C A P T U L O 2 . 1 0 . 5 .

ENFERMEDAD DE LA FRONTERA
RESUMEN
La enfermedad de la frontera (EF) es una enfermedad vrica de las ovejas descrita por primera vez
en 1959 en la regin fronteriza entre Inglaterra y Gales. El virus se distribuye por todo el mundo.
Las tasas de prevalencia varan en las ovejas del 5 al 50% entre pases y de regin en regin
dentro de cada uno de ellos. Entre los signos destacan la esterilidad de las ovejas, la aparicin de
abortos y nacidos muertos y el nacimiento de corderos dbiles de menor tamao. Los corderos
afectados pueden mostrar temblores musculares, deficiente desarrollo corporal y vellones
anormalmente peludos (a los corderos se les llama temblorosos peludos o de lana rizada) y a la
enfermedad se le ha denominado enfermedad de los corderos temblorosos peludos. La
transmisin vertical juega un papel importante en la epidemiologa de la enfermedad. La infeccin
de los fetos puede provocar el nacimiento de corderos con infeccin persistente (IP). Estos
corderos IP son virmicos, anticuerpo-negativos y excretan los virus de manera constante. El virus
se propaga de oveja a oveja, y los animales PI son la fuente ms potente de infeccin. Las ovejas
tambin se pueden infectar despus de un contacto prximo con vacas que excreten el virus
estrechamente relacionado de la diarrea vrica bovina (BVDV).
Es importante identificar los animales PI virmicos para que no sean utilizados con fines
comerciales o de crianza. Las pruebas serolgicas resultan insuficientes. Generalmente se
considera que las ovejas no virmicas, sero-positivas son seguras, ya que no se conoce que se
produzcan infecciones latentes en los animales recuperados.
Identificacin del agente: El virus de la EF (BDV) es un Pestivirus de la familia Flaviviridae y est
estrechamente relacionado con el virus de la fiebre porcina clsica y el BVDV. Muy pocos aislados
del BDV son citopatognicos en cultivo celular. No existen serotipos definidos pero los aislados
vricos exhiben una considerable diversidad antignica, y se han identificado tres grupos
antignicos distintos.
Aparentemente las ovejas IP sanas son el resultado de una infeccin congnita que se puede
identificar mediante el aislamiento y la inmunotincin del virus no citopatognico a partir de sangre
o sueros en cultivos celulares de laboratorio. Entre los mtodos directos de identificacin rpida de
las ovejas IP se encuentran la deteccin del antgeno vrico o del ARN vrico en leucocitos y la
deteccin inmunohistoqumica del antgeno vrico en biopsias cutneas. La deteccin del virus es
menos fiable en corderos menores de dos meses que han recibido anticuerpos calostrales.
Habitualmente la infeccin aguda es subclnica y la viremia es transitoria y difcil de detectar. Es
difcil aislar el virus a partir de tejidos de corderos abortados o nacidos muertos, pero los tejidos de
ovejas IP contienen niveles elevados del virus, lo que se puede detectar fcilmente mediante el
aislamiento y varios mtodos directos.
Pruebas serolgicas: Es preferible confirmar la infeccin aguda por el BDV demostrando la
seroconversin con muestras pareadas o secuenciales procedentes de varios animales del grupo.
Los mtodos de deteccin de anticuerpos que se utilizan ms habitualmente son el
enzimoinmunoensayo y la prueba de neutralizacin vrica.
Requisitos para las vacunas y los materiales de diagnstico: No existe una vacuna estndar
para el BDV, pero se ha preparado una vacuna comercial con el virus entero muerto. Lo ideal sera
que dicha vacuna fuese adecuada para su administracin a hembras antes de la crianza para
prevenir la infeccin transplacentaria. Se ha recomendado el uso de las vacunas del BVDV, pero
se debe tener en cuenta la diversidad antignica de los virus de la EF.
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Captulo 2.10.5. Enfermedad de la frontera
Los virus de la EF han contaminado diversas vacunas vivas modificadas de uso veterinario
producidas en clulas de oveja o que contienen suero de oveja. Los fabricantes de los materiales
biolgicos deberan considerar este riesgo potencial.
A. INTRODUCCIN
El virus de la enfermedad de la frontera (BDV) es un Pestivirus de la familia Flaviviridae y est estrechamente
relacionado con el virus de la fiebre porcina clsica (CSFV) y el virus de la diarrea vrica bovina (BVDV) (21).
Aunque se han propuesto seis especies de Pestivirus, existen cuatro especies reconocidas, a saber: CSFV,
BVDV tipo 1 y 2 y BDV (1). Mientras que los CSFV se restringen principalmente a cerdos, se han recuperado a
partir de ovejas ejemplos de cualquiera de las otras tres especies, siendo los aislados mayoritarios virus de la EF
(27). Casi todos los aislados vricos del BDV son no citopatognicos, aunque se han aislado virus citopticos
ocasionales (23). El BDV se propaga de forma natural entre las ovejas a travs de la va oro-nasal y por
transmisin vertical. Principalmente en ovejas y cabras es causa de enfermedad congnita, pero tambin puede
provocar infecciones agudas y persistentes. Las ovejas se pueden infectar a partir de las vacas (6). Asimismo,
los cerdos pueden resultar infectados y los anticuerpos frente al BDV en cerdos pueden interferir en las pruebas
de diagnstico de la enfermedad debida al CSFV (15). Este capitulo describe la infeccin por el BDV en ovejas.
a) Infecciones agudas
Las ovejas adultas y recin nacidas sanas expuestas al BDV tan slo experimentan una enfermedad leve o
inapreciable. Aparece una fiebre ligera y una leucopenia leve que se asocian con una viremia de vida corta
que se detecta entre los das 4 y 11 posteriores a la infeccin, despus de la cual aparecen anticuerpos
neutralizantes del virus en el suero (19).
