UNIVERSIDAD AUTNOMA DE CIUDAD JUREZ

INSTITUTO DE CIENCIAS BIOMDICAS

DEPARTAMENTO DE CIENCIAS QUMICO-BIOLGICAS
ACADEMIA DE BIOQUMICA






MANUAL DE PRACTICAS DE BIOQUMICA GENERAL

























FECHA DE ACTUALIZACIN AGOSTO 2011
Contenido
PRACTICA #. 1 ................................................................................................................................................ 4
EXPLICACION Y MANEJO DEL MATERIAL DE LABORATORIO......................................................................... 4
Practica # 2 .................................................................................................................................................... 7
BIOSEGURIDAD ............................................................................................................................................. 7
PRCTICA #3 ............................................................................................................................................... 10
USO, CALIBRACIN Y MANEJO DEL POTENCIMETRO ............................................................................... 10
PRCTICA #4 ............................................................................................................................................... 12
TITULACIN ACIDO-BASE ............................................................................................................................ 12
PRACTICA # 5 ............................................................................................................................................... 14
REACCIONES DE IDENTIFICACION DE AMINOACIDOS ................................................................................. 14
PRACTICA # 6 ............................................................................................................................................... 18
SEPARACIN EN CAPA FINA DE UNA MEZCLA DE AMINOCIDOS. ............................................................ 18
Practica # 7 .................................................................................................................................................. 21
REACCIONES DE IDENTIFICACION DE PROTEINAS ...................................................................................... 21
Practica # 8 .................................................................................................................................................. 25
DETERMINACIN DE LAS PROPIEDADES QUMICAS DE LAS PROTENAS ................................................... 25
Prctica #. 9 ................................................................................................................................................. 30
FOTOCOLORIMETRIA .................................................................................................................................. 30
Prctica #. 10 ............................................................................................................................................... 35
ANALISIS ENZIMATICO CUALITATIVO.......................................................................................................... 35
Prctica #. 11 ............................................................................................................................................... 37
CINETICA ENZIMATICA 1: EFECTO DE LA CONCENTRACION DEL SUSTRATO .............................................. 37
SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA ............................................................................................................. 37
Prctica #. 12 ............................................................................................................................................... 40
CINETICA ENZIMATICA 2: EFECTO DEL inhibidor sobre la actividad enzimtica ........................................ 40
Prctica #. 13 ............................................................................................................................................... 42
CINETICA ENZIMATICA 3: EFECTO DEL PH Y TEMPERATURA ...................................................................... 42
Prctica #. 14 ............................................................................................................................................... 46
CUANTIFICACION DE COLESTEROL SERICO ................................................................................................. 46
Prctica #. 15 ............................................................................................................................................... 48
EXTRACCIN DE GLUCOGENO Y REACCIONES DE IDENTIFICACION DE CARBOHIDRATOS ......................... 48
Prctica #. 16 ............................................................................................................................................... 52
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EFECTO DE LAS COENZIMAS SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA ............................................................... 52
Prctica #. 17 ............................................................................................................................................... 56
EFECTO DE LOS INHIBIDORES SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA ............................................................. 56
Prctica #. 18 ............................................................................................................................................... 60
DETERMINACION DE UREA Y CREATININA SERICA ..................................................................................... 60


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PRACTICA #. 1
EXPLICACION Y MANEJO DEL MATERIAL DE LABORATORIO

OBJETIVO
Desarrollar destreza en el manejo tanto de material como de instrumentacin aplicable a tcnicas de
experimentacin en el rea bioqumica.
PRERREQUISITOS
1.- Conocimientos sobre diluciones, soluciones y mezclas.
2.- Definicin de cido, base y amortiguador.
3.- Conocimiento bsico del manejo del potencimetro y el fotocolormetro.
4.- Que es una solucin Molar, Normal y % w/v
INTRODUCCION
Para llevar a cabo con xito un experimento en cualquier laboratorio es necesario que se manejen
tcnicas bsicas de experimentacin tales como:
- Tcnicas de medicin de lquidos.
- Tcnicas de pesado de slidos.
- Tcnicas de mezclado de lquidos y slidos.
Todas estas tcnicas se relacionan con frecuencia con las actividades que cotidianamente se llevan a
cabo en el laboratorio de Bioqumica. A continuacin se dan algunos datos sobre cada una de estas
tcnicas.
Medicin de lquidos: Los instrumentos de medicin de lquidos ms utilizados son: pipetas, probetas y
matraces volumtricos. Las pipetas sirven para medir volmenes de hasta 25 ml. En este rango de
volumen, las pipetas tienen un uso muy frecuente en el laboratorio por su exactitud y confiablilidad. hay
dos tipos generales de pipetas: las serolgicas y las volumtricas.
La pipetas serolgicas miden volmenes diversos debido a que estn graduadas en diferentes medidas,
por ejemplo, una pipeta de 1.0 ml. esta graduada en dcimas de mililitro y por lo tanto sirve para la
medicin de cualquier volumen menor de 1.0 ml. Las pipetas ms frecuentemente usadas son de 1.0,
2.0, 5.0 y 10.0 ml..
Las pipetas volumtricas slo miden volmenes fijos ya que estn graduadas para medir un solo
volumen, por ejemplo, una pipeta volumtrica de 1.0 ml. solo servir para medir este volumen.
Algunas pipetas estn diseadas para que al momento de liberar el lquido que se est midiendo quede
una pequea porcin en la punta de las mismas, esta porcin debe dejarse contenida en la pipeta
porque de otra manera se introducir un error en la medicin. La manera de reconocer este tipo de
pipetas es por las letras TD ( To Deliver ) que se encuentran en la parte superior de la pipeta. Otras
pipetas estn diseadas para liberar todo el volumen incluyendo la porcin que se queda en la punta,
este tipo de pipetas se reconocen por las letras TC ( To Contain ), en este caso, si no se libera el total del
lquido medido se incurre en un error de medicin.
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Las buretas varan en tamao, generalmente de 1 a 100 ml. El flujo del lquido es controlado por una
llave de vidrio o de tefln. Si es de vidrio requiere lubricacin. Las buretas deben llenarse por arriba de
la marca de cero y posteriormente abrir la llave cuidadosamente para que fluya el lquido y el menisco
se ajuste a cero. Dentro de los usos indicados para las buretas se encuentran las titulaciones y para
medicin de volumenes de lquidos txicos, cidos, sustancias corrosivas, etc.
Las probetas son cilindros graduados que miden volmenes por arriba de los 25 ml. todas ellas son
usadas para medir volmenes diversos, por ejemplo, con una probeta de 50 ml. se pueden medir
volmenes de 26, 38 o 42 ml etc.. Estos volmenes se denotan por marcas que se encuentran entre una
graduacin y otra. las probetas ms frecuentemente utilizadas son: 50, 100, 250, 500 y 1000 ml.. Para
medir volumen en una probeta se tiene que tomar en cuenta la siguiente regla: La superficie de un
lquido dentro de una probeta siempre forma una curva o menisco. El diseo de la probeta esta hecho
para medir volmenes exactos al igualar la parte inferior del menisco con la graduacin. Si se mide el
volumen con la parte superior del menisco, se incurrir en un error.
Los matraces volumtricos, tambien llamados de aforacin, sirven para medir volmenes exactos y son
usados cuando se hacen soluciones porcentuales y molares. Los matraces ms frecuentemente usados
son de 50, 100, 500 y 1000 ml.. El uso de estos matraces sigue la misma tcnica de medicin que las
probetas.
Todos los recipientes arriba mencionados son material de vidrio, por lo tanto, estn expuestos a
cambios de tamao en altas y bajas temperaturas y esto puede modificar drsticamente la exactitud de
la medicin. El diseo de este material de cristalera est hecho para medir volmenes a una
temperatura promedio de 25C.
Medicin de slidos: La balanza granataria y la balanza analtica son las ms utilizadas en la medicin de
reactivos qumicos de textura slida. La granataria tiene una exactitud de aproximadamente una
dcima de gramo, se utiliza para pesar cantidades mayores de un gramo y cuando la precisin no sea
menor de 0.1 g.
La balanza analtica se utiliza cuando el peso deseado requiera una precisin menor de 0.1 g. Es uno de
los instrumentos ms sensibles y permite pesar hasta dcimas de miligramo.
Sin embargo, el uso de ambos tipos de balanzas requiere de cuidados bsicos comunes tales como:
limpieza completa de todas las partes de la balanza; mantener la tara especfica de la balanza antes de
cualquier pesada y hacer pesadas racionales con respecto a la capacidad de la balanza.
Las balanzas de torcin son tiles en el laboratorio de bioqumica como una herramienta para el buen
uso de la centrfuga ya que para equilibrar los tubos de centrfuga siempre debe hacerse en base al peso
y no al volumen del contenido.
La centrfuga es un aparato que permite separar slidos de lquidos. Es un instrumento que separa
suspensiones a alta velocidad. El material slido se queda en la base del recipiente (sedimento) y la
porcin lquida en la parte superior del recipiente (lquido sobrenadante).
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Los recipientes utilizados en la centrfuga generalmente son tubos de ensayo y estos siempre deben
balancearse en cuanto a peso y al ser colocados en la centrfuga siempre debe ser en direcciones
opuestas.
Mezclado de lquidos y slidos: Las soluciones normales, molares y porcentuales as como los diferentes
tipos de diluciones son las mezclas ms utilizadas en el laboratorio. Frecuentemente, las soluciones
involucran mezclas de slidos en lquidos o de lquidos en lquidos en tanto que las diluciones solo
involucran mezclas lquidos en lquidos. De la destreza con que se lleven a cabo estas mezclas depende
el xito de la experimentacin en el laboratorio.
El fotocolormetro permite cuantificar concentracin de sustancias en base al color desarrollado. La
concentracin de una sustancia en solucin generalmente es determinada por una reaccin de color,
siendo el principio general que a mayor concentracin de la sustancia en la solucin mayor ser la
intensidad del desarrollo del color. Los fotocolormetros son instrumentos que nos sirven para hacer
estas determinaciones.
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PRACTICA # 2
BIOSEGURIDAD


OBJETIVO
Que el alumno se familiarice con el material Peligroso Biologico infeccioso, su manejo y desecho
adecuado, de acuerdo a las normas mexicanas NOM-087 y NOM 052.

INTRODUCCION
Residuos peligrosos biolgicos infecciosos
Qu son los residuos peligrosos biolgicos infecciosos?
Los residuos peligrosos biolgicos infecciosos en lo sucesivo (RPBI), son aquellos que se generan durante
las actividades asistenciales a la salud de humanos o animales en los centros de salud, laboratorios
clnicos o de investigacin, bioteros, centros de enseanza e investigacin, principalmente; que por el
contenido de sus componentes puedan representar un riesgo para la salud y el ambiente.

Cules son considerados los RPBI?
De acuerdo a la Norma Oficial Mexicana NOM-087-SEMARNAT-SSA1-2002, son considerados los
siguientes:
La sangre
La sangre y los componentes de sta, slo en su forma lquida, as como los derivados no comerciales,
incluyendo las clulas progenitoras, hematopoyticas y las fracciones celulares o acelulares de . la
sangre resultante (hemoderivados).
Los cultivos y cepas de agentes biolgico-infecciosos
Los cultivos generados en los procedimientos de diagnstico e investigacin, as como los generados en
la produccin y control de agentes biolgico-infecciosos.
Utensilios desechables usados para contener, transferir, inocular y mezclar cultivos de agentes
biolgico-infecciosos.
Los patolgicos
Los tejidos, rganos y partes que se extirpan o remueven durante las necropsias, la ciruga o algn otro
tipo de intervencin quirrgica, que no se encuentren en formol.
Las muestras biolgicas para anlisis qumico, microbiolgico, citolgico e histolgico, excluyendo orina
y excremento.
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Los cadveres y partes de animales que fueron inoculados con agentes enteropatgenos en centros de
investigacin y bioterios.
Los residuos no anatmicos
Son residuos no anatmicos los siguientes:
Los recipientes desechables que contengan sangre lquida.
Los materiales de curacin, empapados, saturados, o goteando sangre o cualquiera de los siguientes
fluidos corporales: lquido sinovial, lquido pericrdico, lquido pleural, lquido Cfalo-Raqudeo o lquido
peritoneal.
Los materiales desechables que contengan esputo, secreciones pulmonares y cualquier material usado
para contener stos, de pacientes con sospecha o diagnstico de tuberculosis o de otra enfermedad
infecciosa segn sea determinado por la SSA mediante memorndum interno o el Boletn
Epidemiolgico.
Los materiales desechables que estn empapados, saturados o goteando sangre, o secreciones de
pacientes con sospecha o diagnstico de fiebres hemorrgicas, as como otras enfermedades infecciosas
emergentes segn sea determinado por la SSA mediante memorndum interno o el Boletn
Epidemiolgico.
Materiales absorbentes utilizados en las jaulas de animales que hayan sido expuestos a agentes
enteropatgenos.
Los objetos punzocortantes
Los que han estado en contacto con humanos o animales o sus muestras biolgicas durante el
diagnstico y tratamiento, nicamente: tubos capilares, navajas, lancetas, agujas de jeringas
desechables, agujas hipodrmicas, de sutura, de acupuntura y para tatuaje, bisturs y estiletes de
catter, excepto todo material de vidrio roto utilizado en el laboratorio, el cual deber desinfectar o
esterilizar antes de ser dispuesto como residuo municipal.

Por qu representan un riesgo a la salud o al ambiente?
Por sus caractersticas, ya que pueden contener agentes biolgicos infecciosos que se definen como
cualquier microorganismo capaz de producir enfermedades cuando esta presente en
concentraciones suficientes (inculo), en un ambiente propicio (supervivencia), en un
hospedero susceptible y en presencia de una va de entrada).

