Seminario N1

Antgenos-Inmunizacin
Inmunologa Clnica
2010
INMUNIZACION: el proceso de induccin de
inmunidad artificial frente a una
enfermedad..... (def. mdica)
PASIVA: adquisicin de Ac de una fuente
externa.
ACTIVA: produccin local de Ac.
Qu es un adyuvante?
Son sustancias o preparados qumicos que, incorporados al
antgeno o inyectados simultneamente con l, hacen ms
efectiva la respuesta inmune.
Con su empleo se logra una economa de antgeno y de tiempo, as
como un mayor nivel de anticuerpos especfico
Mecanismo de accin: El antgeno libre normalmente difunde con
mucha rapidez desde los tejidos locales que rodean el sitio de
inoculacin, y una de sus funciones importantes es crear un
reservorio o depsito del antgeno de larga vida. Por otro lado
todos los adyuvantes activan o estimulan los macrfagos; stos
cuando son activados estimulan la respuesta inmune por un
incremento de la cantidad de antgeno expresado en la membrana
celular y de la eficiencia de su presentacin a los linfocitos. El
macrfago tambin libera factores solubles estimulantes, que
amplifican la proliferacin de los linfocitos.
Adyuvantes emulsiones usados en inmunologa
experimental
Completo de Freund
Respuesta de Ac y C.T. Muy txico
Incompleto de Freund Respuesta humoral
Elevada eficacia, amplio espectro de aplicacin, fcil
manipulacin y disponibilidad comercial.
El adyuvante completo de Freud (FCA):
Produccin de antisueros en animales
cantidades limitadas de antgenos
presentan una baja inmunogenicidad.
Toxicidad
En la investigacin pueden utilizarse, adems,
los compuestos de aluminio
"Syntex-1" (SAF-1): treonil anlogo del dipptido
murmico,
polmeros no inicos en bloque (NBP)
saponinas,
bromuro de dimetil dioctadecil amonio (DDA),
lipopptidos,
Consideraciones:
Bienestar animal: la extraccin de los anticuerpos del animal se
realiza de una manera no invasiva, minimizando el sufrimiento del
animal, as como tambin permite la reduccin en el nmero de
animales necesarios para obtener una cantidad de anticuerpos
determinada.
Cientficas: permite el uso de estas inmunoglobulinas en
sistemas de investigacin y diagnstico, permitiendo la obtencin
de anticuerpos contra antgenos mamferos muy conservados
filogenticamente.
Econmicas: reduccin de costos en la produccin de anticuerpos
policlonales, ya que la cantidad de inmunoglobulinas que pueden
obtenerse a partir de la yema de huevo de las aves es similar a la
producida por animales grandes, mientras que el costo de
mantenimiento de una gallina es similar al de un animal pequeo.
Ratn Rata Cobayo Conejo
caballo
Oral 0,5-1ml
/sonda gstrica
1-2ml 1-2ml 5-7ml
ID 0,1ml piel
lomo
0,1ml 0,1ml 0,1ml
SC 0,5- 1ml piel
laxa lomo
1-5ml 1-2ml 1-5ml
IP 1ml lateral
abdomen
5ml 10ml 20ml
IM 0,05ml muslo
posterior
0,1ml 0,1ml 0,2ml
IV 0,2ml vena
lateral cola
0,5ml 0,5ml vena
metatarsiana
0,5ml vena
marginal de la
oreja
Extraccin de
sangre
0,3ml vena de
la cola- seno
orbital-
puncin
cardiaca
0,3ml 5ml Vena de
la oreja- vena
metatarsiana
15ml vena
marginal de la
oreja
30- 50ml
VIAS DE ADMINISTRACI VIAS DE ADMINISTRACI N N
Formas de introducir una vacuna al organismo
Oral
Intramuscular
Subcutnea
Intravenosa
Intradrmica
SITIOS DE APLICACI SITIOS DE APLICACI N N
Lugar anatmico seleccionado para que el dao tisular
vascular sea mnimo
Induzca la respuesta inmune deseada
Provoque el menor dao local y sistmico
Tipo de respuesta inmune
segn la va de infeccin del patgeno
Bacterias no invasivas (Vibrio cholerae, ETEC) epitelios no permeables a las
Igs sricas ruta tpica de vacunacin sIgA producida localmente
Patgenos invasivos (Chlamydias, H. pylori, virus como herpes simple)
proteccin mediada por clulas CD4
+
o por CTLs y clulas NK
Patgenos de la mucosa respiratoria o urogenital mas permeable a las Igs
sricas una ruta parenteral de vacunacin puede ser tambin efectiva.
Patgenos entricos que invaden la mucosa o proliferan en los tejidos linfoides de
la submucosa (S.typhi) y luego se expanden por el organismo una ruta
parenteral de vacunacin puede ser tambin efectiva
Las Igs producidas atraviesan
placenta?
Vaca, cabra , cerdo y caballo mayor
permeabilidad en el intestino: se absorben los
Ac del calostro pero no atraviesan la placenta.
Hombre, mono y cobayo atraviesan la placenta
pero no se absorben en intestino los
anticuerpos de la leche.
.
Inmunizacin con Cndida.
Antgeno?
Mezcla de extracto crudo: fcil de obtener,
gran nmero de antgenos, dificil de
estandarizar y reaccin cruzada ( bacterias y
otros hongos).