En las pruebas serolgicas se diagnostican mejor las infecciones agudas empleando sueros pareados
procedentes de un nmero significativo de ovejas. Se ha demostrado que algunos aislados del BDV
ocasionales provocan fiebre elevada, leucopenia profunda y prolongada, anorexia, conjuntivitis, descarga
nasal, disnea y diarrea y el 50% de mortalidad en los corderos jvenes. Uno de estos aislados se recuper
a partir de una epidemia severa de la EF que afect a ovejas lecheras en 1984 (7). Un segundo de tales
aislados fue un BDV contaminante de una vacuna viva del CSFV (29).
b) Infeccin fetal
Los principales signos clnicos de la EF se observan despus de la infeccin de ovejas gestantes. Mientras
que la infeccin materna inicial es leve y subclnica, las consecuencias en el feto son graves. Puede
provocar la muerte del feto en cualquier etapa de gestacin, pero es ms comn en los fetos infectados
durante la etapa temprana. Es posible que se produzca la reabsorcin de los fetos pequeos muertos o que
pueda pasar desapercibido su aborto ya que las ovejas continan alimentndose de forma correcta y no
muestran signos de malestar. Cuando se aproxima el momento de los partos, se observar el aborto de
fetos mayores, nacidos muertos y el nacimiento prematuro de corderos pequeos y dbiles.
Frecuentemente, es difcil establecer la confirmacin de que un aborto o un nacido muerto se deben al
BDV, pero en algunos casos es posible aislar el virus a partir de los tejidos fetales. En los fetos abortados,
tambin se puede detectar el virus mediante inmunohistoqumica del cerebro, tiroides y otros tejidos (20).
Se debera comprobar la presencia de anticuerpos dirigidos contra el BDV en muestras de fluidos fetales o
de suero.
Durante el tiempo de los partos, aparecer una cantidad excesiva de ovejas estriles, pero son los corderos
vivos enfermos los que presentan los rasgos clnicos principales y caractersticos de la EF. Son muy
variados los signos clnicos que exhiben los corderos con la EF y dependen de la raza de oveja, la
virulencia del virus y el momento en el que se produce la infeccin en el rebao. Habitualmente, los
corderos afectados son pequeos y dbiles, y muchos son incapaces de permanecer incorporados. Con
frecuencia aparecen signos nerviosos y cambios de velln. Los signos nerviosos de la EF son los rasgos
ms caractersticos. Los temblores pueden variar desde contracciones rtmicas violentas de los msculos
de las patas traseras y de la espalda, a un fino temblor apenas indetectable de la cabeza, orejas y rabo. Las
anormalidades del velln son ms obvias en las razas de lana suave, que desarrollan vellones peludos,
especialmente en el cuello y la espalda. En los corderos afectados por la EF tambin se puede observar
una pigmentacin anormal negra o marrn del velln. Se debe analizar la presencia del BDV y/o de
anticuerpos dirigidos contra l en muestras de sangre que se deberan recoger en anticoagulante
procedentes de corderos sospechosos antes de que reciban el calostro. Una vez que lo han ingerido, es
difcil detectar el virus hasta que tienen 2 meses y han descendido los niveles de anticuerpos maternos. Sin
embargo, durante este periodo de tiempo, es posible detectar el antgeno vrico en biopsias cutneas,
mediante inmunohistoqumica y en los leucocitos.
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Es posible criar algunos corderos con la EF con tratamiento mdico, aunque pueden tener lugar muertes en
cualquier momento. Los signos nerviosos se reducen de forma gradual y pueden haber desaparecido a los
36 meses de vida. En los momentos de estrs puede reaparecer un andar tambaleante con debilidad y
oscilacin de los cuartos traseros junto con un temblor ligero de la cabeza. Frecuentemente los corderos
afectados crecen con lentitud y en condiciones normales de campo, muchos morirn antes o durante el
tiempo del destete. En los casos en los que las prdidas han sido bajas y no han nacido corderos con
signos evidentes de la EF, ste puede ser el primer signo que presenten de la enfermedad.
Algunas infecciones fetales que se producen en la etapa media de la gestacin pueden provocar signos
nerviosos graves en los corderos, problemas locomotores y esqueletos anormales. Estos corderos
presentan lesiones de hipoplasia cerebelar y displasia, hidronencefalia y porencefalia (NOTA DEL
TRADUCTOR: he buscado el significado de porencefalia en diccionarios medicos ingleses y espaoles y no
aparece) como resultado de una inflamacin necrotizante. Las lesiones destructivas graves parecen estar
mediadas por anticuerpos, y con frecuencia los corderos con tales lesiones presentan concentraciones
elevadas de anticuerpos en el suero dirigidos contra el BDV. La mayora de los corderos infectados en la
etapa final de gestacin son normales y estn sanos y nacen libres del virus pero presentan anticuerpos
frente al BDV. Algunos de estos corderos pueden estar dbiles y es posible que mueran tempranamente
(2).
c) Viremia persistente
Cuando los fetos sufren una infeccin que se produce antes del inicio de la inmunocompetencia, nacen con
una viremia persistente. El feto ovino puede responder por primera vez a un estmulo antignico
aproximadamente entre los das 60 y 85 de su periodo de gestacin de 150 das. En los fetos afectados
antes del inicio de la inmunocompetencia, se produce una replicacin vrica incontrolada y es comn la
muerte del 50% de los fetos. En los corderos que sobreviven a la infeccin producida en la etapa temprana
de gestacin, el virus se propaga a todos los rganos. Estos corderos parecen ser tolerantes al virus y
presentan una infeccin persistente, normalmente de por vida. Una muestra de sangre precalostral ser
virus-positiva y anticuerpo-negativa. Tpicamente, no existe reaccin inflamatoria y los cambios patolgicos
ms caractersticos se aprecian en el sistema nervioso central (CNS) y en la piel. Existe una deficiencia de
mielna en todo el CNS lo que provoca los signos nerviosos. En la piel, los folculos primarios de lana
aumentan de tamao y decrece el nmero de folculos secundarios de lana, lo que causa el velln peludo o
hirsuto.