Existe regulacin para los RPBI?
Con la finalidad de prevenir alguna situacin de emergencia debida al mal manejo de los RPBI, la
autoridad Ambiental (SEMARNAT) public el 7 de noviembre de 1995 la Norma Oficial Mexicana NOM-
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087-SEMARNAT-1995, Que establece los requisitos para la separacin, envasado, almacenamiento,
recoleccin, transporte, tratamiento y disposicin final de los residuos peligrosos biolgico-infecciosos
que se generan en establecimientos que presten atencin mdica.
Debido a que esta Norma present algunos problemas de interpretacin como en su aplicacin, se
gestiono en coordinacin con la Secretara de Salud, su modificacin, derivndose el 1 de noviembre de
2001 el Proyecto de Norma Oficial Mexicana NOM-087-SEMARNAT-SSA1-2000, Proteccin Ambiental -
Salud Ambiental Residuos Peligrosos Biolgico-Infecciosos Clasificacin y especificaciones de
manejo. De este proyecto se derivaron 370 comentarios, mismos que fueron contestados y publicados
en el Diario Oficial de la Federacin el da 20 de enero de 2003.
Finalmente el 17 de febrero de 2003 se publica en el Diario Oficial de la Federacin la Norma Oficial
Mexicana NOM-087-SEMARNAT-SSA1-2002, Proteccin Ambiental Salud Ambiental Residuos
Peligrosos Biolgico-Infecciosos Clasificacin y especificaciones de Manejo.

A quines aplica la NOM-087-SEMARANT-SSA1-2002?
Con base en el campo de aplicacin de esta norma es de observancia obligatoria a todos aquellos que
por sus actividades generen los RPBI descritos en la Norma, sin importar el volumen de sus generacin,
aclarando que aquellos que su generacin sea menor a 25 kilogramos al mes, podrn ubicarse como
generadores de Nivel I, esto para el tiempo de almacenamiento de sus RPBI.

Existe otra Norma Oficial Mexicana donde aparezcan los RPBI?
Existe la Norma Oficial Mexicana NOM-052-SEMARNAT-2005 que establece las caractersticas, el
procedimiento de identificacin, clasificacin y los listados de los residuos peligrosos, sin embargo esta
es de carcter General, por lo que para los RPBI prevalecen las condiciones establecidas en la NOM-
087-SEMARNAT-SSA1-2002.

Cul es la infraestructura para el tratamiento de los RPBI?
A partir de la publicacin de la Norma Oficial Mexicana NOM-087-SEMARNAT-1995, se desarrollo la
infraestructura para el tratamiento de este tipo de residuos, con la condicin de que dicha norma
establece que los residuos denominados patolgicos sean incinerados, por ese motivo se incremento el
nmero de hornos para el tratamiento de los residuos, sin embargo han sido muchos equipos que han
cerrado por no cumplir con los parmetros establecidos en la Norma Oficial Mexicana NOM-098-
SEMARNAT-2002, Proteccin ambiental-Incineracin de residuos, especificaciones de operacin y
lmites de emisin de contaminantes. Actualmente la incineracin es uno de los procesos de tratamiento
ms observados por las asociaciones no Gubernamentales por ese motivo se concluye que las empresas
que actualmente cuentan con esta autorizacin son capaces de cumplir con los parmetros establecidos
en la NOM-098.
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PRCTICA #3
USO, CALIBRACIN Y MANEJO DEL POTENCIMETRO

OBJETIVO:
Que el alumno conozca el instrumento de medicin, principios y fundamento para aplicarlo en las
caractersticas cido base de las soluciones.
INTRODUCCIN:
El potencimetro, es un sensor utilizado en el mtodo electroqumico como equipo de medicin, en la
cuantificacin del potencial Hidrgeno (pH) de cualquier disolucin.
La determinacin del pH, consiste en medir el potencial que se desarrolla a travs de una fina
membrana de vidrio que separa dos soluciones, con diferente concentracin de protones. En
consecuencia, se conoce la sensibilidad y la selectividad de las membranas de vidrio ante el pH.
Un electrodo para medir el pH consiste en un par de electrodos, uno de calomel (mercurio, cloruro de
mercurio) y otro de vidrio, sumergidos en la disolucin en la que queremos encontrar el pH. El soporte
del electrodo es de vidrio comn y no es conductor, mientras que el bulbo sensible se encuentra
formado por un vidrio polarizable (vidrio sensible de pH). Se llena el bulbo con la solucin de HCl 0.1N
saturado con AgCl. El voltaje en el interior del tubo es constante (pH 7) de manera que la diferencia de
potencial solo depende del pH del medio externo. El alambre que se sumerge al interior (normalmente
Ag/AgCl) permite conducir este potencial hasta un amplificador.
El pH metro es relativamente inmune a las interferencias de color, turbidez, material coloidal, cloro
libre, substancias oxidantes y/o reductoras. La medicin es afectada solo cuando la superficie de la
membrana est sucia con grasa o material orgnico insoluble en agua, que le impide hacer contacto con
la muestra, por lo que se recomienda la limpieza escrupulosa de los electrodos. Los electrodos deben ser
enjuagados con agua destilada entre muestras (el uso adecuado de la pizeta es de vital importancia),
posteriormente deber secarse el electrodo preferentemente con papel klenex o papel sanitario de
textura suave pero que no deje pelusa, nunca debe secarse con tela porque podra cargase
electrostticamente.
Como los electrodos de vidrio de pH cuantifican la concentracin de H+ relativa a sus referencias, deben
ser calibrados peridicamente para asegurar la precisin, es por eso que se utilizan soluciones
especficas llamadas buffers de calibracin (disoluciones reguladoras de pH conocido). Estas soluciones
son: solucin buffer (fosfato) de pH 7 color amarillo, solucin buffer (biftalato) de pH 4 color rojo,
solucin buffer (borato) de pH 10 color azul.


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El pHmetro digital porttil Conductronic pH 10, modelo 1024, electrodo y batera cuadrada. Debe
mantenerse siempre humedecido.
Para su calibracin a un punto:
1. Conecte el electrodo al instrumento y encienda la tecla ON.
2. Introduzca el electrodo en la solucin patrn de pH 7 y permita la lectura que la lectura se estabilice
(aproximadamente 30 seg).
3. Ajuste la perilla de compensacin de temperatura temp oC a la temperatura de la solucin patrn
(buffer).
4. Ajuste la perilla de calibracin calbrate, hasta que el medidor indique el valor pH 7.0 de la solucin
patrn (buffer).
5. Retire el electrodo de la solucin patrn (buffer) y enjuguelo muy bien con agua destilada (pizeta),
pero no seque el electrodo.
6. Ajuste la perilla de compensacin de temperatura temp. oC a la temperatura a la temperatura de la
solucin a medir.
7. Introduzca el electrodo en la solucin a medir y lea el valor pH del medidor. Si el valor de la solucin
no est entre 3 unidades de pH de la solucin patrn (7.0 pH), se necesita hacer una calibracin a
dos puntos (con dos buffers de diferente pH, 7 y 4, o 7 y 10 dependiendo de las soluciones que vaya
a manejar).
8. Despus de cada medicin, retire el electrodo y enjuguelo muy bien con agua destilada (pizeta)
Calibracin a dos puntos
1. Siga los pasos de calibracin a un punto hasta el paso 5
2. Sumerja el electrodo en la segunda solucin patrn de pH 4.00 o pH 10.00. La temperatura de esta
solucin patrn debe ser idntica a la de la primera
3. Ajuste el control de pendiente slope, hasta que el medidor indique el valor del pH de la segunda
solucin patrn.
4. Retire el electrodo, enjuguelo con agua destilada y proceda a efectuar las mediciones. No olvide
enjuagar el electrodo muy bien con agua destilada (pizeta) despus de cada medicin.
Precauciones
El pHmetro debe siempre mantenerse en su estuche si no se est utilizando, con respecto al electrodo
deber mantenerse en la solucin buffer de pH 4.0, misma que se encuentra en el pequeo recipiente
en el que descansa el electrodo.
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PRCTICA #4
TITULACIN ACIDO-BASE
OBJETIVO
Observar una reaccin acido-base fuerte utilizando un indicador de pH y comprobar el pH de la solucin
mediante el uso del potencimetro.
INTRODUCCION
Es una tcnica o mtodo de anlisis cuantitativo muy usada, que permite conocer la concentracin
desconocida de una disolucin de una sustancia que pueda actuar como cido o base, neutralizndolo
con una base o cido de concentracin conocida.1 Es un tipo de valoracin basada en una reaccin
cido-base o reaccin de neutralizacin entre el analito (la sustancia cuya concentracin queremos
conocer) y la sustancia valorante.
Un indicador de pH es una sustancia que permite medir el pH de un medio. Habitualmente, se utilizan
como indicador sustancias qumicas que cambian su color al cambiar el pH de la disolucin. El cambio de
color se debe a un cambio estructural inducido por la protonacin o desprotonacin de la especie. Los
indicadores cido-base tienen un intervalo de viraje de unas dos unidades de pH, en la que cambian la
disolucin en la que se encuentran de un color a otro, o de una disolucin incolora, a una coloreada.
Los ms conocidos son el naranja de metilo, que vira en el intervalo de pH 3,1 - 4,4, de color rojo a
naranja, y la fenolftalena, que vira desde un pH 8 hasta un pH 10, transformando disoluciones incoloras
en disoluciones con colores rosados / violetas.
Los indicadores de pH tienen una constante de protonacin, K, que informa sobre el desplazamiento de
la reaccin de protonacin de la forma bsica del indicador.

Se dice que el cambio de color de un indicador es apreciable cuando la concentracin de la forma cida
o de la forma bsica es superior o igual a 10 veces la concentracin de la forma bsica o la forma cida
respectivamente.
MATERIALES
2 buretas 50 mL
2 Matraz erlenmeyer 150 ml
HCl 0.1N
NaOH 0.1N
Fenolftaleina
METODOLOGIA
1. Verter NaOH y HCl en buretas graduadas.
2. Tomar 20 mL de HCl y colocarlo en un matraz erlenmeyer.
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3. Medir el pH de la solucion un potencimetro
4. Agregar 4 gotas de fenolftalena y mezclar
5. Agregar gota por gota NaOH a los 20 mL de HCl siempre mezclando
6. Observar cambios de coloracin.
7. Una vez obtenido el cambio de coloracin del indicador de pH medir una vez ms el pH de la
solucin ahora titulada.
RESULTADOS
Volumen de NaOH utilizado durante la titulacin de HCl_____________
Concentracin de NaOH y de HCl en la solucin final ______________
Establecer la relacin entre el indicador de pH y el pH obtenido con el potencimetro.
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PRACTICA # 5
REACCIONES DE IDENTIFICACION DE AMINOACIDOS

OBJETIVO
Al trmino de esta practica el alumno sera capaz de diferenciar a los aminocidos utilizando tcnicas
colorimtricas mas comunes para identificarlos, as cmo, relacionar la estructura de los aminocidos
con su reactividad y sus funciones en el organismo.
PREREQUISITOS
1.- Conocer las caracteristicas diferenciales de la estructura de los aminocidos.
2.- Identificar las diferencias y semejanzas de los aminocidos con otros monmeros (por ejemplo :
carbohidratos y lpidos).
3.- Identificar las propiedades qumicas en base a su polaridad.
INTRODUCCION
Los aminocidos son los monmeros que dan la estructura de los polmeros conocidos como protenas o
polipptidos, 20 tipos de aminocidos, son los principales componentes de las protenas, los cuales
poseen las siguientes caracteristicas estructurales:

Contienen un carbn asmetrico (con excepcin de la glicina) llamado carbono alfa. Al cual se le unen
cuatro radicales que son:
- un grupo carboxilo (COO
-
)
- un grupo amino (
+
NH
3
)
- un tomo de hidrgeno (H)
- un radical de composicin variable que permite diferenciar a los aminocidos (R). Llamado cadena
lateral.
Debido a las caracteristicas fisicoqumicas de la cadena lateral, es posible relacionar su posicin, dentro
de la estructura proteca ya que si es de caracteristicas no polares (hidrofbico), al contacto con el agua
tender a esconderse; o en su defecto, si es de caracteristicas polares (hidroflico), tender a
interaccionar con el agua. Desde luego, para saber cual es la estructura de la cadena lateral debemos de
conocer cual es el pH de la solucin ya que dependiendo del pH la cadena lateral estar protonada (H
+
) o
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desprotonada, este parmetro se puede conocer utilizando los pKa de cada aminocido y la ecuacin de
Henderson-Hasselbach lo cual permite determinar cual es la estructura predominante a un pH dado.
Los cambios de carga observados en el aminocido mostrado, dependen del pH en que se encuentre el
aminocido, ya que como se observa en la figura anterior, bajo condiciones cidas el aminocido est
totalmente protonado y en condiciones alcalinas est totalmente desprotonado, esto se debe a que los
aminocidos son cidos dbiles y por lo tanto tienen una constante de disociacin por cada grupo o
radical capaz de comportarse como cido o base dbil. Esto permite conocer el punto isoeltrico de un
aminocido, el cual se define como el pH en el cual la carga neta es cero.
Los aminocidos que son utilizados para la sntesis de protenas son 20, los cuales se les ha identificado
como aminocidos naturales y los no naturales son los que an cuando siendo aminocidos, no forman
parte estructural de las protenas (no estn codificados en el cdigo gentico).
El cuerpo humano es incapaz de sintetizar los 20 aminocidos requeridos para la formacin de todas las
protenas y por lo cual partiendo de esta base, los aminocidos se dividen en : esenciales; porque es
necesario que el individuo ingiera en la dieta y no esenciales; los cuales son producidos por el propio
organismo y por lo tanto no es crtico si el individuo no los consume en su dieta. Cabe hacer notar, que
los 20 aminocidos son importantes para el buen desarrollo del organismo.
MATERIAL.-
1.-15 tubos de ensaye
5.-pipetas de 5.0 ml
2.-gradilla
6.-pipeta de 10.0 ml
3.-pipetas de 1.0 ml
7.-Bureta
4.-pipetas Pasteur
METODOLOGIA
Nota.- A menos que se especifique, todos los volmenes a aadir estn dados en mililtros (ml)
Experimento No. 1
Prueba de sullivan
REACTIVOS BLANCO PATRON PROBLEMA
AGUA 0.5 ----------- --------
CISTEINA ---------- 0.5 ---------
NH4OH 2 gotas 2 gotas 2 gotas
NaCN 0.5 0.5 0.5
NITROPRUSIATO DE
2 gotas 2 gotas 2 gotas
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SODIO
Sol. Problema ------------ ---------- 0.5

Experimento No. 2
Reaccin de identificacin de fenoles para-sustituidos (tirosina)
REACTIVOS BLANCO PATRON PROBLEMA
AGUA 1.0 --- ---
TIROSINA --- 1.0 ---
PROBLEMA --- --- 1.0
NITROSONAFTOL 2 gotas 2 gotas 2 gotas
Mezclar y calentar en bao a ebullicin durante 5 minutos.
ACIDO NITRICO 2 gotas 2 gotas 2 gotas
La aparicin de un color rosa violceo es positiva.
Experimento No. 3
Reaccin de identificacin de aminocidos con ninhidrina
La ninhidrina (hidrato de tricetohidrindeno) es un agente oxidante que reacciona con todos los alfa
aminocidos dando un color purpura. La prolina e hidroxiprolina da un color amarillo.
REACTIVOS BLANCO PATRON PROBLEMA
AMINOACIDO --- 1.0 ---
PROBLEMA --- --- 1.0
NINHIDRINA 1.0 1.0 1.0
AGUA 1.0 --- 1.0
Mezclar y calentar en bao de agua hirviendo durante 10 min.
La aparicin de un color azul violceo es positiva con excepcin de la prolina y la hidroxiprolina.
RESULTADOS
En la siguiente tabla indicar si los resultados del problema fueron positivos o negativos.
Tubo EXP. No. 1 EXP. No. 2 EXP. No. 3
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1
2
3
4
Por lo cual conclumos que el o los aminocidos presentes en la muestra son:______________
CUESTIONARIO
1.- Mencione 5 diferencias fundamentales tanto qumicas como bioqumicas que permiten diferenciar a
los aminocidos de los carbohidratos y de los lpidos.
2.- Existe un enorme grupo de aminocidos no naturales, mencione 10 ejemplos e indique su
importancia bioqumica.
3.- Cmo se calcula el punto isoelctrico de un aminocido?
4.- Cual es el fundamento de la reaccin de Pauly.
5.- Que importancia mdica tiene la identificacin de los aminocidos.?
6.- Cul es el mecanismo de identificacin de aminocidos al utilizar ninhidrina.
7.- Cul es la funcin del cianuro de sodio en la reaccin del nitroprusiato?

