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Identificacin de patgenos periodontales en sitios periimplantarios Sanos

Priscila Ladeira Casado, Ivone Beatriz Otazu, Alex Balduino, Wallace de Mello,
Eliane Porto Barboza, y Maria Eugenia Leite Duarte.
PROPSITO: evaluar la presencia de periodontopatgenos en sitios
periimplantarios subgingivales en pacientes parcialmente edntulos utilizando
procedimientos de reaccin en cadena de polimerasa (PCR), en reas con signos
clnicos y radiogrficos de salud y reas que presentan enfermedad
periimplantaria. MATERIALES Y MTODOS: Treinta pacientes parcialmente
edntulos no fumadores, entre 30 y 76 aos, fueron incluidos en este estudio y
divididos en 3 grupos segn sus caractersticas clnicas y radiogrficas. Grupo A
(n = 10) presenta salud periimplantaria, grupo B (n = 10) presenta mucositis
periimplantaria y grupo C (n = 10) pacientes con periimplantitis. Los tejidos
periimplantarios fueron examinados clnicamente con respecto al color de la
mucosa, presencia de placa bacteriana, profundidad y sangrado al sondaje, y
supuracin local. Tambin se consider la historia de la enfermedad
periodontal. El anlisis radiogrfico evalu la presencia de la prdida de hueso
alrededor del implante. Se recogieron muestras de fluido crevicular periimplantario
para analizar la presencia de patgenos periodontales, Actinobacillus
actinomycetemcomitans (Aa), Porphyromonas gingivalis (Pg), Prevotella
intermedia (Pi), Tannerella forsythensis (Tf), y Treponema denticola (Td).
RESULTADOS: Los resultados mostraron que la historia de la enfermedad
periodontal se asocia con la enfermedad periimplantaria. Las bacterisa Aa, Pg, Pi,
Td y Tf estaban presentes en sitios periimplantarios caracterizados clnicamente y
radiolgicamente, como tejidos sanos periimplantarios, mucositis y periimplantitis.
CONCLUSIONES: se lleg a la conclusin que Aa, Pg, Pi, Td y Tf estn presentes
en condiciones sanas y enfermas. Por lo tanto, estos patgenos periodontales no
estn estrictamente relacionados con sitios de la enfermedad periimplantaria.
(Implant Dentistry 2011; Vol.20, No.3: p. 226 236)


Palabras Clave: enfermedad periimplantaria, enfermedad periodontal, reaccion en
cadena de polimerasa, bacterias
Introduccin
Las tasas altas de xito documentadas de implantes dentales osteointegrados han
conducido a su uso como un protocolo clnico comn para restablecer la salud oral
en sujetos.
1-4
Sin embargo, el mantenimiento a largo plazo de la osteointegracin
depende en gran medida de la conservacin del tejido marginal suave sano y los
tejidos periimplantarios duros. Recientemente, las complicaciones biolgicas,
como la mucositis periimplantaria y periimplantitis, se han descrito en varios
estudios.
5-8

En el 2008, el Sexto Taller Europeo de Periodontologa de la Academia Europea
de Periodoncia en Ittigen, Suiza, discuti temas relacionados con la enfermedad
periimplantaria. Se observ que las lesiones ms comunes que se producen, por
ejemplo, la mucositis periimplantaria y periimplantitis son causadas por bacterias.
Aunque las lesiones de mucositis periimplantaria residen en los tejidos blandos, la
periimplantitis tambin afecta el hueso de soporte.
9

La cavidad oral humana est habitada por >600 especies de bacterias, de las
cuales la mayora son inofensivas.
10,11
Previamente se ha estimado que al menos
400 especies habitan en la regin subgingival.
12

La relacin causa-efecto entre la placa bacteriana y el desarrollo de la mucositis
tambin fue establecida para los implantes orales.
7,13-15
Varias investigaciones han
tratado de caracterizar el biofilm alrededor de los implantes dentales por medio de
diferentes tcnicas, incluyendo la reaccin en cadena de polimerasa (PCR), cultivo
bacteriano, tecnologa de hibridacin por chequeo del ADN-ADN, entre otros.
16-18

Los estudios han demostrado que la infeccin periimplantaria se asocia con
especies anaerobias Gram-negativas.
17-19