Las ovejas con viremia persistente se pueden diagnosticar mediante el aislamiento/deteccin del virus en
muestras de sangre. La viremia es detectable fcilmente en cualquier momento excepto durante los
primeros 2 meses de vida, cuando el virus est enmascarado por los anticuerpos calostrales (sin embargo,
durante este periodo el virus se puede identificar en leucocitos lavados), y en animales mayores de 4 aos,
algunos de los cuales desarrollan niveles reducidos de anticuerpos anti-BDV (13). Aunque resulta difcil la
deteccin vrica en la sangre durante una infeccin aguda, se debera confirmar la viremia persistente
volviendo a realizar pruebas a los animales despus de un intervalo de al menos 3 semanas.
Algunas ovejas virmicas sobreviven a la madurez sexual y se utilizan para la crianza. Los corderos nacidos
de estas hembras progenitoras infectadas son siempre virmicos persistentes. Las ovejas virmicas
persistentes constituyen una fuente continua de virus infecciosos para otros animales y su identificacin es
un factor primordial en cualquier programa de control. Las ovejas que van a ser comercializadas deben ser
examinadas para garantizar la ausencia de viremia del BDV.
Habitualmente, los carneros infectados de manera persistente (PI) tienen un semen de baja calidad
altamente infectivo y presentan una fertilidad reducida. Todos los carneros utilizados para la crianza
deberan ser examinados para descartar una infeccin persistente del BDV en muestras de sangre.
Tambin se pueden examinan las muestras de semen, pero el aislamiento vrico es mucho menos
satisfactorio que el obtenido a partir de sangre debido a la toxicidad del semen para los cultivos
celulares. Puede ser justificable la utilizacin de la reaccin en cadena de la polimerasa de trascripcin
inversa (RT-PCR) para detectar el cido nucleico del pestivirus en el semen procedente de algunos
carneros.
d) Inicio tardo de la enfermedad en ovejas con viremia persistente
Algunas ovejas IP alojadas separadamente de otros animales desarrollan de forma espontnea descargas
nasales y oculares excesivas, debilitantes e incurables, a veces con dificultad respiratoria. En la necropsia
estas ovejas tienen un serio engrosamiento del leo distal, ciego y colon resultado de una enteropata
hiperplstica focal. El BDV citoptico se puede recuperar a partir del intestino de estos corderos. Al no
existir una fuente externa obvia del virus citoptico, lo ms probable es que tales virus se originen a partir
de los virus propios del cordero. Otras ovejas IP del grupo no desarrollan la enfermedad. Este sndrome,
que tambin se ha reconocido en brotes de campo ocasionales de la EF, presenta varias similitudes con la
enfermedad mucosal bovina (13).
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B. TCNICAS DE DIAGNSTICO
1. Identificacin del agente (prueba prescrita para el comercio internacional)
No existe un laboratorio de referencia de la OIE designado para el BDV, pero los laboratorios de referencia para
el BVDV o para el CSFV podrn aconsejar de forma adecuada (vase Cuadro de la Parte 3 de este Manual
sobre animales terrestres). Uno de los mtodos que se ha comprobado que es ms sensible para identificar el
BDV sigue siendo el aislamiento vrico. Tambin son mtodos adecuados para identificar animales infectados por
el BDV las tcnicas de inmunofluorescencia directa u otras inmunohistoqumicas que emplean secciones
congeladas de tejidos as como la RT-PCR y el enzimoinmunoensayo (ELISA) para detectar el antgeno.
a) Aislamiento vrico
Es esencial que los laboratorios que realicen el aislamiento del virus tengan un suministro garantizado de
clulas susceptibles y suero bovino fetal (FBS), o equivalente, libres de pestivirus, que no contengan
actividad anti-pestivirus ni contaminacin vrica. Es importante que se siga un programa que garantice la
calidad del laboratorio.
Se puede aislar el virus en distintos cultivos celulares primarios o secundarios (p.ej. rin, testculo,
pulmn). Son raras las lneas celulares ovinas para la replicacin del BDV. Pueden ser tiles las lneas
celulares semicontinuas derivadas de msculo de cordero fetal (FLM), embriones completos (19) o plexo
coroideo de oveja, pero las diferentes lneas varan de manera considerable en su susceptibilidad frente al
virus. Se han utilizado con xito clulas ovinas para el aislamiento y replicacin de los virus de la EF y del
BVDV de los tipos 1 y 2 a partir de ovejas. En las regiones en las que las ovejas pueden infectarse con los
BVDVs a partir de vacas, lo ms adecuado sera utilizar un sistema de aislamiento vrico con clulas tanto
ovinas como bovinas. Se pueden sugerir diversos cultivos celulares bovinos, entre los cuales estn las
clulas de cornete nasal, traqueales embrionarias o testiculares, o bien una lnea celular continua
susceptible de rin. Sin embargo, las clulas bovinas son insensibles para el aislamiento primario y la
multiplicacin de algunos virus de la EF, por lo que se desaconseja la dependencia exclusiva de clulas
bovinas.