18

PRACTICA # 6
SEPARACIN EN CAPA FINA DE UNA MEZCLA DE AMINOCIDOS.

OBJETIVO
Al termino de esta practica el alumno ser capaz de identificar por lo menos dos tcnicas de separacin
de aminoacidos, as como relacionar las caracterasticas fisicoqumicas de la estructura en funcin de la
tcnica de separacin. Adems describir las ventajas y desventajas de la tecnica utilizada,
comparndola con otras.
PRE-REQUISITOS
1. Cules son las caractersticas diferenciales de los aminocidos naturales en base a su estructura
2. Cul es el fundamento de la reaccin de ninhidrina con los aminocidos.
INTRODUCCIN
Se llama cromatografa al mtodo que se sigue para la resolucin o separacin de mezclas de
componentes en zonas concentradas o en diferentes fases de aquellas en que se encontraban
inicialmente. Esto es independiente, de las fuerzas que provocan el paso de dichas sustancias de una
fase a otra.
Debido a lo anterior, la cromatografa presenta una gran versatilidad, eficiencia y conveniencia que
permite su aplicacin en un gran nmero de tcnicas en el laboratorio.
- Las tcnicas de cromatografa permiten separar mezclas de:
Gases
Iones simples
Molculas orgnicas e inorgnicas (aminocidos, azcares, vitaminas,
drogas, lpidos, esteroides)
Macromolculas (protenas, polisacridos, cidos nuclecos)
Partculas (componentes subcelulares, bacterias)
- Las tcnicas cromatografcas permiten conocer:
El peso molecular de la sustancia de inters
Identificar una o mas sustancias de una mezcla
La concentracin de las molculas presentes
- La cromatografa basa su separacin en:
La diferencia en velocidad de migracin de las sustancias presentes en la
mezcla a travs de los poros del soporte llamado adsorbente.
La migracin se efectua por el flujo de un gas o un liquido llamado fase
mvil, el cual viaja a travs del adsorbente llamado fase estacionaria
- La separacin de los componentes se lleva a cabo por una combinacin de procesos, los cuales
son:
Particin del soluto (componente a separar) entre la mezcla de
solventes (fase mvil)
19

Adsorcin de los solutos con la fase estacionaria (interacciones
superficiales)
Atraccin electrosttica de solutos (iones) con carga opuesta.
- La clasificacin de las tcnicas de cromatografa en base al mtodo en
Cromatografa en columna
Cromatografa en capa fina
Cromatografa en papel
Cromatografa de gases
En el caso de la cromatografa en capa fina, su separacin se basa en una mezcla se procesos: adsorcin
y particin. sta tcnica de separacin de aminocidos es utilizada para determinar fallas metablicas o
renales (aminoaciduria), y la muestra que se utiliza es un concentrado de orina.
MATERIAL
-Equipo para cromatografa en capa fina
- Horno a 80 C
-Pipetas pasteur
-Papel
METODOLOGA
NOTA. No tocar con las manos la placa cromatogrfica porque se contamina por la presencia de
aminocidos en las manos.
1. Hacer unas marcas con lpiz sobre la placa a un centmetro de la base de la placa. No raye a
todo lo largo de la placa, nicamente marque en las orillas
2. A esta altura colocar una gota de la solucin de aminocidos conocidos separados a un
centmetro cada uno y colocar una muestra problema.
3. Dejar secar al aire, sin soplar.
4. Aadir fase mvil a la cmara cromatografica: 40 mL butanol: 10 mL cido actico: 50 mL agua y
cerrar
5. Colocar las placas de cromatografa en la cmara cuidando de no empalmar una con otra. Las
placas deben quedar con la muestra de aminocidos en la parte inferior para hacer una
cromatografa ascendente.
6. Cerrar la cmara y dejar que ascienda el solvente por la placa hasta un poco antes que salga
alrededor de 1 hr. Sacar las placas y marcar con lpiz hasta donde avanz el solvente.
7. Sacar las placas y marcar con lpiz hasta donde avanz el solvente.
8. Secar por 5 minutos en horno a 80C
9. Rociar con la solucin de ninhidrina toda la placa y calentar en el horno por 5 min.
10. Medir los frentes del solvente y del soluto para cada mancha y calcular sus respectivos relacin
de frentes con la siguiente frmula:
Rf= Frente de soluto
Frente de solvente
20

11. Compare el Rf de los aminocidos conocidos con los obtenidos para el problema para identificar
el o los aminocidos presentes en la mezcla.
RESULTADOS
Problema No.___________
La muestra contiene:_____________
CUESTIONARIO
1. Si el Rf para la L-glicina es de 0.45 cual seria el rf para la D-glicina. Explique su respuesta.
2. En base a los resultados obtenidos por todo el grupo, indique de manera ascendente como se
separaran los siguientes aminocidos, utilizando la misma mezcla de solventes.
Ala, Met, Phe, Tyr, His, Glu, Gln.
3. En caso de que se estuviera analizando una mezcla de aminocidos presentes en una muestra
de orina, que componentes de sta adems de los aminocidos se teirn con la ninhidrina.
4. Por qu los Rf son especficos de la tcnica de separacin de los solventes utilizados.

21

PRACTICA # 7
REACCIONES DE IDENTIFICACION DE PROTEINAS

OBJETIVO:
Al trmino de esta practica, el alumno deber ser capaz de describir algunas de las tcnicas de deteccin
cualitativa de protenas en base a los componentes de su estructura.
PR-ERREQUISITOS:
1.- Definicin de Pptido, Polipptido y Protena.
2.- Clasificacin de las Protenas.
3.- Niveles de complejidad estructural de las Protenas.

INTRODUCCION:
La palabra Protena proviene del griego preeminente, que significa primero; fu inicialmente propuesta
por Berzeluis en 1838 para referirse a unas serie de compuestos orgnicos nitrogenados con cierta
complejidad que se encuentran altamente distribuidos en la naturaleza y son la base para actividades
tanto estructurales y funcionales de todo organismo vivo.
Las protenas estas compuestas por aminocidos naturales ordenados en una secuencia discreta y
unidos entre s por enlaces peptdicos que siempre involucran los radicales amino y carboxilo de cada
aminocido.
La variabilidad de las protenas se debe a una serie de aspectos tales como: complejidad estructural,
residuos aminoacdicos que la forman, propiedades qumicas y fsicas y funciones especficas de cada
protena en el organismo que la contiene.
Se concluye, por lo tanto, que el anlisis qumico de las protenas en base a sus propiedades es muy
amplio y su aplicacin en el campo mdico, clnico y de investigacin es muy importante.
Basndose en los anlisis fsicos y qumicos de ellas, se han planteado cuatro niveles estructurales de
conformacin, se han postulado las posible formas estructurales , su naturaleza electrosttica , su
capacidad de solubilidad as como sus funciones dentro del organismo.
MATERIAL.-
1.- 12 tubos de 20 x 150 mm
2.- 3 pipetas de 1.0 ml.
3.- 1 pipeta de 10.0 ml.
4.- 1 Gradilla
5.- Sol. de albmina 0.1%
6.- Sol. de peptona 0.1%
7.- Sol Gelatina 0.1 %
8.- Sol. Tirosina 0.1 %
9.- Sol. NaOH 10.0 %
10.- Sol. Sulfato de Cu 0.5 %
11.- Ac. ntrico concentrado
12.- Hidrxido de amonio
22


METODOLOGIA.-
Experimento No. 1
Reaccin de Biuret:
Existen diversas tcnicas de deteccin y cuantificacin de protenas algunas ms complicadas que otras
y algunas ms confiables que otras. Una de las reacciones ms utilizadas es la de Biuret; en esta
reaccin, el sulfato de cobre alcalino reacciona con compuestos que contienen dos o ms enlaces
peptdicos, ya que el radical carbamilo que se forma en el enlace peptdico es muy afn a los iones de
cobre. Se le da el nombre de Biuret porque este es un compuesto que da una reaccin tpicamente
positiva con el sulfato de cobre alcalino. La formacin del color violeta es directamente proporcional al
nmero de enlaces peptdicos que contenga la protena y no es sensible a pptidos.
Preparar una serie de tubos de acuerdo al siguiente cuadro:
Tubo 1 2 3 4 5
Agua destilada 1 mL -- -- -- --
Albmina -- 1 mL -- -- --
Peptona -- -- 1 mL -- --
Gelatina -- -- -- 1 mL --
Tirosina -- -- -- -- 1 mL
NaOH 2 mL 2 mL 2 mL 2 mL 2 mL
CuSO
4
0.5 mL 0.5 mL 0.5 mL 0.5 mL 0.5 mL

Agitar y dejar reposar los tubos durante 15 min. Observar la coloracin y su intensidad.
Reportar los resultados de la siguiente forma: (++) = violeta intenso, (+) = Ligeramente coloreado, (-) =
no formacin de color.
Experimento No. 2
Reaccin Xantoproteca:
Esta reaccin afecta la integridad estructural de los residuos aminoacdicos de las protenas. En este
caso, Los aminocidos que contienen un ncleo aromtico, forman nitroderivados de color amarillo
cuando se calientan con cido Ntrico concentrado. Al aadir una solucin alcalina se forman sales de
estos derivados que son de color naranja.
Preparar una serie de tubos de acuerdo al siguiente cuadro:

Tubo 1 2 3 4 5
23

Agua destilada 1 mL -- -- -- --
Albmina -- 1 mL -- -- --
Peptona -- -- 1 mL -- --
Gelatina -- -- -- 1 mL --
Tirosina -- -- -- -- 1 mL
HNO
3
1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL

Mezclar y calentar a bao de agua a ebullicin durante 5 min. y enfriar a temperatura ambiente durante
10 min.
Agregar por estratificacin y SIN MEZCLAR 0.5 mL de Hidrxido de Amonio a todos los tubos.
La formacin de un anillo color naranja en la interfase es resultado positivo.
Reportar con un signo positivo (+) los tubos donde se haya formado el color naranja

RESULTADOS
Experimento Testigo Algumina Peptona Gelatina Tirosina
Reaccin de
Biuret

Reaccin
Xantoproteica


DISCUSION:
1.- Describir y explicar mediante un esquema la reaccin entre el Reactivo de Biuret y los enlaces
peptdicos.

2.- Correlacionar los pesos moleculares y los componentes aminoacdicos de la albmina, peptona,
gelatina y tirosina.

3.- Explique porque cada protena se comporta de diferente manera en las reacciones de Biuret y
Xantoproteica.

4.- Analice las dos reacciones y diga si son confiables para una determinacin a nivel clnico.

CUESTIONARIO:
1.- Mencione y describa dos reacciones que sean anlogas a la xantoproteica.
2.- Mencione dos reacciones que sirvan para cuantificar protenas
3.- Describa el metodo de Sanger y mencione que papel juega en la identificacin de protenas.
4.- Defina el trmino Secuenciacin protica.
5.- Mencione tres reacciones de identificacin que se utilicen en la secuenciacin de protenas.
6.- Analice detalladamente una tcnica que se utilice para secuenciar a las protenas.
24

7.- Describa la tecnica de Millon y especifique el tipo de protenas que puede identificar.


25

PRACTICA # 8
DETERMINACIN DE LAS PROPIEDADES QUMICAS DE LAS PROTENAS

OBJETIVOS
Al trmino de la prctica, el alumno ser capaz de describir el efecto de los solventes sobre las
propiedades electroqumicas de las protenas de diferente PM de acuerdo a las siguientes variables.
a) Solubilidad de las protenas en diferentes soluciones de sales.
b) Propiedades electroqumicas de las protenas.
c) Efecto del acido actico sobre el punto isoelctrico de una protena.
PRERREQUISITOS INVESTIGAR LOS SIGUIENTES CONCEPTOS
A) Salting In y Salting Out.
B) Agentes precipitantes de protenas.
C) Propiedades fisicoqumicas del agua.
D) Ecuacin de Henderson/Hasselbach.

