Aislamiento y Evaluación de Microorganismos Celulolíticos A Partir de Residuos Vegetales Frescos y en Compost Generados en Un Cultivo de Crisantemo (Dendranthema Grandiflora)

AISLAMIENTO Y EVALUACION DE MICROORGANISMOS
CELULOLITICOS A PARTIR DE RESIDUOS VEGETALES FRESCOS Y

EN COMPOST GENERADOS EN UN CULTIVO DE CRISANTEMO
(Dendranthema grandiflora)

DIANA MARIA GAITAN BOHORQUEZ
LILIANA IBETH PEREZ PEREZ

TRABAJO DE GRADO
Presentado como requisito
Para optar al ttulo de

MICROBIOLOGA INDUSTRIAL

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIA
Bogot, D.C.
Enero de 2007
i

NOTA DE ADVERTENCIA

Artculo 23 de la Resolucin N 13 de Julio de 1946

La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus
alumnos en sus trabajos de tesis. Solo velar por que no se publique nada
contrario al dogma y a la moral catlica y por que las tesis no contengan
ataques personales contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el
anhelo de buscar la verdad y la justicia.

ii


DIANA MARIA GAITN BOHORQUEZ

APROBADO

Adriana Matiz Villamil Balkys Quevedo Hidalgo
Bacteriloga M.Sc. Ingeniera Quimica M.Sc.
DIRECTORA CODIRECTORA

Andrea Aguirre Ivonne Gutierrez
Bacteriloga M.Sc. Bacteriologa M.Sc.
JURADO JURADO
iii


DIANA MARIA GAITAN BOHORQUEZ

APROBADO

Angela Umaa Muoz, M. Phil. David Gomez Mendez, M.Sc.
Decana acadmica Director Carrera
Facultad de Ciencias Microbiologa Industrial

i

A Dios por ser mi gua, a mi familia, en especial a mi mam, mis abuelitos,
Camila y Batty por su infinito amor y compaa.
A Gustavo por brindarme su amor y orientacin como lo hace un padre.
A Liliana por su constante dedicacin, pero sobre todo por su amistad.
A Paulis, Pili y Memo por su amistad incondicional.
A Mario A. por su continuo inters, apoyo y por hacerme rer siempre.

Diana Gaitn

ii

A Dios por permitirme finalizar este trabajo.
A mis padres y hermanitos por su amor, inters, gua y continuo apoyo.
A mi Ta Nubia y Camilo por su apoyo incondicional.
A Dianis por sus enseanzas y confianza.
A la familia Bohrquez Galindo, por acogerme en su hogar.

Liliana Prez
AGRADECIMIENTOS

A la Doctora Adriana Matz, por sus conocimientos, dedicacin, paciencia y
confianza.

A la Ingeniera Balkys Quevedo, por su continua orientacin, inters y
paciencia.

Al Doctor David Gmez, por su asesoria y apoyo contino.

A cultivos del Norte, por permitirnos hacer uso de sus instalaciones.

A Viviana Gutirrez por su amistad, ayuda y conocimientos.

A Johanna Buitrago y Dolly Tenjo, por su amistad y colaboracin
permanente.

A Marcela Quintero, Martha Hernndez, Jhon Manosalva, Paula Sarmiento,
Erika Fajardo, Sandra Sarmiento, Angela Pinzn, Mnica Chvez, Sandra
Gmez, Leonardo Sastoque, Maritza Lpez por su amistad y su apoyo.

A Carlos Roa, por su paciencia y disposicin.

A todas las personas que de una u otra manera formaron parte de esta
investigacin.
vii
TABLA DE CONTENIDO

Pag.
1. INTRODUCCIN 1
2. MARCO TERICO 2
2.1 La Celulosa 2
2.2 Degradacin de la celulosa 4
2.2.1 Enzimas implicadas en la degradacin de la celulosa 4
2.2.2 Evaluacin de la Actividad Enzimtica 5
2.2.2.1 Endoglucanasas 5
2.2.2.2 Exoglucanasas 6
2.2.2.3 -glucosidasas 6
2.2.2.4 Celulasas Totales 7
2.2.3 Microorganismos Celulolticos 7
2.2.3.1 Degradacin de la celulosa por microorganismos aerobios
y anaerobios 9
2.2.4 Factores ambientales que determinan la degradacin
microbiolgica de la celulosa 10
2.2.4.1 Concentracin de Nitrgeno en el suelo 11
2.2.4.2 Temperatura 11
2.2.4.3 Aireacin 11
2.2.4.4 pH 11
2.2.5 Factores que determinan la Actividad enzimtica de las
Celulasas 12
2.2.5.1 Sinergismo 12
2.2.5.2 Adsorcin 13
2.2.6 Alternativas en el bioprocesamiento de materiales
Lignocelulsicos 13
2.2.7 Productos de degradacin de la celulosa y su utilidad industrial 13
2.2.8 Aplicacin de la glucosa a nivel industrial 14
viii

2.2.9 Determinacin de actividad celuloltica 15
2.2.9.1 Prueba cualitativa con Rojo Congo 15
2.2.9.2 Prueba cuantitativa por la tcnica del cido
3,5- dinitrosaliclico (DNS) 16
2.2.10 Cultivo de crisantemo (Dendranthema grandiflora) 17
2.2.10.1 Disponibilidad y valor comercial del Residuo Vegetal
generado en cultivos de flores (Cultivos del Norte) 18
3. FORMULACIN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIN 19
4. OBJETIVOS 20
4.1 Objetivo general 20
4.2 Objetivos especficos 20
5. MATERIALES Y MTODOS 21
5.1 Localizacin y condiciones de muestreo 21
5.2 Aislamiento e identificacin de microorganismos celulolticos 21
5.2.1 Aislamiento primario 21
5.2.2 Aislamiento secundario 22
5.3 Pruebas de antagonismo 22
5.4 Conservacin de cepas 23
5.5 Caracterizacin y procesamiento del residuo vegetal 23
5.6 Proceso de fermentacin en cultivo discontinuo 24
5.6.1 Utilizacin del sustrato vegetal por parte de los microorganismos
celulolticos seleccionados 24
5.6.1.1 Pruebas preliminares de actividad celuloltica de las cepas
seleccionadas (Individualmente) 24
5.6.1.2 Evaluacin de la actividad celuloltica de las
cepas seleccionadas (Consorcio) 25
5.7 Determinacin de azcares reductores 25
5.8 Determinacin de actividad celuloltica 26

ix

5.8.1 Solucin de carboximetilcelulosa al 1%(p/v) en buffer fosfato 0.1M
pH 7.0 26
5.8.2 Solucin de carboximetilcelulosa al 1%(p/v) en buffer cido ctrico
0.1M pH 5 27
5.9 Identificacin Bioqumica 27
5.10 Evaluacin de azcares fermentables en el extracto crudo 28
5.11 Anlisis Estadstico 28
6. RESULTADOS Y DISCUSION 29
6.1 Aislamiento de microorganismos celulolticos 29
6.2 Pruebas de Antagonismo 35
6.3 Pretratamiento del residuo vegetal 39
6.4 Evaluacin preliminar de la actividad celuloltica de las cepas
aisladas 40
6.4.1 Evaluacin preliminar de la actividad celuloltica del consorcio 41
6.5 identificacin Bioqumica 44
6.6 Utilizacin del sustrato vegetal por parte del consorcio celuloltico 47
6.6.1 Condiciones de pH y temperatura durante la fermentacin 50
6.7 Actividad enzimtica y liberacin de azcares reductores
a partir del residuo vegetal de crisantemo 51
7. CONCLUSIONES 56
8. RECOMENDACIONES 57
9. LITERATURA CITADA 58

x

INDICE DE TABLAS

Pag

Tabla 1. Bacterias con alta Actividad Especfica de celulasas 8

Tabla 2. Hongos con alta Actividad Especfica de celulasas 9

Tabla 3. Caracterizacin macro y microscpica de las cepas
con actividad celuloltica aisladas en agar CMC 1%(p/v) 30

Tabla 4. Actividad celuloltica cualitativa de las cepas aisladas
en agar CMC 1%(p/v) 30

Tabla 5. Pruebas de Antagonismo (Gauze) en agar CMC 1%(p/v) 38



Tabla 24. Identificacin Bioqumica cepa 8 44

Tabla 25. Identificacin Bioqumica Actinomiceto 46

xi

INDICE DE FIGURAS

Pag.

Figura 1. Estructura Qumica de la celulosa 3

Figura 2. Estructura de la Celulosa: regiones cristalinas y amorfas 4

Figura 3. Zonas de aclaramiento, cepa 1 en Agar CMC 1%(p/v) 31








Figura 11. Antagonismo cepa 8 frente a cepa 1 35






Figura 18. Resistencia cepa 8 36

Figura 19. Residuo vegetal de crisantemo molido 40

xii
Figura 20. Azcares reductores en el cultivo de Bacillus sp. (cepa 8)
en SVS al 10% (p/v) 42

Figura 21. Actividad enzimtica en el cultivo de Bacillus sp. (cepa 8)
en SVS al 10%(p/v), establecida bajo condiciones de
pH7 37C y pH5 50C 43

Figura 22. Azcares reductores en el cultivo de Streptomyces sp. en
SVS al 10%(p/v) 43

Figura 23. Actividad enzimtica en el cultivo de Streptomyces sp.
en SVS al 10%(p/v), establecida bajo condiciones de
pH7 37C y pH5 50C 43

Figura 24. Caractersticas macroscpicas cepa 8 en agar
CMC 1%(p/v) 44

Figura 25. Caractersticas macroscpicas Streptomyces sp.
en agar avena 5%(p/v) 45

Figura 26. Caractersticas microscpicas Streptomyces sp. 45

Figura 27. Azcares reductores en el cultivo del consorcio
(Bacillus sp. y Streptomyces sp.) en SV y SVS al 5%(p/v) 49

Figura 28. Azcares reductores en el cultivo del consorcio

Figura 29. Variacin de pH en el cultivo del consorcio

Figura 30. Variacin de pH en el cultivo del consorcio
(Bacillus sp. y Streptomyces sp.) en SV y SVS
al 10%(p/v) 51

Figura 31. Actividad enzimtica en el cultivo del consorcio
(Bacillus sp. y Streptomyces sp.) en SV y SVS al 10%(p/v)
bajo condiciones de pH7 37C 51

(Bacillus sp. y Streptomyces sp.) en SV al 10%(p/v)
bajo condiciones de pH7 37C y pH5 50C 52

xiii
(Bacillus sp. y Streptomyces sp.) en SVS al 10%(p/v)
bajo condiciones de pH7 37C 52

xiv
LISTA DE ANEXOS

Pag.

ANEXO 1. Medios de cultivo y reactivos 64

ANEXO 2. Determinacin de azcares reductotes por el mtodo
del Acido 3,5- dinitrosaliclico 66

ANEXO 3. Pruebas preliminares: Determinacin de Azcares
reductores y Actividad enzimtica cepas 1, 3,4 y 7 68

reductores y Actividad enzimtica de Bacillus sp.
(cepa 8) y Streptomyces sp. por separado y en consorcio 71

reductores y Actividad enzimtica del consorcio
(Bacillus sp y Streptomyces sp.) en cultivo discontinuo
en SV y SVS al 5 y 10%(p/v) 74

ANEXO 6. Anlisis fisicoqumico del residuo vegetal de crisantemo 76

ANEXO 7. Perfil cromatogrfico: Sobrenadante de la hora seis de
fermentacin en SV Y SVS al 10%(p/v) 77

ANEXO 8. Anlisis estadstico (SPSS, versin 14) 79
xv
RESUMEN

El presente trabajo tuvo como objetivo aislar y evaluar microorganismos
degradadores de celulosa a partir de residuos vegetales frescos y en
compost de crisantemo. Ocho cepas bacterianas mesoflicas con actividad
celuloltica a partir de residuos vegetales de crisantemo en compostaje. La
actividad celuloltica de estas cepas fue evaluada cualitativamente mediante
el revelado de halos de hidrlisis con rojo congo en medio
Carboximetilcelulosa (CMC) al 1%(p/v), posteriormente, con el objetivo de
establecer un consorcio bacteriano celuloltico se realizaron pruebas de
antagonismo para determinar si exista algn tipo de inhibicin entre stas.
La actividad celuloltica de las cepas escogidas fue evaluada mediante la
tcnica del cido 3,5-dinitrosaliclico (DNS) a partir de la cual slo una cepa
fue seleccionada para hacer parte del consorcio. Con el fin de potencializar la
actividad de dicha cepa se us un actinomiceto aislado y evaluado en otro
estudio. Estos microorganismos fueron identificados como Bacillus sp. y
Streptomyces sp.. La capacidad degradadora del consorcio sobre el residuo
vegetal de crisantemo fue evaluada en dos medios: uno con sustrato vegetal
a concentraciones del 5%(p/v) y 10%(p/v), suplementado con sales, llamado
medio sustrato vegetal suplementado (SVS) y otro, compuesto de sustrato
vegetal en las mismas concentraciones, extracto de levadura y peptona,
llamado medio sustrato vegetal (SV), determinando la concentracin de
azcares reductores liberados mediante la tcnica de DNS y la actividad
enzimtica en buffer fosfato pH7 37C y buffer cido ctrico pH5 50C. Los
resultados obtenidos mostraron que la degradacin del sustrato vegetal de
crisantemo fue mejor cuando las microorganismos actuaron en consorcio
demostrando una accin sinrgica entre sus enzimas, por otro lado, en el
medio SV en una concentracin del 10%(p/v) se di la mayor liberacin de
azucares reductores con un valor de 1.665g/L y una actividad enzimtica
de0.1056UC.
ABSTRACT

The present investigation was with the aim of isolate and evaluate cellulose
degradation by microorganisms. Eight mesophilic bacteria with cellulolytic
activity were isolation and purified from vegetable wastes of a composting
system of crisantemo. The cellulolytic activity of this microorganism was
evaluated qualitatively through hydrolysis halo using congo red and
carboximethylcellulose (CMC) 1%(w/v) as the substrate, afterwards with the
objective to create a cellulolytic bacterial association developed antagonism
test for determine if any type of inhibition existed between them. The
cellulolytic activity of the selected strain was evaluated with dinitrosalicyc acid
(DNS) method, only one microorganism was selected for the bacterial
association. With the aim of boost the bacteria activity, employed a cellulolytic
actinomycete previously isolated and evaluated in other investigation. This
microorganisms were identified as Bacillus sp. and Streptomyces sp. The
degradation capacity of bacterial association using vegetable wastes of
crisantemo was evaluated employing two broths: one of this with vegetable
waste at different concentrations (5%(w/v) and 10%(w/v)), and additional salts
(SVS), the other only with vegetable waste with the same concentrations,
yeast extract and peptone (SV) the concentration of reducing sugars was
evaluated with DNS method and the cellulose activity using CMC phosphate
buffer pH7 37C and CMC citric acid pH5 50C. The obtained results
indicated that the best degradation of vegetable wastes was using the
bacterial association, showing a synergetic cellulose degradation,
furthermore, the SV 10%(w/v) broth showed the best concentration of
reducing sugars (1.665 g/L) and cellulose activity of 0.1056 UC.
1. INTRODUCCION

La floricultura es una de las actividades ms desarrolladas en Colombia, el
crisantemo ocupa el cuarto lugar en flores de exportacin y genera durante
casi todas las etapas del proceso productivo, grandes cantidades de residuos
vegetales de difcil degradacin en el medio ambiente. Dentro del programa
de gestin ambiental de este sector los residuos slidos generados son
tratados en pilas de compostaje, sin embargo, otra alternativa biotecnolgica
es la utilizacin de microorganismos celulolticos capaces de degradar estos
residuos, con la consecuente produccin de azcares fermentables que a su
vez puedan ser usados como sustrato glicosdico natural.

Los microorganismos encargados de la degradacin de la celulosa, principal
componente de la pared celular de las plantas incluyen bacterias, hongos y
actinomycetes, aerobios, anaerobios, mesoflicos y termoflicos, los cuales
cuentan con la maquinaria enzimtica necesaria para dicho propsito, por tal
razn, su aislamiento e identificacin representa un importante recurso para
lograr la disminucin del impacto ambiental y la generacin de un sustrato
fermentable cuya utilidad podra estar en la produccin de etanol, obtencin
de cidos orgnicos, edulcorantes, productos farmacuticos y alimentos,
entre otros.

2. MARCO TERICO

2.1 La Celulosa

La celulosa es un importante constituyente carbonado de las plantas
superiores y probablemente el compuesto orgnico ms abundante en la
naturaleza. Debido a que gran parte de la vegetacin que pasa a formar
parte del suelo es celulsica, la descomposicin de este carbohidrato tiene
una importancia muy especial en el ciclo biolgico del carbono,
consecuentemente los microorganismos del suelo que catabolizan la
hidrlisis del material vegetal (40-60% de residuos de plantas) influencian el
flujo de energa desde ste hasta la formacin de CO
2
y su liberacin a la
atmsfera. Como las bacterias y hongos del suelo son los microorganismos
mayormente involucrados en el ciclaje del material vegetal, cambios en el
nmero de estos pueden indicar modificaciones en el contenido de materia
orgnica del suelo. Cuando esto se corrobora con otros indicadores
ecolgicos (biomasa y diversidad de especies encontradas) se obtiene
informacin acerca del estado del suelo y su productividad (Hendricks, et al,
1995). Como resultado, se ha prestado gran atencin a los organismos que
participan en la descomposicin de esta sustancia (Alexander, 1980).

Estructuralmente, la celulosa es un carbohidrato compuesto de unidades de
glucosa unidas en una larga cadena lineal por enlaces en los tomos de
carbono 1 y 4 de la molcula de azcar (Fig. 1)

2

Fig.1 Estructura Qumica de la celulosa (Heldt, 1997)

La celulosa existe en las plantas superiores, en las algas, en muchos tipos de
hongos y en los quistes de algunos protozoarios. El polisacrido est
localizado en la pared celular donde se encuentra como unidades
submicroscpicas de forma alargada conocidas como micelas. A su vez,
estas micelas se arreglan en estructuras ms grandes, las microfibrillas, las
cuales estn suficientemente empaquetadas para prevenir la penetracin no
slo de enzimas sino de pequeas molculas semejantes al agua (Lynd, et
al, 2002).

Una importante caracterstica de la celulosa, relativamente inusual de los
polisacridos es su estructura cristalina (Fig. 2), sin embargo, las fibras
individuales no son puramente cristalinas, lo que genera regiones amorfas
donde las fibras contienen torceduras y espacios en sus microfibrillas lo cual
permite la formacin de microporos y capilares lo suficientemente espaciosos
para permitir la penetracin de molculas relativamente grandes incluyendo,
en algunos casos enzimas celulolticas (Lynd, et al, 2002).

Las microfibrillas de celulosa estn estabilizadas por enlaces de hidrgeno
intra e intermoleculares y rodeadas por polisacridos hemicelulsicos
(manano y xilano) que se unen a la celulosa por puentes de hidrgeno y
enlaces covalentes, los cuales la hacen extremadamente resistente a la
3
hidrlisis qumica y biolgica. As mismo, las regiones amorfas de la
estructura cristalina de la celulosa tienen una composicin heterognea
caracterizada por una variedad de enlaces. Finalmente este arreglo
asimtrico que caracteriza las regiones amorfas es crucial para la
biodegradacin de la celulosa (Malherbe y Cloete, 2002)

Fig. 2 Estructura de la celulosa: regiones cristalinas y amorfas
(Guevara, et al, 2003)

2.2 Degradacin de la celulosa
2.2.1 Enzimas implicadas en la degradacin de la celulosa

El mecanismo ampliamente aceptado para explicar la hidrlisis enzimtica de
la celulosa involucra la accin enzimtica de tres enzimas: la endo -1,4
glucanasa (-1,4 glucano glucanohidrolasa), la exo -1,4 celobiohidrolasa y
la -1,4 glucosidasa (Lymar, et al, 1995; Zhang et al, 2006).

La endo - 1,4 glucanasa hidroliza aleatoriamente los enlaces - 1,4
glucosdicos intramoleculares accesibles de cadenas de celulosa para
4
producir oligosacridos de varias longitudes. La exo -1,4 celobiohidrolasa
cliva los extremos no reductores del sustrato generando unidades de
celobiosa o glucosa y por ltimo la -1,4 glucosidasa, completa el proceso
hidroltico convirtiendo los fragmentos de celobiosa a glucosa o removiendo
glucosa desde los extremos no reductores de pequeos celoligosacridos.
(Lymar, et al, 1995; Zhang et al, 2006).

2.2.2 Evaluacin de la Actividad Enzimtica

La actividad enzimtica de las celulasas puede ser medida de dos formas
bsicas:

Medicin de la actividad individual de cada celulasa (endoglucanasas,
exoglucanasas y -glucosidasas).

Medicin de la actividad total de las celulasas (Zhang et al, 2006).

2.2.2.1 Endoglucanasas

Las endoglucanasas actan al azar sobre los enlaces - 1,4 glucosdicos y
su actividad es con frecuencia medida sobre celulosa soluble con alto grado
de polimerizacin, como es el caso de la carboximetilcelulosa CMC. La
accin de las endoglucanasas sobre este sustrato celulsico se caracteriza
por la disminucin de la viscosidad realizando clivajes intramoleculares
(Zhang et al, 2006). Adems la tasa de hidrlisis est condicionada a la
habilidad de las endoglucanasas para actuar en las regiones amorfas de la
matriz cristalina de la celulosa y crear nuevos extremos reductores en los
cuales las exoglucanasas puedan actuar (Malherbe y Cloete, 2002).