A partir de los animales vivos, se puede analizar el suero para detectar la presencia del virus infeccioso,
pero la forma ms sensible para confirmar una viremia de pestivirus consiste en lavar leucocitos
repetidamente (al menos tres veces) con el medio de cultivo antes de co-cultivarlos con las clulas
susceptibles durante 57 das. Las clulas se congelan y descongelan una vez y se pasa una alcuota a
clulas susceptibles posteriores crecidas en un cubreobjetos. Las clulas se tien, tres das ms tarde, para
detectar la presencia de pestivirus utilizando una prueba de inmunofluorescencia o de inmunoperoxidasa.
Se deberan recoger los tejidos a partir de los animales muertos en un medio de transporte vrico
(10% [w/v]). En el laboratorio, los tejidos se trituran, se centrifugan para eliminar los residuos y el
sobrenadante se pasa a travs de filtros de 0,45 m. Las lesiones de bazo, tiroides, timo, rin, cerebro,
ganglios linfticos e intestino son las mejores para el aislamiento vrico.
Se puede examinar el semen para determinar la presencia del BDV, pero el semen sin tratar es fuertemente
citotxico y se debe diluir, normalmente se diluye 1/10 como mnimo en el medio de cultivo. Como la
principal fuente de semen infectado por el BDV procede de carneros IP, para identificar estos animales es
ms fiable la sangre que el semen como muestra clnica. Existen muchas variaciones en los procedimientos
de aislamiento vrico. Se deberan optimizar todos ellos para alcanzar la mxima sensibilidad utilizando una
preparacin vrica estndar de referencia y, cuando sea posible, aislados recientes de campo del BDV. A
continuacin se describe un procedimiento prctico para el aislamiento en tubo:
i) Los cultivos de los tubos de ensayo con monocapas subconfluentes o casi confluentes de clulas
ovinas susceptibles se lavan al menos dos veces con solucin salina balanceada de Hanks para
eliminar el medio de cultivo antes de inocularlos con 0,2 ml de muestra y conseguir la adsorcin
durante 2 horas a 37C.
ii) Se lavan los cultivos con 2 ml de medio. Se elimina y se aade 1 ml de medio de cultivo de
mantenimiento.
iii) Los cultivos se incuban durante 57 das a 37C. Se examinan al microscopio diariamente y se
registra la evidencia de efecto citoptico (ECP).
iv) Los tubos se congelan a 70C, y posteriormente se descongelan, como antes y se pasan a cultivos
frescos en tubo que contengan clulas creciendo sobre cubreobjetos.
v) Se sacan los cubreobjetos 34 das ms tarde, se fijan con acetona fra durante 15 minutos y se tien
empleando un mtodo de inmunofluorescencia directa o indirecta. Los controles esenciales deben
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incluir clulas negativas conocidas y clulas creciendo con cepas estndares citopticas y no
citopticas del BDV.
vi) Los cubreobjetos se examinan con un microscopio UV para detectar fluorescencia citoplsmica difusa
que es caracterstica de los pestivirus.
Alternativamente se pueden aadir cultivos congelados y descongelados a clulas que crezcan sobre
portas compartimentalizados y teirlos mediante una prueba de inmunofluorescencia directa como se ha
indicado ms arriba. As mismo, se puede utilizar una tincin de inmunoperoxidasa sobre cubreobjetos o
portas compartimentalizados as como placas de microtitulacin (vase el mtodo de la prueba de
neutralizacin vrica [NV] ms abajo). Tambin se pueden ensayar cultivos congelados y descongelados
mediante un sistema ELISA para la deteccin antignica.
b) Immunohistoqumica
Es posible la deteccin de la presencia del antgeno vrico en la mayora de los tejidos de los animales IP
(4, 20). Esto se debera realizar con secciones de tejido congeladas y fijadas con acetona (secciones
criostticas) empleando los anticuerpos apropiados. Los tejidos con una cantidad elevada de antgeno vrico
son el cerebro, la glndula tiroides y la mucosa oral. Se ha demostrado que las biopsias cutneas son tiles
para el diagnstico in vivo de la infeccin persistente del BDV
c) Enzimoinmunoensayo para la deteccin antignica
El primer ELISA para la deteccin antignica de pestivirus se describi con el fin de detectar ovejas
virmicas. En la actualidad se ha convertido en un ELISA de captura con sistema doble de anticuerpos
monoclonales (MAbs) para utilizarlo en ovejas y vacas. Se unen dos MAbs de captura a los pocillos de las
placas de microtitulacin, y otros dos MAbs, conjugados con peroxidasa, sirven para detectar los primeros
MAbs (9). Esta prueba es la ms empleada para identificar ovejas virmicas IP utilizando leucocitos
sanguneos lisados con detergente y lavados. La sensibilidad es parecida a la obtenida mediante el
aislamiento vrico y es un mtodo prctico para la deteccin del virus en un gran nmero de muestras de
sangre. Como en el aislamiento vrico, los niveles elevados de anticuerpos calostrales pueden enmascarar
una viremia persistente. El ELISA es ms efectivo que el aislamiento vrico en presencia de anticuerpos,
pero puede dar resultados falsos negativos en corderos virmicos menores de 2 meses de edad.