INTRODUCCIN
Las protena son macromolculas compuestas por unidades de alfa aminocidos que se unen entre s
mediante enlaces peptdico y que alcanzan un peso molecular igual o superior a 5000 D.
El enlace peptdico, caracterstico de estos compuestos, resulta de la reaccin del grupo carboxilo de un
aminocido con el grupo amino del otro aminocido, lo cual da lugar a un enlace covalente de tipo
carbamida y que tiene algunas caractersticas peculiares como:
a) El enlace C-N tiene cierto carcter de doble enlace, por lo cual le confiere rigidez a la molcula.
b) El oxigeno y el nitrgeno quedan en posicin trans.
c) Todos los elementos que componen el enlace se encuentran ubicados en el mismo plano.
d) La rotacin de la molcula formada queda restringida a los carbonos alfa.
El gran nmero de aminocidos que componen la molcula proteica determina que su estructura sea
extraordinariamente compleja, y que para poder estudiarla nos veamos precisados a dividirla
artificialmente en los llamados <<niveles de organizacin de la estructura proteica >>, de los cuales se
describen habitualmente 4, aunque algunos autores llegan a describir 5 o ms.
Por supuesto que toda organizacin estructural que implique determinado orden requiere de la
presencia de una fuerza estabilizadora, que en el caso de las protenas estara constituida por
diferentes tipos de enlaces o interacciones fsicas y qumicas que se enuncian en el cuadro siguiente:

Nivel de organizacin Enlaces que lo mantienen
26

Primario Enlace peptdico.
Secundario Puentes de hidrogeno entre los elementos del enlace peptdico.
Terciario Puentes de hidrgeno entre las cadenas laterales de los aminocidos,
interaccin hidrofbica, interaccines ectrostatica, puentes disulfuro, enlace
ster.
Cuaternario Los mismos que para el nivel terciario ms las fuerzas de Van der Walls.

La complejidad estructural de las protenas se manifiesta desde el punto de vista funcional en una gran
diversidad de funciones biolgicas.
En las proteinas existen aminoacidos hidrofobicos e hidrofilicos. Luego del doblamiento en solucin
acuosa, los aminocidos hidrofobicos usualemente se encuentran en areas protegidas, mientras que los
aminocidos hidrofilicos interactan con las molculas del solvente, permitiendo la formacin de puentes
de hidrgeno con las molculas de agua del medio. Si hay suficiente superficie hidrofilida, la protena
puede ser disuelta en agua.
Cuando la concentracin de sales aumenta, algunas de las moleculas de agua son atraidas por los ions
salinos, lo cual disminuye la cantidad de moleculas de agua disponibles para su interaccion con la
protein. Como resultado de esto, las interacciones protena-proteina se hacen mas fuertes que las
interacciones protena-solvente por lo que las protenas coagulan formando interacciones hidrofobicas
entre ellas, proceso al cual se le conoce como Salting-out.
MTODOS
Experimento No. 1
Efecto de la solubilidad de las protenas por la adicin de sales.
Fundamento qumico.
La adicin de una sal a una solucin proteica modifica la constante dielctrica del solvente, permitiendo
una mayor solubilidad de la protena. Sin embargo, cuando se aade exceso de una sal se neutralizan las
cargas de la protena y esta tiende a precipitar. Este mismo efecto ocurre al aadir sales metlicas
cargadas electropositivamente. Existe variante entre diferentes sales metlicas de la misma valencia, a
la misma concentracin, y de masa atmica diferente.
Tambin se demostrara, la diferencia existente tratndose con diferentes tipos de protenas.
Prepara tres series de tubos como se indica.
REACTIVO Albmina 1% (1ml) Gelatina 1% (1ml) Peptona 1% (1ml)
Testigo H
2
O 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml
ZnSO
4
2 % 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml
27

CuSO
4
2% 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml
C
2
H3O
2
Co 2% 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml
C
2
H3O
2
Co 1% 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml
NaCl 1% 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml
NaCl 20% 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml

Agitar bien los tubos y comparar los cambios en la solubilidad de la protena, comparndolos con un
tubo testigo adicionando agua destilada.
Nota. Si lo requiere, dejar reposar por 20 min.*(o lo que considere), y hacer las observaciones.

Experimento No. 2
Determinacin del punto Isoelctrico de la Albmina por adicin de un cido.
Fundamento Qumico:
Con la adicin de un cido o una base a una solucin protica se alcanza un estado en que hay el mismo
nmero de aniones que de cationes. Este efecto, neutraliza la carga de la protena y tiende a precipitar.
El pH que determina el nmero igual de cargas de signos opuestos se denomina punto isoelctrico.
Preparar una serie de tubos como se indica a continuacin:
Tubo pH Agua destilada
Ac. Acetico
0.01N
Ac. Acetico 0.1
Ac. Acetico
1.0N
Albuminato de
Sodio
1 8.38 0.62 0 0 1.0
2 7.75 1.25 0 0 1.0
3 8.75 0 0.25 0 1.0
4 8.5 0 0.5 0 1.0
5 8.0 0 1.0 0 1.0
6 7.0 0 2.0 0 1.0
7 5.0 0 4.0 0 1.0
8 1.0 0 8.0 0 1.0
9 7.4 0 0 1.6 1.0
28

10 5.8 0 0 3.2 1.0

Mezclar bien y observar los cambios que presente la solubilidad de la casena en cada tubo.
Calcular el pH de cada tubo utilizando la ecuacin de Hendersosn-Hasselbach.
RESULTADOS:
Experimento No.1
Efecto en la solubilidad de las protenas por adicin de sales.
Sal utilizada Solubilidad de la
Albumina
Solubilidad de la
Peptona
Solubilidad de la
Gelatina
Acetato de Cobalto
Cloruro de sodio 1.0%
Cloruro de Sodio 20.0%
Sulfato de Zinc 5.0%
Sulfato de zinc al 20 %

Experimento No. 2
Determinacin del punto Isoelctrico de la casena por adicin de un cido.
Tubo pH Solubilidad
1
2
3
4
5
6
7
8
29

9
10
Cul es el punto isoelctrico de la protena ?
DISCUSION:
1.-Cual es el efecto de la adicin de un sal metlica a una solucin protenica.
2.-De que factores depende la solubilidad de una protena en el agua.
3.-Explique en trminos fisicoqumicos el efecto que provoca la adicin de un cido o una base fuerte.
4.-Explique como afecta un cambio en la constante dielctrica del agua a la solubilidad de una protena.
5.-Qu es el Salting in y que tipo de compuestos pueden promoverlo.
6.-Qu es el Salting out y que tipo de compuestos pueden promoverlo.
7.-Qu relacin existe entre el punto isolelectrico y la solubilidad de una protena.
8.-Qu es la ecuacin de Henderson-Hasselbach y en que casos est indicado utilizarse.
9.-Diga si es posible tener dos protenas con puntos isoelctricos muy alejados solubles en un mismo
solvente. Porqu?
CUESTIONARIO:
1.- Las protenas Bence Jones precipitan a una temperatura mayor de 60C. Las Crioglobulinas precipitan
a una temperatura de 4C. La albmina de huevo precipita a una temperatura mayor de 90C y tambien
precipita a un pH menor de 4.5. Explique el comportamiento de cada una de estas protenas tomando
en cuenta los siguientes parmetros: Fuerza inica del solvente, interacciones electrostticas soluto-
solvente, agentes desacoplantes de la interaccin soluto-solvente.
2.- Mencione que propiedades fisicoqumicas de la albmina le permiten interaccionar y transportar
cualquier compuesto incluyendo hidrofbicos a travs de un medio acuoso.
3.- El punto Isoelctrico de la Gelatina es de 4.7 y el de la colgena es de 8.4. Se sabe que la colgena es
una protena fibrilar precursora de la gelatina. Explique porque hay una diferencia tan grande entre los
puntos isoelctricos de ambas.
4.- El Ac. tricloroactico, el Ac. sulfosaliclico y el Ac. fosfotngstico tienen la propiedad de precipitar
protenas. Cul es el mecanismo fisicoqumico que ocurre en esta precipitacin.
5.- Especifique cual es el efecto del plomo sobre las propiedades electroqumicas de las protenas de la
sangre.
6.- Determine el efecto del litio cuando se encuentra en altas concentraciones sobre las protenas de las
clulas nerviosas.
30

PRCTICA #. 9
FOTOCOLORIMETRIA

OBJETIVO
a) Determinar los espectros de absorcin de 2 sustancias coloridas.
b) Determinar la longitud de onda ptima para la cuantificacin de cada sustancia (mxima
absorbancia).
c) Desarrollar curvas de calibracin para cada una de las sustancias.
d) Comprobar si se sigue la Ley de Lambert-Beer para cada una de las sustancias y cuales sern los
lmites.
PRERREQUISITOS
1.- Definicin de los siguientes trminos:
a) Longitud de onda
b) espectro de absorcin
c) absorbancia
d) transmitancia.
2.- Longitud de onda del espectro visible, ultravioleta e infrarrojo.
INTRODUCCION
La utilizacin de fotocolormetros y espectrofotmetros se basa en la determinacin de un parmetro,
esto es, medir la luz absorbida por una sustancia que se encuentra en el seno de un lquido y esto se
relaciona directamente con la concentracin de la sustancia en el lquido. Estos instrumentos que sirven
para medir la intensidad de la luz transmitida o absorbida por una solucin, consisten prcticamente de
una fuente de luz, filtros (fotocolormetros) o un monocromador (espectrofotmetro ), una hendidura
de salida de luz seleccionada, un receptculo para la muestra ( celdilla ), fotocelda y galvanmetro (
figura 1 ).
Lmpara ------> Filtro ------> Celdilla ---> Fotocelda ------> Galvanmetro
Figura No. 1.- Diagrama de flujo de luz en un fotocolormetro o espectrofotmetro.
La diferencia entre un fotocolormetro y un espectrofotmetro es a nivel del separador de las diferentes
longitudes de onda que componen la luz, siendo ms sensible el monocromador del espectrofotmetro,
ya que los lmites son ms estrechos, que los filtros del fotocolormetro en cul los lmites estn ms
separados.
Las medidas fotocolorimtricas estn basadas en 2 leyes:
31

a) La Ley de Lambert
b) La Ley de Beer
La Ley de Lambert nos indica que la proporcin de luz incidente absorbida por un medio es
independiente de su intensidad, pero no del espesor de la capa lquida ni de las caractersticas del
medio.
La Ley de Beer nos indica que la intensidad de la luz que pasa a travs de una solucin a una
concentracin c y un grosor l es la misma cuando la concentracin es 2c y el grosor l/2 o cuando la
concentracin es c/2 y el grosor 2l, de tal manera que la absorcin de luz es proporcional al nmero de
molculas del material absorbente a travs de las cules pasa la luz. As, si la sustancia absorbente est
disuelta en un solvente transparente, la absorcin de la solucin es proporcional a la concentracin
molar.(1)
Matemticamente la ley de Lambert-Beer se expresa como sigue:

Los materiales que cumplen con la ley de Lambert-Beer, o sea donde hay proporcionalidad entre la
Absorbancia (As) y la concentracin dentro de ciertos lmites de concentracin, pueden ser estudiados
por este mtodo, trabajando una curva de calibracin que permita la interpolacin dentro del margen
de cumplimiento de la ley de Lambert-Beer o utilizando un estndar.
MATERIAL
Solucin de H2SO4 0.5 M.
Solucin de KMnO4 0.0004 M.
Solucin de K2Cr2O7 0.0016 M.
11 Tubos de ensaye de 15x160 mm
2 Pipetas de 10 ml.
2 Pipetas de 5 ml.
2 Celdillas para Fotocolormetro.
1 Gradilla.
Fotocolormetro
METODOLOGIA.-
Experimento No. 1
DETERMINACION DE LOS ESPECTROS DE ABSORCION.
1. Determinar los espectros de absorcin de cada una de las soluciones tipo, leyendo las absorbancias
(As) a cada una de las longitudes de onda (nanmetros, nm) del Fotocolormetro; calibrando a cero
con la solucin de H2SO4 0.05 M.
2. Seleccionar las longitudes de onda de mxima absorbancia para cada una de las soluciones tipo.
3. En el reporte incluir una tabla con las absorbancias de cada sustancia tipo y la longitud de onda
utilizada. Con estos datos construir una grfica para cada espectro de absorcin, colocando en las
ordenadas las absorbancias y en las abcisas las longitudes de onda. Debe indicar cual es la longitud
32

de onda de mxima absorbancia para cada una de las soluciones tipo. Comparar los espectros de
absorcin de cada solucin tipo y discutir porque tienen diferentes espectros de absorcin.
Experimento No. 2
PREPARACION DE CURVA DE CALIBRACION PARA UNA SOLUCION TIPO.
1. Preparar 4 diluciones (1:2, 1:4, 1:8, 1:16) para una de las soluciones tipo, utilizando la solucin de
H
2
SO
4
como diluyente.
2. Leer la absorbancia de cada dilucin a la longitud de onda seleccionada en el inciso anterior.
3. En el reporte incluir las curvas de calibracin para la solucion tipo, graficando absorbancia vs.
concentracin molar. Definir la relacin que existe entre la concentracin y la absorbancia
obtenida.

