UNIVERSIDAD DE LAS FUERZAS ARMADAS-ESPE

INGENIERA EN BIOTECNOLOGA
BIOLOGA MOLECULAR III
NOMBRE: David Ramrez
TEMA: Digestin de DNA de doble cadena del bacterifago Lambda con la enzima de restriccin
HindIII
OBJETIVOS
Objetivo general
Realizar la digestin enzimtica del fago lambda con la enzima de restriccin HindIII, para
visualizar los diferentes fragmentos de ADN mediante electroforesis.
Objetivos especficos
Determinar la actividad de la enzima de restriccin HindIII sobre el genoma del
bacterifago lambda.
Aprender a realizar una correcta digestin enzimtica y corrida electrofortica.
Identificar los posibles tamaos de los fragmentos que se pueden apreciar en las bandas
despus de la corrida de electroforesis.
MARCO TEORICO
Las enzimas de restriccin tambin conocidas como endonucleasas son extradas de organismos
procariontes, donde actan como un mecanismo de defensa, para degradar material gentico
extrao que puede entrar en la clula. Las bacterias tienen la capacidad de metilar su DNA, lo cual
sirve para diferenciar entre el DNA extrao y el DNA propio. Las enzimas de restriccin no pueden
cortar DNA metilado, de este modo solo afectan el DNA extrao y no el DNA bacterial (Gil, 2009).
Existen 3 clases de enzimas de restriccin:
Clase l.- es una enzima multimrica con tres subunidades, al reconocer la secuencia especfica de
ADN, metila y restringe, pero la restriccin no ocurre en el sitio de reconocimiento sino que es
realizada a una distancia al azar de la secuencia de reconocimiento.
Clase II.- son enzimas que reconocen una secuencia especfica en donde realizan la restriccin,
gracias a su especificidad son muy utilizadas en biologa y gentica molecular para recuperar
secuencias conocidas.
Clase III.- las enzimas de clase III son muy similares a las de la clase I; son oligomricas y reconocen
una secuencia especfica, sin embargo el corte lo realizan de 5 a 27 pb despus del sitio de
reconocimiento.
La enzima utilizada en este laboratorio es la enzima de restriccin clase II Hindlll del DNA lambda
es usada para electroforesis en geles de agarosa. Siendo una enzima de clase II reconoce una
secuencia especfica palindrmica (5A\AGCT T3y 3T TCGA\A5), realizando un corte
cohesivo (Berveg, et al, 2006).

MATERIAL Y REACTIVOS
Preparacin de la muestra
Se realiz una solucin madre a una concentracin 3X que contena 9 l de buffer, 0.9 l de BSA
(albumina de suero bovino) y 45.6 l de agua destilada, posteriormente se dividi esta solucin
madre en tres tubos eppendorfs, de los cuales dos nos sirvieron para control negativo el primero
contena 10 l de ADN lambda y el segundo 1.5 l de Enzima Hind III estos dos completaron us
volumen con agua, el control positivo se realiz con 1.5 l de enzima de restriccin HindIII y 10 l
de ADN lambda.
Preparacin del gel de agarosa
Se pes 0.8 gramos de agarosa y se coloc en un vaso de precipitacin para diluir con 40 mL de
buffer de corrida para obtener un gel concentrado al 2 % y obtener mayor resolucin.
Luego se arm la cmara electrofortica y se coloc el gel hasta que gelifique. Una vez gelificado,
se sac las peinetas y la cmara electrofortica se llen de buffer.
Se tom la muestra con la micropipeta de cada control y se mezcl con una gota de blue juice que
sera nuestro tampn de carga esta mezcla, se coloc cuidadosamente para no romper ni
penetrar el gel.
La electroforesis se inici con un voltaje de 60-100vy se dej correr durante una hora y luego se
apag y desconect las lneas elctricas.

RESULTADOS


Bibliografa Observacin en laboratorio

Los resultados obtenidos luego de la electroforesis fueron comparados con datos bibliogrficos.
Como se observa se colocaron las muestras de ADN digerido por la enzima en la primera y
segunda columna estos son e control positivo que se prepar, en las otras dos columnas se coloc
los controles negativos, la tercera que contiene solo enzima y la cuarta que contiene solo ADN,
mientras que en la quinta se puso un marcador molecular para poder identificar los fragmentos de
la corrida electrofortica.
Las bandas que obtuvimos en la corrida electrofortica fueron de 23130, 9416,6557, 4361, 2322,
2027 y 125 bp, los cuales se establecieron mediante la bibliografa. En los resultados que
obtuvimos se puede apreciar que no hubo contaminacin en el ADN ni en la enzima.



CONCLUSIONES
La enzima d restriccin Hind III tiene la capacidad de cortar al bacterifago lambda en
varios fragmentos de ADN.
Se necesita realizar una correcto pipeteo, armado de la cmara electrofortica y
preparacin de la muestra para poder observar todos los fragmentos obtenidos en la
digestin enzimtica.
Para una buena digestin enzimtica se debe tomar en cuenta la temperatura, el PH y el
tipo de enzima de restriccin que se va a utilizar para obtener buenos resultados.



Referencias
1. Gil A. (2009), Enzimas de restriccin, Extrado de:
http://www.slideshare.net/adrianamariagil/enzimas-de-restriccion-medicina-gbm-2009-pdf-
2700223 (22/09/2013)

2. Berveg J., Barcia-macay M. (2006), El bacterifago lambda. Biologa molecular, Cochabamba,
Bolivia. Extrado de: http://genemol.org/biomolespa/fagos-lambda/fago-lambda.html
(22/09/2013)

3. Duina D., Herrera T. (2008), Uso de Marcadores Microsatlites para la Estimacin de Diversidad
Gentica en Plantas. Ediciones IVIC.