Habitualmente el ELISA no es suficientemente sensible para detectar infecciones agudas del BDV en
muestras de sangre. Al igual que para la prueba con leucocitos, tambin se puede emplear el ELISA para
detectar el antgeno en suspensiones de tejidos, especialmente de bazo, procedentes de ovejas
sospechosas IP, como una alternativa a los mtodos de inmunofluorescencia y de inmunoperoxidasa, en
cultivos celulares. Se han publicado diversos mtodos ELISA para pestivirus y en la actualidad se dispone
de kits comerciales para detectar el BDV. La validacin de estos kits est en proceso.
d) Mtodos de reconocimiento de los cidos nucleicos
Se han determinado las secuencias genmicas completas de dos virus de la EF y se han comparado con
las de otros pestivirus (3, 17). El anlisis filogentico demuestra que los virus de la EF estn ms
estrechamente relacionados con el CSFV que con el BVDV (1, 22, 27). En la actualidad se utiliza
ampliamente la RT-PCR para el diagnstico de la infeccin por pestivirus. Un protocolo bsico de una RT-
PCR mixta comprende las etapas siguientes:
i) El ARN total se asla mediante fenol-cloroformo, TRIZOL, isotiocianato de guanidina (GITC), o un
mtodo de paso por columna y centrifugacin.
ii) El ADNc se sintetiza mediante cebadores antisentido o hexmeros aleatorios.
iii) Empleando cebadores pan-pestivirus a partir de la regin no codificadora 5 la PCR mixta utiliza
aproximadamente 25 ciclos en la primera amplificacin y 3035 en la segunda.
iv) Se utiliza el sistema TaqMan o cualquier otro sistema de sondeo para identificar el producto del
pestivirus.
La eleccin de cebadores es fundamental. Los cebadores pan-pestivirus son adecuados para detectar y
tipificar todas las especies de Pestivirus (18, 26). Tambin se han descrito cebadores especficos para un
reconocimiento rpido de los virus de la EF (11, 28). Utilizando un nico tubo cerrado en la RT-PCR con
sondas fluorescentes se reduce la potencial contaminacin cruzada de las muestras de diagnstico (12).
Algunas aplicaciones importantes son la deteccin de ARN vrico en tejidos fetales y en constituyentes de
cultivos celulares o en vacunas (25); la validacin de la RT-PCR se encuentra en proceso. Tambin se
observa que es vlida para detectar el virus cuando estn presentes los anticuerpos especficos del BDV.
Las precauciones que se deben tomar con la RT-PCR estn contempladas en el Captulo I.1.4. Validacin y
Control de Calidad de los Mtodos de la Reaccin en Cadena de la Polimerasa utilizados para el
Diagnstico de las Enfermedades Infecciosas.
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2. Pruebas serolgicas
Normalmente, los anticuerpos dirigidos contra el BDV se detectan en los sueros de oveja utilizando las pruebas
de neutralizacin vrica (NV) o ELISA. Tambin se puede emplear la prueba de inmunodifusin en gel de agar
(IGDA) que es menos sensible. En cada prueba se deben incluir sueros de referencia control positivo y negativo.
Para ser considerados vlidos, stos deberan dar resultados dentro de los lmites predeterminados para la
prueba. Se pueden probar sueros individuales para determinar la prevalencia del BDV en un rebao, regin o
pas. Sin embargo, para el diagnstico, los sueros de la etapa aguda y convaleciente son las muestras ms
adecuadas para confirmar una infeccin aguda por el BDV. Siempre se deberan probar las muestras repetidas
de suero procedente de cada animal, una junto a la otra en la misma placa.
a) Prueba de neutralizacin vrica
Para la prueba de NV se puede utilizar una cepa citoptica estndar del BDV (p.ej. la cepa Moredun) con
clulas semicontinuas como las de FLM). Ms abajo se indica un protocolo resumido.
i) Los sueros control y problema se inactivan por calor durante 30 minutos a 56C.
ii) Partiendo de una dilucin 1/4 del suero, se preparan diluciones seriadas al doble de los sueros
problema en el medio de crecimiento del cultivo celular en una placa de microtitulacin de 96 pocillos
de fondo plano para cultivos celulares. Para cada muestra se utilizan dos o cuatro pocillos de cada
dilucin dependiendo de la precisin requerida. El rango de diluciones tambin puede variar. Es
habitual ensayar los sueros inicialmente a la dilucin 1/4 y titular los sueros positivos. Para titular los
sueros se necesita un mnimo de cuatro pocillos. El volumen estndar de trabajo es 25 l: a cada
pocillo se aaden 25 l del suero diluido; se aaden 25 l de medio a cada uno de los dos pocillos
control inferiores y 25 l de medio que contenga 100 DICT
50

(dosis infectiva 50% en cultivo de tejido)
del virus se aaden a cada uno de los dos pocillos problema superiores. En cada prueba se incluyen
una titulacin del virus y sueros control positivo y negativo.
iii) Las placas se sellan con un sellador de placas no txico o una tapa, y se incuban a 37C durante
1 hora.
iv) A cada pocillo se aaden 100 l de una suspensin celular con una concentracin de 2 10
5

clulas/ml. El FBS o el suero equivalente para el crecimiento de las clulas deben estar libres de
anticuerpos frente al BDV.
v) Se sella la placa o se incuba en una cmara hmeda con CO
2
al 5% durante 4 das a 37C.
vi) Los pocillos se examinan al microscopio para detectar posibles efectos citopticos (ECPs). En los
pocillos control de los sueros problema, los ECPs sern debidos a la toxicidad. Se puede intentar la
dilucin posterior de los sueros txicos, pero es posible que no se obtengan resultados fiables con
sueros ocasionales. El ttulo de NV para cada suero es la dilucin a la cual se consigue neutralizar al
virus en el 50% de los pocillos. Se puede calcular mediante el mtodo de SpearmanKrber. Un
animal seronegativo no mostrar neutralizacin a la dilucin ms baja (p.ej. 1/4).