Experimento No. 3
DETERMINACION DE LAS CONCENTRACIONES MOLARES DE LOS COMPONENTES EN UNA MEZCLA.
1.- Preparar las siguientes mezclas:
Tubo K
2
CR
s
O
7
KMnO
4
H
2
SO
4
H
2
O
1 5.0 1.0 0.2 3.8
2 2.5 2.5 0.2 3.8
3 1.0 5.0 0.2 3.8

2.- Medir las absorbancias de cada mezcla a las longitudes de onda seleccionadas en el experimento No.
1. Utilice la misma solucin tipo del experimento 2. Determinar la concentracin del analito deseado.
3.- Medir un tubo problema a la misma longitud de onda para determinacin de la concentracin
desconocida, en base a una lectura patrn de la solucin tipo.
RESULTADOS:
EXPERIMENTO No. 1
1.- Llenar la siguiente tabla:
Longitud de
onda
Abs
K
2
CR
s
O
7

Abs
KMnO
4

415
445
460
490
33

520
535
550
580
610
640

En el reporte incluir una tabla con las absorbancias de cada sustancia tipo y la longitud de onda
utilizada. Con estos datos construir una grfica para cada espectro de absorcin, colocando en las
ordenadas las absorbancias y en las abcisas las longitudes de onda. Debe indicar cual es la longitud de
onda de mxima absorbancia para cada una de las soluciones tipo.
EXPERIMENTO No. 2
Longitud de onda seleccionada para el K
2
Cr
2
O
7
= __________ =As
1

Longitud de onda seleccionada para el KMnO
4
= __________ =As
2

K
2
Cr
2
O
7
KMnO
4

Dilucin Absorbancia Concentracin
1 : 2
1 : 4
1 : 8
1 : 16

En el reporte incluir la curva de calibracin para la solucion tipo, graficando absorbancia vs.
concentracin molar.
EXPERIMENTO No. 3
Llenar la siguiente tabla:
Determina la concentracin de K
2
Cr
2
O
7
KMnO
4
en las mezclas y en el tubo problema utilizando un
tubo patrn de solucin tipo.
Mezcla Absorbancia Conc. Practica
34

1
2
3
Problema


35

PRCTICA #. 10
ANALISIS ENZIMATICO CUALITATIVO

OBJETIVO:
Al trmino de esta prctica, el alumno ser capaz de definir el efecto fisicoqumico que generan las
enzimas sobre diferentes sustratos. Indicando adems, las propiedades qumicas que permiten que un
enzima, catalize la modificacin de un sustrato
PREREQUISITOS:
1. Definicin de enzima, substrato, apoenzima, holoenzima, proenzima, zimgeno, coenzima,
cofactor.
2. Determine lo que significa: especifidad enzimtica y alosterismo.
3. Defina el efecto de una hidrolasa, oxidoreductasa, transferasa, liasa, ligasa e isomerasa.
INTRODUCCION:
Todos los organismos vivos pueden obtener y gastar la energa muy rpidamente, debido a la presencia
de catalizadores biolgicos llamadas enzimas. Al igual que los catalizadores inorgnicos; las enzimas
modifican la velocidad de una reaccin qumica sin afectar el equilibrio final y slo se requieren
pequeas cantidades para efectuar la transformacin de un gran nmero de molculas de sustrato. Sin
embargo, a diferencia de la mayora de los catalizadores inorgnicos las enzimas son bastante
especficas ya que catalizan un nmero comparativamente pequeo de reacciones; en algunos casos,
tan solo una reaccin , as mismo las enzimas funcionan solo bajo condiciones muy definidas de pH,
temperatura, concentracin de sustrato, coenzimas etc.
Estas condiciones se ilustran en algunos de los experimentos que se tienen determinados en este tema.
Las enzimas se designan y se clasifican de acuerdo con el tipo de reaccin que catalizan; los 6 grupos
principales de enzimas son: Oxidoreductasas, Transferasas, Hidrolasas, Liasas, Isomerasas, Ligasas o
Sintetasas.
MATERIAL:
1.- 6 tubos de ensaye
2.- 3 pipetas de 1.0 ml
3.- 2 pipetas de 5.0 ml
4.- 2 pipetas Pasteur
5.- 2 gradillas
6.- Tapones de algodon
METODOLOGIA.-
Experimento No. 1
EFECTO DEL CALOR SOBRE LA ACTIVIDAD DE LAS ENZIMAS. "ACTIVIDAD DE LA UREASA"
Tubo 1 2 3
Semilla de Vegetal pizca pizca pizca
36

Agua 0 5.0 5.0
Mezclar para tratar de homogenizar el polvo de sandia y enseguida coloque un tapn de algodn a los
tubos 1 y 2 y colquelos en bao a ebullicin durante 20 minutos. (cuidar que no se acabe el agua del
bao,)
Agua 5.0 0 0
Azul de Bromotimol 2 Gotas 2 Gotas 2 Gotas
Aadir cido dbil (GOTAS) en caso de que la solucin tenga un color azul.
Urea 5.0 5.0 5.0
Mezclar y tomar el tiempo que transcurre hasta alcanzar el vire de color amarillo a azul en cada uno de
los tubos.
Experimento No. 2
DETERMINACION DE LA ACTIVIDAD DE RENINA.
Tubo 1 2 3

Leche 3.0 3.0 3.0
Oxalato de Amonio 0 0.5 0.5
Solucin renina 3 Gotas 3 Gotas 3 Gotas
Mezclar e incubar a 37C durante 10 minutos y anotar los cambios observados en cada uno de los tubos.
Calentar el tubo No. 2 a ebullicin y enfriar.
Cloruro de Calcio 0 10 Gotas 10 Gotas
Mezclar y comparar los cambios observados en los tubos No 2 y 3 con el 1.
CUESTIONARIO:
1.- Deacuerdo a la clasificacin enzimtica a que clase pertenecen las enzimas utilizadas (renina y
ureasa) y porqu?
2.- Mencione 3 bacterias que contengan la enzima ureasa:
3.- Qu grupos qumicos participan en el sitio activo de las enzimas ?
4.- Las enzimas cambian la constante de equilibrio de las reacciones que catalizan ? si, no ; porqu?
5.- Porqu algunas protenas actan como catalizadores (enzimas) de reacciones con alta especificidad,
mientras que otras protenas que tambin contienen aminocidos en su estructura no lo hacen?



37

PRCTICA #. 11
CINETICA ENZIMATICA 1: EFECTO DE LA CONCENTRACION DEL SUSTRATO
SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA

OBJETIVOS:
El alumno observar el comportamiento de la actividad enzimtica de acuerdo a los parmetros de
concentracin tanto del sustrato determinando los valores de:
a) Vmax ( velocidad mxima de la reaccin ).
b) 1/2 Vmax
c) Km ( constante de Michaelis ).
d) [S] ptima ( concentracin ptima de sustrato ).

PRE-RREQUISITOS:
1. Describir el mecanismo de accin de las enzimas en las reacciones qumicas.
2. Cul es la relacin que existe entre la velocidad de una reaccin catalizada y la concentracin de
enzima.
3. Definir la relacin entre la concentracin de sustrato y la velocidad de la reaccin enzimtica.
4. Interpretar la cintica de Michaelis-Menten y la de Lineweaver-Burk.
INTRODUCCION:
La cintica qumica es el estudio de la velocidad de cambio que existe entre el estado inicial de
reactantes y productos y el estado final. La velocidad es expresada en trminos de cambios de
concentracin de sustrato o producto por unidad de tiempo, esto se puede seguir, determinando la
desaparicin de reactantes o aparicin de productos en funcin del tiempo. Es particularmente
importante hacer notar que constantemente hay cambios en la velocidad de reaccin conforme procede
la reaccin hasta llegar al equilibrio, una vez alcanzado ste, los cambios de velocidad son iguales a cero.
El determinar la velocidad de una reaccin no revela nada acerca de la estequiometra de los reactantes
y productos ni del mecanismo de la reaccin.
En la mayora de las reacciones enzimticas al seguir su comportamiento cintico se pueden obtener
generalmente varios rdenes de reaccin; al examinar la curva de velocidad respecto a la concentracin
de sustrato, se encuentran tres regiones distintas donde la velocidad responde en forma caracterstica a
los aumentos de concentracin de sustrato:
a) A muy bajas concentraciones de sustrato el comportamiento de velocidad con respecto a la
concentracin de sustrato es esencialmente lineal, esto es, la velocidad es directamente
proporcional a la concentracin de sustrato y en esta regin se presenta la cintica de primer
orden.
b) En la etapa final de la curva observamos que la velocidad es esencialmente independiente de la
concentracin de sustrato, aqu la cintica es de orden cero.
38

c) En la parte intermedia de la curva se presenta una mezcla de rdenes de reaccin, ya que se
observan cambios en la velocidad de reaccin pero no siguen una constante de
proporcionalidad.
Este tipo de estudio cintico fue desarrollado por primera vez por Michaelis-Menten y formularon la
siguiente ecuacin:
V =Vmax [S]
Km + [S]
donde las constantes Vmx y Km son caractersticas para cada enzima bajo ciertas condiciones.
En forma prctica es difcil determinar el valor de Km de una curva de saturacin de sustrato, pero se
puede recurrir a la grfica de Lineweaver-Burk que utiliza los recprocos de velocidad y sustrato, sta
tiene la ventaja de dar valores de Km y Vmx estadsticamente ms significativos con tan slo 6 a 8
datos experimentales.
En los experimentos a realizar se van a observar los efectos de la concentracin de sustrato y
concentracin de enzima sobre la actividad enzimtica en una reaccin.
MATERIAL
1.- 8 Tubos de ensaye
2.- 1 Gradilla
3.- 3 Pipetas de 1.0 ml
4.- 2 Pipetas de 5.0 ml
5.- 1 Bao de agua a 37C
6.- 1 Bao de agua en ebullicin
METODOGIA:
La invertasa es una enzima hidroltica que acta sobre sacarosa ( un disacrido ) liberando glucosa y
fructosa. La actividad de la enzima se detiene al aadir una solucin alcalina y el poder reductor de los
productos se mide hacindolos reaccionar con el reactivo de 3,5-dinitrosalicilato.
Tubo

1 2 3 4 5 6
Invertasa 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
Amortiguador 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
Sacarosa 0.02 M 1.0 0 0 0 0 0
Sacarosa 0.03 M 0 1.0 0 0 0 0
Sacarosa 0.05 M 0 0 1.0 0 0 0
Sacarosa 0.10 M 0 0 0 1.0 0 0
Sacarosa 0.30 0 0 0 0 1.0 0
Agua 0 0 0 0 0 1.0
Mezclar e incubar a 35 C durante 20 min.
Agregar 1 mL de Dinitrosalicilato a todos los tubos.
39

Mezclar y calentar en bao de agua a ebullicin durante 5 min. Enfriar y leer a 540 nm ajustando a cero
con el tubo No. 6
RESULTADOS:
1.- Graficar los valores de As vs. [S]
2.- Graficar los valores de 1/As vs. 1/[S]
3.- Determinar los valores de:
Grfica de M-M Grfica de L-B
Vmx
Km
Vmx
[ S ] ptimo

CUESTIONARIO:
1.- La velocidad inicial de una reaccin enzimtica es dependiente exclusivamente de la cantidad de
sustrato presente? si, no por qu?
2.- Cual es la diferencia entre los cambios de energa libre que existen entre un proceso catalizado por
una enzima y el mismo proceso no catalizado.
3.- Por qu a concentraciones de sustrato mucho mayores que el valor de la Km la velocidad de la
reaccin es independiente de la concentracin de sustrato?
4.- La Km de una enzima vara con la concentracin de enzima? si, no, por qu?

40

PRCTICA #. 12
CINETICA ENZIMATICA 2: EFECTO DEL INHIBIDOR SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMTICA

OBJETIVO
El alumno observar el comportamiento de la inhibicin de la actividad enzimtica de acuerdo a los
parmetros de concentracin tanto del sustrato como de inhibidor determinando los valores de:
a) Vmax ( velocidad mxima de la reaccin ).
b) 1/2 Vmax
c) Km ( constante de Michaelis ).
INTRODUCCIN
Los inhibidores enzimticos son molculas que se unen a enzimas y disminuyen su actividad. Puesto que
el bloqueo de una enzima puede matar a un organismo patgeno o corregir un desequilibrio
metablico, muchos medicamentos actan como inhibidores enzimticos. Tambin son usados como
herbicidas y pesticidas. Sin embargo, no todas las molculas que se unen a las enzimas son inhibidores;
los activadores enzimticos se unen a las enzimas e incrementan su actividad.
La unin de un inhibidor puede impedir la entrada del sustrato al sitio activo de la enzima y/u
obstaculizar que la enzima catalice su reaccin correspondiente. La unin del inhibidor puede ser
reversible o irreversible. Normalmente, los inhibidores irreversibles reaccionan con la enzima de forma
covalente y modifican su estructura qumica a nivel de residuos esenciales de los aminocidos
necesarios para la actividad enzimtica. En cambio, los inhibidores reversibles se unen a la enzima de
forma no covalente, dando lugar a diferentes tipos de inhibiciones, dependiendo de si el inhibidor se
une a la enzima, al complejo enzima-sustrato o a ambos.
Los inhibidores reversibles se unen a las enzimas mediante interacciones no covalentes tales como los
puentes de hidrgeno, las interacciones hidrofbicas y los enlaces inicos. Los enlaces dbiles mltiples
entre el inhibidor y el sitio activo se combinan para producir una unin fuerte y especfica. Al contrario
de lo que ocurre con el sustrato y los inhibidores irreversibles, los inhibidores reversibles generalmente
no experimentan reacciones qumicas cuando se unen a la enzima y pueden ser eliminados fcilmente
por dilucin o por dilisis.
Existen tres tipos de inhibidores reversibles. Se clasifican en base al efecto producido por la variacin de
la concentracin del sustrato de la enzima en el inhibidor.
En la inhibicin competitiva, el sustrato y el inhibidor no se pueden unir a la misma enzima al mismo
tiempo, como se muestra en la figura de la derecha. Esto generalmente ocurre cuando el inhibidor tiene
afinidad por el sitio activo de una enzima en el que tambin se une el sustrato; el sustrato y el inhibidor
compite para el acceso al sitio activo de la enzima. Este tipo de inhibicin se puede superar con
concentraciones suficientemente altas del sustrato, es decir, dejando fuera de competicin al inhibidor.
Los inhibidores competitivos son a menudo similares en estructura al sustrato verdadero (ver ejemplos
expuestos ms abajo).
41

En la inhibicin mixta, el inhibidor se puede unir a la enzima al mismo tiempo que el sustrato. Sin
embargo, la unin del inhibidor afecta la unin del sustrato, y viceversa. Este tipo de inhibicin se puede
reducir, pero no superar al aumentar las concentraciones del sustrato. Aunque es posible que los
inhibidores de tipo mixto se unan en el sitio activo, este tipo de inhibicin resulta generalmente de un
efecto alostrico donde el inhibidor se une a otro sitio que no es el sitio activo de la enzima. La unin del
inhibidor con el sitio alostrico cambia la conformacin (es decir, la estructura terciaria o la forma
tridimensional) de la enzima de modo que la afinidad del sustrato por el sitio activo se reduce.
La inhibicin no competitiva es una forma de inhibicin mixta donde la unin del inhibidor con la enzima
reduce su actividad pero no afecta la unin con el sustrato. Como resultado, el grado de inhibicin
depende solamente de la concentracin de inhibidor
MATERIALES

METODOLOGA
42

PRCTICA #. 13
CINETICA ENZIMATICA 3: EFECTO DEL PH Y TEMPERATURA

OBJETIVOS:
El alumno analizar el efecto del pH y de la temperatura sobre la actividad enzimtica en una reaccin.
Basado en:
a. Discutir el efecto sobre el comportamiento cataltico de una enzima al variar el pH de la
mezcla de reaccin.
b. Discutir los cambios que se presentan en la cintica enzimtica al variar la temperatura
de reaccin.
c. Determinar las condiciones ptimas de reaccin en funcin de estos dos factores ( pH,
temperatura).