Durante el fracaso periimplantario, se establece una microbiota compleja, muy
parecida a la que se encuentra en la periodontitis del adulto.
20,21
Segn estudios
anteriores, el perfil microbiolgico en los implantes fracasados se diferencia de ese
en los tejidos periimplantarios sanos. Los autores han relacionado niveles altos de
5 patgenos periodontales en pacientes con periimplantitis, Actinobacillus
actinomycetemcomitans(Aa), Porphyromonas gingivalis (Pg), Prevotella intermedia
(Pi), Bacteroides forsythus (Bf), and Treponema denticola (Td).
19,22
En contraste,
segn Mombelli et al
18
y Ong et al,
23
Pg y espiroquetas casi nunca se encuentran
en los implantes en una boca edntula an cuando los signos de inflamacin
estaban presentes.
La divergencia de los resultados, los diferentes procedimientos clnicos y de
laboratorio para la identificacin de bacterias entre los autores y el hecho que la
investigacin reciente
9
afirm que la mucositis periimplantaria se produce en
aproximadamente el ~80% de los sujetos (50% de los sitios) restaurados con
implantes y la periimplantitis en 28% a 56% de los sujetos (12% - 40% de los
sitios) estimul nuestro grupo de investigacin para identificar la presencia real de
las bacterias previamente estudiadas en sitios presentando salud y enfermedad
alrededor de los implantes, porque consideramos que es muy importante para
entender el proceso de enfermedad en los tejidos periimplantarios, para mejorar
los protocolos futuros de tratamiento que involucran la enfermedad periimplantaria.

El objetivo del presente estudio fue evaluar la presencia de periodontopatgenos
en sitios periimplantarios subgingivales en pacientes parcialmente edntulos
utilizando procedimientos de PCR, en lo que respecta a las reas con signos
clnicos y radiogrficos de salud y reas que presentan enfermedad
periimplantaria.

MATERIALES Y MTODOS

Los procedimientos clnicos del estudio se llevaron a cabo segn las
recomendaciones de la Junta tica de Investigacin Medica de la Universidad
Federal Fluminense (Nmero de Registro CMM / Huap 0061.0.258.000-07).

Procedimiento Clnico

Treinta pacientes no fumadores, parcialmente edntulos (12 mujeres y 18
hombres) con edad promedio de 53 11.8 aos (rango 30 76 aos),
presentando un total de 130 implantes endseos oseointegrados (Titanium Fix
Implants A.S.; Sao Jos dos Campos, Sao Paulo, Brasil), 80 en el maxilar y 50 en
la mandbula, sin enfermedad sistmica fueron seleccionados aleatoriamente para
este estudio. Todos los pacientes firmaron un consentimiento informado sobre la
naturaleza del estudio.

Todas las regiones periimplantares fueron evaluadas radiogrficamente y
clnicamente. De estas, se seleccion 1 regin periimplantaria de cada individuo,
17 en el maxilar y 13 en la mandbula, segn los siguientes criterios: (1) en
pacientes que presentaban solo 1 implante, se seleccion este para el anlisis
clnico y de laboratorio, (2) en los pacientes que presentan > 1 implante, el tejido
periimplantario presenta signos clnicos o radiogrficos de enfermedad,
compatibles con mucositis o periimplantitis fue seleccionado para caracterizar el
individuo; (3) cuando todos los implantes presentan condiciones saludables, el
implante ms cercano a la lnea media fue seleccionado para el anlisis. El
examen clnico de los sitios periimplantarios consisti en la inspeccin visual y la
palpacin, el anlisis del color gingival, la acumulacin de placa, y la movilidad del
implante. Se consider la historia de la enfermedad periodontal. El surco
periimplantario fue sodeado cuidadosamente en 4 aspectos de cada implante y se
registr la presencia de sangrado o supuracin. Una radiografa,convencional
periapical utilizando una tcnica en paralelo, midi la presencia de la prdida sea
vertical adyacente a los implantes. La altura sea periimplantaria alrededor del
implante fue registrada segn la exposicin del tornillo. Cuando se identificaron >2
exposiciones de tornillo, se consider como prdida sea patolgica y caracteriz
periimplantitis.