Es difcil la eleccin del virus de prueba debido a la diversidad antignica entre los pestivirus (8, 14). Se
pueden utilizar cepas estndares de los BVDV citopticos y clulas bovinas. Los resultados con la cepa
Oregon C24V se correlacionan mejor con el BDV Modedun que los resultados con la cepa NADL. Ninguna
cepa individual es ideal. Debera emplearse una cepa local que proporcione el ttulo mayor de anticuerpos
con un rango de sueros positivos de oveja. Tambin se puede utilizar la prueba de NV con virus no
citopticos cuando se emplee el sistema de tincin de inmunoperoxidasa despus de la etapa v) indicada
ms arriba. Este sistema de tincin consiste en:
i) Se elimina el medio de cultivo y las clulas se lavan suavemente con solucin salina tamponada con
fosfato (PBS) templada, se secan al aire y se enfran a 4C.
ii) Las clulas se fijan rpidamente aadiendo a todos los pocillos acetona al 95% (en agua) previamente
enfriada a 20C. Las placas se mantienen a 20C durante 30 minutos y no se deberan apilar o
permitir que se calienten porque el plstico se puede deteriorar.
iii) Se elimina la acetona y las placas se secan rpidamente en un ambiente fresco.
iv) A todos los pocillos se les aaden 50 l de antisuero frente al BDV a una dilucin predeterminada en
PBS con Tween 80 al 1% (PBST). Las placas se incuban a 37C durante 30 minutos en una atmsfera
hmeda.
v) Las placas se vacan y lavan tres veces con PBST.
vi) Los pocillos se vacan y se les aade un suero apropiado anti-especie conjugado a peroxidasa a una
dilucin predeterminada y las placas se dejan durante 30 minutos a 37C en una atmsfera hmeda.
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vii) Las placas se vacan y lavan tres veces con PBST.
viii) Los pocillos de las placas se vacan y se les aaden 50 l de sustrato activado, p.ej. 3-amino-9-
etilcarbazol (AEC). La solucin de base AEC es: AEC (0,1 g) disuelto en dimetil formamida (15 ml).
Para utilizar se aade la solucin de base (0,3 ml) a 0,05 M tampn acetato pH 5,0, filtrado a travs de
membrana (4,7 ml), y posteriormente se aade H
2
O
2

al 30% (5 l). NB: esta solucin es txica y se
debera manejar con las precauciones adecuadas.
ix) Las placas se incuban a temperatura ambiente y se observan con detalle los pocillos control virus-
positivos conocidos para detectar el desarrollo de la tincin citoplsmica especfica roja-marrn.
Cuando la tincin es completa se elimina el sustrato cuidadosamente y se lavan a fondo los pocillos
con agua corriente. Se deja el agua corriente en los pocillos y las placas se examinan al microscopio
para observar los pocillos que contengan el virus.
x) El ttulo de NV se calcula como se ha indicado ms arriba utilizando el mtodo de SpearmanKrber.
xi) Alternativamente, la prueba se puede llevar a cabo empleando la tincin directa con el conjugado de
isotiocianato de fluorescena.
En ocasiones puede ser necesario determinar si el anticuerpo en el rebao est dirigido contra un virus
perteneciente a un serogrupo particular de Pestivirus. Se puede utilizar una prueba diferencial de NV en la
que los sueros se titulan contra virus representativos de cada uno de los grupos de Pestivirus, i.e. el BDV,
los tipos 1 y 2 del BVDV y el CSFV. El ttulo mximo identificar al serotipo infectante y tambin se revelar
el espectro de reaccin cruzada con los restantes serotipos.
b) Enzimoinmunoensayo
Se ha descrito un ELISA de captura con MAbs para medir los anticuerpos frente al VDV. Se emplean dos
MAbs de pan-pestivirus que detectan eptopos diferentes de la protena no estructural inmunodominante NS
2/3 que capturan el antgeno crecido en cultivo celular y lisado con detergente. Los resultados se
correlacionan cualitativamente con la prueba de NV (10).
El antgeno se prepara como se indica a continuacin: Se utilizan ocho frascos de 225 cm
2
de clulas FLM
recientemente confluentes; cuatro frascos actuarn de controles y cuatro se infectarn. Los frascos se lavan
y se infectan cuatro con 0,010.1 m.o.i. (multiplicidad de infeccin) del BDV citoptico Moredun. El virus se
adsorbe durante 2 horas a 37C. Se aade medio de mantenimiento que contiene FBS al 2% (libre de
anticuerpos frente al BDV) y los cultivos se incuban durante 45 das hasta que se evidencian ECPs. Se
juntan los sobrenadantes de los cuatro frascos controles y por separado los sobrenadantes de los cuatro
frascos infectados. Se centrifugan a 3.000 g durante 15 minutos para precipitar las clulas. Se eliminan los
sobrenadantes. Se retienen los precipitados celulares. Se lavan los frascos con 50 ml de PBS y se repite la
etapa de centrifugacin como se ha indicado ms arriba. Se juntan todos los precipitados controles en 8 ml
de PBS que contenga Nonidet P40 al 1% y se devuelven 2 ml a cada frasco control para lisar las clulas
que han permanecido fijadas. Se repite lo mismo para el caso de las clulas infectadas. Se mantienen los
frascos a 4C durante al menos 2 horas agitando vigorosamente el volumen escaso de lquido en las
clulas durante 30 minutos para asegurar la separacin completa de las clulas. Se centrifuga el antgeno
control y el infectado a 12.000 g durante 5 minutos para extraer los residuos celulares. Los sobrenadantes
antignicos se conservan a 70C en alcuotas pequeas.