PRE-RREQUISITOS:
1. Describir el efecto del pH sobre la estabilidad y actividad de una enzima.
2. Describir el efecto de la temperatura sobre la estabilidad y actividad de una enzima.
3. Describir el sitio activo y sitio de enlace de una enzima.
4. Describir los agentes desnaturalizantes y su mecanismo de accin sobre una enzima.
5. Explicar los conceptos de pH y temperatura ptimos de una enzima en una reaccin catalizada.

INTRODUCCION:
Es lgico pensar que el pH de una solucin influye sobre la velocidad de una reaccin catalizada por
enzimas. El sitio activo y el sitio de enlace de una enzima generalmente estn compuestos por grupos
ionizables que deben presentarse con una forma inica apropiada o especfica, de tal manera, que se
pueda mantener la conformacin adecuada de estos sitios en la enzima y pueda llevarse a cabo la unin
del sustrato y su transformacin hacia productos.
Igualmente puede existir un sustrato con grupos ionizables y debe contener una forma inica especfica
para que pueda unirse a la enzima y posteriormente se realize la catlisis. Los efectos de pH sobre la
estabilidad de una enzima se debe tomar en cuenta en cualquier estudio de efecto de pH sobre la
catlisis de sustrato.
Se observa que el pH ptimo de la reaccin enzima -sustrato es a 6.8 segn la grfica de la curva A, sin
embargo, no nos indica porque declina la velocidad por arriba y abajo de este valor.
En la curva B se observa que la preincubacin de la enzima entre pH de 5.0 - 8.0 no tiene efecto sobre la
actividad medida a pH 6.8. Por lo tanto, la interpretacin de las 2 grficas nos indica que la cada en la
actividad entre 6.8 - 8.0 y entre 6.8 - 5.0 es el resultado de la formacin de una estructura inica
impropia de la enzima y/o sustrato o los dos.
Cuando la enzima es preincubada a pH entre 5.0 - 8.0, se mantiene la actividad completa de la enzima a
6.8. Por arriba o abajo de este valor de pH resulta en inactivacin de la enzima.
La estabilidad de la enzima depende de varios factores, por ejemplo, temperatura, fuerza inica,
naturaleza del amortiguador, concentracin de iones metlicos, concentracin de sustratos o cofactores
y concentracin de enzima.
43

El ltimo factor es muy importante ya que existen algunas enzimas que a bajas concentaciones se
disocian en monmeros y que son menos estables.
Otro de los factores que afectan la velocidad de una reaccin es la temperatura, de tal suerte que un
incremento de temperatura proporciona mayor energa cintica a las molculas reactantes, dando como
resultado choques ms productivos por unidad de tiempo. La actividad cataltica de las enzimas resulta
de una estructura altamente ordenada. Si la molcula absorbe mucha energa, la estructura se rompe y
la enzima se desnaturaliza y por lo tanto pierde su actividad cataltica.
Si se grafica velocidad vs. temperatura se obtiene una curva en forma de campana, en el cual el pico se
conoce como temperatura ptima. La estabilidad a la temperatura, de una enzima depende del pH,
fuerza inica del medio, as como de la presencia o ausencia de metales. La mayora de los sustratos
ejercen un efecto de proteccin a la enzima contra la desnaturalizacin por temperatura. Las enzimas de
bajo PM compuestas de cadenas sencillas y que poseen enlaces disulfuro son ms estables al calor que
las de alto PM. Las enzimas obtenidas de un extracto crudo libre de clulas son ms estables al calor por
la alta concentracin de otras protenas (efecto protector).
MATERIAL :
1.- 14 tubos de ensaye
2.- 1 gradilla
3.- Celdas de fotocolormetro
4.- Fotocolormetro
5.- Baos de agua de temperatura controlada
6.- 3 Pipetas de 1.0 ml
7.- 2 pipetas de 5.0 ml

METODOLOGIA :
Efecto del pH
Tubo 1 2 3 4 5 6 7

8
Sacarosa 0.3 M 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
Amortiguador pH = 2.5 0.5 0 0 0 0 0 0 0
Amortiguador pH = 2.5 0 0.5 0 0 0 0 0 0
Amortiguador pH = 3.5 0 0 0.5 0 0 0 0 0
Amortiguador pH = 4.5 0 0 0 0.5 0 0 0 0
Amortiguador pH = 5.5 0 0 0 0 0.5 0 0 0
Amortiguador pH = 6.5 0 0 0 0 0 0.5 0 0
Amortiguador pH = 7.5 0 0 0 0 0 0 0.5 0
Agua 0 0 0 0 0 0 0 1.0
Mezclar e incubar a 37 C durante 2 min.
Agregar 0.5 mL de Enzima (Invertasa) a todos los tubos.
Mezclar e incubar a 25C durante 20 min.
Agregar 1 mL de Dinitrosalicilato a todos los tubos.
44

Mezclar y calentar en bao de agua a ebullicin durante 5 min. Enfriar y leer a 540 nm ajustando a cero
con el tubo No. 8
Efecto de la Temperatura
Tubo 1 2 3 4 5 6 7

Sacarosa 0.3 M 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
Amortiguaor pH = 4.7 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
Invertasa 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 0
Agua 0 0 0 0 0 0 1.0
Temperatura C 4 26 37 45 60 100 25
Mezclar e incubar 5 min a la temperatura indicada.
Agregar 1 mL de Dinitrosalicilato a todos los tubos.
Mezclar y calentar en bao de agua a ebullicin durante 5 min. Enfriar y leer a 540 nm ajustando a cero
con el tubo No. 7
RESULTADOS :
1.- Grafique los resultados obtenidos de velocidad vs pH.
2.- Grafique los resultados obtenidos de velocidad vs temperatura.
3.- Indique cuales son los valores de pH y temperatura ptimos obtenidos.
CUESTIONARIO :
1.- La pepsina presenta su mxima actividad a un pH 1. Mencione cules podran ser los grupos
funcionales presentes en el sitio activo y sobre cuales residuos de aminocidos rompe los enlaces
peptdicos.
2.- Si la concentracin de sustrato en una reaccin enzimtica es igual a un 1/3 de Km. Cul ser la
velocidad inicial de la reaccin.
3.- De acuerdo a la clasificacin de las enzimas a que clase pertenece una enzima que participa en la
conversin de un azcar de tipo aldosa a un azcar de tipo cetosa.
4.- En esta prctica se ha observado como influye el pH en la actividad de invertasa, a una concentracin
de sacarosa dada. La estaquiosa es un tetrasacrido y es un sustrato para esta enzima y se ha observado
que es hidrolizado a una velocidad igual al 5% de la sacarosa, bajo las mismas condiciones de
concentracin y pH. Cmo explicara esta velocidad mxima tan baja en relacin al pH de la reaccin. ( a-
Gal-a-Gal-a-Glu--Fru ).
5.- Cuando las soluciones enzimticas son calentadas, hay una prdida progresiva de la actividad
cataltica con el tiempo. As, una solucin de hexocinasa incubada a 45C durante 12 minutos pierde el
50% de su actividad; pero cuando la hexocinasa se incuba a 45C, en presencia de altas concentraciones
de glucosa durante el mismo tiempo, solamente se pierde un 3% de su actividad. Explique el porque de
45

la variacin desnaturalizante de la hexocinasa por efecto de la temperatura en ausencia y presencia del
sustrato.

46

PRCTICA #. 14
CUANTIFICACION DE COLESTEROL SERICO

OBJETIVO:
Determinar la concentracin de colesterol srico y analizar las implicaciones clnicas de niveles
anormales de colesterol.
PRE-REQUISITOS.
1. Estructura, funcin y tipos de colesterol
2. Relacin metablica entre el colesterol y las lipoprotenas
3. Anlisis de la digestin del colesterol esterificada y no esterificado
4. Relacin de las Lipoprotenas plasmticas con la Aterognesis.
INTRODUCCION.
El colesterol es uno de los lpidos que se encuentran en mayor concentracin en la sangre, se puede
afirmar que la fraccin lipdica del colesterol, es la segunda en cuanto a concentracin y sta se localiza
principalmente formando parte de las lipoprotenas. Qumicamente el colesterol es un compuesto
cclico con estructura bsica de perhidrofenantreno con un total de 27 carbones, un radical OH en el
carbono 3 y un doble enlace entre los carbonos 5 y 6.
El colesterol existe en dos formas: como colesterol libre en muy pequeas cantidades y como colesterol
esterificado mediante la unin de un cido graso no saturado de cadena media al carbono 3. Este tipo
de colesterol es el ms frecuente tanto en sangre como en tejidos.
La mayor parte de colesterol que existe en el organismo es sintetizado en el hgado, sto implica que el
colesterol exgeno tenga menor importancia metablica. La sntesis de colesterol endgeno es activada
en primera instancia ante el excedente de Acetil-S-CoA que haya en el hepatocito, ya que ste funciona
como metabolito precursor y en segunda instancia ante la presencia de efectores hipercolesterolmicos
que aumentan la sntesis de colesterol o bin disminuyen el catabolismo del colesterol ya formado. El
colesterol exgeno se reduce en el intestino por medio de enzimas bacterianas para dar lugar al
colestanol y as entra a la sangre en pequeas concentraciones, otra parte del colesterol exgeno se
convierte en un producto de excresin llamado coprostano que se libera con las heces.
El colesterol endgeno con frecuencia se cataboliza en el hgado y en otros rganos. El 7-
dihidrocolesterol se obtiene por oxidacin del colesterol; ste compuesto predomina en la piel y en
presencia de radiacin ultravioleta se convierte en colecalciferol que es una de las formas de vitamina D.
Otros productos del catabolismo del colesterol son los cidos biliares que en general se deben a una
carboxilacin de la cadena lateral del colesterol y sta reaccin sucede en el hgado. Entre los cidos
biliares ms comunes est el cido clico, el cido desoxiclico, cido quenodesoxiclico y el cido
litoclico. Por ltimo, otros metabolitos son la progesterona y los esteroides corticales, as como
hormonas andrognicas y estrognicas.

47


METODOLOGIA
Fundamento qumico : Esta tcnica se basa en utilizar los derivados polienos del colesterol como
elementos cromforos( que dan reaccin de color). En presencia de cido sulfrico concentrado y
anhdrido actico ( reactivo de colesterol) se producen diferentes tonalidades de color verde cuya
tonalidad es proporcional a la cantidad de colesterol presente en la muestra. Los polienos son
estructuras cclicas que resultan de la oxidacin del colesterol.
La cuantificacin de HDL colesterol se determina por mtodos de precipitacin en los cuales la
formacin de complejos insolubles se debe a interacciones entre los grupos cargados negativamente de
los polianiones y los grupos positivos de las subunidades proteicas de las lipoprotenas
TECNICA: preparar una serie de tubos de acuerdo al siguiente cuadro.
REACTIVOS Colesterol HDL Patron o Estandar Blanco
SUERO 0.05 ml. -- -- --
SOL. PATRON -- -- 0.05 ml. --
AGUA -- -- -- 0.05 mL
SOBRENADANTE* -- 0.05 ml -- --
REACTIVO DE
COLESTEROL
2.0 ml. 2.O ml 2.0 ml. 2.0 ml

*NOTA: Para adquirir sobrenadante: A 0.5 ml de suero, agregar 0.05 ml de Reactivo precipitante de
HDL-COLESTEROL, mezclar, reposar 5 minutos y centrifugar 5 min a 3000 rpm.
Mezclar y dejar que se lleve a cabo la reaccin durante 20 minutos a temperatura ambiente y aadir
en forma directa sobre la superficie del lquido 0.20 ml. de Acido sulfrico concentrado.
Colocar los tubos por separado inmediatamente despues de la adicin del cido sulfrico en un bao de
agua a temperatura ambiente y agitar suavemente. Se deben mantener los tubos en bao de agua
mnimo 5.0 minutos.
Leer la absorbancia del problema y el patrn ajustando a cero con el tubo blanco a una longitud de onda
de 640nm.
CALCULOS:
[Colesterol Total] = Abs. problema / Abs. del Patrn X [ conc. patrn mg/dl ]
[ HDL-COLESTEROL ] = Abs problema / abs patrn x [ conc. Patrn]

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PRCTICA #. 15
EXTRACCIN DE GLUCOGENO Y REACCIONES DE IDENTIFICACION DE CARBOHIDRATOS

OBJETIVO.
a) Desarrollar una tcnica de extraccin de glucgeno a partir de tejido heptico de conejo o rata y
determinar la calidad del glucgeno obtenido por medio de reacciones cualitativas de
caracterizacin.
b) Conocer las tcnicas de anlisis cualitativo que permiten identificar carbohidratos y su
utilizacin como herramienta de trabajo en ciertos experimentos.
PREREQUISITOS.
1. Identificar la composicin del glucgeno y sus diferencias estructurales y funcionales con el
almidn.
2. Diferenciar los efectos sobre el metabolismo del glucgeno de las siguientes hormonas :
Insulina, Glucagn y Adrenalina
3. Identificar las caractersticas de por lo menos tres enfermedades por almacenamiento de
glucgeno.
4. Definir el trmino carbohidrato.
5. Diferenciar los tipos de carbohidratos y mencionar ejemplos.
6. Identificar las propiedades qumicas de los carbohidratos.
INTRODUCCIN.
Los carbohidratos son derivados aldehdicos o cetnicos de alcoholes superiores polivalentes ( ms de
un OH). se clasifican en base al nmero de molculas que los componen. Monosacridos (azcares
simples) no se pueden hidrolizar en molculas ms sencillas, pueden subdividirse en triosas, tetrosas,
pentosas, hexosas etc. segn el nmero de tomos de carbono que tengan. Las siguientes reaccines
permiten identificar de manera cualitativa la presencia de cierto tipo de azucares en una muestra
problema y se utilizan en la prctica tanto clnica como vegetal.
Muchas de las pruebas que se estudiarn en el laboratorio requieren tiempo para que aparezca un
precipitado o se desarrolle un color. La mayara de las reacciones son muy sensibles, por lo que el uso de
reactivos en cantidades mayores pueden conducir a interpretaciones errneas.
El glucgeno es un polisacrido ramificado constitudo de molculas de alfa d-glucosa unidas por enlaces
glucosdicos. Es el nico polisacrido que se produce y se almacena en el humano, siendo el hgado el
principal promotor de la glucognesis que es la va metablica de dicho polisacrido.
Todas las clulas del organismo son capaces de producir glucgeno y la capacidad de sntesis de cada
clula estar dada por la cantidad de enzima glucgeno sintetasa que presenta. El hepatocito, por lo
tanto, es la clula que mayor cantidad de glucgeno sintetasa presenta.
Desde el punto de vista energtico, ste polisacrido es importante ya que por ser una fuente
almacenadora de glucosa es factible que se pueda utilizar cuando el organismo as lo requiera mediante
una va de hidrlisis del glucgeno que se conoce como glucogenolisis.
49

