Universidad de los Andes

Departamento de Ingeniera Civil y Ambiental

Tratamiento de Aguas Residuales ICYA 3408

TAREA 1

Acaba de encontrar una enzima llamada BaaTen Arthrobacter JBH1, que es capaz de transformar
un qumico bastante txico en un sustrato que le sirve a esta cepa para su crecimiento. Usted
quiere estudiar esta enzima y determinar que tan rpido puede transformar este compuesto,
identificando todos los parmetros cinticos que describen la reaccin. En el laboratorio usted
utiliz enzima extrada de esta cepa (95 mg enzima/mL) y obtuvo los siguientes resultados:

Concentracin de sustrato (M)
t = 0 min t = 10 min
47 10
49 11
92 48
100 55
150 104
158 110

1. Determine los parmetros cinticos K
M
, v
max
y k.

En primer lugar se calcula la velocidad de reaccin v
0
para cada concentracin inicial de sustrato
S
0
, utilizando la ecuacin:

Para S
0
= 47 M, v = (47 10)/10 = 3,70 M/min

En la siguiente tabla se reportan los resultados para cada concentracin inicial de sustrato:

S
0
(M) v
0
(M/min)
47 3,70
49 3,80
92 4,40
100 4,50
150 4,60
158 4,80


La siguiente grfica muestra la velocidad de reaccin v en funcin de S
0
:



En la grfica se observa que el comportamiento de la velocidad de reaccin en funcin de la
concentracin del sustrato est de acuerdo con el modelo de Michaelis Menten. As, la curva
obtenida puede ajustarse a la siguiente ecuacin:


Para determinar los parmetros cinticos K
M
, v
max
y k, se recurre a los mtodos grficos de
Lineweaver, Eadie-Hosfee y Hanes, cuyas ecuaciones se muestran a continuacin:

Lineweaver

Eadie Hosfee


Hanes

Como cada uno de los mtodos presenta ventajas y desventajas sobre los otros, resulta
conveniente utilizar los tres para comparar los resultados finales.

En la siguiente tabla se muestran los resultados de los clculos de 1/S
0
, 1/v
0
, v
0
/S
0
y S
0
/v
0
para cada
S
0
:

0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
0 50 100 150 200
v
o
(

M
/
m
i
n
)
So(M)
S
0
(M) v
0
(M/min) 1/S
0
1/v
0
v
0
/S
0
S
0
/v
0
47 3,70 0,0212766 0,27027027 0,0787234 12,7027027
49 3,80 0,02040816 0,26315789 0,07755102 12,8947368
92 4,40 0,01086957 0,22727273 0,04782609 20,9090909
100 4,50 0,01 0,22222222 0,045 22,2222222
150 4,60 0,00666667 0,2173913 0,03066667 32,6086957
158 4,80 0,00632911 0,20833333 0,03037975 32,9166667

A continuacin se muestran los resultados obtenidos para cada mtodo:


Grfica No. 1/v
0
vs. 1/S
0
(mtodo de Lineweaver)


Grfica No. 1/v
0
vs. V
0
/S
0
(mtodo de Lineweaver)



0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0 0,01 0,02 0,03
1
/
v
o
1/So
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
0 0,05 0,1
v
o

Vo/So

Grfica No. S
0
/v
0
vs. S
0
(mtodo de Hanes)

Para cada mtodo se obtuvo una recta de regresin lineal. A partir de la pendiente y del intercepto
de la recta con el eje de ordenadas pueden calcularse los valores de K
M
y v
max
. La siguiente tabla
muestra las pendientes, interceptos y coeficientes de correlacin de cada recta de regresin, as
como los valores de K
M
y v
max
:

Mtodo grfico Pendiente Intercepto R
2
K
M
(M) v
max
(M/min)
Lineweaver

0,9850 20,51 5,359
Eadie-Hosfee

0,9716 20,31 5,350
Hanes

0,9979 19,69 5,319

Para hallar el valor de la constante k, hay que considerar la siguiente ecuacin de velocidad:

Donde k
3
= k y S >>> K
M
(enzimas saturadas).
Como [E]
total
= 95 mg enzima/ml y se calcul v
max
[M/min] para cada mtodo grfico, es posible
obtener el valor de k en mol/g min para cada v
max
:

Mtodo grfico v
max
(M/min)

(mol/g min)
Lineweaver
5,359 0,0564
Eadie-Hosfee
5,350 0,0563
Hanes
5,319 0,0560




0
5
10
15
20
25
30
35
40
0 50 100 150 200
S
o
/
V
o
So
Usted se dio cuenta de que en presencia de acetona se reduce la velocidad de reaccin. Esto es un
problema grande, ya que el contaminante de inters en la mayora de los casos se produce en
conjunto con la acetona. Inmediatamente ha pensado en que existe inhibicin, pero an no sabe
de qu tipo. Usted repite el mismo experimento pero esta vez adiciona 50 M de acetona.