Procedimiento de la prueba
i) Los dos MAbs se diluyen a una dilucin predeterminada (normalmente 1/4000) en 0,05 M tampn
bicarbonato, pH 9,6. Todos los pocillos de una placa de microtitulacin adecuada para la prueba
ELISA (p.ej. Nunc maxisorb, Greiner 129b) se cubren toda la noche con estos anticuerpos a 4C.
ii) Despus de lavar tres veces con PBST, a todos los pocillos se les aade una solucin de bloqueo de
PBST que contenga suero de caballo al 10% (PBSTH), y se incuban a 37C durante 1 hora.
iii) El antgeno se diluye a una dilucin predeterminada con PBSTH y se antigenan filas alternas de
pocillos con los antgenos vricos y controles durante 1 hora a 37C. Posteriormente, las placas se
lavan tres veces con PBST antes de aadirles los sueros problema.
iv) Los sueros problema se diluyen 1/50 en PBSTH y se aaden a los pocillos vricos duplicados y
controles duplicados durante 1 hora a 37C. Posteriormente, las placas se lavan tres veces con PBST.
v) Se diluye la IgG anti-ovina conjugada a peroxidasa a una dilucin predeterminada en PBSTH y se
aade a todos los pocillos durante 1 hora a 37C. Las placas se lavan tres veces con PBST.
vi) Se aade un sustrato enzimtico activado adecuado, tal como orto-fenilendiamina (OPD) o tetrametil
azul (TMB) teniendo en cuenta las advertencias del fabricante acerca de su toxicidad. Despus de el
desarrollo de color, la reaccin se para con cido sulfrico y la absorbancia se lee con un lector de
placas ELISA. El valor medio de los dos pocillos controles se sustrae de los valores medios de los dos
1122 Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Captulo 2.10.5. Enfermedad de la frontera
pocillos vricos para obtener la absorbancia corregida para cada suero. Los resultados se expresan
como absorbancia corregida con respecto a la correspondiente de sueros conocidos positivos y
negativos. Alternativamente, se pueden extrapolar los ttulos de ELISA a partir de una curva estndar
de diluciones seriadas de un suero positivo conocido de referencia
Si se pueden preparar antgenos de suficiente potencia se puede omitir la etapa de captura con MAbs.
En este caso filas alternas de los pocillos se cubren con el antgeno vrico y control diluidos a una
dilucin predeterminada (normalmente 1/100) en 0,05 M tampn bicarbonato, pH 9,6, toda la noche a
+4C. Las placas se lavan y bloquean como en la etapa ii indicada ms arriba. Despus de lavar, se
aaden los sueros problema diluidos y la prueba sigue adelante a partir de la etapa iv) como se indica
ms arriba.
c) Prueba de inmunodifusin en gel de agar
La prueba de IGDA se utiliz por primera vez para demostrar la relacin inmunolgica entre los BDV, BVDV
y CSFV.
La cepa Oregon C24V del BVDV crecida en clulas de testculo de ternero se ha utilizado para detectar los
anticuerpos en ovejas. Se puede preparar un antgeno adecuado empleando el medio recogido procedente
de clulas que muestren tempranamente ECPs. Se necesita concentrar el medio aproximadamente 100
veces mediante dilisis contra polietilenglicol (PEG). Alternativamente, se puede aadir PEG 6000 para
sonicar suspensiones virus/clulas en una proporcin del 8% (w/v). Despus de agitar constantemente
durante toda la noche a 4C, se elimina el precipitado por centrifugacin a 1.800 g durante 1 hora. Se
decanta por completo el sobrenadante y se resuspende el precipitado hasta el 1% del volumen de cultivo
original virus/clulas en agua destilada. El precipitado resuspendido se centrifuga a 286.000 g durante
2 horas y se recoge el sobrenadante para ser utilizado como antgeno. El precipitado se elimina.
C. REQUISITOS PARA LAS VACUNAS Y LOS MATERIALES DE DIAGNSTICO
Para considerar til una vacuna del BDV debera ser efectiva al administrarla a las ovejas hembras antes del
periodo de crianza con el fin de prevenir la infeccin transplacentaria. En Europa se han preparado vacunas con
el virus BDV entero inactivado con fines experimentales y comerciales (5, 24).
Se han encontrado pestivirus contaminantes de vacunas de virus vivos modificados que provocan enfermedades
graves despus de ser administradas a cerdos, vacas, ovejas y cabras. Entre las vacunas contaminadas estn
las utilizadas para el control de la enfermedad de Aujeszky, del CSFV, de rotavirus, de coronavirus, de la peste
bovina, de la viruela ovina y de la dermatitis pustular contagiosa. La capacidad insidiosa de los pestivirus para
atravesar la placenta y de este modo establecer los animales IP, les proporciona la potencialidad de contaminar
vacunas a travs de las clulas, el suero empleado como suplemento en los medios o el virus utilizado como
base de inculo. Como casi todos los aislados de los pestivirus son no citopticos, permanecern sin ser
detectados a menos que se lleven a cabo pruebas especficas.