Segn las caractersticas clnicas y radiolgicas de los sitios periimplantarios, los
pacientes fueron separados en 3 grupos, cada uno con 10 individuos.


Los pacientes del grupo A (sitios sanos: grupo control) no mostraron signos
clnicos de inflamacin en la mucosa periimplantaria y sin signos de prdida sea.
En el grupo B, los sitios periimplantarios caracterizados como mucositis
periimplantaria, la presencia de sangrado al sondaje, mucosa presentando color
rojo e inflamacin, pero no se observaron signos de prdida sea patolgica. Los
pacientes en el grupo C (sitios con periimplantitis) mostraron signos clnicos de
inflamacin, incluyendo movilidad del implante, supuracin en algunos casos, y
signos radiogrficos de prdida sea patolgica.

Examen microbiolgico
Un total de 120 muestras de microorganismos subgingivales fueron obtenidas de
30 pacientes. La placa supragingival, si estba presente, fue eliminada. El rea fue
secada y aislada con rollos de algodn. Se obtuvieron muestras del fluido
crevicular periimplantario (PICF) colocando pipetas microcapilares volumtricas
calibrados intracrevicularmente. Las pipetas en sitios que no expresaron volumen
de fluido y las pipetas que fueron contaminados con sangre / saliva fueron
descartadas. De cada sitio, un volumen estandarizado de 1 L fue recogido en los
4 aspectos, la pipeta se enjuag inmediatamente en 400 L de la solucin lisis
(Tris 1 M / HCl pH 7,5; EDTA 0,5 M pH 8,0; NaCl 3 M) y despus se incub a -20
C.
Para la extraccin de ADN, se adicionaron 5 L de proteinasa K (10 mg / ml)
(Sigma Chemical Co., St Louis, MO) y 40 L de SDS al 10%, agitados
vigorosamente durante 5 segundos, e incubados en agua a 65C durante 45
minutos. Despus de la incubacin, se aadieron 450 L de fenol fro (pH 7,5) y se
centrifug a 13.000 rpm a 4C, durante 2 minutos. La fase acuosa (superior), que
contiene ADN, se transfiri cuidadosamente a un tubo nuevo. Se aadi solucin
(1:01) de alcohol cloroformisoamlico fro (24:1) y se mezcl suavemente durante
1 minuto. La solucin fue centrifugada a 13.000 rpm a 4C durante 2 minutos. La
fase acuosa se transfiri a un nuevo tubo de microcentrfuga. Brevemente, se
aadi un dcimo del volumen de NaCl 3M y dos veces el volumen de etanol
absoluto fro y se centrifugaron a 13.000 rpm a 4C durante 30 minutos para
eliminar las sales y molculas orgnicas pequeas. El sobrenadante fue retirado
cuidadosamente y los pellets (bolas) secados con aire. El ADN se resuspendi en
40 L de agua destilada estril. La cuantificacin del ADN y el anlisis de pureza
se lograron por espectrofotometra (Nanodrop Products, Wilmington, Delaware).

Nested PCR
1
se utiliz para detectar patgenos periodontales. En la primera
reaccin de amplificacin, 1 L de ADN (100 ng de DNA) se mezcl con 20 L de
mezcla Universal (0,8 L de MgCl2 50 mM, 2,5 L de tampn 10x; 0,2 L de 25
mM dNTPs con cantidades equimolares de dTTP, dCTP, dGTP y dATP; 0,1 L de
cebador 27F [25 mM]; 0,1 L de cebador 1492R [25 mM]; 0,35 L de 2
polimerasas UTaqDNA [Amersham Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Suecia]).

La segunda amplificacin identific 5 microorganismos: Actinobacillus
actinomycetemcomitans (Aa), Porphyromonas gingivalis (Pg), Prevotella
intermedia (Pi), Tannerella forsythensis (Tf) y Treponema denticola (Td). Un
microlitro del volumen final de la primera reaccin de amplificacin se mezcl con
20 L de cada mezcla especfica de especie (0,4 L de MgCl2 50 mM; 2,5 L
tampn 10x; 0,2 L de 25 mM dNTPs con cantidades equimolares de dTTP,