5
La medicin de la actividad de endoglucanasa puede ser basada en la
reduccin de la viscosidad del sustrato y/o en el incremento de extremos
reductores que se determinan por tcnicas que permitan medir azcares
reductores. Sin embargo, la actividad de las exoglucanasas tambin
incrementa el nmero de extremos reductores por lo cual, es recomendable
que la actividad de las endoglucanasas sea medida por ambos mtodos
(viscosidad y extremos reductores) (Lynd et al, 2005).

Por otro lado, dicha actividad puede ser fcilmente detectada en medios con
CMC o celulosa y adicin de varios colorantes como el rojo congo, debido a
que estos son adsorbidos slo por largas cadenas de polisacridos. Este
mtodo es semi-cuantitativo y muy adecuado cuando se requiere procesar un
gran nmero de muestras (Ten et al, 2004).

2.2.2.2 Exoglucanasas

Las exoglucanasas clivan los extremos accesibles de la molcula de celulosa
para liberar glucosa y celobiosa. La celulosa microcristalina (Avicel) es un
sustrato adecuado para la medicin de la actividad por tener un bajo grado
de polimerizacin y una baja accesibilidad (Lynd et al, 2005; Zhang et al,
2006).

2.2.2.3 -glucosidasas

La -glucosidasa hidroliza la celobiosa soluble y otras celodextrinas con un
grado de polimerizacin superior a 6 y la posterior produccin de glucosa. La
tasa de hidrlisis disminuye con el incremento en el grado de polimerizacin
del sustrato. La actividad de esta enzima tambin puede ser medida usando
celobiosa, la cual no es hidrolizada por las endoglucanasas ni exoglucanasas
(Lynd et al, 2005).
6
2.2.2.4 Celulasas Totales

El sistema de celulasas esta conformado por endoglucanasas,
exoglucanasas y - glucosidasas, las cuales hidrolizan sinrgicamente la
celulosa cristalina. La evaluacin de la actividad de las enzimas celulolticas
es con frecuencia evaluada usando sustratos insolubles los cuales incluyen:
papel filtro Whatman N1 y celulosa microcristalina. La heterogeneidad de la
celulosa insoluble y la complejidad del sistema de celulasas causa problemas
en la medicin de la actividad total. Resultados experimentales muestran que
la estructura heterognea de la celulosa insoluble induce la disminucin en la
tasa de hidrlisis en corto tiempo (menos de una hora) provocando la
desactivacin de las celulasas (Zhang et al, 2006).

2.2.3 Microorganismos Celulolticos

Los microorganismos degradadores de celulosa incluyen hongos y bacterias,
aerobios y anaerobios, mesoflicos y termoflicos que ocupan una variedad
de habitats (Aubert, 1988). Entre los hongos celulolticos se destacan:
Trichoderma reesei, Phanerochaete chrysosporium, Fusarium solani,
Penicillum funiculosum, Trichoderma koningii, Sporotrix sp., Alternaria sp.,
Geotrichum sp., Rhizoctonia sp., Trametes sp., Paecilomyces sp. , Mucor
sp.,Cladosporium sp., Bulgaria sp., Chaetomium sp., Helotium sp.,
Aspergillus sp.. Las bacterias celulolticas ms abundantes y conocidas son
las aerobias entra las cuales se pueden citar: Cellulomonas sp., Microbispora
bispora, Thermomonospora sp. ,Cytophaga sp., Corynebacterium sp., Vibrio
sp., Bacillus sp., Pseudomonas sp.,Thermobifida sp.. Adems se encuentran
algunos anaerobios como: Acetivibrio cellulolyticus, Butirivibrio sp.,
Bacteroides cellulosolvens, Bacteroides succinogenes, Clostridium
cellulovorans, Clostridium thermocellum, Ruminococcus albus,
Ruminococcus flavefaciens (Lynd, et al, 2002). Entre los actinomicetes se
7
destacan: Streptomyces drozdowiczii, Streptomyces cellulolyticus (Semedo,
et al., 2004; Grigorevski, et al., 2005; Li, 1997), Themomonospora curvata,
Thermomonospora chromogena, Thermomonospora alba y Thermomobifida
fusca (Ramrez y Coha, 2003).

El pH ptimo para la actividad de las celulasas producidas por bacterias
abarca un amplio rango, el cual incluye condiciones cidas y alcalinas. (Tabla
1). Por otro lado, las celulasas producidas por hongos requieren
generalmente un pH cido (Tabla 2).

Tabla 1. Bacterias con alta Actividad Especfica de celulasas

Microorganismo

Actividad Especfica (mol.min
-1
.mg
-1
)

pH ptimo
Bacillus subtilis 514 5-7
Clostridium thermocellum 428 7
Streptomyces murinus 6.7 6
Bacillus macerans 5030 6
Bacillus sp. 369.6 9
(Howard et al., 2003)

8
Tabla 2. Hongos con alta Actividad Especfica de celulasas.

Microorganismo

Actividad Especfica
(mol.min
-1
.mg
-1
)

pH ptimo
Sclerotium rolfsii 475 3.3
Aspergillus niger 194 5
Achlya bisexualis 7840 6
Orpinomyces sp. 3659 5.8
Rizhopus chinensis 4800 ND
Penicillium
brefeldianum
405 4.2

(Howard et al., 2003)
N.D. No determinado

2.2.3.1 Degradacin de la celulosa por microorganismos aerobios y
anaerobios

Existe una diferencia fundamental en el mecanismo de hidrlisis de la
celulosa entre bacterias y hongos aerobios y anaerobios. Los hongos y
bacterias aerbicos caractersticamente cuentan con un sistema de celulasas
no complejo lo cual, conlleva a la secrecin de enzimas hidrolticas de
celulosa en el medio de cultivo. Sin embargo, bacterias anaerbicas
especialmente Clostridium spp. y hongos del gnero Neocallimastix,
Piromonas y Sphaeromonas contienen un sistema de celulasas que forman
un complejo donde las enzimas que degradan la celulosa estn contenidas
en una membrana llamada celulososoma. Esta fundamental diferencia tiene
implicaciones en el uso biotecnolgico de estos microorganismos, pues las
basadas en bacterias y hongos anaerobios pueden tener ventajas sobre los
sistemas aerbicos en trminos de eficiencia hidroltica. El sistema de
celulasas dispuestas en un complejo permite un alto grado de coordinacin
entre las enzimas involucradas en la hidrlisis de la celulosa lo que permite
9
evitar la prdida de los intermediarios durante la degradacin por los cambios
en las condiciones ambientales (Malherbe y Cloete, 2002).

En los sistemas aerbicos donde se requiere una agitacin y aireacin
continuas, la prdida de las enzimas secretadas y de los intermediarios de
degradacin puede afectar la eficiencia del proceso. Sin embargo, los
microorganismos aerobios ganan ms energa de la glucosa que los
anaerobios (38 moles de ATP vs 2-4 moles de ATP por cada mol de glucosa)
por lo tanto, la aparente eficiencia hidroltica de los microoganismos
aerbicos es benfica en cuanto a ganancia energtica. Sin embargo, dado
los bajos requerimientos tcnicos para la aplicacin de microorganismos
anaerbicos comparados con los sistemas aerbicos (ausencia de agitacin
vigorosa para facilitar la aireacin y tecnologas para el control de flujo) el uso
de hongos y bacterias anaerobios en proyectos de biorremediacin pueden
ser ms atractivos por el bajo costo que requieren y la alta eficiencia de la
maquinaria hidroltica sobre la celulosa (Malherbe y Cloete, 2002).

2.2.4 Factores ambientales que determinan la degradacin
microbiolgica de la celulosa

La tasa a la cual se metaboliza la celulosa est dada por varios factores del
medio ambiente, y los suelos que varan en sus caractersticas fsicas y
qumicas poseen marcadas diferencias en su capacidad celuloltica. Los
principales factores del medio ambiente que afectan la transformacin son el
nivel de nitrgeno disponible, la temperatura, aireacin, humedad, pH, la
presencia de otros carbohidratos y la proporcin relativa de lignina en los
restos vegetales ( Alexander, 1980).

10
2.2.4.1 Concentracin de Nitrgeno en el suelo

La aplicacin de nitrgeno inorgnico aumenta la descomposicin de la
celulosa en el suelo y tanto las sales de amonio como las de nitrato son
buenas fuentes de este elemento. La respuesta a ste indica que el nivel de
nitrgeno en el suelo es un factor limitante (Alexander, 1980).

2.2.4.2 Temperatura

La utilizacin biolgica de la celulosa puede llevarse a cabo desde
temperaturas cercanas a la congelacin hasta alrededor de los 65C. Cada
una de las variedades de organismos celulolticos es afectada en forma
diferente por la temperatura. Los mesfilos dominan en temperaturas
moderadas mientras que la microflora termoflica puede degradar la celulosa
por arriba de los 45C. Debido a los cambios en la composicin de la flora
inducidos por la temperatura, el calor aumenta la velocidad de transformacin
del sustrato a causa del efecto directo de sta sobre la accin enzimtica
(Alexander, 1980).

2.2.4.3 Aireacin

La aireacin tambin rige la composicin de la flora activa. A causa del
proceso anaerbico, el metabolismo de la celulosa es reducido
significativamente en medios deficientes de oxigeno en comparacin con
habitats aireados (Alexander, 1980).

2.2.4.4 pH

En medios con pH entre neutro y alcalino, muchos microorganismos son
capaces de crecer y liberar las enzimas apropiadas para la hidrlisis del
11
polisacrido; bajo condiciones cidas la desaparicin de la celulosa se debe
principalmente a los hogos filamentosos. Aunque el proceso es rpido a pH
menor de 5 y ocasionalmente por debajo de 4, los suelos con bajas
concentraciones del ion hidrgeno degradan la celulosa ms fcilmente
(Alexander, 1980).

2.2.5 Factores que determinan la Actividad enzimtica de las celulasas

Diversos factores asociados con la naturaleza del sistema enzimtico de las
celulasas ha sido sugerido por influenciar el proceso hidroltico. Estos
incluyen: inhibicin del complejo de celulasas por el producto final,
inactivacin trmica, sinergismo e irreversible adsorcin de las enzimas,
teniendo estos ltimos la mayor influencia en la tasa de degradacin del
polisacrido (Mansfield et al, 1999).

2.2.5.1 Sinergismo

El sinergismo ocurre cuando la accin combinada de dos o ms enzimas
aumenta la tasa de accin sobre el sustrato respecto a la accin individual.
Se han hecho estudios en los que se ha observado una actividad cooperada
de las celulasas de Trichoderma reseei en el que las endoglucanasas actan
al azar a lo largo de las cadenas de celulosa generando sitios donde actan
las exoglucanasas las cuales liberan celobiosa como producto principal, una
tercera enzima, la -glucosidasa es necesaria para hidrolizar la celobiosa
previniendo de esta manera la inhibicin de las exoglucanasas por
acumulacin de producto y por tanto generando un aumento en la tasa
hidroltica. (Mansfield et al, 1999)

12
2.2.5.2 Adsorcin

La hidrlisis de la celulosa difiere de otras reacciones enzimticas en que el
sustrato es insoluble y requiere una previa adsorcin de la enzima al
sustrato. La adsorcin de las celulasas es facilitada por la presencia de
dominios en el sustrato los cuales son susceptibles al clivaje proteoltico
mediante uniones por fuerzas de van der waals y puentes de hidrogeno.
Adems dichos dominios cuentan con aminocidos aromticos que confieren
una especificidad adicional y estabilidad al complejo enzima - sustrato
(Mansfield et al., 1999).

Existen dos teoras para explicar la interaccin de los dominios con la
celulosa. La primera se basa en que los dominios incrementan la
concentracin local de enzimas en la superficie de la celulosa, la segunda
propone que los dominios son un instrumento que permite el rompimiento de
cadenas de celulosa cristalina pero no de celulosa amorfa (Mansfield et al.,
1999).

2.2.6 Alternativas en el bioprocesamiento de materiales lignocelulsicos

Los materiales lignocelulsicos pueden ser tratados aplicando estrategias
que incluyen: tratamiento anaerbico, compostaje, produccin de protena
celular para la alimentacin de animales rumiantes y cultivo de champin
(Howard et al., 2003).

2.2.7 Productos de degradacin de la celulosa y su utilidad industrial

Las bacterias aerobias generalmente convierten la celulosa en dos productos
principales: CO
2
y biomasa. No existen acumulaciones significativas de
intermediarios carbonados y la concentracin de cidos orgnicos raramente
13
alcanza un nivel apreciable. Por otro lado, en condiciones anaerobias las
bacterias son incapaces de metabolizar completamente dicho sustrato,
siendo los principales productos de acumulacin, CO
2
, CH
4
, H
2
, etanol y
cidos actico, frmico, succnico, butrico y lctico (Alexander, 1980).

La celulosa es empleada a nivel industrial en la manufactura de papel y
cartn, telas, pelculas fotogrficas, celofanes, explosivos, diluyentes,
jabones, aromas y alimentos (Alexander, 1980).

En Colombia se han adelantado diferentes investigaciones en bsqueda de
nuevas alternativas para la utilizacin de celulosa fibra, entre estas:

Diseo, frmula, elaboracin y evaluacin de un excipiente
coprocesado a base de celulosa fibra para la elaboracin de formas
farmacuticas slidas (tabletas) por el mtodo de compresin directa
(Snchez y Zuluaga, 1999).

Utilizacin de residuos vegetales generados en el sector floricultor
nacional en la elaboracin de papel manual (Prez, 1996).

Obtencin de etanol como biocombustible a partir de residuos
lignocelulsicos y amilceos mediante ensayo de hidrlisis y
fermentacin de azcares (Tellez y Pava, 2003).

2.2.8 Aplicacin de la glucosa a nivel industrial

La glucosa, por ser un producto que posee diferentes caractersticas, entre
ellas el ser edulcorante, preservativo de la humedad, inhibidor frente a
levaduras y mohos, estabilizador de la viscosidad, etc, tiene gran aplicacin
en la industria farmacutica y de alimentos. La caracterstica reductora de la
14
glucosa referida a la capacidad de su grupo carboxilo para reaccionar como
tal, esta directamente relacionado con la capacidad de formar colores, y
aromas de tostado por la reaccin con las protenas (Forero, 1986).

Industria de alimentos: En confitera como agente anti cristalizador, en
produccin de jaleas y mermeladas previene la cristalizacin del azcar,
en la elaboracin de productos horneados de panadera se utiliza para
dar volumen, endulzar y prolongar la vida til de los productos.

Industria Farmacutica: Es utilizada como excipiente en la elaboracin de
jarabes y grageas, hace parte de la formulacin de algunos sueros orales,
etc.

Produccin de etanol como biocombustible

Produccin de cidos orgnicos (Forero, 1986).

2.2.9 Determinacin de actividad celuloltica

2.2.9.1 Prueba cualitativa con Rojo Congo

Diferentes procedimientos utilizados en la identificacin y enumeracin de
los microorganismos capaces de utilizar la celulosa han sido descritos;
siendo la base de estos la hidrlisis de sustratos celulsicos. La utilizacin de
medios lquidos que contienen celulosa permiten estimar cualitativa y
cuantitativamente los microorganismos degradadores, los medios slidos son
generalmente ms usados pero en estos las colonias de microorganismos
que utilizan el sustrato son con frecuencia difciles de diferenciar de otros
microorganismos que no lo hacen. Teather y Wood en 1982, observaron que
el rojo congo poda ser usado en los ensayos para evidenciar la hidrlisis de
15
polisacridos debido a que el colorante forma complejos con las molculas
an no hidrolizadas, facilitando as la diferenciacin entre microorganismos
celulolticos y no celulolticos por la formacin de zonas de aclaramiento
alrededor de las colonias (Hendricks, et al., 1995).

2.2.9.2 Prueba cuantitativa por la tcnica del cido 3,5- dinitrosaliclico
(DNS)

La actividad del sistema enzimtico en el complejo celuloltico puede medirse
determinando la cantidad de glucosa liberada mediante DNS. Esta tcnica
demuestra la presencia del grupo carbonilo libre (C=O) de los azcares
reductores que implica la oxidacin del grupo funcional aldehdo de la
glucosa (Miller,1959).

En este mtodo el cido 3,5- dinitrosaliclico es reducido a cido 3-amino-5-
nitrosaliclico, mientras que los grupos aldehdos son oxidados a grupos
carboxilos. La reduccin del cido genera un color amarillo el cual es
proporcional a la concentracin del azcar reductor presente y se evidencia
por medio de la lectura de absorbancias en el espectrofotmetro lo que
implica la aplicacin de la ley de Beer Lambert (Miller,1959).

La lectura de la prueba de DNS es altamente influenciada por las mismas
condiciones de la prueba, como la temperatura del agua de calentamiento, la
transferencia de calor, el tiempo de reaccin, la proporcin de glucosa,
celobiosa y celodextrinas presentes y el tiempo de preparacin del reactivo,
el cual con frecuencia es ignorado (Zhang et al., 2006).

16
2.2.10 Cultivo de crisantemo (Dendranthema grandiflora)

Uno de los cultivos que actualmente genera el mayor nmero de divisas
dentro de las exportaciones no tradicionales colombianas es el de la
floricultura. En un perodo no superior a diez aos, Colombia se ha
convertido en el segundo exportador mundial (despus de Holanda) de flores
cortadas, con una participacin del 10% sobre el total de las exportaciones
mundiales. Ms de 50 tipos diferentes de flores, entre las cuales se destacan
el clavel, el pompn, la rosa y el crisantemo se cultivan principalmente en la
Sabana de Bogot, el Oriente Antioqueo y el Valle del Cauca siendo sus
principales mercados Estados Unidos (80%) y la Unin Europea (14%).
(http://www.unalmed.edu.co/~prensa/impro4.htm).

El crisantemo (Dendranthema grandiflora) es un hbrido complejo
perteneciente a la familia Asteraceae y engloba flores de las ms antiguas
cultivadas en Colombia. Las hojas pueden ser lobuladas o dentadas,
ligulosas o rugosas, de color variable entre el verde claro y oscuro,
recubiertas de un polvillo blanquecino que le da un aspecto grisceo (Stace,
2003; Santana, et al, 2002).

La propagacin se realiza por esquejes terminales que se obtienen de
plantas madre seleccionadas por su conformacin a la progenie, capacidad
de cosecha y vigor mantenidas bajo condiciones de da largo para inhibir la
formacin de botones finales. Los esquejes terminales de 8-10cm de longitud
pueden colocarse directamente en el medio para enraizamiento o
almacenarse a 0-3C durante unas seis semanas, en cajas de cartn
forradas con polietileno para evitar la deshidratacin (Vidiale, 1983). Entre los
sustratos utilizados en el proceso de enraizamiento se destacan: perlita,
vermiculita, arena, turba o mezclas de estos. En la sabana de Bogot se
17
emplean productos naturales como cascarilla de arroz o escoria (Santana, et
al,2002).

En cuanto a sus requerimientos nutricionales el crisantemo es un cultivo
bastante exigente en lo referido a las cantidades de nitrgeno, fsforo y
potasio necesarias para la obtencin de flores y plantas de ptima calidad.
Cuando existen deficiencias, aplicaciones moderadas no logran remediar los
trastornos ocasionados, por lo cual, luego de la siembra de los esquejes se
recomienda utilizar fertilizantes con alto contenido en nitrgeno, potasio y
otros microelementos, manteniendo un pH entre 55.5 y 6.5 (Santana, et al.,
2002).

2.2.10.1 Disponibilidad y valor comercial del Residuo Vegetal generado
en cultivos de flores (Cultivos del Norte).

Durante la actividad de cosecha realizada en cultivo de flores (Cultivos del
Norte) se generan aproximadamente cuatro toneladas de residuos vegetales
al mes, dichos residuos son acumulados y posteriormente llevados en su
totalidad a pilas de compostaje; con el fin de obtener abono orgnico utilizado
en la adecuacin de los suelos, por lo cual en este caso los residuos
vegetales no tienen ningn valor comercial. (comunicacin verbal)

18
3. FORMULACIN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIN

Actualmente una gran cantidad de residuos de celulosa que puede ser
medida en billones de toneladas son producidos en el mundo entero como
resultado de actividades en la agricultura y la industria.

En Colombia, el cultivo de flores representa una fuente importante de dichos
residuos, se cultivan ms de 50 tipos diferentes, del total de las
exportaciones colombianas de flores para el ao 2001 la participacin fue de
24.7% de rosa, 21.4% de clavel estndar, 11.3% de mini clavel y 2.3% de
crisantemo. Actualmente este sector libera altos volmenes de residuos
vegetales que dificultan su manejo y debido a su lenta degradacin se
convierten en un problema de alto impacto ambiental (prdida de espacio
fsico, impacto paisajstico, generacin de plagas, etc) (Asocolflores, 2001)

La utilizacin de microorganismos con actividad celuloltica representa una
de las opciones con mayor viabilidad en la solucin de esta problemtica ya
que el costo de inversin es bajo y se da un uso adecuado a dichos residuos
obteniendo un sustrato que puede ser aprovechado como fuente de carbono
en produccin industrial.

En el presente trabajo se plantea el aislamiento e identificacin de consorcios
microbianos con actividad celuloltica, a partir de residuos celulsicos
generados en un cultivo productor de crisantemo (Dendranthema
grandiflora), tiles en la degradacin celulsica de residuos vegetales y
adems generadores de sustratos glucosdicos que pueden ser empleados
en la obtencin de etanol, cidos orgnicos, edulcorantes, alimentos e
industria farmacutica.