1. Control del inculo
a) Caracterizacin del inculo
Una vacuna ideal debera contener una cepa o cepas del virus que proporcionen proteccin frente a todos
los pestivirus ovinos. Recientemente, se ha demostrado que existen tres grupos de pestivirus antignicos
distintos que infectan ovejas. Un grupo es el representado por la cepa de referencia del BDV Moredun; el
segundo grupo contiene los virus similares a la mayora de las cepas del BVDV bovino (BVDV tipo 1); y el
tercer grupo engloba las cepas menos comunes del BVDV (tipo 2) (30). Hacen falta estudios posteriores de
proteccin cruzada para determinar el significado de estos descubrimientos. No obstante, parece lgico que
cualquier vacuna del BDV debera contener al menos un representante de los grupos BDV y BVDV (tipo 1).
La caracterizacin de los virus de las vacunas clonadas biolgicamente debera comprender la tipificacin
con MAbs y la genotipificacin (16).
b) Cultivo
Se puede utilizar una variedad de cultivos celulares de rumiantes. Los rendimientos ptimos dependen del
tipo celular y aislado empleados. Existe una vacuna comercial del BDV que contiene dos cepas del virus y
que se prepara en lneas celulares ovinas (5). Las clulas se deberan preparar de acuerdo con el sistema
de lotes del inculo procedente de un virus del inculo original (MCS) que se haya demostrado que est
libre de microorganismos contaminantes. Slo se debera preparar la vacuna en clulas con menos de
20 pases a partir del MCS. Se debera comprobar que no existe contaminacin debida a pestivirus en
clulas control procedentes de cada pase.
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004 1123
Captulo 2.10.5. Enfermedad de la frontera
c) Validacin como vacuna
Todas las vacunas deberan pasar las pruebas estndar de inocuidad y eficacia. La prueba de inocuidad de
las vacunas inactivadas del BDV debera suponer el control de todos los componentes de las vacunas para
detectar los posibles pestivirus contaminantes.
Las pruebas de eficacia de las vacunas del BDV deberan demostrar su capacidad para prevenir la
propagacin transplacentaria del virus. Se ha logrado un desafo efectivo de las ovejas gestantes
vacunadas entre los das 5060 de gestacin mediante la instalacin intranasal del virus o mezclndolas
con ovejas IP (5).
2. Mtodo de produccin
Se han preparado vacunas inactivadas empleando tcnicas de laboratorio convencionales con cultivos celulares
estacionarios o en botellas rotatorias. Algunos inactivantes son la formalina y la beta-propiolactona. Los
adyuvantes pueden ser hidrxido de aluminio o aceite (5, 24).
3. Control del proceso
Los cultivos se deberan inspeccionar a diario para asegurar que estn libres de contaminacin bacteriana
evidente y que cualquier ECP observado sea el apropiado al virus citoptico que se est tratando de multiplicar.
No se deberan observar ECPs en cultivos que se estn utilizando para que se repliquen cepas vricas no
citopticas.
4. Control de lotes
a) Esterilidad
En el Captulo I.1.5. se pueden encontrar las pruebas para determinar que los materiales biolgicos estn
estriles y libres de contaminacin.
b) Inocuidad
Se debera comprobar rigurosamente que las muestras procedentes de las vacunas inactivadas carecen de
virus viables. Se deberan realizar varios pases con muestras del producto empleando cultivos celulares
susceptibles para asegurar la ausencia del BDV vivo. Este control in vitro se puede mejorar inyectando dos
ovejas BDV-seronegativas con 20 dosis de antgeno sin valorar como parte de una prueba de inocuidad
estndar. La presencia del virus vivo tendr como resultado el desarrollo de una respuesta serolgica ms
convincente que la que se observara utilizando el virus inactivado solo. Tambin se pueden examinar los
sueros de oveja para detectar anticuerpos dirigidos contra otros agentes conocidos.
c) Potencia
Asimismo, es mejor ensayar la potencia de la vacuna con ovejas seronegativas en las que se mida el
desarrollo y nivel de anticuerpos. Una medida indirecta de la potencia la proporciona el nivel de infectividad
vrica previa a la inactivacin. El contenido antignico despus de la inactivacin se puede valorar mediante
un ELISA de captura con MAbs y relacionar con los resultados de potencia establecidos in vivo. Al igual que
se recomienda en el caso de las pruebas de potencia de la vacuna del BVDV en vacas, se aconseja
demostrar que la vacuna puede prevenir la transmisin transplacentaria del BDV en ovejas gestantes.
d) Duracin de la inmunidad
No se dispone de informacin acerca de la duracin de la inmunidad despus de la vacunacin. Es
improbable que las vacunas inactivadas proporcionen niveles sostenidos de inmunidad y es probable que
despus de un tratamiento inicial de 2 o 3 inyecciones sean necesarias dosis anuales de refuerzo. No se
dispone de informacin suficiente para determinar si existe una correlacin entre los ttulos de anticuerpos
vacunales en la hembra progenitora y la proteccin fetal.
e) Estabilidad
Existe escasa informacin sobre la estabilidad de las vacunas del BDV. Es de suponer que las vacunas
inactivadas tengan al menos un ao de periodo de validez si se protegen de la luz y conservan a 4C.
f) Conservantes
Se pueden aadir conservantes a los contenedores multidosis de vacunas que estarn sujetos a la
aprobacin de la Autoridad de Control.
1124 Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
Captulo 2.10.5. Enfermedad de la frontera
g) Precauciones (riesgos)
El BDV se considera un riesgo para la salud humana. Se deberan utilizar prcticas microbiolgicas
adecuadas y estndares para manipular el virus.
5. Pruebas sobre el producto final
a) Inocuidad
Slo pruebas in vitro.
b) Potencia
Pruebas in vitro del contenido antignico
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