1
La PCR anidada conocida como Nested PCR es una variante de la PCR convencional que
comprende dos rondas de amplificacin con distintos pares de cebadores en cada una, con el fin
de incrementar la sensibilidad y la especificidad de la deteccin.
dCTP, dGTP, y dATP; 0,1 L del cebador directo para cada bacteria [25 mM]; 0,35
L de polimerasa 2 UTaqDNA [Amersham Pharmacia Biotech AB, Uppsala,
Suecia]). Cebadores especficos de las especies se basaron en la secuencia del
gen 16S rRNA segn Mayanagi et al.
24


Seis controles positivos de ADN se utilizaron de cultivos anteriores de clulas para
PCR universal y para cada especie de bacteria. Adicionalmente, tambin se
utilizaron 2 controles negativos: (1) del resultado del primer control negativo de la
extraccin de ADN de la primera amplificacin, y (2) de mezclas de reaccin del
control negativo de la primera reaccin de PCR de las segundas amplificaciones.
Todas las amplificaciones de PCR se llevaron a cabo con un gradiente MyGenie
96 Gradient Thermal Block (Bioneer Corporation) en las condiciones enumeradas en
la Tabla 1. Los productos de reaccin se sometieron a electroforesis en geles de
agarosa al 1.5%, se tieron con bromuro de etidio y fotografiado bajo luz
ultravioleta. Un DNA Ladder 100 pb (Invitrogen Corp. Carlsbad) se utiliz como
marcador de pares de base.
Anlisis estadstico

Los datos de los pacientes individuales, incluyendo las caractersticas clnicas,
radiogrficas, y microbiolgicas se transcribieron en un software estadstico para
PC (SPSS versin 12.0, SPSS Inc., Chicago). La prueba chi-cuadrado se utiliz
para analizar la presencia de cada bacteria (Aa, Pg, Pi, Td y Tf) dentro de cada
grupo. La prueba de Cochran se utiliz para comparar la presencia de todas las
bacterias entre los grupos. La prueba de McNemar se utiliz para identificar la
diferencia en las proporciones bacterianas, cuando est presente. Las diferencias
se consideraron significativas cuando P <0,05.

Resultados

La Tabla 2 muestra los resultados clnicos y radiogrficos en cada grupo. Dos
pacientes (20%) con los tejidos periimplantarios sanos (grupo A) presentaron
historia de enfermedad periodontal. Ocho pacientes del grupo B (mucositis) y
todos los pacientes en el grupo C (periimplantitis) presentaron antecedentes de
enfermedad periodontal. Sangrado al sondaje se observ en 2 pacientes del grupo
A, mostrando las condiciones clnicas de salud. La acumulacin de placa estaba
presente slo en los tejidos periimplantarios enfermos (grupos B y C). La
profundidad media al sondaje fue 1,1 0,6 mm, 2,9 0,7 mm, y 4,2 1,9 mm en
los grupos A, B, y C, respectivamente. Cinco implantes con periimplantitis
presentaron prdida sea completa alrededor del implante y movilidad del
implante.

Las frecuencias de deteccin de las bacterias objeto en sitios periimplantarias
subgingivales para cada grupo se muestran en la Tabla 3. El producto de
amplificacin por PCR mostr que no hubo diferencias (P> 0,05) en las
frecuencias de deteccin de Aa, Pg, Pi, y Td dentro de los grupos sanos y
enfermos. El anlisis de la prueba chi-cuadrado mostr que la proporcin de
bacterias Tf pareca ser menor en las muestras subgingivales del grupo B que en
los grupos A y C (P> 0,05). La prueba de McNemar, con un nivel de significacin
= 0.05, permiti identificar diferencias entre los grupos, teniendo en cuenta la
proporcin total de bacterias. Como resultado, las proporciones mostraron que, en
condiciones saludables, las bacterias Pg (90%) son ms expresivas que las
bacterias Aa (30%).

Los resultados mostraron la presencia de 5 patgenos periodontales, Aa, Pg, Pi,
Td, y Tf (Tabla 3), en sitios periimplantarios clnicamente y radiogrficamente
caracterizados como tejidos sanos periimplantarios, mucositis y periimplantitis.