19
4. OBJETIVOS

4.1 Objetivo general

Aislar y evaluar microorganismos degradadores de celulosa a partir de
residuos vegetales frescos y en compost generados en un cultivo de
crisantemo (Dendranthema grandiflora).

4.2 Objetivos especficos

Aislar e identificar microorganismos con actividad celuloltica a partir
de residuos vegetales frescos y en compost provenientes de un cultivo
de crisantemo (Dendranthema grandiflora).

Seleccionar los microorganismos que presenten mayor actividad
celuloltica y realizar banco de cepas.

Realizar pruebas de antagonismo entre las cepas que presenten
mayor actividad celuloltica.

Evaluar actividad celuloltica del consorcio microbiano aislado
utilizando como sustrato residuo vegetal con y sin suplemento, a una
concentracin del 5%(p/v) y 10%(p/v).

20
5. MATERIALES Y MTODOS

5.1 Localizacin y condiciones de muestreo

El muestreo del residuo vegetal se realiz a partir de residuos frescos y en
compostaje de un cultivo de crisantemo (Dendranthema grandiflora)
localizado en el municipio de Tocancip, ubicado a 2606 m.s.n.m cuya
temperatura promedio es de 13C y una humedad relativa del 80%
(http:/www.alcaldiatocancipa.gov.co)

Se tomaron en forma aleatoria cinco submuestras de residuo fresco de 1
semana de almacenamiento, de 100g cada una, registrando una temperatura
de 18C; en el caso de los residuos en degradacin se muestrearon
diferentes puntos de la pila de compostaje de 4 semanas de degradacin,
registrando una temperatura de 50C y un pH de 8.6. Los residuos vegetales
fueron recolectados manualmente con ayuda de un barreno y depositados en
bolsas de polipropileno, que posteriormente fueron llevadas al laboratorio de
Biotecnologa Aplicada de la Pontificia Universidad Javeriana y mantenidas
en nevera a 4C, mientras fueron procesadas.

5.2 Aislamiento e identificacin de microorganismos celulolticos

5.2.1 Aislamiento primario

Se pesaron 10g de las muestras de residuos vegetales frescos y en
compostaje, cada uno de los cuales fueron llevados a 90ml de agua
peptonada 0.1%(p/v). Posteriormente se realizaron diluciones seriadas de
10
-1
a 10
-5
en agua peptonada a 0.1%(p/v). A partir de las diluciones
preparadas se realiz siembra en superficie en agar Carboximetilcelulosa
(CMC) al 1%(p/v) (Anexo 1). Las cajas fueron incubadas a 35
o
C por 48
21
horas. Transcurrido el tiempo de incubacin se adicion rojo congo al
1%(p/v) (Anexo 1) como revelador a las colonias presentes en los medios,
luego de quince minutos se retir el exceso y se adicion NaCl 0.1M (Anexo
1), dejando reposar por quince minutos ms, para luego hacer el recuento de
las colonias que presentaron halos de hidrlisis (Teather y Wood, 1982).

5.2.2 Aislamiento secundario

A partir de los microorganismos obtenidos en el aislamiento primario se
realizaron repiques en agar CMC al 1%(p/v) de las colonias que presentaron
actividad celuloltica, llevando a incubacin y revelado bajo las mismas
condiciones del aislamiento primario.

5.3 Pruebas de antagonismo

Para llevar a cabo las pruebas de antagonismo se sigui el mtodo de
Gauze, para lo cual se prepar una suspensin en solucin salina 0.85%
(p/v) de 10ml de cada uno de los microorganismos seleccionados por
presentar mayor actividad enzimtica, igualando la concentracin al tubo uno
del patrn de Mc Farland (3x10
8
cel/ml) y llevando a incubacin a 100 rpm,
35C durante 14h. (Moreno et al, 2000). Por triplicado se dispusieron sobre
agar CMC al 1%(p/v), 2%(p/v) y 3%(p/v) (con siembra masiva del
microorganismo a enfrentar), anillos plsticos estriles de un centmetro de
dimetro de tal modo que una parte del anillo qued dentro del agar sin tocar
la base de la caja de petri. Dentro de los anillos se inocul una suspensin de
50l del microorganismo antagonista. Control negativo: anillo con agua
destilada estril. Teniendo como criterio de seleccin halos mayores a 5mm
(Gauze, 1967).

22
5.4 Conservacin de cepas

Las cepas seleccionadas en la pruebas de antagonismo fueron sometidas a
tincin de Gram y una vez definidas sus caractersticas microscpicas se
procedi a obtener cultivos axnicos en agar CMC 1%(p/v). Se llevaron a
cabo suspensiones de cada una de las cepas en caldo celulosa al 1%(p/v)
(composicin igual a agar celulosa excepto agar) igualando la concentracin
al tubo 1 del patrn de Mc. Farland (3*10
8
cel/ml). Estas suspensiones se
mezclaron con glicerol a una concentracin final de 25% (v/v), posteriormente
las suspensiones celulares fueron distribuidas en tubos eppendorf, cada uno
conteniendo un volumen de un mililitro que luego fueron almacenados a
20C (Poutou, et al., 1994).

5.5 Caracterizacin y procesamiento del residuo vegetal

Los residuos vegetales frescos provenientes del cultivo de crisantemo fueron
sometidos a una caracterizacin fsico-qumica en AGRILAB, laboratorio de
anlisis qumicos e insumos agrcolas certificado como laboratorio de
referencia por el ICA. Para el procesamiento de dicho residuo se llev a cabo
el siguiente protocolo: lavado con agua para retirar partculas de suelo,
reduccin de tamao mediante picado, lavado con SDS (Sodio Dodecil
Sulfato) al 1%(p/v) ebullicin por un perodo de media hora con SDS al 1%
(p/v), secado a 55C y finalmente molienda en molino Industrial. (Guevara, et
al., 2003)

23
5.6 Proceso de fermentacin en cultivo discontinuo

5.6.1 Utilizacin del sustrato vegetal por parte de los microorganismos
celulolticos seleccionados

Para la realizacin de este proceso se emplearon dos medios: uno con
sustrato vegetal a concentraciones del 5%(p/v) y 10%(p/v) junto con los
componentes del caldo celulosa exceptuando la carboximetilcelulosa,
llamado medio sustrato vegetal suplementado (SVS) (Anexo 1) y otro,
compuesto de sustrato vegetal en las mismas concentraciones, extracto de
levadura (2.5g/L) y peptona (2.5g/L) llamado medio sustrato vegetal (SV)
(Anexo 1).

5.6.1.1 Pruebas preliminares de actividad celuloltica de las cepas
seleccionadas (Individualmente)

Las curvas preliminares para evaluar el comportamiento enzimtico y la
subsecuente liberacin de azcares reductores utilizando las cepas aisladas
y seleccionadas en las pruebas de antagonismo, se llevaron a cabo en caldo
CMC al 1%(p/v), 3%(p/v) y 5%(p/v) y SVS al 10%(p/v).

Inicialmente estas cepas fueron reactivadas del banco en cajas de agar CMC
al 1%(p/v) e incubadas a 35C durante 48 horas. A partir de cada cepa se
hizo un raspado en caldo CMC 1%(p/v) llevando a una concentracin de 3 x
10
8
cel/ml e incubando a 35C y 120rpm durante 24 horas. Las
fermentaciones se llevaron a cabo por triplicado en un VET de 250ml
adicionando el 10% de inculo, con un tiempo de duracin entre 18 y 24
horas, a 35C y 120rpm, muestreando cada dos horas hasta completar el
tiempo de fermentacin. En cada una de las horas de muestreo. En cada una
de las horas de muestreo se realiz la determinacin de azcares reductores
24
por triplicado mediante la tcnica de DNS (Numeral 5.7). Adems se evalu
Actividad enzimtica en CMC al 1%(p/v) en buffer fosfato pH7 37C y buffer
acido ctrico pH5 50C relacin 1:1 (numeral 5.8) con tiempos de reaccin
enzima-sustrato de 30, 60 y 120, realizando cada una de estas
evaluaciones por triplicado.

5.6.1.2 Evaluacin de la actividad celuloltica de las cepas
seleccionadas (En consorcio)

Para evaluar la actividad hidroltica de las cepas en consorcio se realizaron
fermentaciones en caldo CMC al 1%(p/v), caldo SV y SVS en
concentraciones del 5%(p/v) y 10%(p/v), cada uno, con un VET de 1000ml, .
adicionando 10% de inculo repartido en volmenes iguales de cada cepa a
evaluar ; incubando a 35C y 120 rpm durante 18-24 horas. La biomasa
inicial fue determinada mediante recuento en placa, en el caso de bacterias y
recuento de conidios en cmara de Neubawer, para microorganismos
filamentosos. A partir de los muestreos realizados la determinacin de
azcares reductores mediante DNS (numeral 5.7) y actividad enzimtica en
CMC al 1%(p/v) en buffer fosfato pH7 37C y CMC al 1%(p/v) en buffer cido
ctrico pH5 50C, relacin 1:1 (numeral 5.8) con tiempo de reaccin enzima-
sustrato de 60 minutos.

5.7 Determinacin de azcares reductores

Las muestras tomadas en cada hora de fermentacin fueron inmediatamente
centrifugadas durante 20 minutos a 100rpm, a partir del sobrenadante
obtenido se tom un volumen de 0.25ml, al cual se adicion 0.25ml de DNS
(Anexo 2), esta mezcla se someti a ebullicin por 5 minutos, transcurrido
este tiempo, la mezcla se llev a un recipiente con hielo durante 5 minutos y
posteriormente se adicionaron 2.5ml de agua destilada. Esta solucin fue
25
leda en el espectrofotmetro a una longitud de onda de 540nm y sensibilidad
media, para registrar la absorbancia generada, la cual se reemplaz en la
ecuacin de la lnea recta arrojada por la curva patrn previamente realizada
(Anexo2), para la obtencin de la concentracin de glucosa residual en cada
hora de muestreo (Miller, 1959).

5.8 Determinacin de actividad celuloltica

Se prepararon dos soluciones de carboximetilcelulosa al 1%(p/v) en buffer
fosfato 0.1M pH 7 y buffer cido ctrico pH5 (Anexo 1).

5.8.1 Solucin de carboximetilcelulosa al 1%(p/v) en buffer fosfato 0.1M
pH7

Se tom 1ml de extracto crudo correspondiente a cada tiempo de muestreo
en cada una de las fermentaciones para hacerlos reaccionar con 1ml de la
solucin carboximetilcelulosa - buffer fosfato pH7. Dicha preparacin se
realiz por triplicado para evaluar la reaccin enzima-sustrato durante el
tiempo de reaccin establecido para cada curva, incubando a 37C en bao
termostatado. Transcurrido el tiempo de incubacin las muestras fueron
llevadas a un recipiente con hielo durante diez minutos para detener la
reaccin enzimtica, posteriormente se centrifugaron por 20 minutos a 100
rpm. A partir de los sobrenadantes se tomaron 0.25ml adicionando 0.25ml
de DNS, la mezcla fue puesta en ebullicin por 5 minutos para luego
detener la reaccin en hielo por 10 minutos luego, se adicionaron 2.5ml de
agua destilada y finalmente de hizo la lectura de las absorbancias
generadas en el espectrofotmetro a 540nm, sensibilidad media,
registrando los valores obtenidos para luego reemplazarlos en la curva
patrn de DNS (Anexo 2) (Dvila, et al, 2002).

26
5.8.2 Solucin de carboximetilcelulosa celulosa al 1%(p/v) en buffer
cido ctrico 0.1M pH5

La determinacin de la actividad enzimtica con buffer cido ctrico pH5. (se
llevo a cabo haciendo reaccionar 1ml de extracto crudo correspondiente a
cada hora de muestreo con 1ml de la solucin de celulosa en buffer cido
ctrico pH5. Esta preparacin se realiz por triplicado para evaluar la reaccin
enzima-sustrato durante 60 minutos a 50C. Transcurrido cada tiempo de
incubacin se detuvo la reaccin en hielo por 10 minutos para
posteriormente ser centrifugado por 20 minutos a 100rpm. A partir del
sobrenadante se tom 0.25ml adicionando 0.25ml de DNS, la mezcla se llev
a ebullicin por 5 minutos, posteriormente se paso a hielo por 10 minutos y
por ltimo se adicionaron 2.5ml de agua destilada realizando las lecturas de
absorbancia en el espectrofotmetro a 540nm, sensibilidad media registrando
los valores obtenidos para luego reemplazarlos en la curva patrn de DNS
(Anexo 2) (Adrado, et al, 2005).

5.9 Identificacin Bioqumica

La identificacin bioqumica se realiz a los dos microorganismos que
finalmente fueron seleccionados para conformar el consorcio microbiano
celuloltico, por presentar la mejor actividad hidroltica sobre el sustrato
evaluado. Las cepas fueron identificadas macroscpica y
microscpicamente, as mismo se realiz la evaluacin del comportamiento
metablico de acuerdo con el Manual de Bergeys de Bacteriologa
Sistemtica.

27
5.10 Evaluacin de azcares fermentables en el extracto crudo

El extracto crudo correspondiente a la hora seis de fermentacin en SV y
SVS al 10%(p/v), obtenido como resultado de la actividad hidroltica del
consorcio celuloltico definitivo, fue evaluado mediante cromatografa lquida
en el laboratorio de Ingeniera Qumica de la Universidad Nacional de
Colombia, con el fin de determinar la concentracin de azcares reductores
presentes.

5.11 Anlisis Estadstico

El anlisis estadstico de los datos obtenidos durante la prueba experimental
se realiz determinando inicialmente la distribucin normal de los datos
mediante la prueba de Chapiro Wilk y como prueba paramtrica T student,
utilizando el programa estadstico SPSS versin 14.

28
6. RESULTADOS Y DISCUSION

6.1 Aislamiento de microorganismos celulolticos

Los residuos vegetales frescos de crisantemo no permitieron el aislamiento
de microorganismos con actividad celuloltica, mientras que a partir de los
residuos vegetales en compostaje se logr el aislamiento de 8 cepas
bacterianas con dicha actividad (Tabla 3), esta diferencia probablemente se
debi a que en el proceso de compostaje la actividad metablica microbiana
se incrementa, adems, el tiempo de degradacin transcurrido, la alta
temperatura y el pH alcalino permitieron el aislamiento de microorganismos
celulolticos, pues dichas condiciones facilitan que bacterias esporgenas y
actinomicetes incrementen su actividad y por ende su poblacin (Granados y
Valderrama, 2003).

La actividad celuloltica se evidenci mediante evaluacin cualitativa con el
revelado de zonas de aclaramiento utilizando rojo congo al 1% (p/v) como ha
sido reportado por diferentes autores (Hendricks et al., 1995; Lu et al.,2005;
Zhang et al.,2006). El dimetro de los halos de hidrlisis generados no fue
establecido para la mayora de las cepas, pues, se obtuvieron zonas de
aclaramiento que se difundieron en todo el medio; sin embargo, en el caso de
la cepas 2, 6 y 8 el dimetro del halo fue de 0.3, 0.2 y 0.35mm,
respectivamente (Tabla 4, figura 3-10), que comparados con el estudio
realizado por Lu et al. (2005), en el que los dimetros de hidrlisis de las
cepas aisladas de tallos de flores cultivadas en agar CMC e incubadas a una
temperatura de 30+/-2C durante 5 das, alcanzaron valores de 6.4cm,
demuestran una baja actividad celuloltica de las cepas 2, 6 y 8 en este
medio. Sin embargo, se debe resaltar que las dems cepas pueden poseer
una actividad superior a la reportada por este autor.

29
Tabla 3. Caracterizacin macro y microscpica de las cepas aisladas con actividad
celuloltica en agar CMC 1%(p/v)
Cepa Morfologa Gram Borde Color Textura
1 Bacilos esporulados Positivo Irregular Rosa plido Cremosa
2 Bacilos esporulados Positivo Irregular Blanco Cremosa
3 Bacilos esporulados Negativo Irregular Incolora Cremosa
4 Bacilos esporulados Negativo Irregular Blanco Cremosa
5 Bacilos esporulados Positivo Irregular Blanco Cremosa
6 Bacilos esporulados Positivo Irregular Incolora Cremosa
7 Bacilos esporulados Positivo Irregular Incolora Cremosa
8 Bacilos esporulados Positivo Regular Beige Cremosa
Fuente: Autores

Tabla 4. Actividad celuloltica cualitativa de las cepas aisladas en agar CMC 1%(p/v)

Fuente: Autores
Cepa Figura Dimetro halo de hidrlisis
1 3 Indeterminado
2 4 0.3 mm
3 5 Indeterminado
4 6 Indeterminado
5 7 Indeterminado
6 8 0.2 mm
7 9 Indeterminado
8 10 0.35 mm

30

Fig 3 Zonas de aclaramiento, cepa 1 en Agar CMC 1% (p/v)
Fuente: Autores

Fig 4. Zonas de aclaramiento, cepa 2 en Agar CMC 1% (p/v)
Fuente: Autores
31

Fuente: Autores

Fuente: Autores

32

Fuente: Autores

Fuente: Autores

33

Fuente: Autores

Fuente: Autores

34
6.2 Pruebas de Antagonismo

Con el fin de potencializar la actividad celuloltica de algunos de los
microorganismos aislados, se plante la posibilidad de establecer un
consorcio microbiano para lo cual fue necesario realizar pruebas de
antagonismo que descartaran aquellas cepas que generaran algn tipo de
inhibicin sobre las dems.

Durante las pruebas de antagonismo en agar CMC al 1%(p/v) la cepa 8 tuvo
la mayor actividad antagnica frente a las dems cepas evaluadas
generando el mximo halo de inhibicin (7.5mm) frente a la cepa 1 (Figura
11), por lo que en un principio fue descartada como parte del consorcio
microbiano, debido a su antagonismo frente a las siete cepas restantes
(Tabla 5, Figura 11-18).

Fig 11 Antagonismo cepa 8 frente a cepa 1 Fig 12 Antagonismo cepa 8 frente a cepa 2
Fuente: Autores Fuente: Autores

35



Fig 18 Resistencia cepa 8
Fuente: Autores
36
La mayor susceptibilidad se observ en las cepas 2, 5 y 6, cuyo crecimiento
se vi inhibido por las dems cepas, generndose halos con dimetros hasta
de 5.0mm (Tabla 5). Las pruebas de antagonismo tambin se realizaron en
concentraciones de CMC al 2%(p/v) y 3 %(p/v) con el fin de determinar si el
comportamiento antagnico y crecimiento de cada cepa se mantena a pesar
del incremento en la concentracin de la fuente de carbono y de alguna
manera evaluar la inhibicin por sustrato de las cepas seleccionadas.

En la concentracin de 2%(p/v) en agar CMC se confirm la susceptibilidad
de las cepas 2, 5 y 6 (Tabla 6) pues los resultados fueron muy similares a los
obtenidos en agar CMC al 1%(p/v) por lo cual, quedaron descartadas para
ser parte del consorcio.

La actividad antagnica evidenciada durante el desarrollo de las pruebas en
CMC al 1%(p/v) y 2 %(p/v) demuestra que a pesar de tratarse de
microorganismos aislados de una misma fuente puede generarse inhibicin
entre ellos, una posible explicacin a este hecho es que existan diferencias
en la complejidad del sistema enzimtico que les permite degradar el
sustrato, generando diferentes tasas de crecimiento y dando lugar a una
competencia por sustrato y espacio.

En los resultados obtenidos en agar CMC al 3%(p/v) las cepas 1, 3, 4 y 7, no
desarrollaron ningn efecto antagnico entre s (Tabla 7), presentando un
crecimiento normal a dicha concentracin, lo que demostr que estos
microorganismos contaban con una maquinaria enzimtica adecuada para
degradar un sustrato celulsico, por lo cual, fueron escogidos inicialmente
para conformar el consorcio microbiano celuloltico.

37
Tabla 5. Pruebas de Antagonismo (Gauze) en agar CMC 1%(p/v)

Cepas en siembra masiva Cepa
Antagnica
1 2 3 4 5 6 7 8
1 N.D. - - - 0.6
a
0.5
a
0.5
a
-
2 - N.D. - - 1.0
a
- - -
3 - 5.0
a
N.D. - 1.8
a
2.0
a
- -
4 - 5.0
a
- N.D. - 2.0
a
- -
5 - 4.0
a
- - N.D. 2.5
a
- -
6 - 3.2
a
- - - N.D. - -
7 - - - - 0.7
a
1.0
a
N.D. -
8 7.5
a
4.4
a
3.8
a
3.1
a
5.0
a
3.8
a
2.9
a
N.D.
Fuente: Autores

a
Promedio de tres repeticiones del dimetro del halo de inhibicin (mm)
( - ) No hubo inhibicin
ND No se determina


Cepa en siembra masiva
Cepa Antagnica
2 5 6
1 - - 0.8
a
2 N.D. - -
3 3.0
a
1.5
a
-
4 4.5
a
- 2.5
a
5 3.5
a
N.D. 3.2
a
6 - 2.8
a
N.D.
7 - 1.5
a
4.0
a
Fuente: Autores

a
Promedio de tres repeticiones del dimetro del halo de inhibicin (mm)
(-) No hubo inhibicin
N.D. No se determino

38

Cepa en siembra masiva
Cepa Antagnica
1 3 4 7
1 N.D. - - -
3 - N.D. - -
4 - - N.D. -
7 - - - N.D.
Fuente: Autores
( - )No hubo inhibicin
ND No se determina

6.3 Pretratamiento del Residuo Vegetal

Un pretratamiento eficiente reduce el contenido de lignina y de celulosa
cristalina e incrementa el rea superficial para las reacciones enzimticas.
Los pretratamientos pueden ser clasificados en mtodos mecnicos,
qumicos y fsicos (Mtui y Nakamura, 2005).