2.
a. Identifique el tipo de inhibicin y la constante de inhibicin de acetona, K
I


Concentracin de sustrato (M)
t = 0 min t = 10 min
47 28
49 29
92 64
100 71
150 116
158 122
Al realizar clculos similares a los del punto 1 con los datos obtenidos cuando se adicionan 50 M
de acetona, estos son los resultados:

S
0
(M) v
0
(M/min) 1/S
0
1/v
0
v
0
/S
0
S
0
/v
0
47 1,90 0,0212766 0,52631579 0,04042553 24,7368421
49 2,00 0,02040816 0,5 0,04081633 24,5
92 2,80 0,01086957 0,35714286 0,03043478 32,8571429
100 2,90 0,01 0,34482759 0,029 34,4827586
150 3,40 0,00666667 0,29411765 0,02266667 44,1176471
158 3,60 0,00632911 0,27777778 0,02278481 43,8888889


Grfica No. v
0
vs. S
0
para reacciones inhibida y no inhibida

0
1
2
3
4
5
6
0 50 100 150 200
v
o
(

M
/
m
i
n
)
So(M)
Inhibida
No inhibida
De acuerdo con los resultados y con la grfica, es evidente que se presenta una inhibicin debido a
la acetona. Para determinar el tipo de inhibicin, es necesario calcular K
M
y v
max
y compararlos con
estos mismos parmetros en la reaccin no inhibida. En la siguiente tabla aparecen los valores
obtenidos:

Mtodo grfico Pendiente Intercepto R
2
K
M
(M) v
max
(M/min)
Lineweaver

0,9973 85,87 5,429
Eadie-Hosfee

0,9862 86,09 5,437
Hanes

0,9954 87,90 5,491

Al contrastar los valores de K
M
y v
max
de las reacciones inhibida y no inhibida, se encuentra que:

Con base en lo anterior, se puede concluir que se presenta una inhibicin competitiva por parte
de la acetona.

Para calcular la constante de inhibicin de la acetona, K
I
, se utiliza la siguiente ecuacin:


As,

Donde: K
M aparente
= K
M inhibida

K
M
= K
M no inhibida

I = concentracin acetona = 50 M

A continuacin se muestran los resultados de K
I
para cada mtodo grfico.

Mtodo grfico K
M
(aparente) (M) K
M
(M) K
I
(M)
Lineweaver
85,87 20,51 15,69
Eadie-Hosfee
86,09 20,31 15,44
Hanes
87,90 19,69 14,43

b. Basado en esta observacin, qu puede hacer para aumentar la eficiencia de su
reactor?

La eficiencia del reactor puede aumentar incrementando la concentracin de sustrato.

3. Explique la diferencia entre respiracin y fermentacin en cuanto a:

a. Donantes y aceptores de electrones

Tanto la respiracin como la fermentacin comparten un mismo donante de electrones, en este
caso un compuesto orgnico o sustrato.
La principal diferencia entre ambos procesos radica en los aceptores de electrones: en la
respiracin, el aceptor de electrones es suministrado externamente. La siguiente tabla muestra los
principales aceptores y el producto final que se genera:

Aceptor Producto final
Oxgeno CO
2

Nitrato Nitritos, N
2

Sulfato Sulfuros
Azufre Sulfuros
CO
2
Metano
Fe
3+
Fe
2+

Mn
4+
Mn
2+

Arseniato Arsenito
Fumarato Succinato
DMSO DMS

Si el aceptor final de electrones es oxgeno, la respiracin se denomina aerobia u oxignica. Para
otros aceptores, se tiene el nombre genrico de respiracin anaerobia. En ausencia total de
oxgeno se habla de respiracin anxica.