Antgenos recombinantes: en husped
procariota, fcil de estandarizar y se eliminan
las reacciones cruzadas.
Pptidos sintticos
Levadura completa?
Microorganismo entero muerto por calor,
acetona, formol, etanol.
A partir de cultivos en medios enriquecidos,
se selecciona la colonia y se transfiere a caldo
enriquecido, se incuba 6-8hs a 37C y se
calienta a 100C 2hs.
Preservar con 0,5ml de formol al 10%
Concentracin del inoculo?
Concentracin 10
9
/ml Cmo ajusto la
concentracin?
Tubo 3 del nefelmetro de Mac Farland
(0,3ml ClBa 1%+ 9,7ml H2S4Al1%)
Leer a 660nm (previamente una curva
(Abs. 700 correlaciona con 10000000)
Contar en cmara de Neubauer.
Pared celular de C.
albicans:
quitina N-
acetilglucosamina (rojo)
(componente fibrilar)
-1,3-D-glucano
(verde)
-1,6-D-glucano (azul)
mananos (D-manosa)
(negro)
protenas (naranja)
Antgeno purificado?
Hongos
Hongos
Nature Reviews Immunology 4, 11-24 (January 2004)
Interacci
Interacci

n
n
PAMP
PAMP
-
-
TLR
TLR
The yeast cell wall is made of ~25% helical (1-3) and (1-6)-D-
glucans and ~25% oligo-mannans, ~20 % protein, ~10% lipids,
and some chitin. The protein component exists predominantly
as a mannoprotein complex. Covalent linkages are reported to
exist as (1-4)-linkages between the reducing ends of chitin and
the nonreducing end of b(1-3)-glucans as well as among
glycoproteins, (1-6)-glucans, and (1-3)-glucans.
Colonizacin vs Infeccin
Colonizacin comensal de la sup de
mucosas. Individuos normales tienen
anticuerpos. Falsos positivos
Infecciones oportunistas en
inmunocomprometidos baja produccin
de anticuerpos. Falsos negativos
H. UNICELULAR
H. UNICELULAR
(levadura) (levadura)
Blastoconidio
Tubo germinal
Pseudomicelio
Invasin
Penetracin: secresin de enzimas hidrolticas
como SAPs ( proteasa), Plbs (fosfolipasa), Lips
(lipasa) que digieren la sup. epitelial
Endocitosis por cl. Epitelial ( Als3 . Proteina
de adhesin anclada a GPI)
Antgenos especficos
de la forma hifal
La transformacin a la forma hifal es un factor de
virulencia, asociado con una fase invasiva:
Hyr1; proteina reguladora hifal glicoproteina de la
pared del tubo germinal
Ece1: proteina de elongacin de la clula
Als3: glicoproteina de la pared celular similar a
aglutinina implicada en la adhesin a la superficie del
hesped
Hwp1: glicoproteina expresada en la superficie de la
pared hifal relacionada con la adherencia y factor de
virulencia
Enzimas
Enolasa: enzima glicoltica inmunodominante
presente en el citoplasma y en la pared
interna de Cndida Albicans en ambas formas.
Proteinasa aspartil secretada: Pt secretadas
por Cndida sp. Considerada un antgeno
inmunodominante y factor de virulencia
asociado con adherencia e invasin a tejidos y
diseminacin.
Protenas Recombinantes
Sistema de expresin: bacterias, hongos, baculovirus-
cl de insectos: eleccin del vector( plsmido) y el
hesped. Considerar: tamao del inserto, sitios de
restriccn, estrategias de purificacin, resistencia a
antibioticos para seleccin
DNA constructor
Data base genoma de Cndida (CGD)
http// www.candidagenome. org
Importante conocer estado y sitios de glicosilacin,
uniones disulfuras,modificaciones postraslacionales,
estabilidad de la proteina
Ej. Bacteriofago T7 en E.Coli ( pt no glicosiladas)
Fuentes naturales de protenas
Bajos rendimientos
Impurezas
Tcnicas de ADN recombinante
Permiten la sntesis y la expresin autnoma, en un
husped determinado, de un hbrido formado por la
combinacin de molculas de ADN de orgenes
diferentes
Protena heterloga
Estrategia para la obtencin
de una Protena Heterloga
Clonado
Sistema de Expresin
Estabilidad
Solubilidad
Tamao
Modificaciones Post-traduccionales
Aplicaciones
Antgeno (alta cc, fcil purificacin)
Estudio de la funcin biolgica
(mantener la actividad)
Estudios estructurales (solubilidad)
Aspectos Tcnicos
1- Seleccin del ADN de inters
Dnde buscarlo ?
Qu expresamos ?
Cunto necesitamos ?
2- Seleccin del vector
Expresin en eucariotas
Expresin en procariotas
3- Digestin, Ligacin del vector y del inserto y
transformacin
4- Clonado y Expresin de la protena
Plegamiento de la protena
5- Purificacin
6- Deteccin (SDS-PAGE)
Confirmacin de identidad (WB/secuencia de ADN)
Seleccin del ADN de inters
Conocida cADN PCR
(Gene Bank)
Desconocida
(DNA library)
Qu porcin del gen vamos a expresar ?
Inserto Compatible con el
del vector
Protena Entre 20- 100 kDa
Tener en cuenta:
hidrofilicidad/hidrofobicidad
Secuencia
Tamao