En este estudio los residuos vegetales de crisantemo fueron sometidos a un
pretratamiento mecnico el cual involucr la reduccin de tamao del
material celulsico por cortado, molienda y pulverizacin con el fin de
modificar la estructura cristalina de la celulosa (figura 19), pues la cantidad
de lignina que contiene este residuo no hizo necesario someter el sustrato a
otro tipo de tratamiento ya que los resultados de los anlisis fsico-qumicos
indicaron un muy bajo porcentaje de esta (Anexo 6).

39

Fig 19. Residuo vegetal de Crisantemo molido
Fuente: Autores

El pretratamiento mecnico utilizado permiti la obtencin de un tamao de
partcula muy pequeo (menor a 850) que adems de favorecer el acceso
de las enzimas hidrolticas del consorcio facilit la preparacin de los medios
de produccin y el seguimiento de los montajes realizados. Krishna (1999)
report la importancia de esta condicin pues afecta la relacin rea/
volumen y la densidad de empaquetamiento que determina la fraccin de
sustrato inicialmente accesible al microorganismo. Esta relacin se
incrementa cuando el tamao de partcula disminuye determinando as el
espacio vaco que es ocupado por el aire, y por ende la tasa de transferencia
de oxigeno que afecta directamente el crecimiento de los microorganismos.

6.4 Evaluacin preliminar de la actividad celuloltica de las cepas
aisladas

Con las cepas seleccionadas (1, 3, 4 y 7) en las pruebas de antagonismo se
realizaron pruebas preliminares para evaluar la capacidad celuloltica de
cada una de ellas determinando la liberacin de azcares reductores por la
tcnica de DNS (Miller,1959) y utilizando como sustrato CMC al 1%(p/v),
3%(p/v) y 5%(p/v), los resultados indicaron una actividad celuloltica nula en
todas las cepas, en las tres concentraciones y durante las veinte horas de
40
fermentacin (Anexo 3, Tablas 8-11), lo cual indic la falta de concordancia
entre la evaluacin cualitativa y cuantitativa de actividad, una posible
explicacin de este hecho es que en la prueba cualitativa, el microorganismo
permaneci en contacto con el sustrato durante 48 horas de incubacin,
aumentando as la probabilidad de liberar las enzimas necesarias para
degradar el polisacrido; mientras que en la tcnica de actividad cuantitativa
por DNS, el extracto enzimtico entr en contacto con la celulosa con un
tiempo de reaccin de 60 minutos que probablemente no fue suficiente para
que se diera una reaccin enzima-sustrato completa.

Otro posible factor a tener en cuenta es que la cantidad de enzima presente
en el sobrenadante no haya sido suficiente para hidrolizar la celulosa o para
obtener cantidades de azcares reductores que pudieran ser detectados por
esta tcnica, a pesar de que la prueba se realiz en condiciones de pH y
temperatura ptimos para la deteccin de las enzimas encargadas de la
degradacin del sustrato.

6.4.1 Evaluacin preliminar de la actividad celuloltica del consorcio

Al evaluar la actividad celuloltica de las cepas 1, 3, 4 y 7 en consorcio, los
resultados obtenidos tanto en la fermentacin realizada en caldo CMC al 1%
(p/v) como en caldo SVS al 10%(p/v), mostraron que la cantidad de azcares
reductores y la actividad enzimtica del consorcio en los dos sustratos fue
nula. (Anexo 3, tablas 12-14). Con base en estos resultados se decidi
buscar una segunda opcin que incluy la evaluacin de la cepa 8 que haba
sido inicialmente descartada en las pruebas de antagonismo, para lo cual,
se realizaron fermentaciones en caldo CMC al 1%(p/v) y SVS al 10%(p/v)
determinando azcares reductores y actividad enzimtica, alcanzndose
valores mayores a los obtenidos con el consorcio propuesto (Anexo 2, Tablas
15-16).
41
Con el objetivo de potencializar la actividad enzimtica de la cepa 8, teniendo
en cuenta que fue un microorganismo nativo del sustrato vegetal a evaluar
y, que durante la realizacin de las pruebas de antagonismo se caracteriz
por inhibir a las dems cepas, probablemente por tener una alta tasa de
crecimiento que lo haca competitivo por espacio y nutrientes y basados en
que el sinergismo de las enzimas celulolticas hacen posible la hidrlisis de
celulosa a glucosa (Lu, et al., 2005; Malherbe y Cloete, 2002) se evalu el
efecto sinrgico entre la cepa 8 y un actinomiceto con buena actividad
celuloltica cualitativa en CMC al 1%(p/v) (halos de hidrlisis de 2.14cm de
dimetro) aislado de suelo de un cultivo de Stevia durante el desarrollo del
trabajo de investigacin: Estandarizacin de la tcnica de deteccin de -
1,4 Glucanasas con el uso de sustratos fluorgenos en suelos provenientes
de cultivos de Stevia Rebaudiana bertoni (Gutierrez, et al, 2006).

Para lo anterior se realizaron curvas de cada microorganismo por separado
en caldo SVS al 10%(p/v) con el fin de evaluar la actividad enzimtica sobre
dicho sustrato. Los dos microorganismos presentaron una degradacin del
sustrato vegetal de crisantemo, lo que se evidenci con la cuantificacin de
azcares reductores y la actividad enzimtica obtenida (Anexo 2, Tablas 15-
18) (Figura 20-23).

0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
12 14 16 18 20 22 24
Tiempo (h)
A
z
c
a
r
e
s

r
e
d
u
c
t
o
r
e
s

(
g
/
L
)
Fig 20 Azcares reductores en el cultivo de Bacillus sp. (cepa 8) en SVS al 10%(p/v)
42

0
0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
0,06
0,07
12 14 16 18 20 22 24
Tiempo (h)
A
c
t
i
v
i
d
a
d

e
n
z
i
m
t
i
c
a

(
U
C
)
UC pH 7 37C UC pH 5 50C

Fig 21. Actividad enzimtica en el cultivo de Bacillus sp. (Cepa 8) en SVS al
10%(p/v), establecida bajo condiciones de pH7 37C y pH5 50C

Fig 22. Azcares reductores en el cultivo de Streptomyces sp. en SVS al 10%(p/v)

0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
12 14 16 18 20 22 24
Tiempo (h)
A
z
c
a
r
e
s

r
e
d
u
c
t
o
r
e
s

(
g
/
L
)

0
0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
0,06
0,07
12 14 16 18 20 22 24
A
c
t
i
v
i
d
a
d

e
n
z
i
m
t
i
c
a

(
U
C
)
Tiempo (h)
UC pH 7 37C UC pH 5 50C

Fig 23. Actividad enzimtica en el cultivo de Streptomyces sp. en SVS al 10%(p/v),
establecida bajo condiciones de pH7 37C y pH5 50C
43
6.5 Identificacin Bioqumica

El perfil bioqumico de la cepa 8 (Figura 24) indic su capacidad para
asimilar la glucosa como fuente de carbono y la subsecuente produccin de
cidos, as mismo redujo sulfatos y nitratos, produjo la enzima catalasa y
mostr crecimiento en concentracin de NaCl al 3%(p/v) (Tabla 24).
Teniendo en cuenta el perfil bioqumico obtenido segn Bergeys y que al
realizar la coloracin de Gram se observaron bacilos Gram positivos
esporulados, la cepa 8 fue identificada como Bacillus sp.
.

Fig. 24 Caractersticas macroscpicas
cepa 8 en agar CMC 1%(p/v)
Fuente: Autores

Tabla 24. Identificacin Bioqumica cepa 8
Fuente: Autores
Caracterstica Resultados (Cepa 8)
Motilidad Negativo
Reduccin de sulfato a sulfito Negativo
Reduccin de nitratos a nitritos Positivo
Oxidasa Negativo
Catalasa Positivo
Produccin de cido Positivo s a partir de glucosa
Crecimiento en concentraci Positivo n de NaCl 3% (p/v)
Produccin endosporas Positivo
44
La identificacin mediante observacin de
las caractersticas macro y microscpicas. En agar avena (Anexo 1) dicho
microorga io areo abundante inicia lanco y
con el transcurso del tiempo de color caf, las colonias se observaron
pequeas, de bord ar y aspecto pulverulento (Fig 25), al reverso de la
caja se observ la produccin de un pigmento difusible de c
os lo hmedo. Micro mente el
microorganismo se ti como Gram positivo, en cuanto al nmero y
esporas otra caracterstica importante para distinguir los
del Actinomiceto se llev a cabo
nismo desarroll un micel lmente b
e irregul
olor amarillo
curo, gener un olor caracterstico a sue scpica
disposicin de
gneros de Actinomicetes- se presentaron esporas ovoides en cadenas
espiraladas y rectas (Fig 26).

Fig 25 Caract
S
ersticas macroscpicas Fig 26 Caractersticas microscpicas
treptomyces sp. en agar avena 5 %(p/v) Streptomyces sp.

Como parte complementaria de la identificacin se realiz el perfil bioqumico
del actino. (Tabla 25). El microorganismo hidroliz galactosa, fructosa,
sucrosa, arabinosa, rafinosa, xilosa, celobiosa, ramnosa, esculina e inositol,
as mismo se evidenci la produccin de la enzima catalasa y la reduccin de
nitratos a nitritos.

45
Tabla 25. Identificacin Bioqumica Actinomiceto

Caracterstica Resultados (Actino)

Galactosa Positivo
Fructosa Positivo
Sucrosa Positivo
Arabinosa Positivo
Rafinosa Positivo
Xilosa Positivo
Urea Negativo
Celobiosa Positivo
Ramnosa Positivo
Melobiosa Negativo
Inositol Positivo
Manitol Negativo
Fenilalanina Negativo
Triptofano Negativo
Esculina Positivo
Reduccin de nitratos a nitritos Positivo
Catalasa positivo
Gelatina Negativo
Fuente: Autore

Con base en las caractersticas macro y microscpicas la cepa fue
identificada como presuntiva de Streptomyces sp. Lo que se corrobor con
los resultados obtenidos a partir del perfil bioqu l microorganismo
(Holt, et al, 2000).

Tanto Bacillus s Streptomyces sp. han sido reportados como
microorganismos con alta actividad celuloltica. Muchas especies del gnero
uelo y en la materia orgnica en
egradacin, por lo que se considera que juegan un papel importante en la
y agua en la regin amaznica (Heck et al, 2002), en
siduos de banano (Krishna,1999), y en fibras de palma (Apun et al, 2000),
s
mico de
p. como
Bacillus estn normalmente presentes en el s
d
biodegradacin y bioconversin de componentes de alto peso molecular. Se
ha realizado el aislamiento de Bacillus licheniformis a partir de residuos
vegetales de flores en compostaje (Lu et al, 2005) y Bacillus subtilis en
muestras de suelo
re
46
en los que dicho gnero bacteriano ha demostrado un alto potencial
celuloltico.

Por otro lado, Streptomyces sp. ha sido muy estudiado debido a que es parte
importante de la comunidad microbiana del suelo responsable de la
degradacin y recirculacin de biopolmeros como la celulosa, la
hemicelulosa y la lignina (Semedo et al, 2004). Los estudios realizados con
este microorganismo en cuanto a su capacidad hidroltica en materiales
lignocelulsicos han reportado buenos resultados, como es el caso de
Streptomyces drozdowiczii y Streptomyces cellulolyticus asilados de
muestras de suelo (Semedo et al, 2004; Grigorevski et al, 2005; Li, 1997).
amrez y Coha (2003) aislaron 145 cepas de actinomicetos celuloltcos
urante las curvas realizadas con el consorcio microbiano en SV y SVS al
y
.849g/L, respectivamente, en la hora 18 de fermentacin, (Anexo 5, Tablas
cromatografa liquida realizada a los sobrenadantes obtenidos en la hora seis
R
entre los cuales Streptomyces sp. tuvo una prevalencia de 50.63% y adems
mostr los ms altos niveles de actividad enzimtica en el estudio.

6.6 Utilizacin del sustrato vegetal por parte del consorcio celuloltico

Teniendo en cuenta la actividad hidroltica de Streptomyces sp. y Bacillus sp
en el residuo vegetal a evaluar (Anexo 4, Tablas 16 y 18 )(Figura 20-23); y
con el objetivo de potencializar la degradacin del sustrato por una posible
accin sinrgica entre las enzimas de cada cepa, se realizaron curvas en las
que los microorganismos actuaron en consorcio.

D
5% (p/v) se obtuvieron valores mximos de azcares reductores de 0.624
0
20 y 21) (Figura 27) mientras que, en SV y SVS al 10%(p/v) se alcanzaron
valores de 1.665 y 1.474g/L, (Anexo 5, Tablas 22 y 23) (Figura 28)
respectivamente, en la hora seis de fermentacin. Los resultados de la
47
de las fermentaciones en los medios al 10%(p/v) mostraron la presencia de
glucosa y fructosa como azcares reductores. En el medio SV la glucosa se
ncontr en una concentracin de 0.475g/L, mientras que, en el medio SVS e
adems de la glucosa en una concentracin de 0.391g/L se detecto fructosa
en una concentracin de 1.417 g/L (Anexo 7) estos resultados permitieron
inferir en primer lugar que el sustrato celulsico a concentracin de 10%(p/v)
estimul la actividad hidroltica del consorcio microbiano, generndose
diferencias significativas (p<0.05) (Anexo 8) con la actividad hidroltica al
5%(p/v), en segundo lugar que la adicin de sales al medio de produccin no
gener diferencias significativas (p>0.05) (Anexo 8) en la liberacin de
azcares reductores respecto al medio sin suplemento, como habra de
esperarse, pues los elementos traza en un medio de cultivo, juegan un papel
importante en la sntesis de cidos nucleicos, fosfolpidos, pared celular,
enzimas y otros constituyentes celulares, lo cual incrementa la biomasa
celular responsable de la hidrlisis del sustrato vegetal. Esto demuestra que
el residuo vegetal de crisantemo provee una fuente de carbono, nitrgeno y
minerales que suplen los requerimientos nutricionales necesarios para el
crecimiento y la actividad metablica de los microorganismos evaluados; lo
que puede corroborarse con los anlisis fisicoqumicos realizados al sustrato
(Anexo 6), la composicin de este residuo se presenta como una ventaja
para su utilizacin, pues, no se hace necesario suplementarlo con la adicin
de compuestos qumicos que generaran un costo adicional.

Finalmente, como pudo verse en los resultados obtenidos en la
cromatografa lquida se corrobor que la suplementacin del medio sustrato
vegetal no gener un incremento en la conversin de celulosa a glucosa, por
el contrario la concentracin de este azcar fue mayor en el medio sin
suplemento.

48
Sin embargo, se esperaba una mayor concentracin de azcares reductores
teniendo en cuenta que el residuo vegetal de crisantemo contena un alto
orcentaje de celulosa (65.3%) de acuerdo al anlisis fisicoqumico realizado p
(Anexo 6).

0
0,1
0,2
0,3
0 6 12 16 18 20 22
Tiempo (h)
A
z
c
a
r
e
s
0,4
0,5
0,6

r
e
d
u
c
0,7
0,8
0,9
t
o
r
e
s

(
g
/
L
)
SV 5% (p/v) SVS 5% (p/v)

Figura 27. Azcares reductores en el cultivo del consorcio ( Bacillus sp. y
Streptomyces sp.) en SV y SVS al 5%(p/v)

Figura 28. Azcares reductores en e cultivo del consorcio ( Bacillus sp. y
Streptomyces sp.) en SV y SVS al 10%(p/v)

Por otro lado, al comparar la concentracin de azcares reductores obtenidos
en las pruebas preliminares en las que Bacillus sp y Streptomyces sp.
actuaron por separado en la degradacin de SVS al 10% (p/v) (Anexo
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
1,8
0 6 12 16 18 20 22 25
Tiempo (h)
A
z
c
a
r
e
s

r
e
d
u
c
t
o
r
e
s

(
g
/
L
)
SV 10%(p/v) SVS 10%(p/v)

l
49
4,Tablas 16 y 18) con los obtenidos con el consorcio (Bacillus sp.-
Streptomyces sp.) en el mismo sustrato y a la misma concentracin (Anexo 4
y 5,Tablas 19 y 23), demuestran que se estableci un sinergismo en el que
probablemente se logr una complementariedad entre las enzimas
celulolticas que favorecieron la degradacin del sustrato con el consecuente
aumento en la liberacin de azcares reductores.

6.6.1. Condiciones de pH y Temperatura durante la Fermentacin

Durante pH y la
temperatura se mantuvieron en un valor cercano a 6.0 y 35C,
las curvas d alizadas, el e degradacin del residuo vegetal re
respectivamente (Figura 29 y 30). Krishna (1999), report que el pH y la
temperatura de la fermentacin tienen una gran influencia en la produccin
de enzimas celulolticas, en su investigacin la mayor produccin se alcanz
a un pH de 7.0 manteniendo una temperatura constante de 35C, sin
embargo, el autor reporta otros estudios donde a un pH de 6.0 se da la
mayor liberacin enzimtica, lo que permite afirmar que tanto el pH como la
temperatura de operacin en esta investigacin favorecieron la hidrlisis del
residuo vegetal.

6
6,1
6,3
6,2
5,5
5,6
5,7
5,8
5,9
0 6 12 16 18 20 22
Tiempo (h)
p
H
SV 5% (p/v) SVS 5% (p/v)

Figura 29 Variacin de pH en el cultivo del consorcio
(Bacillus sp. y Streptomyces sp.) en SV y SVS al 5%(p/v)

50
5,4
5,6
5,8
6
6,2
6,4
6,6
p
H
0 6 12 16 18 20 22 25
Tiempo (h)
SV 10% (p/v) SVS 10% (p/v)

Figura 30 Variacin de pH en el cultivo del consorcio
(Bacillus sp. Y Streptomyces sp.) en SV y SVS al 10%(p/v)

6.7 Actividad Enzimtica y liberacin de azcares reductores a partir
del residuo vegetal de Crisantemo.

el ms SV al 10%
(p/v) en la hora 6, pH 7 37C con un valor de 0.1056 UC (UC definida como
la cantidad de enzima capaz de liberar un micromol de glucosa por minuto)
(Anexo 5 Tablas 22 y 23) (Figura 31) valor que coincidi con la mayor
concentracin de azcares en el mismo sustrato. Sin embargo, no existieron
diferencias significativas (p>0.05) en la concentracin de celulasas liberadas
en los medios SV y SVS en las concentraciones evaluadas.

El niv alto de celulasas se produjo en la fermentacin con
0
0,02
0,04
A
c
t
i
v
i
d
a
d

e
n
0,06
0 6 12 16 18 20 22 25
z
i
m
t
i
c
a

0,08
0,1
0,12
(
U
C
)
Tiempo (h)
UC SV 10% (p/v) UC SVS 10% (p/V)

Figura 31. Actividad enzimtica en el cultivo del consorcio (Bacillus sp. y
Streptomyces sp.) en SV y SVS al 10%(p/v),bajo condiciones de pH7 37C
51
Por otro lado, la actividad enzimtica a pH cido y una temperatura de 50C
(Figuras 32 y 33) fue menor, demostrando que dicha actividad vara de
acuerdo a las condiciones de pH y la temperatura en la que es evaluada
(p<0.05). Una explicacin a este hecho puede ser que en condiciones
aturales la actividad hidroltica de la celulosa se ve afectada cuando el pH
del suelo es cido, como es el caso de Cellulomonas sp. cuyo
comportamiento metablico se ve influenciado bajo estas condiciones (Lynd
et al.,2002)

n
0
0 6 12 16 18 20 22 25
Tiempo (h)
A
c
0,02
t
i
v
i
0,04
d
a
d

e
0,06
0,08
0,1
0,12
n
z
i
m
t
i
c
a

(
U
C
)
UC pH7 37C UC pH 5 50C

Figura 32. Actividad enzimtica en el cultivo del consorcio (Bacillus sp. y
Streptomyces sp.) en SV al 10%(p/v),bajo condiciones de pH7 37C y pH5 50C

0
0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
0,06
0,07
0,08
0,09
0 6 12 16 18 20 22 25
Tiempo (h)
A
c
t
i
v
i
d
a
d

e
n
z
i
m
t
i
c
a

(
U
C
)
UC pH7 37C UC pH5 50C

Figura 33. Actividad enzimtica en el cultivo del consorcio(Bacillus sp. y
Streptomyces sp.) en SVS al 10%(p/v), bajo condiciones de pH7 37C
y pH5 50C
52

La actividad enzimtica del consorcio evaluada en SV y SVS en
concentraciones de 5%(p/v) y 10%(p/v), no es comparable con los resultados
reportados por otros estudios en los que tambin se ha realizado la
evaluacin de microorganismos celulolticos en residuos celulsicos (Lu et al
2005), (Krishna, 1999), debido a que el material celulsico difiere en sus
caractersticas fsico-qumicas como son: el tamao y la superficie de las
fibrillas, en las
regio cin
stereoscpica y la rigidez de las nidades de celulosa, el grado de
polimerizacin de la celulosa, la naturaleza de los componentes con los que
la celulosa esta asociada, la naturaleza, concentracin y distribucin de
grupos sustituyentes (Malherbe y Cloete, 2002; Petre et al., 1999; Zhang et
al., 2006). Dichos parmetros condicionan drsticamente la habilidad de los
microorganismos celulolticos para degradar este tipo de sustratos, lo cual
explica que el comportamiento metablico sea especfico y por ende, la
acumulacin del producto de hidrlisis difiera de un ensayo a otro.

s de
los cambios en las caractersticas del sustrato durante la hidrlisis han sido
imulados por modelos matemticos aplicados a una variedad de materiales
el espacio entre las microfibrillas y las molculas de celulosa
nes amorfas, el grado de cristalinidad de la celulosa, la conforma
e u
Por otro lado, las interacciones complejas entre las enzimas encargada
hidrolizar la celulosa (endoglucanasas, exoglucanasas y -glucosidasas ) y
s
lignocelulsicos teniendo en cuenta dos propiedades importantes: la fraccin
de enlaces -glucosidicos accesibles a las celulasas y el grado de
polimerizacin, dicho modelo sugiere que es casi imposible la prediccin del
funcionamiento hidroltico de una mezcla de celulasas de un sustrato a otro
debido a variaciones como la concentracin de celulasas, la proporcin
endo/exocelulasas, el tiempo de reaccin y las caractersticas del sustrato
(Zhang et al., 2006). De esta manera, la actividad celuloltica de los
53
microorganismos va a ser especfica para cada sustrato celulsico a evaluar,
como ha sido reportado en diferentes estudios, Lu et al (2005) obtuvo 7.9 y
28UC en una fermentacin de residuos de tallos de flores con Bacillus
pasteuri y Bacillus cereus, dichos microorganismos crecieron en un medio
que contena sulfato, fosfato y nitrato entre otros componentes, durante 7
das a 35C y un pH de 6.8-7.2; Krishna (1999) report 3.30UC a partir de
residuos de banano utilizando Bacillus subtilis durante 72 horas de
fermentacin, pH7, 35C, y en este estudio la mayor actividad fue de 0.1056
UC a partir de residuos vegetales de crisantemo.
(En todos los casos la actividad celuloltica fue definida como la cantidad de
o de polimerizacin (Zhang
enzima necesaria para producir una micromol de glucosa por minuto).

