AISLAMIENTOS DE HELICOBACTER PYLORI OBTENIDOS
DE PACIENTES DISPEPTICOS DEL EJE CAFETERO

FINANCIADO
CONVOCATORIA INTERNA UTP
2012
CENTRO DE BIOLOGA MOLECULAR
Y BIOTECNOLOGA

FUNDADO EN 1995


GRUPO DE INVESTIGACIN
INTEGRANTES


Investigadores asociados que participan o han participado y su papel:

Beatriz Franco O. Patloga. Examen histolgico.
Manuel Alfonso Lpez B. Patlogo. Examen histolgico.
Emiro Meissel Chinchilla. Gastroenterlogo. Toma de biopsias y PRU en Pereira.
Fabio Salazar J. Gastroenterlogo. Toma de biopsias y PRU en Pereira.
Sonia Valencia Yepes. Mdica. Consulta con estudiantes en Pereira.
Solangel Cano Giraldo. Mdica. Consulta con estudiantes en Pereira.
Mario Santacoloma. Gastroenterlogo. Toma de biopsias y PRU en Manizales.
Brenda Luca Arturo. Gastroenterloga. Toma de biopsias y PRU en Manizales.
Alberto Angel. Gastroenterlogo. Toma de biopsias y PRU en Armenia.
Carlos Alberto Isaza. Farmaclogo.


Asesores estadsticos:

Herman Serrano L. PhD .
Jos William Martnez. PhD.
Clculo tamao de muestra y comparacin de mtodos diagnsticos
INTEGRANTES

Investigadores principales y su papel:

Jos Ignacio Moncayo Ortiz. MSc.
Jorge Javier Santacruz Ibarra. MSc.
Adalucy lvarez Aldana. MSc .

Cultivo de las biopsias.
Identificacin de los aislamientos.
Almacenamiento de los aislamientos.
Pruebas de biologa molecular.
Almacenamiento de la informacin.
Anlisis de los resultados.
Escritura de informes y artculos.
Consecucin de recursos

Estudiantes dirigidos y tesis:

Maestra: 5
Especializacin: 2
Pregrado: 2



GRACIAS
CONTACTO:
LABORATORIO DE MICROBIOLOGA Y
PARASITOLOGA
cenbiotep@utp.edu.co
3215393 Ext 15