Tanto en la glucognesis como la glucogenolisis son vas reguladas hormonal y alostricamente. La
insulina promueve la actividad de la glucognesis y en forma directa sobre la glucgeno sintetasa y la
adrenalina activa en forma indirecta a la glucogenlisis e inhibe de la misma forma a la glucogenesis esto
es , induce la formacin de AMP-Cclico para que este a su vez active a la glucogeno-fosforilasa e inhiba
a la glucgeno sintetasa.
El mecanismo de regulacin es complejo y algunas veces puede fallar a tal grado que altera el
almacenamiento de glucgeno y generar estados patolgicos llamados glucognosis, algunos de los
cuales pueden llegar a ser fatales tales como las enferedades de Von-Gierke, Andersen, de Pompe, Mc.
Ardle, Hers, etc. Estas enfermedades se caracterizan por presentarse debido a una deficiencia congnita
de algunas de las enzimas arriba mencionadas y otras relacionadas con ellas.
MATERIAL.
1. 6 Tubos de ensaye 15 X 150 mm
2. 1 Mortero con pistilo
3. 2 Pipetas de 1.0 ml.
4. 1 Pipeta de 5.0 ml.
5. 1 vaso de precipitados
6. Gradilla.
7. Vidrio de reloj
8. Balanza granataria
9. Probeta de 100 ml.
10.- Bao de agua a ebullicin
11 Tubos de ensaye
12.- 2 Pipetas de 1.0 ml
13.- Pipeta de 5.0 ml
14.- Gradilla
METODOLOGIA:
Extraccin de Glucgeno
1. Pesar 5g de hgado y cortarlo en trozos pequeos (utilizar el vidrio de reloj).
2. Colocar unos trozos en un mortero fro al cual se le aade TCA al 10 % en proporcin de 1.0 ml
por cada gramo de tejido y una pizca de arena lavada.
3. Centrifugar 5 min. a 2000 r.p.m.
4. Recuperar el sobrenadante en un tubo de ensaye grande y medir el volmen.
5. Aadir 2 volmenes de alcohol al 95 % por volmen de sobrenadante agitando lentamente
hasta que el glucgeno flocule.
6. Centrifugar a 2 000 r.p.m. 5 Min.
7. Desechar el sobrenadante y resuspender el precipitado en 4.0 ml. de agua destilada.
8. Utilizado la suspensin de glucgeno como muestra problema, desarrolle las tcnicas de Fehling
,Lugol y Molish al mismo tiempo que los carbohidratos provedos por el profesor.

EXPERIMENTO # 1
REACCION DE FEHLING (IDENTIFICACION DE COMPUESTOS REDUCTORES )
Esta reaccin nos identifica carbohidratos con capacidad reductora, se basa en que algunos azcares en
un medio fuertemente alcalino y en presencia de oxgeno o de diversos agentes oxidantes ej. Cu, Ag dan
las reacciones de reduccin que dependen de la existencia de un grupo carbonilo libre como en la
glucosa, galactosa, fructosa, maltosa y lactosa. Si la prueba se efecta con una solucin que contenga
cloroformo como conservador, puede obtenerse un resultado positivo, sin que exista azcar, las sales de
amonio tambin interfieren en la reaccin. Si la solucin problema es cida debe neutralizarse antes de
efectuar la prueba.
50

Fundamento: si calentamos una solucin de Cu(OH)
2
en un medio alcalino formamos oxido cprico
(negro) CuO y en presencia de sustancias reductoras se precipita como oxido cuproso Cu
2
O de color
caf rojizo pardo .
Solucion A contiene sulfato de cobre .
Solucion B contiene tartrato de sodio y potasio e Hidroxido de potasio .
METODO
MUESTRA (carbohidratos sealados y glucgeno) 1.0 ml.
SOL. DE FEHLING A 0.5 ml
SOL. DE FEHLING B 0.5 ml.
MEZCLAR Y CALENTAR A BANO DE EBULLICION 5 MIN. COLOR ROJO ES POSITIVO.
EXPERIMENTO # 2
REACCION DE MOLISH-UDRANSKY.
Esta prueba es positiva con aldehidos y algunos cidos como el frmico, oxlico, lctico, ctrico, etc. Esta
reaccin es muy sensible , dicha sensibilidad para la glucosa es de hasta 0.001% y para sacarosa de
0.0001%.
METODO
MUESTRA (carbohidratos sealados y glucgeno) 1.0 ml
Reactivo de Molish 3 GOTAS
Mezclar y aadir 0.5 ml de cido sulfrico concentrado ( resbalando por la pared del tubo ) NO
mezclar.
La aparicin en la interfase de un anillo violceo es indicativo de que la prueba result positiva.
EXPERIMENTO # 3
REACCION DE SELIWANOFF
Est reaccin permite diferenciar Aldosas de Cetosas. Anote el tiempo en el cual aparece el color en
cada uno de los tubos. Una reaccin positiva est dada por la aparicin de un color rojo. Es utilizada
para diferenciar Cetosas de Aldosas ( Reaccin de Seliwanoff )
METODO
MUESTRA (carbohidratos sealados y glucgeno) 1.0 ml
REACTIVO DE SELIWANOFF 5.0 ml
Mezclar y calentar en bao de ebullicin durante 1 minuto, anote el resultado.
Las cetosas dan un color rojo y las aldosas dan la prueba dbil y lentamente.
EXPERIMENTO # 4
REACCION DEL YODO O LUGOL
51

Esta reaccin identifica los polisacridos como Amilosa, Amilopectina, Glucogeno, Almidon formando
un complejo adsortivo entre el Iodo y las cadenas helicoidales del polisacrido (enlaces alfa 1,4
glucosdicos y enlaces alfa 1,6 glucosdicos de por lo menos 8 residuos de glucosas ) .
METODO.
MUESTRA (carbohidratos sealados y glucgeno) 1.0 ml.
LUGOL 3 GOTAS
Mezclar y si es necesario calentar 2 segundos en bao de ebullicin.
La aparicin de un color azul o violeta indica la presencia de un polisacarido.
RESULTADOS
FEHLING LUGOL MOLISH
MUESTRA
GLUCGENO
AGUA

CUESTIONARIO
1. Mencione las diferencias en las propiedades qumicas de los monosacridos con los aminocidos
y los lpidos.
2. Mencione 3 funciones fundamentales de los carbohidratos en la clula, ejemplificando en cada
caso.
3. Mencione 2 homopolisacaridos y 3 heteropolisacaridos y su composicin, indicando tambin los
tipos de enlaces que presentan.
4. Defina y ejemplifique con carbohidratos los siguientes conceptos: Isomera ptica, Anomerismo,
Epimerismo.
5. Explique el mecanismo de accin de los segundos mensajeros en la regulacin hormonal y
enzimtica del metabolismo del glucgeno.
6. Describa las implicaciones bioqumicas que se presentan en la enfermedad de Von Gierke
7. Describa dos eventos bajo los cuales se puede activar la va de la glucogenolisis.

52

PRCTICA #. 16
EFECTO DE LAS COENZIMAS SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA

OBJETIVO:
Determinar cualitativamente, mediante la observacin de los grados de decoloracin; las relaciones
existentes entre la actividad de la deshidrogenasa lctica (LDH) y la presencia de nicotinamida adenin
dinucletido (NAD), en funcin de los siguientes aspectos:
a) Determinar si la actividad de LDH depende de la presencia de NAD.
b) Especificar la actividad de indicador redox del azul de metileno.
c) Aportar pruebas experimentales que demuestren que la coenzima no se modifica estructuralmente
durante la actividad de la enzima.
PRERREQUISITOS:
1.- Definir los trminos: cofactor, coenzima y metaloenzima.
2.- Mencionar las coenzimas que actan en oxidorreducciones.
3.- Explicar como afectan las coenzimas a la cintica enzimtica.
INTRODUCCION:
La mayora de las manifestaciones metablicas de un organismo, se relacionan con cambios de energa,
la cual se obtiene por la oxidacin sistemtica de los nutrientes y esto es debido a que en los procesos
de oxidorreduccin hay transferencias de energa generadas por diferencias en el potencial
elecroqumico. Un sistema de potencial elevado, oxida al de ms bajo potencial con la consiguiente
liberacin de energa para las necesidades vitales.
En todas las reacciones de oxidorreduccin, existe transferencia de electrones. La oxidacin se define
como: la prdida de electrones por parte de un compuesto, mientras que la reduccin es la ganancia de
dichos electrones por otro compuesto. Por lo tanto, la oxidacin y la reduccin son fenmenos que se
realizan en forma simultnea.
La oxidacin biolgica implica transferencia de hidrgenos y electrones a travs de una serie de sistemas
enzimticos que actan como intermediarios, para llegar al aceptor final que es el oxgeno. El proceso
oxidativo se inicia por la oxidacin de una deshidrogenasa especfica que no reacciona directamente con
el oxgeno, sino que requiere intermediarios como el NAD, las flavoprotenas y los citocrmos.

Piruvato Lactato

53

En el presente experimento, se pretende realizar un estudio cualitativo, donde se utilizar la
deshidrogenasa lctica de msculo de rata; que slo es activa en estado de anaerobiosis y requiere NAD
como intermediario para completar su actividad, la cual se manifiesta en la siguiente reaccin:
Con este experimento se pretende demostrar que: Si la LDH es una enzima que funciona normalmente,
en base a la concentracin de NAD y anerobiosis promoviendo la reduccin del piruvato en presencia de
NADH + H+; entonces, aumentando la concentracin de NAD
+
podemos revertir la reaccin para oxidar
al lactato y generar NADH + H
+
el cual reccionar con el azul de metileno y provocar su decoloracin. Si
esta premisa se cumple se habr demostrado que la concentracin de la coenzima puede regular la
direccin de la actividad de una enzima reversible.
MATERIAL :
1. 4 tubos de ensayo de 20 x 150 mm.
2. 3 pipetas de 5.0 ml.
3. 1 pipeta de 2.0 ml.
4. 1 pipeta de 1.0 ml.
5. 2 vasos de precipitado de 150 ml.
6. 1 matraz erlenmeyer de 125 ml.
7. 1 mortero con pistilo.
8. 1 bao Mara ajustado a 37C.
9. Arena lavada. (agente triturante).
10. NaCl al 0.9% (solucin isotnica para suspender clulas)
11. KCN al 0.5% (inhibidor de las deshirogenasas mitocondriales).
12. Lactato de sodio al 1.0%.(substrato de la LDH).
13. Azul de metileno 0.002 M.(indicador redox que reacciona con NAD).
14. Aceite mineral. (compuesto que al sellar los tubos promueve la anaerobiosis).
METODOLOGIA :
Preparacin de la enzima LDH:

1. Colocar 5 gr de msculo de res en un mortero previamente sumergido en hielo y aadir NaCl al
0.9% (10 ml. por gramo de tejido) y agregar un poco de arena. Triturar perfectamente.
2. Dejar reposar la mezcla en el mortero por 15 minutos.
3. Centrifugar a 3000 rpm por 15 minutos y recuperar el sobrenadante etiquetndolo como LDH.
Preparacin de la coenzima NAD:
1. Obtener otros 3 gr. de tejido muscular.
2. Cortar el msculo en fragmentos ms pequeos y ponerlo en agua a ebullicin por 5 minutos en
un matraz Erlenmeyer de 125 ml. en una proporcin de 8 ml. de agua por gramo de msculo.
3. Pasar la preparacin a un mortero con un poco de arena y triturar perfectamente.
4. Centrifugar a 3000 rpm por 15 minutos. Recuperar el sobrenadante y etiquetarlo como NAD.
Preparacin de la enzima DSC a partir de msculo cardico
1. Tomar de 2 a 3 g de msculo de corazn cortarlo en fragmentos pequeos.
2. Colocar el tejido en un mortero previamente sumergido en hielo y aadir NaCl al 0.9% en
una proporcin de 10 ml. por gramo de msculo, agregar un poco de arena lavada y triturar
perfectamente.
54

3. Dejar reposar la mezcla en el mortero por 15 min.
4. Centrifugar el homogeneizado a 3000 rpm por 15 min. Recuperar el sobrenadante y
etiquetarlo como DSC.

Deteccin de la actividad enzimtica de LDH:
Preparar una serie de cuatro tubos de ensayo como se indica a continuacin:
NOTA: se debe tener precaucin al utilizar el KCN ya que es altamente txico. utilice bureta.
TUBO 1 2 3 4
KCN 0.5% 1.0 ml 1.0 ml 1.0 ml 1.0 ml
Lactato de Sodio al
1.0%
1.0 ml 1.0 ml --------- 1.0 ml
Azul de metileno
0.002 M
0.3 ml 0.3 ml 0.3 ml 0.3 ml
Agua destilada 1.0 ml ---------- 1.0 ml 1.0 ml
Coenzima ( NAD ) -------- 1.0 ml 1.0 ml 1.0 ml
Enzima ( LDH ) 1.0 ml 1.0 ml 1.0 ml ---------

Mezclar bien el contenido de cada tubo y agregar 1.0 ml. de aceite mineral, evitando mezclarlos.
Incubar en bao de agua a 37C los tubos MANTENIENDOLOS INMOVILES y observar los grados de
decoloracin de cada solucin. Hacer estas observaciones en intervalos de 15 minutos durante 45
minutos.