Durante las pruebas realizadas se observaron marcadas diferencias entre la
actividad celuloltica cualitativa y cuantitativa evaluada, lo cual puede estar
directamente relacionado con el tipo de sustrato en el que se realizaron
dichas pruebas, pues, segn Zhang et al.,(2006), es necesario tener en
cuenta la solubilidad o insolubilidad en agua del sustrato que se quiere
evaluar ya que determina los parmetros para realizar el screening y
determinacin de la actividad enzimtica de microorganismos con capacidad
celuloltica.

En esta investigacin el screening se realiz en agar CMC al 1%(p/v)
(sustrato celulsico soluble), posteriormente la induccin de enzimas en
residuos vegetales de crisantemo (sustrato insoluble) y la cuantificacin de
dichas enzimas fue llevada a cabo en CMC al 1%(p/v) buffer fosfato y buffer
cido ctrico (pH7 y 5). La utilizacin de sustratos con diferente tipo de
solubilidad probablemente influy en la variacin de los resultados, pues la
relacin existente entre la tasa de hidrlisis obtenida en sustratos solubles e
insolubles no es clara, principalmente porque existen diferencias en la
accesibilidad de las enzimas al sustrato y el grad
54
et al., 2006), lo cual explica la obtencin de halos de dimetro incuantificable
y su baja correlacin con los niveles de azcares reductores obtenidos y la
actividad enzimtica evaluada tanto para las cepas inicialmente aisladas
a enzima fue evaluada en celulosa insoluble.

como para el consorcio. Este mismo autor concluy que los datos obtenidos
en la hidrlisis de sustratos solubles no pueden ser comparados con la
hidrlisis de sustratos insolubles. Un claro ejemplo de este concepto es el
reportado por Himmel et al.,(1999) quien en su estudio obtuvo una actividad
especfica de endoglucanasas de Thermobifida fusca diez veces ms alta
que la actividad de la endoglucanasa de Trichoderma reesei al ser evaluada
en CMC (sustrato soluble). Sin embargo, esta actividad no se mantuvo
cuando dich

Otro de los factores que pudo haber influido en la variacin de los resultados
es el tiempo de fermentacin y el de reaccin enzima-sustrato durante las
pruebas de actividad enzimtica. Teniendo en cuenta que la lignocelulosa
pretratada utilizada para evaluar la actividad enzimtica de preparaciones
comerciales de celulasas, requiere un rango de tiempo que va de minutos a
horas para que inicie la hidrlisis y hasta varios das para obtener una
digestibilidad final (conversin de la celulosa) (Zhang et al, 2006), hace
pensar que probablemente las evaluaciones realizadas requeran un mayor
tiempo de reaccin que diera lugar a la obtencin de mejores resultados.

Finalmente se puede considerar la importancia de continuar realizando
screening de microorganismos celulolticos pues la utilizacin de estos se
convierte en una alternativa viable para el tratamiento de residuos
celulsicos, pues tan solo se ha identificado y evaluado menos del 1% del
potencial de dichos microorganismos presentes en la biosfera (Howard et al,
2003)

55
7. CONCLUSIONES

Se logr el aislamiento de ocho cepas bacterianas con actividad
ar la actividad enzimtica de los microorganismos evaluados por lo
ual no se hace necesario suplementar el residuo con sales

celuloltica en CMC 1%(p/v) a partir de residuos vegetales de crisantemo en

compostaje

Las pruebas de antagonismo en CMC (1%(p/v), 2% (p/v) y 3%(p/v))
permitieron seleccionar los microorganismos capaces de actuar en consorcio
en la degradacin del residuo vegetal

Las enzimas de Bacillus sp. y Streptomyces sp. actuaron sinrgicamente
en la degradacin del residuo vegetal

La mayor concentracin de azcares reductores y actividad enzimtica se
obtuvieron en el cultivo del consorcio (Bacillus sp. y Streptomyces sp.) en SV
10% (p/v)

El residuo vegetal de crisantemo aport los nutrientes necesarios para
estimul
c

56
8. RECOMENDACIONES
nismos celulolticos termfilos que
uedan ser aprovechados en el tratamiento de residuos agroindustriales
empleando sustratos de la misma naturaleza de donde fueron
islados
dio
Tener en cuenta el tamao de partcula del sustrato vegetal, pues,
puede generar inconvenientes en la manipulacin y seguimiento de las
fermentaciones

Establecer el tipo de interaccin que ocurre entre Bacillus sp. y
treptomyces sp., durante el desarrollo de la biomasa

Evaluar actividad celuloltica cualitativa y cuantitativa en tiempos iguales

Determinar el tipo de e roorganismo, evaluando
la actividad de cada una de estas en sustratos especficos
ciones entre 5%(p/v) y 10%(p/v)

Realizar screening de microorga
p

Realizar el aislamiento y evaluacin de microorganismos con actividad
celuloltica,
a

Evaluar la actividad hidroltica de los microorganismos celulolticos en
rangos de tiempo ms amplios a los empleados en este estu

S
nzimas que libera cada mic

Evaluar el sustrato fermentable obtenido, en la produccin de etanol

Lleva a cabo la determinacin de azcares reductores y evaluacin de la
actividad enzimtica utilizando residuo vegetal de crisantemo en
concentra

57
9. LITERATURA CITADA

Adrado, B; Chpeborska, P; Galbe, M; Zacchi, G. 2005. Ethanol production
de Tocancip.<http:/www.alcaldiatocancipa.gov.co>

Editor, S.A. Mxico. Pg. 162-177
Apun, K; Jong, B; Salleh, M. 2000. Screening and isolation of a cellulolytic
Bacillus from sago pith waste. J. Gen. Appl. Microbiol. 4:263-
Aubert, J.1988.Biochemistry and Genetics of Cellulose degradation.

cademic press. USA. Pg 11.
Ayala, S.; Snchez, D. 2001 Caracterizacin y evaluacin de la actividad
ectinolitica y celuloltica de microorganismos aislados a partir de desechos
ara el anlisis de las ciencias de la
alud. Ed. Limusa Wiley. Mxico, D.F.. Pag. 41-46,161,321-327.
Dvila, D; Lpez, L; P n de diferentes soportes
para la preformulacin de un producto elerador de compostaje.
. 1986. Industrializacin de la Glucosa en Colombia. Tesis de
from non-starch carbohydrate of wheat bran. Bioresource Technology.
96:843-850.

Alcalda
[Consulta 27 Nov. 2005]

Alexander, M. 1980 .Introduccin a la ,microbiologa del suelo. AGT

and amylolytic
267.

Asocolflores. Florverde, el programa social y ambiental de la floricultura
Colombiana. Revista Asocolflores. 61:23

p
ctricos. Tesis de Pregrado. Microbiologa Industrial. Facultad de Ciencias.
Pontificia Universidad Javeriana. Bogot.

Daniel, W. 2002. Bioestadstica, Base p
s

edroza, A. 2002 Evaluaci
termoflico ac
Tesis de Pregrado. Microbiologa Industrial. Facultad de Ciencias. Pontificia
Universidad Javeriana. Bogot

For ro, M e
Pregrado. Facultad de Ingeniera Industrial. Pontificia Universidad Javeriana.
Bogot.

Gauze, G. 1967.Conferencia de Antibiticos elaborados por hongos. La
Habana. Cuba. Editorial Universitaria La Habana.

58
Granados, L; Valderrama, J. 2003. Evaluacin de la Actividad Proteoltica
y Amiloltica de Actinomycetes termoflicos aislados a partir de pilas de
compost. Tesis de Pregrado. Microbiologa Industrial. Facultad de Ciencias.
ontificia Universidad Javeriana. Bogot
. 2003. Determinacin de actividad
eluloltica y establecimiento de un consorcio bacteriano aislado de diferentes
Javeriana. Facultad de ciencias. Bogot.
genos en
uelos provenientes de cultivos de Stevia Rebaudiana bertoni. Tesis de
02. Cellulase and Xylanase production by
olated amazon Bacillus strains using soybean industrial residue based solid-
H. 1997. Plant Biochemistry and Molecular Biology Oxford
niversity Press Pg 7.
A New Solid Medium for
numerating Cellulose-Utilizing Bacteria in Soil. Appl. Environ. Microbiol. 61:
nol 10:358-364
Howard, R ; Abotsi, E; Rensburg, J; Howard,S. Lignocellulose
P

Guevara, C; Paez, A; Zambnrano, M
c
regiones y sustratos del pas. Tesis de Pregrado. Carrera de Microbiologa
Industrial. Pontificia Universidad

Grigorevski, A; Nascimento, R;Bonb, E; Coelho, R. 2005. Streptomyces
drozdowiczii cellulase production using agro-industrial by-products and its
potential use in the detergent and textile industries. Enzyme and Microbial
Technology. 37: 272277.

Gutierrez, V y Pinzn, A. 2006. Estandarizacin de la tcnica de
deteccin de - 1,4 Glucanasas con el uso de sustratos fluor
s
Pregrado. Carrera de Microbiologa Industrial. Pontificia Universidad
Javeriana. Facultad de ciencias. Bogot.

Heck,J; Hertz, P; Ayub, M.20
is
state cultivation. Brazilian journal of microbiology. 33: 213-218

Heldt,
U

Hendricks, C. Doyle, J and Hugley, B. 1995.
E
2016-2019.

Himmel, M; Ruth, M; Wyman, C.1999. Cellulase for commodity products
from cellulosic biomass. Curr Opin Biotech

Holt, J; Krieg, N; Sneath, P; Staley, J; Williams, S. 2000.Bergeys Manual
of Determinative Bacteriology. Novena Edicin. Lippincott Williams & Wilkins.
Pg. 605-607.

Biotechnology: issues of bioconversion and enzyme production. African

Journal of Biotechnology. 2: 602-619

59
Krishna, C. 1999. Production of bacterial cellulases by solid state
d
51: 353-360.
cellulose-binding -glucosidase from cellulose
egrading cultures of Phanaerochaete chrysosporium. Appl. Environ.
Weimer, P., Zyl, H., Pretorius, I. 2002. Microbial cellulose
tilization : Fundamentals and Biotechnology. Microbiology and Molecular
Lynd, L; Van Zyl, W; MacBride, J; Laser, M.2005. Consolidated
Malherbe, S y Cloete, T. E. 2002. Lignocellulose Biodegradation:
Mansfield, S; Mooney, C y Saddler, J. 1999. Substrate and Enzime
Miller, G.1959.Use of Dinitrosalisyc Acid Reagent for determination of
arca, M.; Menes,L.;Gutierrez, M.; Polledo,F. 2000.
omisin Internacional de especificaciones microbiologicas alimentarias.

elected dumping sites in Dark es Salaam, Tanzania. Biodegradation.
bioprocessing of banana wastes. Bioresource Technology. 69:231-239.

Li, X. 1997. Streptomyces cellulolyticus sp. nov., a New Cellulolytic
Member of the Genus Streptomyces.International journal of systematic
bacteriology. 47: 443-445

Lu, W. Wang, H. Yang, S. Wang, Z. Nie, Y. 2005. Isolation an
characterization of mesophilic cellulose-degrading bacteria from flower stalks-
vegetable waste co-composting system. J.Gen. Appl. Microbiol.

Lymar, E. Li, B. And Renganathan, V. 1995. Purification and
Characterization of a
d
Microbial. 8 : 2976-2980.

Lynd, L.,
u
Biology Reviews. 16: 577-583.

bioprocessing of cellulosic on celulosic biomass: an update. Curr Opin

Biotechnol. 66:506-577

Fundamentals and applications. Re/Views in Environmental Science &

Bio/Technology 1:105-114.

Characteristics that Limit Cellulose Hydrolysis. Biotechnol. Prog. 15:804-816

reducing sugar. Analytical chemistry. 31:426-428

Moreno, B.; Diez, V.; G
C
ICMFS. Editorial Acribia. Zaragoza (Espaa). Pag. 125-126

Mtui, G y Nakamura, Y. 2005. Bioconversion of lignocellulosic waste from
s
16:493-499.

60
Pez, A. Castro,D. Martinez, M. M , Pedroza, A. 2001. El manejo de los
vedo, B.; Gomez, D. 2003. Manual de
aboratorio Introduccin a la Biotecnologa. Departamento de Microbiologa.
Manual de Laboratorio
cnologa de las Fermentaciones. Departamento de Microbiologa. Facultad
1996. Aislamiento y caracterizacin de cepas
icrobianas para un proceso de compostaje de desechos de la palma de
. Universidad Nacional de
olombia. Facultad de Ciencias. Bogot
nd fungal cells
mobilized in radiopolymerized hydrogels. Resourses, Conservation and
oyola, T; De la Torre, M. 1993. Interactions in a mixed cultura
omponed of Cellulomonas flavigena and Xanthomonas sp. Growing in
. Sociedad
eroamericana de Biotecnologa. 11:55-59
y determinacin de la
ctividad celuloltica. Rev. Per. Biol. 10: 67-77.
utica. Universidad Nacional de
olombia. Facultad de Ciencias. Bogot

residuos slidos para la nutricin de suelos. Agricultura de las Amricas .
301: 2630.
Pedroza, A.; Matiz, A.; Que
L
Facultad de Ciencias. Pontificia Universidad Javeriana. Pag 63.

Pedroza, A.; Matiz, A.; Quevedo, B.2003.
te
de Ciencias. Pontificia Universidad Javeriana. Pag 5.

Pea, A. y Rivera, G.
m
aceite. Tesis de Pregrado. Carrera de Bacteriologa. Pontificia Universidad
Javeriana . Facultad de Ciencias. Bogot .

Prez, J. 1996. Utilizacin de residuos florales en la elaboracin de papel
manual. Tesis de Pregrado. Carrera de Qumica
C

Petre, M; Zaharea, G; Adrian, P; Gheorghiu, E. 1999. Biodegradation
and Bioconversion of cellulose wastes using bacterial a
im
Recycling 27:309-332

Ponce- N
c
continuous cultura on sugar cane bagasse.Appl Microbial Biotechnol. 40:
531-534

Poutou, R.; Amador, E.; Candelario,M. 1994. Banco de clulas primario
(BCP): Caracterizacin y papel en la produccin de protenas recombinantes.
Centro de Ingeniera Gentica y Biotecnologa Aplicada
Ib

Ramirez, P; Coha, J. 2003. Degradacin enzimtica de celulosa por
actinomicetos termfilos: Aislamiento, caracterizacin
a

Snchez, G; Zuluaga, M. 1999. Propuesta y Elaboracin de un prototipo
de material para compresin directa a base de Celulosa fibra. Tesis de
Pregrado. Carrera de Qumica Farmac
C
61

Santana, M; Vasquez, C. 2002. Evaluacin de cepas de Azotobacter sp. Y
e bacterias solubilizadoras de fosfato (BFS), como biofertilizante mixto en
, C; Lindares, A; Duarte, G; Nascimento, R; Rosado,
; Pinheiro, M; Margis, R; Silva, K; Alviano, C; Manfio, G; Soares, M;
Mansfield, S; Mooney, C; Saddler, N. 1999. Substrate and Enzyme
Ten, L; Im, W; Kim, M; Kang, M; Lee, S. 2004. Development of a plate
chnique for screening of Polisaccharide-degrading microorganism by using
mixture of insoluble chromogenic substrates . J Microbiol Methods . 56:375-

005]
p. enzymes involved in degradation
f plant cell wall polysaccharides. Microbiology and Molecular Biology
d
un cultivo de crisantemo (Crysanthemum morifolium var. Regal suerte). Tesis
de pregrado. Pontificia Universidad Javeriana.Facultad de Ciencias. Bogot.

Semedo, L; Gomes
A
Lindares, L; Coelho, R. 2004. Streptomyces drozdowiczii sp. nov., a novel
cellulolytic streptomycete from soil in Brazi. Journal of Systematic and
Evolutionary Microbiology. 54:1323-1328

Characteristics that Limit Cellulose Hydrolysis. Biotechnol. Prog. 15: 804-816

Stace, C. 2003. Plant taxonomy and biosistematics. Quinta edicin.
Cambridge University Press. Pag. 163

Teather, R ; Wood, P.1982. Use of congo red polysaccharide interaction
in enumeration and characterization of cellulolytic bacteria from the bovine
rumen. Appl Environ. Microbiol. 43: 777-780

Tllez, A; Paba, J. 2003.Produccin de Etanol a partir de residuos
Amilceos y Lignocelulsicos. Trabajo de Investigacin. Universidad
Autnoma de Bucaramanga (UNAB)

te
a
382

Universidad Nacional de Colombia Comunicaciones de divulgacin
cultural.<http://www.unalmed.edu.co/~prensa/impro4.htm> [Consulta 27 Nov.
2

Vidiale, H. 1983. Produccin de Flores y Plantas Ornamentales. Madrid,
Mundi-Prensa 260 pag. 42-69.

Vries, R., Viser, J. 2002. Aspergillus s
o
Reviews. 65: 497-522.