DISCUSIN
En este estudio se evalu la presencia de 5 bacterias (Aa, Pg, Pi, Td y Tf)
implicadas en la etiopatogenia de la enfermedad periodontal en sitios
periimplantarios subgingivales, en relacin a las reas con signos clnicos o
radiolgicos de reas sanas que presentan enfermedad periimplantaria en 30
pacientes. En nuestro estudio, todos los pacientes eran parcialmente edntulos,
en un intento por entender la presencia de infeccin cruzada entre los sitios
periodontales y sitios periimplantarios. Estudios previos detectaron altos niveles de
periodontopatgenos en implantes fracasados y en fracaso.
19, 22


Sin embargo, todava hay controversias en la literatura. George et al
25

demostraron que la presencia de Pi, Pg y Aa fue correlacionada con una mayor
profundidad al sondaje, ms sangrado y una velocidad de fluido mayor del surco
gingival. Estos 3 patgenos tambin se encontraron en el 60% de las lesiones
periimplantarias,
26
y, sobre todo, altos niveles de Pi y Aa estaban asociados con
los implantes en fracaso.
20,27


Botero et al2
8
evaluaron la microbiota subgingival utilizando un mtodo de cultivo,
observndo diferencias significativas entre los tejidos sanos y enfermos. En su
estudio, Pg se encontr en los implantes enfermos, pero no en las regiones sanas.
En 2002, Buchmann et al
29
afirmaron que la presencia de Aa y Pi no es compatible
con un estado saludable alrededor de los implantes. En contraste, nuestro estudio
mostr la presencia de 5 patgenos periodontales, Aa, Pg, Pi, Td, y Tf (Tabla 3) en
sitios periimplantarios clnicamente y radiogrficamente caracterizados como
tejidos sanos periimplantarios, mucositis y periimplantitis. Sin embargo, slo en
sitios enfermos fueron detectados estos patgenos al mismo tiempo. Nuestros
resultados indican que la presencia de estos patgenos periodontales en surcos
periimplantarios no conduce necesariamente a la destruccin o an a sntomas
inflamatorios, pero se involucra una combinacin de factores, incluyendo la
respuesta gentica, inflamatoria, y la sobrecarga oclusal.
La discrepancia entre los autores y el hecho que pocas diferencias se observaron
como resultado de la condicin del implante sugiere que los patgenos distintos a
los estudiados aqu pueden estar involucrados en el proceso de la enfermedad
implantar. Esto es coherente con la idea que muchas especies se pueden
encontrar en la cavidad oral y an no se han identificado.
30
Otro aspecto
importante
31
es la idea que el mtodo de muestreo ptimo bacteriano no ha sido
establecido an. En nuestro estudio, consideramos PICF como una fuente segura
para el muestreo, el cual se puede hacer con anlisis de laboratorio por medio del
PCR para diferentes especies de bacterias. PICF no es un exudado inflamatorio
mediado osmticamente y cambio el ndice de flujo y sucede el perfil segn la
condicin de los tejidos periimplantarios. Por lo tanto, el anlisis PICF puede
ayudar a detectar lesiones metablicas y bioqumicas que nos son perceptibles y
en monitorear el proceso de oseointegracin as como la respuesta sea a la
carga oclusal, por lo tanto mejorando el xito a largo plazo de los implantes.
32


Los mtodos de cultivo han sido ampliamente utilizados en los estudios con el
objetivo de caracterizar la microflora subgingival. Sin embargo, este mtodo slo
puede cultivar bacterias viables. Por lo tanto, algunos de los patgenos putativos,
como Td y Tf, son muy exigentes y difciles de cultivar,
(33)
de manera que
cantidades bajas de un patgeno especfico en una muestra subgingival podran
ser detectadas.
34
Por el contrario, las pruebas inmunolgicas para las bacterias
orales han demostrado una mayor sensibilidad y especificidad para la deteccin
de microorganismos, sin embargo, requieren el uso de anticuerpos monoclonales
para asegurar una alta especificidad, que se limitan a la cantidad de anticuerpos
probados, adems de la falta de estudios controlados y clnicos para validar este
procedimiento.
35

Diferentes mtodos qumicos, enzimticos, o fsicos se han utilizado en la biologa
molecular para obtener ADN para el anlisis posterior por medio de sondas de
ADN o PCR.
35, 36
La tcnica descrita en nuestro estudio ha aislado con xito ADN
de cantidades minsculas de lquidos, como PICF sin necesidad de sofisticados
equipos de laboratorio y de experiencia. Sin embargo, la purificacin del ADN
desde PICF puede ser un procedimiento crtico debido a la cantidad mnima de
fluido. Por lo tanto, hemos desarrollado un protocolo simplificado de
fenolcloroformo-isoamilo para facilitar la obtencin de ADN de PICF. Se consider
un estudio diagnstico y epidemiolgico basado en el anlisis de ADN como un
factor clave en la planificacin y el establecimiento del tratamiento de la
enfermedad.