En la fermentacin, el aceptor de electrones no es suministrado desde el exterior, sino que es un
compuesto orgnico derivado del sustrato inicial que se ha oxidado anteriormente. Por esta razn,
la fermentacin no es un proceso de respiracin anaerobia.

b. Cantidad de energa producida
Los procesos de respiracin son energticamente ms eficientes que los de fermentacin. La
respiracin oxignica genera treinta y ocho (38) molculas de ATP (la cual almacena la energa en
la clula), mientras que la fermentacin slo produce dos (2) de estas molculas.
Otros procesos de respiracin anaerobia no son tan eficientes energticamente como la
respiracin aerobia, debido a que el potencial de reduccin de los aceptores es menor que el del
oxgeno molecular.

c. Mecanismo para formacin de ATP

En la respiracin, el ATP se genera a travs de transportadores de electrones (flavoprotenas,
quinonas, citocromos, etc.), los cuales conforman la cadena transportadora caracterstica del
proceso. La reaccin general de produccin de ATP es la siguiente:

ADP
3-
+ H
+
+ HPO
4
2-
ATP
4-
+ H
2
O, H
0
= +31,0 kJ/mol

La energa necesaria para esta reaccin proviene de los procesos de xido-reduccin que se llevan
a cabo en la cadena transportadora de electrones.

En general el proceso de respiracin aerobia puede resumirse como sigue:

Reacciones que generan energa:

a. Dos molculas de gliceraldehido-3-fosfato se oxidan a dos molculas de cido pirvico (se
producen 4 molculas de ATP y dos de NADH).
b. El Ciclo de Krebs comienza cuando los dos carbonos del in acetato se adicionan a una
molcula de oxaloacetato (de cuatro carbonos), para producir citrato (con 6 carbonos).
Por cada ciclo, se producen tres molculas de NADH
+
, un in H
+
, una molcula de ATP, una
molcula de FADH
2
y dos molculas de CO
2
. As, para dos grupos acetilos se generarn 2
molculas de ATP.
c. En la cadena respiratoria total se liberan 32 molculas de ATP.

Reacciones que requieren inversin de energa

a. Los fosfatos de cada ATP se adicionan al carbono 6 y al carbono 1 de la molcula de
glucosa para formar fructosa 1,6-bifosfato. La enzima aldolasa divide la molcula en dos
molculas de 3 carbonos cada una, que se convierten en gliceraldehido-3-fosfato (G3P). En
este proceso se utilizan dos molculas de ATP.

En total se generan 36 molculas de ATP netas si la gluclisis sigue un proceso aerbico, y slo
seran 2 molculas de ATP si la gluclisis toma una ruta anaerbica.

En la fermentacin, por otro lado, al no intervenir la cadena respiratoria el sustrato no se oxida
completamente, por lo que la energa liberada es menor que la del proceso de respiracin. La
sntesis de ATP se lleva a cabo por fosforilacin a nivel de sustrato, la cual consiste en un sustrato
orgnico (donador de electrones) que es oxidado por un coenzima (p. ej., NAD
+
), de manera que se
origina un intermediario no fosforilado con una gran energa de hidrlisis. Este intermediario
experimenta una sustitucin con un fosfato, para dar la correspondiente forma acil-fosfato (siendo
este enlace de alta energa). Finalmente, este acil-fosfato dona su fosfato de alta energa al ADP,
que pasa a ATP.

4. Explique la diferencia entre la respiracin oxignica y la respiracin anxica. Cules son
los aceptores de electrones? Cules son los donantes de electrones? Cul es la fuente
de carbono?

La principal diferencia entre la respiracin oxignica y la respiracin anxica es el tipo de aceptor
de electrones externo utilizado: en el caso de la oxignica o arobica el aceptor es el oxgeno
molecular (O
2
) mientras que la respiracin anxica usa otros aceptores, tales como nitrato (NO
3
),
sulfato (SO
4
2-
), in frrico (Fe
3+
) y en general una especie inorgnica u orgnica capaz de reducirse
(de aceptar electrones).
En ambos procesos, el donante de electrones o sustrato puede ser el mismo, sin embargo se
generan productos distintos: la respiracin aerobia resulta en CO
2
y H
2
O, mientras que la anxica,
dependiendo del aceptor, termina en nitrgeno (N
2
), sulfuro de hidrgeno (H
2
S), in ferroso (Fe
2+
),
etc.
La cuestin de la fuente de carbono depender del tipo de organismo que est realizando el
proceso. Si se trata de un organismo hetertrofo la fuente de carbono deber ser un compuesto
orgnico como la glucosa. Sin embargo, si el organismo es auttrofo su fuente de carbono puede
ser un compuesto inorgnico, tal como el CO
2
.