62
Zhang, Y. Himmel, M. Mielenz, J. 2006. Outlook for cellulase
improvement: Screening and selection strategies. Biotechnology Advances.
4: 452-481. 2

63
ANEXO 1

Medios de cultivo y reactivos

MEDIO DE CULTIVO COMPOSICIN (g/L)
Agar CMC 1%(p/v)

Carboximetilcelulosa
Extracto de levadura
Peptona universal
Sulfato de amonio
Cloruro de calcio
Fosfato monobsico de potasio
Fosfato dibsico de potasio
Agar-agar
Ajustar pH 7.0+/-2
10
2.5
2.5
0.5
0.5
0.1
0.1
15
Caldo Sustrato vegetal
(SV) 5%(p/v) 10%(p/v)

Residuo vegetal de Crisantemo
Peptona universal
Ajustar pH 7.0+/-2
50-100
2.5
2.5
Caldo Sustrato vegetal
suplementado (SVS)
5%(p/v) 10%(p/v)

Residuo vegetal de Crisantemo
Peptona universal
Sulfato de amonio
Cloruro de calcio
Fosfato monobsico de potasio
Fosfato dibsico de potasio
Agar-agar
Ajustar pH 7.0+/-2
50-100
2.5
2.5
0.5
0.5
0.1
0.1
15
Agar avena Avena molida
NaCl
Agar-agar
50
10
15
REACTIVOS COMPOSICIN (g/L)
Rojo congo 1%(p/v) go 10 Rojo con
NaCl 0.1 M Nacl 200

64

Prepar
1. P fosfato 0.1 M

Pesar 3.5 g de Na
2
e agua des a
Pesar 3.45 g de NaH l de agua d ada
Mezclar lentamente las dos soluciones
7+/- 0.2
en baln aforado tar 500 ml

2. Preparacin de Carboximetilcelu v) en buffer fosfa M

.0g de carboximetilce y disolver lentamente en 50ml
de buffer fosfato 0.1M pH7
Calentar la solucin en horno microondas por un minuto
Ajustar pH a 7 +/-2
Enrasar a 100ml con el buffer fosfato 0.1M pH7 en baln
volumtrico
Preparacin buffer cido ctrico pH 5

1. Preparacin buffer cido ctrico 0.1M pH5

Pesar 5.37g de Na
2
PH
4
.7H
2

Pesar 2.10g de cido ctrico
Pesar 1g de carboximetilcelulosa
Disolver todos los componentes en 100 ml de agua destilada
Ajustar a pH5

acin buffer fosfato pH 7

reparacin buffer pH 7
HPO
4
y disolver en 100 ml d tilad
2
PO
4
y disolver en 100 m estil
Ajustar pH
Enrasar hast ple a com
losa al 1.0%(p/ to 0.1
Pesar 1 lulosa

O

65
ANEXO 2
rminacin de azcares reductores
por e NS)
re

Dete
l mtodo del cido 3,5-dinitrosaliclico (D

P paracin del reactivo de DNS

Depos e agua destilada, adicionar 1.6g de
Hidrx te agitacin continua en plancha
magn riormente adicionar lentamente
43.8g pleto.
Recub 3,5-
initros con agua destilada hasta 100ml en baln aforado.
eje en agitacin toda noche en un frasco oscuro
reparacin de la solucin stock de glucosa 2g/L
itar en un beaker de 250ml, 50ml d
an ido de sodio y disolver medi
tica a temperatura ambiente. Poste
de Tartrato de sodio y potasio hasta que se disuelva por com
papel kraft y agregar lentamente 1g de cido rir el beaker con
aliclico. Complete d
D

P
ese 2g de glucosa anhdrida y disuelva en 500ml de agua destilada
tilizando un baln volumtrico de 1000ml, homogenice y complete hasta
00ml con agua destilada
reparacin de las soluciones de concentracin conocida 0.5- 2g/L

P
u
1

P
mpleando la formula V1*C1 = V2*C2. Se preparan seis soluciones que
ngan un volumen final de 2ml

E
te

Concentracin g/L Solucin concentrada de Agua destilada
glucosa en ml ml
0.5 0.5 1.5
0.7 0.7 1.3
1 1 1
1.5 1.5 0.5
1.7 1.7 0.3
2 2 0

66
Curva patrn de glucosa N 1

Curva patrn de glucosa N 2

Concentracin
g/L
Absorbancia
540nm

0.5 0.271
0.7 0.353
1 0.484
1.5 0.774
1.7 0.827
2 0.995
Concentr acin
g/L

Absorbancia
540nm
0.5

0.247
0.7

0.36
1

0.529
1.5

0.746
Curva patrn de cosa (g/L) N2
y = 0,4981x + 0,098
R
2
= 0,995
0
0,2
0,4
0,6
0,8
0,5 0,7 1 1,5
Concentracin glucosa (g/L)
A
b
s
o
r
b
a
n
c
i
a

5
4
0

n
m
Glu
Curva patrn de Glucosa (g/L) N1
y = 0,4883x + 0,0153
R
2
= 0,996
0,4
r
b
a
n
0
0,2
0,6
1,2
0,5 0,7 1 1,5 1,7 2
Concentracin glucosa (g/L)
A
b
s
o
c
i
m
0,8
1
a

5
4
0
n
67
ANEXO 3
Pruebas preliminares: Determinacin Azcares reductores y Actividad
enzimtica cepas 1, 3,4 y 7

Tabla 8. Azcares reductores (g/L) en el

Tabla 9. Azcares reductores (g/L) en el cultivo de la cepa 3 en diferentes concentraciones
de caldo CMC

cultivo de la cepa 1 en diferentes concentraciones
de caldo CMC
Fuente: Autore

s
Tiempo
(h)
Azcares reductores
(g/L), %(p/v) CMC 1
Azcares reductores
(g/L), CMC 3%(p/v)
Azcares reductores
(g/L), CMC 5%(p/v)
0 0.06 0.055 0.084
1 0.99 0.048 0.085
2 0.028 0.076 0.037
4 0.01 0.072 0.048
6 0.054 0.065 0.076
8 0.26 0.060 0.081
10 0.05 0.089 0.1
12 0.020 0.052 0.058
14 0.072 0.1 0.13
16 0.05 0.05 0.09
18 0.06 0.070 0.069
Fuente: Autores

Tiempo
(h)
Azcares reductores
(g/L),CMC 1%(p/v)
Azcares reductores Azcares reductores
(g/L), CMC 3%(p/v) (g/L), CMC 5%(p/v)
0 0.075 0.079 0.094
1 0.108 0.062 0.090
2 0.030 0.081 0.040
4 0.0076 0.075 0.049
6 0.063 0.069 0.079
8 0.32 0.061 0.088
10 0.049 0.093 0.104
12 0.028 0.055 0.067
14 0.083 0.106 0.11
16 0.062 - 0.10
18 0.065 0.079 -
68
Tabla 10 Azcares reductores (g/L) en cepa 4 en diferentes concentraciones
Fuente: Autores

Tabla Azcares red (g/L) en el cultivo de la cepa 7 en diferentes traciones
de caldo C
Fuente: Autores

el cultivo de la
de caldo CMC

11. uctores c n once
MC
Tiempo
(h)
Azcares reductores
(g/L), CMC 1%(p/v)
(g/L), CMC 3%(p/v) (g/L), CMC 5%(p/v)
0 0.071 0.074 0.07
1 0.046 0.051 0.065
2 0.049 0.06 0.081
4 0.05 0.068 0.05
6 0.06 0.07 0.054
8 0.07 0.06 0.06
10 0.058 0.075 0.043
12 0.07 0.077 0.062
14 0.072 0.069 0.053
16 0.065 0.06 0.068
18 0.063 0.07 0.068
Tiempo
(h)
Azcares reductores
(g/L), CMC 1%(p/v)
(g/L), CMC 3%(p/v) (g/L) CMC 5%(p/v)
0 0.075 0.079 0.094
1 0.108 0.062 0.090
2 0.030 0.081 0.040
4 0.0076 0.049 0.075
6 0.063 0.069 0.079
8 0.32 0.061 0.088
10 0.049 0.093 0.104
12 0.028 0.055 0.067
14 0.083 0.106 0.11
16 0.062 - 0.10
18 0.065 0.079 -
69
Tabla 12. Azcares reductores (g/L) en el cultivo del consorcio (cepas 1, 3, 4 y 7) en caldo
CMC al 1%(p/v) y SVS al 10%(p/v)

Fuente: A

enzimtica del consorcio (cepas 1, 3, 4 y 7) en caldo CMC al 1%(p/v),a
pH7 37C y tiempos de reaccin enzima sustrato de 30, 60 y 120
Fuente: Autores
UC de a como la ca de enzima capaz d r una mol de glucosa por minuto a
pH 7 3

nz a del consorcio (cepa
C y tiempos de reaccin enzima sustrato de 30,60 y 120

Fuente: Autores
UC definida como la cantidad de enzima capaz de liberar una mol de glucosa por minuto a
pH7 37C

utores
Tabla 13 Actividad

finid ntidad e libera
7C
Tabla 14 Actividad e
pH7 37
imtic s 1, 3, 4 y 7) en caldo SVS al 10%(p/v), a
Tiempo(h) Azcares reductores (g/L)
CMC 1%(p/v)
Azcares reductores (g/L)
SVS 10%( p/v)
0 0.0076 0.083
2 0.011 0.08
4 0.03 0.08
6 0.32 0.073
8 0.07 0.120
11 0.02 0.051
15 0 0.036
19 0 0.028
23 - 0.034
Tiempo (h) Actividad enzimtica
(UC) 30
Actividad enzimtica Actividad enzimtica
(UC) 60 (UC) 120
2 0.005 0.012 0.016
4 0.016 .022 43 0 0.0
6 0.002 .016 22 0 0.0
8 0.011 .026 18 0 0.0
11 0.029 0.015 14 0.0
15 - 0.004 0.004
19 - 0.023 0.008
Tiempo (h) Actividad enzimtica
(UC) 30
(UC) 60 (UC) 120
2 0.031 0.024 0.023
4 0.032 0.028 0.023
6 0.003 0.025 0.032
8 0.002 0.025 0.036
11 0.003 0.034 0.013
15 - 0.017 0.017
19 - 0.025 0.023
70

rueba a vidad
enzimtica de Bacillus s Streptomy parado y en
nsorcio

Tabla 15. Azcares reductores (g ctividad enzimtica a C con tiempo de
reaccin enzi sustrato de 60 minutos en el cultivo de Bac . en caldo CMC al
1%(p/v)

Fuente: Autores
UC definida como dad de enzima c liberar una mo cosa
por minuto a pH 7 37C y pH5 50C

Tabla 16. Azcares reductores /L) y Actividad enzi a pH7 37C, pH5 on
tiempo de reaccin enzima-sustrato de 60 minutos en el cultivo de Bacillus sp. o SVS
al 10% (p/v)
Fuente: Autores
UC definida como la cantidad ima capaz de lib mol de glucos inuto
a pH7 37C y pH5 50C

ANEXO 4

P s prelimin res: Determinacin Az
p. (Cepa 8) y
cares reductores y Acti
ces sp. por se
co
/L) y A pH7 37
ma- illus sp

la canti apaz de l de glu

(g mtica 50C c
en cald

de enz erar una a por m

Tiempo (h) Azcares reductores Actividad enzimtica
(g/L) (U 7 37C C) pH
12 0.26 0.025
14 0.23 0.028
16 0.19 0.043
18 0.23 0.033
20 0.20 0.024
22 0.15 0.023
24 1 02 0. 6 0. 5
Tiempo (h) Azcares reductores
(g/L)
(UC) pH7 37C (UC) pH5 50C
12 1.07 0.03 0.04
14 0.88 0.03 0.035
16 0.91 0.03 0.04
18 0.87 0.06 0.05
20 0.81 0.04 0.05
22 0.53 0.04 0.02
24 0.95 - -
71
Tabla 17. Azcares reductores (g/L) y Actividad enzimtica a pH7 37C, con tiempo de
reaccin enzima-sustrato de 60 minutos de Streptomyces sp. en caldo CMC al

Fuente: Autores
UC definida como la cantidad de a capaz de libera de glucosa
por minuto a pH7 37C
Tabla 18. Azcar ductores (g/L) y Actividad enzimtica a pH pH5 50C con
tiempo de reaccin enzima-sustrato de 60 tos en el cultivo d tomyces sp. en
caldo SV 0%(p/v)

Fuente: Autores
UC defin como la cantidad az de libe mol de glucosa inuto
a pH7 37 pH5 50C

en el cultivo
1% (p/v)

(g/L)
Actividad enzimtica
(UC) pH7 37C
12 0.29 0.05
14 0.28 0.05
16 0.26 0.04
18 0.27 0.04
20 0.25 0.03
22 0.24 0.02
24 0.15 0.02

enzim r una mol

es re 7 37C,
minu e Strep
S al 1

ida de enzima cap rar una por m
C y

(g/L)
12 1.173 0.04 0.04
14 1.054 0.04 0.03
16 0.98 0.03 0.03
18 1.30 0.06 0.05
20 1.0 0.04 0.04
22 0.644 0.03 0.02
24 0.876 - -
72
Tabla 19. Azcares reductores (g/L) y Actividad enzimtica a pH7 37C, pH5 50C con
tiempo de reaccin enzima-sustrato de 60 minutos en el cultivo del consorcio (Bacillus sp.y
en caldo Streptomyces sp.) SVS al 10%(p/v)

capaz de liberar una mol de glucosa por minuto a
H7 37C y pH5 50C

Fuente: Autores
UC definida como la cantidad de enzima
p

(g/L)
12 1.109 0.03 0.03
14 1.085 0.04 0.02
16 0.96 0.04 0.04
18 1.092 0.06 0.04
20 1.197 0.04 0.04
22 0.501 0.04 0.02
24 1.095 - -
73
ANEXO 5

azcares reductores y Actividad enzimt Determinacin de ica del consorcio
(Bacillus sp. y Streptomyces sp.) en cultivo discontinuo en SV y SVS al
5%(p/v) y 10% (p/v)

Tabla 20. Azcares reducto ctividad celuloltica en el cultivo del consorcio
celuloltico con SV al 5%

uente: Autores
C definida como la cantidad de enzima capaz de liberar una mol de glucosa por minuto a
H7 37C
Tabla 21. Azcares reductores y Actividad celuloltica en el cultivo del consorcio
celuloltico con SVS al 5%(p/v)
uente: Autores
efinida como la cantidad de enzima capa erar una mol de glucosa por minuto a
pH7 37C

res y A
(p/v)
F
U
p

F
UC d z de lib

Tiempo (h) pH
Actividad celuloltica (UC) pH7
Azcares reductores (g/L) 37C
0 6,18 0,437
6 6,15 0,591 0,0175
12 6,22 0,445 0,0149
16 5,95 0,535 0,0227
18 5,97 0,624 0,0258
20 6,1 0,296 0,0471
22 6,07 0,317 0,0178
Actividad celuloltica (UC) pH7
Tiempo (h) pH Azcares reductores (g/L) 37C
0 5,78 0,378
6 5,82 0,435 0,01185
12 5,86 0,352 0,03027
16 5,88 0,589 0,0178
18 5,84 0,849 0,0357
20 5,81 0,423 0,035
22 5,8 0,419 0,0255
74

Tabla 22. Azcares reductores y Acti ltivo del consorcio

Fuente: Autores
UC d da como tidad de enzim erar una mol de glucosa por minuto
a pH C y pH5
*Valo ados a partir de la curva p e Glucosa N 2

celuloltico con SVS al 10%(p/v)
Fuente: Autores
o la cantidad de enzima capaz de liberar una mol de glucosa por minuto a
vidad celuloltica en el cu
celuloltico con SV al 10%(p/v)
efini la can a capaz de lib
7 37
res hall
50C
atrn d
Tabla 23. Azcares reductores y Actividad celuloltica en el cultivo del consorcio

UC definida com
pH7 37C y pH5 50C
*Valores hallados a partir de la curva patrn de glucosa N 2

Tiempo (h) pH
Azcares reductores*
(g/L)
Actividad celuloltica*
(UC) pH7 37C
(UC) pH5 50C
0 6,27 1,38
6 5,88 1,665 0,1056 0,0394
12 5,87 1,145 0,05074 0,026
16 5,89 0,858 0,042 0,0279
18 5,99 0,02954 0,856 0,0387
20 6,24 0,9 0,0372 0,0291
22 6,31 0,0625 0,0321 1,27
25 6,23 0,647 _ _
Tiempo(h)
Azcares
reductores*
pH (g/L)
(UC) pH7 37C
Actividad celuloltica* (UC)
pH5 50C
0 6,26 1,289
6 5,79 1,474 0,08555 0,0328
12 5,98 1,074 0,0502 02231 0,
16 6,01 0,884 0,04426 16 0,019
18 6,08 0,82 0,0465 42 0,018
20 6,3 0,777 0,04574 77 0,01
22 6,29 1,225 0,0575 92 0,030
25 6,41 0,767 _ _
75
ANEXO 6
Anlisis fisicoqumico del residuo vegetal de crisantemo

PARMETRO RESULTADO UNI DADES MTODO
ANA LTICO
Humedad 7.92 GRAVIMTRICO
(MET. INTERNO
%
Fraccin Min
GRAVIMTRICO
(MET. INTERNO)
eral 2,84 %
Prdidas p
latilizac
GRAVIMTRICO
(MET. INTERNO)
or
Vo in
89,2 %
CARACTERIZAC LA FRACCIN O NICA (89.2 %) IN DE RG
Protena 5,01 %
MICRO-KJELDHAL
(MET. INTERNO)
Celulosa 65,3 % SUMATORIA
Hemicelulosa 2,03 % SUMATORIA
Carbohidratos no
estructurales
16,6 %
COLORIMTRICO
(MET. INTERNO)
Lignina 0,51 %
GRAVIMTRICO
(MET. INTERNO)
Fu
uente: Laboratorio de Anlisis qumicos e insumos agrcolas, AGRILAB

ente: Laboratorio de Anlisis qumicos e insumos agrcolas, AGRILAB

ELEMENTO RESULTADO UNIDADES
MTODO
ANALTICO
FRACCIN OR %) GNI (89.2 CA
Gra 31
GRAVIMTRICO
(MET. INTERNO)
sa 0, %
Fibra C ,4
GRAVIMTRICO
(MET. INTERNO)
ruda 46 %
Extrac
Nitroge
7,5 % RIA
to no
nado
3 SUMATO

ibra det te
,3 %
GRAVIMTRICO
(MET. INTERNO)
ergen
tra
F
68
neu
Fibra detergente
cida
66,3 %
GRAVIMTRICO
(MET. INTERNO)
NUTRIENTES
Fsforo (P
2
O
5
) 0,27 %
COLORIMTRICO
(NTC 234)
Calcio (CaO) 0,69 %
ABS. ATMICA
(MET. INTERNO)
Slice (SiO
2
) 0,55 %
ABS. ATMICA
(MET. INTERNO)
F

76
ANEXO 7
Perfil cromatogrfico
Sob p/v) renadante de la hora seis de fermentacin en SV al 10%(

Fuente: Laboratorio de Ing umica de la Un idad Nacion

eniera Q ivers al de Colombia

77
Perfil cromatogrfico
Sobrenadante de la ho n en SVS al 10%(p/v) ra seis de fermentaci

Fuente: Laboratorio de Ingeniera Qumica de la Universidad Nacional de Colombia

78
ANEXO 8
Anlisis estadstico (SPSS, versin 14.)

Distribucin de datos

Tests of Normality

Kolmogorov-Smirnov(a) Shapiro-Wilk

Statistic df Sig. Statistic df Sig.
AzR
,135 28 ,200(*) ,919 28 ,033
et
* This is a lower bound of the true significance.
a Lilliefors Significance Correction
Resultados arrojados (F
28
=0,919, p=0,033)

Datos normalizados

Tests of Normality

Kolmogorov-Smirnov(a) Shapiro-Wilk

Statistic df Sig. Statistic df Sig.
Log ,136 28 ,196 ,956 28 ,278
a Lilliefors Significance Correction

79

Comparacin de l sustrato vegetal
concentraciones 5%(p/v) y 10%(p/v)
neway Analysis of Log A.R By Concentracion
a liberacin de azcares reductores entre

O
0,3
L
o
g

A
.
R
-0,6
-0,5
-0,4
-0,3
-0,2
-0,1
0
0,1
0,2
10% 5%
entracion Conc

square 0,7622
dj Rsquare 0,742383
oot Mean Square Error 0,120137
ean of Response -0,14997
bservations (or Sum
gts)
14
Test
Difference t-Test DF Prob > |t|
Oneway An
ummary of Fit
ova
S
R
A
R
M
O
W

t-

Estimate 0,398255 6,202 12 <.0001
Std Error 0,064216
Lower 95% 0,258341
Upper 95% 0,538170
Assuming equal variances

80
81
omparacin de la liberacin de azcares reductores entre los medios SV y

neway Analysis of Log A.R By Medio
C
SVS a concentracin de 5%(p/v) y 10%(p/v)
O
L
o
g

A
.
R
-0,6
-0,5
-0,4
-0,3
-0,2
-0,1
0
0,1
0,2
0,3
SV SVS
Medio

neway Anova
0,000039
re -0
uare Error
m
Test
Difference t-Test DF Prob > |t|
stimate

u
O
Summary of Fit
Rsquare
Adj Rsqua ,03842
Root Mean Sq 0,230817
Mean of Response -0,14859
Observations (or Su
Wgts)

28
t-

E -0,00277 -0,032 26 0,9750
Std Error 0,08724
Lower 95% -0,18209
Upper 95% 0,17656
Assuming eq al variantes
Diana Gaitn, Liliana Prez
AISLAMIENTO Y EVALUACION DE MICROORGANISMOS CELULOLITICOS A PARTIR DE
Diana Gaitn, Liliana Prez, Adriana Matiz, Balkys Quevedo
dgaitan@javeriana.edu.co
RESIDUOS VEGETALES FRESCOS Y EN COMPOST GENERADOS EN UN CULTIVO DE
CRISANTEMO (Dendranthema grandiflora)

, liliana.perez @javeriana.edu.co,
amatiz @javeriana.edu.co. bquevedo@javeriana.edu.co.
Departamento de Microbiologa. Pontificia Universidad Javeriana, Cra 7 N 43-88

RESUMEN

El presente trabajo tuvo como objetivo aislar y evaluar microorganismos degradadores de celulosa a
partir de residuos vegetales frescos y en compost de crisantemo. Ocho cepas bacterianas mesoflicas
con actividad celuloltica fueron aisladas y purificadas a partir de residuos vegetales de crisantemo en
compostaje. La actividad celuloltica de estas cepas fue evaluada cualitativamente mediante el revelado
de halos de hidrlisis con rojo congo en medio Carboximetilcelulosa (CMC) al 1% (p/v),
posteriormente, con el objetivo de establecer un consorcio bacteriano celuloltico se realizaron
pruebas de antagonismo para determinar si exista algn tipo de inhibicin entre stas. La actividad
celuloltica de las cepas escogidas fue evaluada mediante la tcnica del cido 3,5-dinitrosaliclico
(DNS) a partir de la cual slo una cepa fue seleccionada para hacer parte del consorcio. Con el fin de
potencializar la actividad de dicha cepa se us un actinomiceto aislado y evaluado en otro estudio.
Estos microorganismos fueron identificados como Bacillus sp. y Streptomyces sp.. La capacidad
degradadora del consorcio sobre el residuo vegetal de crisantemo fue evaluada en dos medios: uno con
sustrato vegetal a concentraciones del 5%(p/v) y 10%(p/v), suplementado con sales (SVS) y otro,
compuesto de sustrato vegetal en las mismas concentraciones, extracto de levadura y peptona (SV),
determinando la concentracin de azcares reductores liberados mediante la tcnica de DNS y la
actividad enzimtica en CMC en buffer fosfato pH7 37C y CMC en buffer cido ctrico pH5 50C.
Los resultados obtenidos mostraron que la degradacin del sustrato vegetal de crisantemo fue mejor
ando las microorganismos actuaron en consorcio demostrando una accin sinrgica entre sus
en el medio SV en una concentracin del 10%(p/v) se di la mayor liberacin
on un valor de 1.665g/L y una actividad enzimtica de 0.1056 UC.
e: actividad celuloltica, ctores, celulosa, residuo vegetal
f isolate and evaluate cellulose degradation by
ilic bacteria wi llulolytic activity were isolation and purified from
es of a composting system of crisantemo. The cellulolytic activity of this microorganism
as evaluated qualitatively through hydrolysis halo using congo red and carboximethylcellulose
%(w/v) as the substrate, afterwards with the objective to create a cellulolytic bacterial
n devel tes rmin ibition existed between them.
tic a electe was e t osalicyc acid (DNS) method,
oorga cted acterial associa the aim of boost the bacteria
oyed a ctinomycete previously isolated and evaluated in other investigation.
ism fied as Bacillus sp. and Streptomyces sp. The degradation capacity of
tion ble wastes of crisantemo was evaluated employing two broths: one of
rent concentrations (5%(w/v) and 10%(w/v)), and additional salts
ble waste with the same concentrations, yeast extract and peptone
(SV) the concentration of reducing sugars was evaluated with DNS method and the cellulose activity
using CMC phosphate buffer pH7 37C and CMC citric acid pH5 50C. The obtained results indicated
that the best degradation of vegetable wastes was using the bacterial association, showing a synergetic
cellulose degradation, furthermore, the SV 10%(w/v) broth showed the best concentration of reducing
sugars (1.665 g/L) and cellulose activity of 0.1056 UC.