55

RESULTADOS :
TUBO 1 2 3 4
15 min
30 min
45 min

DISCUSION:
1.- Relacione el efecto de cada reactivo con los resultados obtenidos.
2.- Determine si los resultados que obtiene son acordes con los esperados.
3.- Explique el fundamento qumico de la reaccin entre el azul de metileno y el NAD.
4.- Mencione los errores, si es el caso, en el planteamiento o en el manejo del experimento que
pudieran modificar los resultados.
CUESTIONARIO:
1.- Mencione las diferencias entre una enzima y un cofactor.
2.- Explique cual es el efecto del oxgeno en la actividad de las oxidasas.
3.- Mencione cinco coenzimas que acten con transferasas.
4.- Explique la relacin que existe entre algunas coenzimas y las vitaminas del complejo B.
5.- Describa la funcin del fosfato de piridoxal en la reaccin que cataliza la enzima transaminasa
glutmico oxaloactica (GOT).

56

PRCTICA #. 17
EFECTO DE LOS INHIBIDORES SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA

OBJETIVO:
Analizar el efecto inhibitorio de los compuestos qumicos malonato de sodio y oxalato de sodio, sobre la
actividad enzimtica de lactato deshidrogenasa y succinato deshidrogenasa, en base al tipo de inhibicin
que generan.
PRERREQUISITOS:
1. Explicar el trmino actividad enzimtica.
2. Describir el fenmeno de inhibicin competitiva.
3. Describir el fenmeno de inhibicin no competitiva.
4. Enumerar al menos cinco inhibidores que acten en cada tipo deinhibicin.
5. Explicar el comportamiento cintico de una enzima cuando esta bajo el efecto de ambos tipos
de inhibicin.
INTRODUCCION:
Algunos compuestos reaccionan con las enzimas disminuyendo su actividad cataltica. Este efecto se
utiliza para preparar drogas o insecticidas que inhiben selectivamente ciertas enzimas en la bacteria o
insecto infectante y que no afecte al hospedero.
La inhibicin es una de las formas ms tiles para regular la actividad de una enzima. Los estudios
logrados en base a inhibidores, han contribuido a la informacin actual sobre cintica enzimtica y
mecanismos tanto metablicos como clnicos.
Los dos tipos principales de inhibicin son: La inhibicin competitiva: donde el compuesto inhibidor
interacciona con el sitio cataltico, compitiendo con el sustrato por la unin con dicho sitio. En este caso
el grado de inhibicin depende directamente de la concentracin del inhibidor, con respecto al sustrato
especfico, por lo tanto, si la concentracin de sustrato es mayor que la del inhibidor, no se presentar el
efecto inhibitorio. Ms an, si a una enzima bajo el efecto de un inhibidor competitivo se le adiciona
mayor cantidad de sustrato, casi siempre desaparecer el efecto inhibitorio.
La mayora de los inhibidores competitivos tienen una estructura qumica semejante a la del sustrato
natural por lo tanto son muy especficos. Como el inhibidor competitivo se une al sitio cataltico, la
enzima pierde afinidad con el sustrato original y esto modifica la constante de Michaelis (Km).
La inhibicin no competitiva es aquella, donde el inhibidor se combina con la enzima, pero no con el sitio
cataltico de manera que la enzima puede unirse al sustrato y al inhibidor simultneamente. La
inhibicin ocurre porque al unirse el inhibidor provoca cambios moleculares en la enzima que
disminuyen su actividad cataltica. El aumento de la concentracin de sustrato no tiene efecto sobre el
inhibidor.
Los inhibidores no competitivos son inespecficos o sea que un mismo inhibidor puede afectar a varias
enzimas a la vez. Existen inhibidores muy complejos como el pentacloruro de mercurio, el benzoato de
57

sodio o muy simples como los iones metlicos plata, cobre, plomo y cianuro. La inhibicin no
competitiva no afecta la afinidad de la enzima por el sustrato por los que la Km se mantiene intacta.
En este caso, el complejo enzima-sustrato-inhibidor no puede disociarse y ocurre una disminucin en la
cantidad de enzima activa disponible.
MATERIAL :
1. 14 tubos de ensayo de 20 X 150 mm.
2. Cuatro pipetas de 1.0 ml.
3. Dos pipetas de .0 ml.
4. Dos pipetas Pasteur.
5. Una gradilla.
6. Solucin de succinato de sodio 0.1 M.
7. Solucin de malonato de sodio 0.1 M.
8. Solucin de azul de metileno 0.002 M.
9. Preparacin de la enzima deshidrogenasa succinica (DSC).
10. Solucin de cloruro de sodio al 0.9%.
METODOLOGIA:
En este experimento se probar el efecto inhibitorio del malonato de sodio mediante un diseo en
donde, se aumenta gradualmente la concentracin de inhibidor con respecto al sustrato, manteniendo
constante la concentracin de la enzima. La verificacin de la actividad se determinar, en referencia a
la actividad de un redox biolgico (azul de metileno) ya que las enzimas que utiliza el diseo son
oxidorreductasas.

Preparacin de DSC a partir de msculo cardico de rata.
1.- Tomar de 2 a 3 g de msculo de corazn cortarlo en fragmentos pequeos.
2.- Colocar el tejido en un mortero previamente sumergido en hielo y aadir NaCl al 0.9% en una
proporcin de 10 ml. por gramo de msculo, agregar un poco de arena lavada y triturar perfectamente.
3.- Dejar reposar la mezcla en el mortero por 15 min.
4.- Centrifugar el homogeneizado a 3000 rpm por 15 min. Recuperar el sobrenadante y etiquetarlo como
DSC.
Efecto del malonato de sodio sobre la actividad de DSC:
Preparar una serie de tubos de acuerdo al siguiente cuadro:
TUBO 1 2 3 4 5 6 7
58

Succinato de Sodio 0.1M 0.5 ------- 0.5 0.5 0.5 0.5 1.0
Azul de metileno 0.002M 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3
Malonato de sodio 0.1M ------ ----- ----- 1.5 0.5 0.25 0.25
Agua destilada 1.0 1.5 3.0 ----- 0.5 0.75 0.25
Enzima DSC 2.0 2.0 ---- 2.0 2.0 2.0 2.0

Mezclar bien el contenido de cada tubo.
Incubar en bao de agua a 37 C y observar los grados de decoloracin que genera cada tubo a los 15,
30, 45 y 60 min de incubacin.

RESULTADOS

TUBO 1 2 3 4 5 6 7
15 min
30 min
45 min
60 min

DISCUSION:
1.-Discuta el tipo de inhibicin que genera el malonato de sodio.
2.-Determine si el diseo experimental que se plantea en esta practica es el adecuado para la
diferenciacin de una inhibicin competitiva y no competitiva.
3.-Explique los cambios moleculares que genera el inhibidor no competitivo sobre la estructura de la
enzima.
CUESTIONARIO:
1.- Describa el comportamiento cintico de una enzima bajo el efecto de un inhibidor competitivo.
2.- Haga la misma descripcin para una inhibicin no competitiva.
3.- Analice las diferencias entre un inhibidor y un efector alostrico negativo.
4.- Qu tipo reacciones especficas inhiben los siguientes compuestos:
59

a.- Yodoacetato
b.- Cianuro
c.- Alopurinol
d.- Tioguanina
e.- Fluoruros
f.- 2,4-dinitrofenol
g.- Metotrexato

60

PRCTICA #. 18
DETERMINACION DE UREA Y CREATININA SERICA

OBJETIVO:
Al finalizar esta prctica, el alumno deber tener los fundamentos para poder interpretar desde el punto
de vista clnico, los resultados obtenidos de la cuantificacin de urea y creatinina de una muestra de
suero de un paciente.
PREREQUISITOS:
1.- Describir los puntos principales del ciclo de la urea.
2.- Describir los mecanismos de produccin de la cretinina.
3.- Identificar los principales tejidos productores de urea y creatinina.
4.- Interpretacin de aumento y disminucines de los analitos anteriormente analizados.
INTRODUCCION:
La urea es el principal producto de excrecin, proveniente del catabolismo de las protenas, el cual se
origina a partir de los grupos amino de los aminocidos. Esta va, es el principal medio de excrecin de
nitrgeno por el organismo. La urea es sintetizada en el hgado por medio del ciclo de la urea (descrito
en 1932 por Sir Hans Krebs y Kurt Henseleit) tambin llamado ciclo de la ornitina, cuya funcin
fundamental es convertir el amonico y el bixido de carbono en urea. Fig. 1
La urea es el producto final del metabolismo protico; sintetizada por el hgado, transferida al torrente
circulatorio y excretada por el rion.
La urea contiene en su estructura dos nitrgenos cuyo peso atmico es 28, los cuales relacionados con el
peso molecular de la urea que es 60 se obtiene una constante de 2.14 que es utilizado para convertir en
valores de nitrgeno ureico y viceversa.
Los aumentos del BUN estn relacionados con los siguientes trastornos tales como: PREREANAL en los
que se encuentra un flujo sanguneo reducido como en la insuficiencia cardaca congestiva, shock,
deplecin de agua y sal as como tambien vmito, diarrea, diuresis, sudoracin etc.
En trastornos POSTRENALES como obstrucciones del tracto urinario, hemorragia digestiva, infarto al
miocardio, stress etc.
Y clsicamente en insuficiencia renal y otras entidades tales como dieta alta en protenas y pancreatitis.
El nitrgeno urico sanguneo (BUN) esta elevado en toda lesin renal, que perturbe su funcin
excretora. La urea tambin se eleva en casos de azoemia prerrenal (elevacin de los productos
nitrogenados del metabolismo orgnico POR CAUSAS NO RENALES), que depende un bajo volumen
plasmtico circulante, como ocurre en la hemorragia masiva, deshidratacin.
Est tambin elevada en los casos que cursen con catabolia protenica elevada, acompaada de baja
eliminacin renal.
61

Cuando los niveles de urea pasan de 214 mg/100 ml, aparece depresin mental, somnolencia y
desequilibrio hidroelectroltico, y si los niveles siguen aumentando, aparece el coma urmico.

La creatinina se forma en los msculos a partir del fosfato de creatina. Un 2% de esta sustancia se
convierte diariamente en esta sustancia. Es excretada por los riones, y en pequea cantidad por las
heces. La creatinina libre que aparece en la sangre y orina no vuelve a ser utilizada. Esta se excreta en la
orina de manera constante. En condiciones fisiolgicas normales la creatinina urinaria representa la
filtracin glomerular y la excrecin tubular activa, formndose a partir de la creatina en cantidades
constantes. La creatinina normal del suero no se modifica ni con la dieta, edad, sexo, catablia
protenica ni ejercicio. Sin embargo, con una ingesta proteca sustancial, que incluye una cantidad
considerable de carne y con ejercicios intensos durante largos perodos, se han observado en sujetos
jvenes sanos, excreciones urinarias de creatinina del orden del 2.5 a 2.7 g/24 hrs., pero con niveles
sanguneos normales; por lo tanto, se deduce que los niveles sanguneos de creatinina en los sujetos
normales son ms constantes que los niveles en la orina.
La cifra normal dependiendo de la tcnica esta comprendida entre 0.5 y 1.6 mg/100 ml de suero o
plasma, y es proporcional a la masa muscular. Sus aumentos generalmente van parejos con los de la
urea, aunque la creatinina tarda ms en aumentar.
Se presentan aumentos:
62

1.BUN/Creatinina Mayor 10:1 en aporte excesivo de protenas, excesivo catabolismo tisular
(quemaduras, fiebre, tratamiento con corticosteroides), obstruccin postrenal, shock hipovolmico y en
la insuficiencia renal aguda y crnica.
2. BUN/Creatinina Menor 10:1 Escaso aporte de protenas, dialisis, deshidratacin (diarrea, vmito),
insuficiencia heptica.
MATERIAL:
1.- Fotocolormetro
2.- Bao de agua a ebullicin
3.- 2 Pipetas 5.0 ml
4.- 2 Pipetas 1.0 ml
5.- 2 Pipetas 0.1 ml
6.- 3 Tubos de ensaye 13 X 150 mm
7.- 2 Tubos de ensaye 10 X 100 mm
8.- 2 celdas de fotocolormetro
METODOLOGIA :
Tomar una muestra de sangre pos puncin venosa (3.0 ml aproximadamente) de uno de sus
compaeros, (revisar el Apndice I) con o sin anticoagulante, centrigugar la muestra ysepare el suero o
plasma segn sea el caso.
Experimento No. 1
Cuantificacin de urea srica.
Reactivos Blanco Patron Problema
Diacetilmonoxima 3 ml. 3 ml. 3 ml.
Agua 0.05 ml ----- ------
Sol. patrn o std. ----- 0.05 ml. ------
Suero o plasma ----- ----- 0.05 ml
Reactivo cido 3 ml. 3 ml. 3 ml
Mezclar y calentar en bao a ebullicin durante 10 minutos. Enfriar al chorro de agua y leer las
absorbancias ajustando con el blanco a cero a una longitud de onda de 520 nm.
CALCULOS

( )

()

63

Experimento No. 2
Cuantificacin de creatinina srica


REACTIVOS PATRON PROBLEMA BLANCO
Agua 3.5 3.5 4.0
Tungstato de sodio 10% 0.5 0.5 0.5
Acido sulfrico 0.5 0.5 0.5
Suero o plasma (ml.) --- 0.5 0.5
Sol. Patrn o estandar (ml.) 0.5 --- ---
Centrifugar los tubos Patron y Problema a 2,500 rpm por 5 min
Tomar sobrenadante y realizar lo siguiente:
REACTIVOS PATRON PROBLEMA BLANCO
Sobrenadante 3.0 3.0 3.0
NaOH 0.75 N 1.0 1.0 1.0
Acido Picrico 1.0 1.0 1.0

Reposar por 15 min a temperatura ambiente y leer absorbancia a 490 nm del tubo patrn y problema,
ajustando a cero de absorbancia con el tubo blanco.
CALCULOS

( )