A pesar de los indicadores de riesgo para la enfermedad periimplantaria, como la
mala calidad y cantidad de hueso y tejidos blandos, la condicin mdica del
paciente, los hbitos del paciente desfavorables, las tcnicas quirrgicas y de
prtesis e implantes subptimos, las causas de fracaso de los implantes estn
an lejos de ser comprendidas.
37-39
En nuestro estudio, hemos considerado la historia de la enfermedad periodontal, la
profundidad al sondaje, sangrado al sondaje, el gnero, la edad y la acumulacin
de placa como posibles indicadores para el desarrollo de la enfermedad
periimplantaria. Adems, con base en las observaciones clnicas, se sugiere que
la historia de la enfermedad periodontal est muy relacionada a este fracaso del
implante. Se excluyeron los pacientes fumadores o pacientes con condiciones
mdicas que podran afectar a la cicatrizacin del hueso, para estudiar los factores
locales solamente.
Otro punto importante relacionado con la enfermedad periimplantaria es el
diagnstico correcto. En el presente estudio, el sangrado al sondaje suave estuvo
presente en el 100% de los sitios de la enfermedad periimplantaria, sin embargo, 2
sitios sanos alrededor de los implantes presentaron sangrado aunque no se
encontraron signos clnicos de inflamacin. Sin embargo, algunos estudios han
reportado tasas ms bajas de sangrado periimplantario al sondaje.
40,41
Una
posible explicacin para estas diferencias seal hacia la fuerza de la sonda
utilizada en los procedimientos de sondeo alrededor de los implantes. Segn
Ferreira et al,
3
no se ha definido claramente si BOP periimplantario podra
representar un parmetro fiable para la identificacin de la presencia de la
enfermedad periimplantaria. Nuestros resultados sugieren que la ausencia de BOP
periimplantario podra indicar una condicin estable del periimplante, pero la
presencia de BOP no siempre est relacionada con la condicin de enfermedad.
CONCLUSIONES
En base a los resultados, se concluye que una historia de enfermedad periodontal
puede predisponer al establecimiento de enfermedad periimplantaria. Adems, las
bacterias Aa, Pg, Pi, Tf y Td, no se correlacionaron con el estado o condicin de la
enfermedad periimplantaria. Estos patgenos periodontales estn presentes en
condiciones sanas y enfermas. Adems, el mtodo de PCR y el protocolo para la
extraccin del ADN de PICF, descrito en este estudio, ha demostrado ser eficaz
para la identificacin de bacterias en sitios subgingivales, incluyendo Td y Tf, no
susceptibles de ser detectable por mtodos de cultivo. Sugerimos considerar la
tcnica utilizada para la evaluacin microbiana alrededor del implante, adems de
las condiciones clnicas y radiogrficas, como una forma de estandarizar los
protocolos de tratamientos futuros que implican enfermedad periimplantaria.

DNA Checkerboard



Chequeo del DNA para la identificacin de especies bacterianas probadas contra
muestras de placa dental. Muestras aplicadas dentro de los espacios extendidos
del aparato MiniSlot y concentradas dentro de una membrana de nylon de 15x15
cm; aplicacin de las sondas marcadas sobre los espacios individuales en el
aparato MiniSlot, los caminos horizontales numerados de 1 hasta 28 son las
muestras de placa y las dos verticales a la derecha son contenidos estndar de
105 o 106 clulas en cada especie probada. El camino vertical contiene las
sondas indicadas de ADN en el bfer de hibridacin. (Cssio do Nascimento.
DNA Checkerboard Method for Bacterial Pathogen Identification. En: Int. J.
Morphol. 2006; Vol.24, No.4: p. 620