Key words: cellulose, cellulolytic activity, reducing sugars, vegetable waste.
cu
enzimas, por otro lado,
de azucares reductores c

Palabras clav azcares redu

ABSTRACT

The present investigation was with
microorganisms. Eight mesoph
vegetable wast
the aim o
th ce
w
(CMC) 1
ssociatio a
T
oped antagonism
ctivity of the s
t for dete
d strain
e if an
valua
y type of inh
ed with dinitr he celluloly
only one micr nism was sele for the b tion. With
activity, empl cellulolytic a
This microorgan s were identi
bacterial associa using vegeta
this with vegetable waste at diffe
(SVS), the other only with vegeta
1
INTRODUCCION
a de las actividades ms desarrollad La floricultura es un as en Colombia. El
crisantemo ocup ctor libera altos
volmenes de re bido a su lenta
degradacin se co iental; prdida de
spacio 2001).
programa de gestin ambiental los residuos vegetales generados son
pilas de compostaje, sin embargo, otra alternativa biotecnolgica es la
del residuo vegetal se realiz a partir de residuos frescos y en compostaje
e un cultivo de crisantemo (Dendranthema grandiflora) localizado en el municipio
se adicion rojo congo al 1%(p/v),
ego de quince minutos se retir el exceso y se adicion NaCl 0.1M, dejando reposar
a el cuarto lugar en flores de exportacin. Este se
siduos vegetales que dificultan su manejo y de
nvierten en un problema de alto impacto amb
e fsico, generacin de plagas, impacto paisajstico etc. (Asocolflores,
Dentro del
atados en tr
utilizacin de microorganismos celulolticos capaces de degradar estos residuos, con
la consecuente produccin de azcares fermentables que a su vez puedan ser usados
como sustrato glicosdico natural y permitan la reduccin en el volumen de los
residuos vegetales generados.

Los microorganismos encargados de la degradacin de la celulosa, principal
componente de la pared celular de las plantas incluyen bacterias y hongos, aerobios,
anaerobios, mesoflicos y termoflicos, los cuales cuentan con la maquinaria
enzimtica necesaria para dicho propsito (Lynd, et al., 2002), por tal razn, su
aislamiento e identificacin representa un importante recurso para lograr la
disminucin del impacto ambiental y la generacin de un sustrato fermentable cuya
utilidad podra estar en la produccin de etanol, obtencin de cidos orgnicos,
edulcorantes, productos farmacuticos y alimentos, entre otros.

METODOLOGIA

Localizacin y condiciones de muestreo

El muestreo
d
de Tocancip cuya temperatura promedio es 13C, una humedad relativa del 80% y
esta ubicado a 2606m.s.n.m. Se tomaron en forma aleatoria cinco submuestras de
residuo fresco de 1 semana de almacenamiento, de 100g cada una, registrando una
temperatura de 18C; en el caso de los residuos en degradacin se muestrearon
diferentes puntos de la pila de compostaje de 4 semanas de degradacin, registrando
una temperatura de 50C y un pH de 8.6.

Aislamiento e identificacin de microorganismos celulolticos

Se pesaron 10 g de las muestras de residuos vegetales frescos y en compostaje, cada
uno de los cuales fueron llevados a 90ml de agua peptonada 0.1%(p/v).
Posteriormente se realizaron diluciones seriadas de 10
-1
a 10
-5
en agua peptonada al
0.1%(p/v). A partir de las diluciones preparadas se realiz siembra en superficie en
agar Carboximetilcelulosa (CMC) al 1%(p/v). Las cajas fueron incubadas a 35
o
C por
48 horas. Transcurrido el tiempo de incubacin
lu
2
por quince minutos ms, para luego hacer el recuento de las colonias que presentaron
alos de hidrlisis (Teather y Wood, 1982).
e presentaron mayor actividad enzimtica, en 10ml de
olucin salina 0.85%(p/v), llevando a incubacin a 100 rpm, 35C durante 14h.
as cepas seleccionadas en la pruebas de antagonismo fueron sometidas a tincin de
cedi a obtener cultivos axnicos en agar CMC 1%(p/v). Se
evaron a cabo suspensiones de cada una de las cepas en caldo celulosa al 1% (p/v).
rol a una concentracin final de 25%(v/v),
osteriormente fueron almacenados a 20C como banco de cepas de la Pontificia
cil Sulfato SDS al 1%(p/v), ebullicin por
n perodo de media hora con SDS al 1% (p/v), lavado con agua, secado a 55C y
.
a concentraciones del 5%(p/v) y 10%(p/v) suplementado con sulfato de amonio
h

Posteriormente se realizaron repiques en agar CMC al 1%(p/v) de las colonias que
presentaron actividad celuloltica, llevando a incubacin y revelado bajo las mismas
condiciones del aislamiento primario. Realizando medicin de los halos de hidrlisis
generados.

Pruebas de antagonismo

Para llevar a cabo las pruebas de antagonismo se sigui el mtodo de Gauze, para lo
cual, se prepar una suspensin de cada uno de los microorganismos seleccionados a
igual concentracin celular, qu
s
(Moreno et al., 2000). Por triplicado se dispusieron sobre agar CMC al 1%(p/v),
2%(p/v) y 3%(p/v) (con siembra masiva del microorganismo a enfrentar), anillos
plsticos estriles de un centmetro de dimetro. Dentro de los anillos se inocul una
suspensin de 50l del microorganismo antagonista y agua destilada estril como
control negativo. Teniendo como criterio de seleccin halos mayores a 5mm (Gauze,
1967).

Conservacin de cepas

L
Gram y luego se pro
ll
Estas suspensiones se mezclaron con glice
p
Universidad Javeriana (Poutou, et al., 1994).

Caracterizacin y procesamiento del residuo vegetal

Los residuos vegetales frescos provenientes del cultivo de crisantemo fueron
sometidos a una caracterizacin fsico-qumica. Para el procesamiento de dicho
residuo se llev a cabo el siguiente protocolo: lavado con agua, reduccin de tamao
mediante picado, lavado con Sodio Dode
u
finalmente molienda en molino Industrial. (Guevara, et al., 2003)

Proceso de fermentacin en cultivo discontinuo

Utilizacin del sustrato vegetal por parte de los microorganismos celulolticos
seleccionados

Para la realizacin de este proceso se emplearon dos medios: uno con sustrato vegetal
3
(0.5g/L), cloruro de calcio (0.5g/L), fosfato monobsico de potasio (0.1g/L), fosfato
dibsico de potasio (0.1g/L), llamado medio sustrato vegetal suplementado (SVS) y
tro, compuesto de sustrato vegetal en las mismas concentraciones, extracto de
as curvas preliminares para evaluar el comportamiento enzimtico y la subsecuente
ctores utilizando las cepas aisladas y seleccionadas en las
ruebas de antagonismo, se llevaron a cabo en caldo CMC al 1%(p/v), 3%(p/v) y
trico pH5 50c, evaluando tiempos de reaccin enzima-sustrato de 30, 60 y
20.
ruebas Consorcio
terias y recuento de conidios en cmara
e Neubawer, para microorganismos filamentosos. A partir de los muestreos
mediante DNS y actividad
nzimtica en CMC al 1% (p/v) en buffer fosfato pH 7 37C y CMC al 1%(p/v) en
inmediatamente
entrifugadas durante 20 minutos a 100 rpm, a partir del sobrenadante se tom un
olumen de 0.25 ml, al cual se adicion 0.25 ml de DNS, esta mezcla se someti a
la mezcla se llev a un recipiente
on hielo durante 5 minutos y posteriormente se adicionaron 2.5 ml de agua destilada.
trar la absorbancia generada, la cual se reemplaz en la
cuacin de la lnea recta arrojada por la curva patrn previamente realizada, para la
o
levadura y peptona llamado medio sustrato vegetal (SV).

Pruebas preliminares cepas seleccionadas

L
liberacin de azcares redu
p
5%(p/v) y caldo SVS al 10%(p/v).

Inicialmente, estas cepas fueron reactivadas del banco. A partir de cada cepa se
prepar un inoculo en caldo CMC 1%(p/v) llevando a una concentracin de 3 x 10
8

cel/ml e incubando a 35C y 120 rpm. Transcurrido el tiempo de incubacin, 25ml de
inculo fueron adicionados a cada uno de los caldos de fermentacin, con un VET de
250ml y condiciones de operacin de 35C y 120rpm. En cada una de las horas de
muestreo se determinaron azcares reductores mediante la tcnica de DNS y
actividad enzimtica utilizando CMC en buffer fosfato pH7 37C y CMC en buffer
cido c
1

P

Para evaluar la actividad hidroltica de las cepas en consorcio se realizaron
fermentaciones en caldo CMC al 1%(p/v), caldo SV y SVS en concentraciones del
5%(p/v) y 10%(p/v), cada uno; incubando a 35C y 120 rpm. Adicionando un inculo
de volmenes iguales de cada cepa a evaluar. La biomasa inicial fue determinada
mediante recuento en placa, en el caso de bac
d
realizados la determinacin de azcares reductores
e
buffer cido ctrico pH 5 50C, relacin 1:1 con tiempo de reaccin enzima-sustrato
de 60 minutos.

Determinacin de azcares reductores

Las muestras tomadas en cada hora de fermentacin fueron
c
v
ebullicin por 5 minutos, transcurrido este tiempo,
c
Esta solucin fue leda en el espectrofotmetro a una longitud de onda de 540 nm y
sensibilidad media, para regis
e
obtencin de la concentracin de azcares reductores en cada hora de muestreo
(Miller, 1959).
4

Determinacin de actividad celuloltica

Se prepararon dos soluciones de carboximetilcelulosa al 1%(p/v), una en buffer
reparacin de la Solucin de CMC al 1%(p/v) en buffer fosfato 0.1M pH7.0
ha preparacin se realiz para evaluar la reaccin
nzima-sustrato durante el tiempo de reaccin establecido para cada curva, incubando
erminacin de la actividad enzimtica con buffer cido ctrico pH 5.0 se llev a
abo haciendo reaccionar 1 ml de extracto crudo correspondiente a cada hora de
de la solucin de CMC en buffer cido ctrico pH 5.0. Esta
reparacin se realiz para evaluar la reaccin enzima-sustrato durante 60 minutos a
hidroltica sobre el sustrato evaluado. Las cepas fueron identificadas
ediante evaluacin de caractersticas macroscpicas, microscpicas y
on el Manual de Bergeys de Bacteriologa
istemtica.
fosfato 0.1M pH7.0 y otra en buffer cido ctrico pH 5.0.

P

Se tom 1ml de extracto crudo correspondiente a cada tiempo de muestreo de cada
una de las fermentaciones para hacerlos reaccionar con 1 ml de la solucin de CMC
1%(p/v) en buffer fosfato pH7. Dic
e
a 37C en bao termostatado. Transcurrido el tiempo de incubacin las muestras
fueron llevadas a un recipiente con hielo durante diez minutos para frenar la reaccin
enzimtica, posteriormente se centrifugaron por 20 minutos a 100 rpm. A partir de
los sobrenadantes se tomaron 0.25 ml para evaluar la concentracin de azcares
reductores liberados, empleando la tcnica de DNS (Dvila, et al., 2002).

Solucin de CMC al 1%(p/v) en buffer cido ctrico 0.1M pH5.0

La det
c
muestreo con 1ml
p
50C. Transcurrido cada tiempo de incubacin se detuvo la reaccin en hielo por 10
minutos para posteriormente ser centrifugado por 20 minutos a 100 rpm. A partir del
sobrenadante se tomaron 0.25 ml para evaluar la concentracin de azcares
reductores liberados, empleando la tcnica de DNS (Adrado, et al., 2005).

Identificacin Bioqumica

La identificacin bioqumica se realiz a los microorganismos que finalmente fueron
seleccionados para conformar el consorcio microbiano celuloltico, por presentar la
mejor actividad
m
comportamiento metablico de acuerdo c
S

Evaluacin de azcares fermentables en el extracto crudo

El extracto crudo correspondiente a la hora de fermentacin en la que se present la
mayor liberacin de azcares reductores fue evaluado mediante cromatografa lquida
(HPLC) con el fin de determinar el tipo y concentracin de los azcares reductores
presentes.

Anlisis Estadstico

5
El anlisis estadstico de los datos obtenidos durante la prueba experimental se realiz
ormal de los datos mediante la prueba de
hapiro Wilk y como prueba paramtrica T student, utilizando el programa
ADOS Y DISCUSIN
Aislamiento de microorganismos celulolticos
or ende su
oblacin (Granados y Valderrama, 2003).
La actividad celuloltica se evidenci mediante evaluacin cualitativa con el revelado
as en agar
MC, alcanzaron valores de 6.4cm, demuestran una baja actividad celuloltica de las

determinando inicialmente la distribucin n
C
estadstico SPSS, versin 14.

RESULT

Los residuos vegetales frescos de crisantemo no permitieron el aislamiento de
microorganismos con actividad celuloltica, mientras que a partir de los residuos
vegetales en compostaje se logr el aislamiento de 8 cepas bacterianas mesoflicas
con dicha actividad, esta diferencia probablemente se debi a que en el proceso de
compostaje la actividad metablica microbiana se incrementa, adems, el tiempo de
degradacin transcurrido, la alta temperatura y el pH alcalino permitieron el
aislamiento de microorganismos celulolticos, pues dichas condiciones facilitan que
bacterias esporgenas y actinomicetes incrementen su actividad y p
p

de zonas de aclaramiento utilizando rojo congo al 1%(p/v) como ha sido reportado
por diferentes autores (Hendricks et al, 1995; Lu et al, 2005; Zhang et al, 2006). El
dimetro de los halos de hidrlisis generados no fue establecido para la mayora de
las cepas, pues, se obtuvieron zonas de aclaramiento que se difundieron en todo el
medio; una alta actividad hidroltica en CMC 1%(p/v); sin embargo, en el caso de la
cepas 2, 6 y 8 el dimetro del halo fue de 0.3, 0.2 y 0.35 mm, respectivamente
(figura 1), que comparados con el estudio realizado por Lu, et al. (2005), en el que
los dimetros de hidrlisis de las cepas aisladas de tallos de flores cultivad
C
cepas 2, 6 y 8 en este medio.

Cepa 1 Cepa 2

Cepa 6 Cepa 8
1. Zonas de aclaramiento en agar CMC 1%(p/v)
Fuente: Autores
Fig
6

Pruebas de Antagonismo

Con el fin de potencializar la actividad celuloltica de algunos de los
icroorganismos aislados, se plante la posibilidad de establecer un consorcio
cesario realizar pruebas de antagonismo que
escartaran aquellas cepas que generaran algn tipo de inhibicin sobre las dems.
al 1%(p/v) la cepa 8 tuvo la mayor
ctividad antagnica frente a las dems cepas evaluadas generando el mximo halo de
m
microbiano para lo cual fue ne
d
Durante las pruebas de antagonismo en agar CMC
a
inhibicin (7.5 mm) frente a la cepa 1 (Figura 2), por lo que en un principio fue
descartada como parte del consorcio microbiano.

Fig 2. Antagonismo cepa 8 frente a cepa 1
nciada durante el desarrollo de las pruebas en CMC al
%(p/v) y 2 %(p/v) demuestra que a pesar de tratarse de microorganismos aislados de
una misma fuente puede generarse inhibicin entre ellos, una posible explicacin a
este hecho es que existan diferencias en la complejidad del sistema enzimtico que
les permite degradar el sustrato, generando diferentes tasas de crecimiento y dando
lugar a una competencia por sustrato y espacio

Los resultados obtenidos itieron seleccionar a las
cepas 1, 3, 4 y 7 como parte del consorcio m

Pretratamiento del Residuo Vegetal

En este estudio los residuos vegetales de crisantemo fueron sometidos a un
pretratamiento mecnico el cual involuc ao del material
de m
la obtencin
e favorecer el
acceso de las enzimas hidrolticas ilit la preparacin de los medios
Fuente: Autores

Las pruebas de antagonismo tambin se realizaron en concentraciones de CMC al 2 y
3 % (p/v) con el fin de determinar si el comportamiento antagnico y crecimiento de
cada cepa se mantena a pesar del incremento en la concentracin de la fuente de
carbono y de alguna manera evaluar la inhibicin por sustrato de las cepas
seleccionadas.

En la concentracin de 2%(p/v) en agar CMC las cepas 2, 5 y 6 quedaron descartadas
para ser parte del consorcio.
La actividad antagnica evide
1
en agar CMC al 3%(p/v), perm
icrobiano celuloltico.
r la reduccin de tam
odificar la estructura celulsico por cortado, molienda y pulverizacin con el fin
cristalina de la celulosa. El pretratamiento mecnico utilizado permiti
de un tamao de partcula muy pe 50) que adems d queo (menor a 8
del consorcio fac
7
de produccin y el seguimiento de las f rmentaciones realizadas. Krishna (1999)
sta condicin pues afecta la relacin rea/ volumen y la
ensidad de empaquetamiento que determina la fraccin de sustrato inicialmente
uebas de antagonismo se realizaron
ruebas preliminares para evaluar la capacidad celuloltica de cada una de ellas
determinando la liberacin de azcares reductores por la tcnica de DNS
(Miller,1959) y utilizando como sustrato CMC al 1%(p/v), 3%(p/v), y 5%(p/v), los
resultados indicaron una actividad celuloltica nula en todas las cepas, en las tres
concentraciones y durante las veinte horas de fermentacin, lo cual indic la falta de
concordancia entre la evaluacin cualitativa y cuantitativa de actividad, una posible
explicacin de este hecho es que en la prueba cualitativa, el microorganismo
permaneci en conta bacin, aumentando
as la probabilidad de liberar las as para degradar el polisacrido;
ientras que en la tcnica de actividad cuantitativa por DNS, el extracto enzimtico
or esta tcnica, a pesar de que la prueba se realiz en condiciones de
H y temperatura ptimos para la deteccin de las enzimas encargadas de la
nula. Con base en estos resultados se
ecidi buscar una segunda opcin que incluy la evaluacin de la cepa 8 que haba
VS al 10%(p/v)
eterminando azcares reductores y actividad enzimtica, alcanzndose valores
io propuesto.
e
report la importancia de e
d
accesible al microorganismo. Esta relacin se incrementa cuando el tamao de
partcula disminuye determinando as el espacio vaco que es ocupado por el aire,
aumentando la tasa de transferencia de oxigeno que afecta directamente el
crecimiento de los microorganismos.

Evaluacin preliminar de la actividad celuloltica de las cepas aisladas

Con las cepas seleccionadas (1, 3, 4 y 7) en las pr
p
cto con el sustrato durante 48 horas de incu
enzimas necesari
m
entr en contacto con la celulosa con un tiempo de reaccin de 60 minutos que
probablemente no fue suficiente para que se diera una reaccin enzima-sustrato
completa, o, la cantidad de enzima presente en el sobrenadante no era suficiente para
hidrolizar la celulosa o para obtener cantidades de azcares reductores que pudieran
ser detectados p
p
degradacin del sustrato.

Evaluacin preliminar de la actividad celuloltica del consorcio

Al evaluar la actividad celuloltica de las cepas 1, 3, 4 y 7 en consorcio, los resultados
obtenidos tanto en la fermentacin realizada en caldo CMC al 1%(p/v) como en caldo
SVS al 10%(p/v), mostraron que la cantidad de azcares reductores y la actividad
enzimtica del consorcio en los dos sustratos fue
d
sido inicialmente descartada en las pruebas de antagonismo, para lo cual, se
realizaron fermentaciones en caldo CMC al 1%(p/v) y S
d
mayores a los obtenidos con el consorc

Con el objetivo de potencializar la actividad enzimtica de la cepa 8, teniendo en
cuenta que fue un microorganismo nativo del sustrato vegetal a evaluar y, que
durante la realizacin de las pruebas de antagonismo se caracteriz por inhibir a las
dems cepas, probablemente por tener una alta tasa de crecimiento que lo haca
competitivo por espacio y nutrientes y basados en que el sinergismo de las enzimas
celulolticas hacen posible la hidrlisis de celulosa a glucosa (Lu, et al., 2005;
8
Malherbe y Cloete, 2002) se evalu el efecto sinrgico entre la cepa 8 y un
actinomiceto aislado a partir de suelo, en cultivo de Stevia con buena actividad
celuloltica cualitativa en CMC al 1% (p/v), (halos de hidrlisis de 2.14cm de
dimetro) (Gutirrez, et al., 2002) aislado de suelo. Para lo anterior se realizaron
curvas de cada microorganismo por separado en caldo SVS al 10%(p/v) con el fin de
evaluar la actividad enzimtica sobre dicho sustrato. Los dos microorganismos
presentaron una degradacin del sustrato vegetal de crisantemo, lo que se evidenci
on la cuantificacin de azcares reductores (Figura. 3)
juegan un papel importante en la biodegradacin y
do el aislamiento
ompostaje (Lu et
an reportado buenos resultados,
c

Fig.3 Azcares reductores en el cultivo de cepa 8 y actinomicete en SVS al 10% (p/v).

