Nicols Cataldo Pablo Fagndez Vernica Lpez Natalia Bobba - Lourdes Lebrato-

Mara Jos Gonzlez

Practico 7. Inhibicin enzimtica irreversible.
Xantina oxidasa y cianuro
Objetivo:
Estudiar la inhibicin de la xantina oxidasa en presencia de KCN y determinar los parmetros
cinticos.
Resultados:
Evolucin en el tiempo de la inhibicin por cianuro
Se incubo xantina oxidasa 0.3 mM, con una concentracin fija de cianuro (KCN, 1 mM) durante
70 min. A intervalos de 3 min se tomaron alcuotas de dicha mezcla, y se determin la
velocidad de reaccin de la enzima a una concentracin de xantina de 100 M. Los valores de
velocidad fueron obtenidos a partir de la aparicin del producto de reaccin cido rico, en
base al aumento en la absorbancia a 292 nm de la mezcla (va relacin Lambert-Beer). En la
Figura 1 se representan los valores de velocidad obtenidos en funcin del tiempo de
incubacin con KCN.

Figura 1. Velocidad de reaccin de la xantina oxidasa en funcin de tiempo de incubacin con
concentracin fija de KCN
-
.


0 30 60
0.000000
0.000001
0.000002
0.000003
0.000004
v

(
M
.
m
i
n
-
1
)
t (min)
Nicols Cataldo Pablo Fagndez Vernica Lpez Natalia Bobba - Lourdes Lebrato-
Mara Jos Gonzlez

El grfico de la Figura 1 muestra un patrn que se corresponde claramente con una inhibicin
irreversible, como era de esperar. El mismo, viene definido segn:

El grfico fue ajustado a dicha ecuacin, y a partir de este se obtuvieron entonces los
parmetros v
o
= (2.8 0.2) x 10
-6
M.min
-1
y kobs = 0.035 0.005 min
-1
.
A su vez, dado que la concentracin de KCN utilizada fue en exceso respecto a la concentracin
de enzima, puede asumirse que la primera prcticamente no variar a lo largo del ensayo, lo
que entonces permite expresar que kobs = k[KCN]. Despejando de la ecuacin se obtiene un
valor de k = 35 M
-1
.min
-1
.
Por otro lado, a partir del valor de kobs tambin es posible calcular el tiempo de vida media de
la enzima segn la ecuacin

, de la cual se obtuvo t
1/2
= 19.8 min.
Sabemos que el efecto observado en la Figura 1, no se debe a la temperatura dado que se
realiz un control adicional, de la enzima a temperatura ambiente en ausencia de inhibidor.
Los valores de velocidad registrados a tiempo cero y a 70 min se muestran en la tabla 1.
Tabla 1. Velocidad y actividad de la xantina oxidasa en ausencia de KCN.
t (min) v x 10
-6
(M. min
-1
) Actividad x 10
-3
(U)
0 3.444 3.444
70 3.195 3.195

Claramente se puede observar que luego de transcurridos 70 min, la actividad de la enzima no
sufre cambios significativos, con lo cual podemos asegurarnos que el comportamiento
mostrado en la Figura 1, para el caso del ensayo en presencia de KCN se debe a este ltimo
actuando como inhibidor y no a un efecto de la temperatura.
Reversibilidad de formacin del complejo E-I
Para comprobar la irreversibilidad de la inhibicin se realiz una gel filtracin, con la finalidad
de constatar si existe o no recuperacin de la actividad enzimtica luego del pasaje por la
columna. Se determin la actividad de la enzima y la concentracin antes y despus del pasaje
por la columna. Durante la elucin se recogieron volmenes de 1 mL, a los cuales se le midi
posteriormente la concentracin, para determinar en qu fraccin se encontraba la mayor
cantidad de enzima, representado en la Figura 2. Una vez identificado el dicho tubo, se
procedi a determinar la actividad de la enzima.
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Mara Jos Gonzlez


Una vez eluidas todas las fracciones colectadas de la columna, se observ que la que
presentaba mayor absorbancia a 280 nm era la fraccin 3, a la cual se le midi la actividad
enzimtica. Para ello fue necesario un volumen mayor a los 50 L de alcuota utilizado en las
medidas de inhibicin previas, dado que la elucin en la columna disminuy ampliamente su
concentracin (Tabla 2).
Tabla 2. Velocidad y actividad de la xantina oxidasa, antes y despus del pasaje por la columna.

v x 10
-7
(M. min
-
1
)
Actividad x 10
-4

(U)
Actividad x 10
-3

por mL (U.mL
-1
)
antes 3.428 3.428 6.856
despus 3.432 3.432* 1.716

*para la determinacin de la actividad de la enzima luego de la elucin se empleo un volumen
de 200L
La actividad obtenida para el tubo 3, no es comparable a la calculada para la enzima antes de
ser eluida, dado que hay menor concentracin de protena (el valor de absorbancia a 280 nm
antes de la elucin fue de 0.292 y despus 0.147) y que en el tubo 3 no se recogi la totalidad
de la enzima, la cual se distribuy en otras fracciones (ver cromatograma). Una medida de
cuan diluida estaba la fraccin, es determinar la relacin:


=

Por lo tanto, la actividad por mL del tubo 3 corregida por un factor de 2,
N Tubo Abs 280 nm
Previo el. 0.292
1 0.004
2 0.01
3 0.147
4 0.087
5 0.012
6 0.004

Figura 2. Tabla de valores Cromatograma de elucin de xantina oxidasa tratada con KCN
0
0.02
0.04
0.06
0.08
0.1
0.12
0.14
0.16
0.18
0.2
0 1 2 3 4 5 6 7
A
b
s

2
8
0

n
m

N de tubo
Nicols Cataldo Pablo Fagndez Vernica Lpez Natalia Bobba - Lourdes Lebrato-
Mara Jos Gonzlez

Act/mL = 3.432 x10
-3
U.mL
-1

Teniendo en cuenta estos valores, podemos decir que la inhibicin por KCN es irreversible ya
que luego del pasaje por la columna la enzima no recupera su actividad.
Si se realiza el experimento en concentraciones mayores de cianuro, la fase de decaimiento
sera ms rpida con una pendiente ms pronunciada. Por otro lado si se realiza el
experimento en mayores concentraciones de enzima, la fase de decaimiento seria ms lenta, y
en caso de que la concentracin de enzima superara a la del inhibidor, no veramos el
decaimiento a cero ya que la enzima nunca se inhibira totalmente.
De forma alternativa a la gel filtracin utilizada en este prctico, una forma de determinar si la
inhibicin es irreversible sera realizar un experimento de dilisis para intentar separar el
inhibidor de la enzima y posteriormente, observar si se recupera la actividad enzimtica.