Identificacin Bioqumica
Los resultados del perfil bioqumico y la observacin de las caractersticas macro y
microscpicas realizadas a la cepa 8 y el actimomicete permitieron identificarlos
como Bacillus sp. y Streptomyces sp.

Tanto Bacillus sp. como Streptomyces sp. han sido reportados como microorganismos
con alta actividad celuloltica. Muchas especies del gnero Bacillus estn
normalmente presentes en el suelo y en la materia orgnica en degradacin, por lo
ue se considera que
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
12 14 16 18 20 22 24
Tiempo (h)
A
z
c
a
r
e
s

r
e
d
u
c
t
o
r
e
s
(
g
/
L
)
1,4
CEPA 8 EN SVS 10%(p/v) ACTINO EN SVS 10%(p/v)
q
bioconversin de componentes de alto peso molecular. Se ha realiza
e Bacillus licheniformis a partir de residuos vegetales de flores en c d
al., 2005) y Bacillus subtilis en muestras de suelo y agua en la regin amaznica
(Heck et al., 2002), en residuos de banano (Krishna, 1999), y en fibras de palma
(Apun et al., 2000), en los que dicho gnero bacteriano ha demostrado un alto
potencial celuloltico.

Por otro lado, Streptomyces sp. ha sido muy estudiado debido a que es parte
importante de la comunidad microbiana del suelo responsable de la degradacin y
recirculacin de biopolmeros como la celulosa, la hemicelulosa y la lignina (Semedo
et al., 2004). Los estudios realizados con este microorganismo en cuanto a su
apacidad hidroltica en materiales lignocelulsicos h c
como es el caso de Streptomyces drozdowiczii y Streptomyces cellulolyticus asilados
de muestras de suelo (Semedo et al., 2004; Grigorevski et al., 2005; Li, 1997).
Ramrez y Coha (2003) aislaron 145 cepas de actinomicetos celuloltcos entre los
cuales Streptomyces sp. tuvo una prevalencia de 50.63% y adems mostr los ms
altos niveles de actividad enzimtica en el estudio.

9
10
urante las curvas realizadas con el consorcio microbiano en SV y SVS al 5% (p/v)
e obtuvieron valor
respectivamente en la h cin, (Figura 4) mientras que, en SV y
SVS al 10% (p/v) se alcanzaron valores de 1.665 y 1.474g/L, respectivamente en la
hora seis de fermentacin (Figura 5). Los resultados de la cromatografa liquida
realizada a los sobrenadantes obtenidos en la hora seis de las fermentaciones en los
medios al 10% (p/v) mostraron la presen ia de glucosa y fructosa como azcares
reductores. En el medio SV la glucosa se ncontr en una concentracin de 0.5g/L,
mientras que, en el medio SVS adems de a glucosa en una concentracin de 0.4g/L
se n
inferir en primer lugar que el sustrato vegetal de crisantemo a concentracin de
dad hidroltica del consorcio microbiano, generndose
una fuente de carbono, nitrgeno y minerales

Utilizacin del sustrato vegetal por parte del consorcio celuloltico

Teniendo en cuenta la actividad hidroltica de Streptomyces sp. y Bacillus sp. en el
residuo vegetal a evaluar (Figura 3); y con el objetivo de potencializar la degradacin
del sustrato por una posible accin sinrgica entre las enzimas de cada cepa, se
realizaron curvas en las que los microorganismos actuaron en consorcio.

D
s es mximos de azcares reductores de 0.624 y 0.849g/L,
ora 18 de fermenta
c
e
l
detect fructosa en una concentracin de 1.4g/L. Estos resultados permitiero
10%(p/v) estimul la activi
diferencias significativas (p<0.05) con la actividad hidroltica al 5% (p/v), en segundo
lugar, que la adicin de sales al medio de produccin no gener diferencias
significativas (p>0.05) en la liberacin de azcares reductores, lo que demuestra que
l residuo vegetal de crisantemo provee e
que suplen los requerimientos nutricionales necesarios para el crecimiento y la
actividad metablica de los microorganismos evaluados, as mismo, los resultados de
la cromatografa lquida corroboraron que la suplementacin del medio sustrato
vegetal no gener un incremento en la conversin de celulosa a glucosa, por el
contrario la concentracin de este azcar fue mayor en el medio sin suplemento. Sin
embargo, se esperaba una mayor concentracin de azcares reductores teniendo en
cuenta que el residuo vegetal de crisantemo contena un alto porcentaje de celulosa
(65.3%) de acuerdo al anlisis fisicoqumico realizado.

0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0 6 12 16 18 20 22
Tiempo (h)
A
z
c
a
r
e
s

r
e
d
u
c
t
o
r
e
s

(
g
0,8
0,9
/
L
)
SV 5% (p/v) SVS 5% (p/v)

Fig. 4 Azcares reductores en el cultivo del consorcio (Bacillus sp. y Streptomcyes sp. en SV
y SVS al 5% (p/v)


Fig. 5 Azcares reductores en el cultivo del consorcio (Bacillus sp. y Streptomcyes sp.) en
SV y SVS al 10% (p/v)

Por otro lado, al comparar la concentracin de azcares reductores obtenidos en las
pruebas preliminares en las que Bacillus sp. y Streptomyces sp. actuaron
individualmente en la degradacin de SVS al 10%(p/v), con los obtenidos con el
consorcio (Bacillus sp.- Streptomyces sp.) el mismo sustrato y a la misma
concentracin, demuestran que se estableci un sinergismo en el que probablemente
se logr una complementariedad entre las enzimas celulolticas que favorecieron la
degradacin del sustrato con el consecuente aumento en la liberacin de azcares
reductores (Figura 6).

0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
0 6 12 14 16 18 20 22 24 25
Tiempo (h)
A
z
c
a
r
e
s

r
e
d
u
c
t
o
r
e
s

(
g
/
L
)
Bacillus sp. Streptomyces sp. consorcio

ig 6. Azcares reductores en los cultivos de Bacillus sp.y Streptomyce F s sp.(individual y en
consorcio) en SVS al 10%(p/v)
Condiciones de pH y Temperatura durante la Fermentacin

Durante las curvas de degradacin del residuo vegetal realizadas, el pH y la
temperatura se mantuvieron en un valor cercano a 6.0 y 35C, respectivamente.
Krishna (1999), report que el pH y la temperatura de la fermentacin tienen una gran
influencia en la produccin de enzimas celulolticas, en su investigacin la mayor
produccin se alcanz a un pH de 7.0 m nteniendo una temp atura constante de
temperatura de operacin en esta in drlisis del residuo
vegetal.

a er
35C, sin embargo, el autor reporta otros estudios donde a un pH de 6.0 se da la
mayor liberacin enzimtica, lo que permite afirmar que tanto el pH como la
vestigacin favorecieron la hi

0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
0 6 12 16 18 20 22 25
Tiempo (h)
A
z
c
a
r
e
s

r
e
d
u
c
t
o
r
e
1,4
s

(
g
1,6
1,8
/
L
)
SV 10%(p/v) SVS 10%(p/v)
11
Actividad Enzimtica y liberacin de azcares reductores a partir del residuo
egetal de Crisante

El nivel m con SV al 10%(p/v) en
o la cantidad de
enzima capaz de liberar un m nuto) (Figura 7) valor que
coincidi con la ma o sustrato. Sin embargo,

li

Por otro lado, la actividad enzim e 50C fue
menor, demostrando que dicha actividad vara de acuerdo a las condiciones de pH y
v mo.
s alto de celulasas se produjo en la fermentacin
la hora 6, pH7 37C con un valor de 0.1056 UC (UC definida com
icromol de glucosa por mi
yor concentracin de azcares en el mism
no existieron diferencias significativas (p>0.05) en la concentracin de celulasas
beradas en los medios SV y SVS en las concentraciones evaluadas.
tica a pH cido y una temperatura d
la temperatura en la que es evaluada (p<0.05). Una explicacin a este hecho puede ser
que en condiciones naturales la actividad hidroltica de la celulosa se ve afectada
cuando el pH del suelo es cido, como es el caso de Cellulomonas sp., cuyo
comportamiento metablico se ve influenciado bajo estas condiciones (Lynd et
al.,2002)

0
0,02
0,04
0,06
0,08
0,1
0,12
U
C
)
0 6 12 16 18 20 22 25
Tiempo (h)
A
c
t
i
v
i
d
a
d

e
n
z
i
m
t
i
c
a

(
UC pH7 37C UC pH 5 50C

Fig.7 Actividad enzimtica en el cultivo del consorcio (Bacillus sp. y Streptomyces sp.) en
SV al 10% (p/v), bajo condiciones de pH7 37C y pH 5 50C

La actividad enzimtica del consorcio evaluada en SV y SVS en concentraciones de
5%(p/v) y 10%(p/v), no es comparable con los resultados reportados por otros
aterial celulsico difiere e icas como son: el tamao
y las molculas de
de la celulosa, la
lado, las interacciones complejas entre las enzimas encargadas de hidrolizar
celulosa (endoglucanasas, exoglucanasas y -glucosidasas ) y los cambios en las
estudios en los que tambin se ha realizado la evaluacin de microorganismos
celulolticos en residuos celulsicos (Lu et al 2005), (Krishna, 1999), debido a que el
n sus caractersticas fsico-qum m
y la superficie de las fibrillas, el espacio entre las microfibrillas
elulosa en las regiones amorfas, el grado de cristalinidad c
conformacin estereoscpica y la rigidez de las unidades de celulosa, el grado de
polimerizacin de la celulosa, la naturaleza de los componentes con los que la
celulosa esta asociada, la naturaleza, concentracin y distribucin de grupos
sustituyentes (Malherbe y Cloete, 2002; Petre et al., 1999; Zhang et al., 2006).
Dichos parmetros condicionan drsticamente la habilidad de los microorganismos
celulolticos para degradar este tipo de sustratos, lo cual explica que el
comportamiento metablico sea especfico y por ende, la acumulacin del producto
de hidrlisis difiera de un ensayo a otro. (Zhang et al., 2006).

or otro P
la
12
caractersticas del sustrato durante la hidrlisis han sido simulados por modelos
matemticos aplicados a una variedad de materiales lignocelulsicos, dicho modelo
ugiere que es casi imposible la prediccin del funcionamiento hidroltico de una
urante las pruebas realizadas se observaron marcadas diferencias entre la actividad
n esta investigacin el screening se realiz en agar CMC al 1%(p/v) (sustrato
celulsico soluble), posteriormente la induccin de enzimas en residuos vegetales de
crisantemo (sustrato insoluble) y la cuantificacin de dichas enzimas fue llevada a
cabo en CMC al 1% (p/v) en buffer fosfato pH7 y en buffer cido ctrico pH5. La
utilizacin de sustratos con diferente tipo de solubilidad probablemente influy en la
variacin de los resultados, pues la relacin existente entre la tasa de hidrlisis
obtenida en sustratos solubles e insolubles no es clara, principalmente porque existen
diferencias en la accesibilidad de las enzimas al sustrato y el grado de polimerizacin
(Zhang et al., 2006), lo cual explica la obtencin de halos de dimetro incuantificable
y
enzimtica ev omo para el
onsorcio. Este mismo autor concluy que los datos obtenidos en la hidrlisis de
ichos microorganismos
resentes en la biosfera (Howard et al., 2003)
s
mezcla de celulasas de un sustrato a otro debido a variaciones como la concentracin
de celulasas, la proporcin endo/exocelulasas, el tiempo de reaccin y las
caractersticas del sustrato (Zhang et al, 2006). De esta manera, la actividad
celuloltica de los microorganismos va a ser especfica para cada sustrato celulsico a
evaluar.

D
celuloltica cualitativa y cuantitativa evaluada, lo cual puede estar directamente
relacionado con el tipo de sustrato en el que se realizaron dichas pruebas, pues, segn
Zhang et al., (2006), es necesario tener en cuenta la solubilidad o insolubilidad en
agua del sustrato que se quiere evaluar ya que determina los parmetros para realizar
el screening y determinacin de la actividad enzimtica de microorganismos con
capacidad celuloltica.

E
su baja correlacin con los niveles de azcares reductores obtenidos y la actividad
aluada tanto para las cepas inicialmente aisladas c
c
sustratos solubles no pueden ser comparados con la hidrlisis de sustratos insolubles.

Otro de los factores que pudo haber influido en la variacin de los resultados es el
tiempo de fermentacin y el de reaccin enzima-sustrato durante las pruebas de
actividad enzimtica, si se tiene en cuenta que la lignocelulosa pretratada utilizada
para evaluar la actividad enzimtica de preparaciones comerciales de celulasas,
requiere un rango de tiempo que va de minutos a horas para que inicie la hidrlisis y
hasta varios das para obtener una digestibilidad final (conversin de la celulosa)
(Zhang et al., 2006), las evaluaciones realizadas requeran un mayor tiempo de
reaccin que diera lugar a la obtencin de mejores resultados.

Finalmente, se puede considerar la importancia de continuar realizando screening de
microorganismos celulolticos pues la utilizacin de estos se convierte en una
alternativa viable para el tratamiento de residuos celulsicos, pues tan solo se ha
identificado y evaluado menos del 1% del potencial de d
p

13
CONCLUSIONES

Se logr el aislamiento de ocho cepas con actividad celuloltica en CMC 1%
(p/v) a partir de residuos vegetales de crisantemo en compostaje

No se estableci una relacin directa entre la actividad celuloltica cualitativa
y cuantitativa de los microorganismos evaluados durante el estudio.

La mayor concentracin de azcares reductores y actividad enzimtica se
necesario suplementar el residuo con sales.

Dvila, D; Lpez, L; Pedroza, A. 2002 Evaluacin de diferentes soportes para
ctividad Proteoltica y
Amiloltica de Actinomycetes termoflicos aislados a partir de pilas de
g agro-industrial by-products and its
potential use in the detergent and textile industries. Enzyme and Microbial
Technology. 37: 272277.
obtuvieron en el cultivo del consorcio (Bacillus sp. y Streptomyces sp.) en SV
10% (p/v).

El residuo vegetal de crisantemo aport los nutrientes necesarios para
estimular la actividad enzimtica de los microorganismos evaluados por lo
cual no se hace
LITERATURA CITADA
Adrado, B; Chpeborska, P; Galbe, M; Zacchi, G. 2005. Ethanol production
from non-starch carbohydrate of wheat bran. Bioresource Technology.
96:843-850.

Apun, K; Jong, B; Salleh, M. 2000. Screening and isolation of a cellulolytic
and amylolytic Bacillus from sago pith waste. J. Gen. Appl. Microbiol. 4:263-
267.

Asocolflores. Florverde, el programa social y ambiental de la floricultura
Colombiana. Revista Asocolflores. 61:23

la preformulacin de un producto termoflico acelerador de compostaje. Tesis
de Pregrado. Microbiologa Industrial. Facultad de Ciencias. Pontificia
Universidad Javeriana. Bogot

Gauze, G. 1967. Conferencia de Antibiticos elaborados por hongos. La
Habana. Cuba. Editorial Universitaria La Habana.

Granados, L; Valderrama, J. 2003. Evaluacin de la A
compost. Tesis de Pregrado. Microbiologa Industrial. Facultad de Ciencias
Pontificia Universidad Javeriana. Bogot

Grigorevski, A; Nascimento, R;Bonb, E; Coelho, R. 2005. Streptomyces
drozdowiczii cellulase production usin
14

Guevara, C; Paez, A; Zambrano, M. 2003. Determinacin de actividad
icrobiologa
Industrial. Pontificia Universidad Javeriana. Facultad de ciencias. Bogot.

cnica de
deteccin de -1,4 glucanasas con el uso de sustratos fluorgenos en suelos
ciencias. Bogot.
Heck,J; Hertz, P; Ayub, M.2002. Cellulase and Xylanase production by

Hendricks, C. Doyle, J and Hugley, B. 1995. A New Solid Medium for
se-Utilizing Bacteria in Soil. Appl. Environ. Microbiol.

Bacteriology. Novena Edicin. Lippincott Williams & Wilkins.
Pg. 605-607

chnology: issues of bioconversion and enzyme production. African
Journal of Biotechnology. 2: 602-619.

cterial cellulases by solid state
bioprocessing of banana wastes. Bioresource Technology. 69:231-239.

g bacteria from flower
stalks-vegetable waste co-composting system. J.Gen. Appl. Microbiol. 51:

logy. Microbiology and Molecular
Biology Reviews. 16: 577-583.

celuloltica y establecimiento de un consorcio bacteriano aislado de diferentes
regiones y sustratos del pas. Tesis de Pregrado. Carrera de M
Gutirrez, V; Martinez, M; Pinzn, A. 2007. Estandarizacin de la t
provenientes de cultivos de Stevia Rebaudiana bertoni. Tesis de Pregrado.
Carrera de Microbiologa Industrial. Pontificia Universidad Javeriana.
Facultad de

isolated amazon Bacillus strains using soybean industrial residue based solid-
state cultivation. Brazilian journal of microbiology. 33: 213-218.
Enumerating Cellulo
61: 2016-2019.
Holt, J; krieg, N; Sneath, P; Staley, J; Williams, S. 2000. Bergeys Manual of
Determinative
Howard, R ; Abotsi, E; Rensburg, J; Howard,S. Lignocellulose
Biote
Krishna, C. 1999. Production of ba
Li, X. 1997. Streptomyces cellulolyticus sp. nov., a New Cellulolytic
Member of the Genus Streptomyces. International journal of systematic
bacteriology. 47: 443-445.
Lu, W. Wang, H. Yang, S. Wang, Z. Nie, Y. 2005. Isolation and
characterization of mesophilic cellulose-degradin
353-360.
Lynd, L., Weimer, P., Zyl, H., Pretorius, I. 2002. Microbial cellulose
utilization: Fundamentals and Biotechno
Malherbe, S y Cloete, T. E. 2002. Lignocellulose Biodegradation:
Fundamentals and applications. Re/Views in Environmental Science &
Bio/Technology 1:105-114.
15

Miller, G.1959. Use of Dinitrosalisyc Acid Reagent for determination of
reducing sugar. Analytical chemistry. 31:426-428
Moreno, B.; Diez, V.; Garca, M.; Menes,L.;Gutierrez, M.; Polledo,F. 20 00.
Comisin Internacional de especificaciones microbiolgicas alimentaras.

ls. Resourses, Conservation and
Recycling 27:309-332.

ombinantes.
Centro de Ingeniera Gentica y Biotecnologa Aplicada. Sociedad

oha, J. 2003. Degradacin enzimtica de celulosa por
actinomicetos termfilos: Aislamiento, caracterizacin y determinacin de la

omes, C; Lindares, A; Duarte, G; Nascimento, R; Rosado, A;
Pinheiro, M; Margis, R; Silva, K; Alviano, C; Manfio, G; Soares, M;
28.
bovine
rumen. Appl Environ. Microbiol. 43: 777-780

nd selection strategies. Biotechnology Advances.
24: 452-481.

ICMFS. Editorial Acribia. Zaragoza (Espaa). Pg. 125-126
Petre, M; Zaharea, G; Adrian, P; Gheorghiu, E. 1999. Biodegradation and
Bioconversion of cellulose wastes using bacterial and fungal cells
immobilized in radiopolymerized hydroge

Poutou, R.; Amador, E.; Candelario,M. 1994. Banco de clulas primario
(BCP): Caracterizacin y papel en la produccin de protenas rec
Iberoamericana de Biotecnologa. 11:55-59
Ramrez, P; C
actividad celuloltica. Rev. Per. Biol. 10: 67-77.
Semedo, L; G
Lindares, L; Coelho, R. 2004. Streptomyces drozdowiczii sp. nov., a novel
cellulolytic streptomycete from soil in Brazil. Journal of Systematic and
Evolutionary Microbiology. 54:1323-13

Teather, R; Wood, P.1982. Use of congo red polysaccharide interaction in
enumeration and characterization of cellulolytic bacteria from the
Zhang, Y. Himmel, M. Mielenz, J. 2006. Outlook for cellulase
improvement: Screening a

16

Aislamiento y Evaluación de Microorganismos Celulolíticos A Partir de Residuos Vegetales Frescos y en Compost Generados en Un Cultivo de Crisantemo (Dendranthema Grandiflora)

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AISLAMIENTO Y EVALUACION DE MICROORGANISMOS

CELULOLITICOS A PARTIR DE RESIDUOS VEGETALES FRESCOS Y

celuloltica en CMC 1%(p/v) a partir de residuos vegetales de crisantemo en

Aubert, J.1988.Biochemistry and Genetics of Cellulose degradation.

Biotechnology: issues of bioconversion and enzyme production. African

bioprocessing of banana wastes. Bioresource Technology. 69:231-239.

bioprocessing of cellulosic on celulosic biomass: an update. Curr Opin

Fundamentals and applications. Re/Views in Environmental Science &

Characteristics that Limit Cellulose Hydrolysis. Biotechnol. Prog. 15:804-816

reducing sugar. Analytical chemistry. 31:426-428

Characteristics that Limit Cellulose Hydrolysis. Biotechnol. Prog. 15: 804-816

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