RESUMEN

Las clulas madre pluripotentes inducidas (iPSCs) tienen el potencial de generar tejidos especficos del paciente para
modelado de la enfermedad e incluso la medicina regenerativa. Sin embargo, antes de que la tecnologa puede IPSC
avanzar a la fase de traduccin, varios obstculos deben ser superados. Estos incluyen la incertidumbre en relacin con
el tipo de clula somtica ideal para la reprogramacin, la cintica bajos y eficiencia de reprogramacin, y las
discrepancias entre cariotipo iPSCs y sus precursores somticas. Aqu describimos el uso de la tarde-excrecencia clulas
progenitoras endoteliales (EPC-L), que poseen varios favorable caractersticas, como sustrato celular para la generacin
de iPSCs.Wehave desarrollaron un protocolo que permite el aislamiento fiable de L-EPC de preparaciones de clulas
mononucleares de sangre perifrica, incluidas las muestras congeladas. Como prueba de principio para aplicaciones
clnicas generamos EPC-iPSCs tanto de los individuos sanos y pacientes con heredables y formas idiopticas de la arteria
pulmonar la hipertensin. L-EPC creci clonal; eran altamente proliferativo, passageable y financiables, y muestra ms
altos cintica de reprogramacin y la eficiencia en comparacin con los fibroblastos drmicos. Desemejante
fibroblastos, la alta eficiencia de la L-EPC reprogramacin permitidos para la generacin fiable de iPSCs en un formato
de 96 pocillos, que es compatible con las plataformas de alto rendimiento. Matriz comparativa del genoma anlisis de
hibridacin de L-EPC frente donantes emparejados monocitos circulantes demostrado que la L-EPC tienen cariotipos
normales en comparacin con el genoma de referencia de su tema. Adems, > 80% de las lneas EPC-IPSC probados no
adquiri las variaciones del nmero de copia durante la eprogramacin
en comparacin con sus padres lnea L-EPC. Este trabajo identifica L-EPC como un celular, prctico y eficiente sustrato
para la generacin de IPSC, con el potencial para hacer frente a muchos de los factores que limitan actualmente la
traduccin de esta tecnologa. CLULAS MADRE Translational Medicine 2012; 1:855-865
INTRODUCCIN
Las clulas madre pluripotentes inducidas (iPSCs) proporcionan el potencial de generar tejidos especficos del
paciente para el modelado de la enfermedad, las drogas y toxicologa
seleccin, el reemplazo de tejidos, y la entrega de la terapia gnica [1, 2]. Sin embargo, para la tecnologa de IPSC
para pasar a la fase de traduccin, variosobstculos. Estos incluyen la incertidumbre en relacin con el tipo de
clula somtica ideal para la reprogramacin,
la cintica de baja y la eficiencia de la reprogramacin, y las diferencias genmicas entre
iPSCs y sus progenitores somticas [3-5], que puede que no les permiten aplicaciones clnicas.
Muchos se han logrado avances en la tecnologa de entrega transgn utilizado en la reprogramacin nuclear
protocolos. Sin embargo, la eleccin de los
de partida tipo de clula tambin es crtica. las caractersticas de un sustrato celular ideal para simple, eficiente, y
la generacin de IPSC gran escala incluira
las clulas que son (a) claramente definida; (b) reproducible aislados y fcilmente cultivada de sujetos de todas las
edades y de todo el espectro de la normalidad y estados de enfermedad; (c) expansible en la cultura y adecuado
para la banca (almacenamiento a largo plazo); (d) en posesin de un "normal" genoma inalterada;y (e) capaz de
reprogramacin altamente eficiente. Estudios recientes han demostrado que los genomas
de muchos de fibroblastos derivados de lneas de IPSC se alteran
en comparacin con las clulas de las que eran derivados [3-5]. En estos informes, los genomas de las lneas
analizaron las variaciones del nmero de copias exhibidas
(CNV). La frecuencia de la CNV correlacionada con la tcnica de reprogramacin, con retroviral mtodos que
resultan en el mayor nmero de
CNV. Se ha sugerido que estos defectos son una consecuencia del proceso de reprogramacin
[3]. Estos hallazgos tienen implicaciones para el el uso de clulas iPS en el modelado de la enfermedad, ya
genmica anomalas podran alterar el comportamiento fenotpico.
La inestabilidad genmica tambin es una preocupacin para las terapias basadas en clulas como
esto plantea la posibilidad de transformacin maligna. Una alternativa para causar el aumento observado en la carga
mutacional es que al menos algunas de las CNV se deben a los genomas de clonalmente iPSCs derivados que se
comparan con un genoma de referencia generado
a partir de una poblacin policlonal de fibroblastos , slo algunos de que tienen un representante genoma de la matriz
de fibroblastos clula. Por lo tanto una caracterstica adicional de un celular ideales sustrato para la generacin de
clulas iPS podra ser que el celular sustrato se clonalmente deriva o es capaz de expansin clonal antes para la
reprogramacin . Esto permitira la generacin de una clonal referencia genoma , que es esencial para la posterior alta
resolucin
las pruebas genticas como array hibridacin genmica comparativa y la comparacin de la secuencia genmica .
A pesar de fibroblastos de la piel son el tipo de clula ms comn usado para la generacin de clulas iPS , estas clulas
no pueden ser ideal por varias razones . El aislamiento de estas clulas requiere un procedimiento quirrgico , que no es
deseable en los nios , los pacientes con trastornos de la piel , y pacientes con alteracin de la coagulacin o curacin de
la herida . Adems ,reprogramar fibroblastos con relativamente baja eficiencia [ 1 , 2 ] . A universalmente alternativa
aceptable es el muestreo de sangre venosa , que es una relativamente menor, procedimiento bien tolerado . Aunque las
clulas T y mieloides clulas derivadas de sangre perifrica se pueden utilizar para generar CMPI especficos del paciente
[ 6 -11 ] , el uso de estas clulas est limitado por
varios factores . Estos incluyen la baja capacidad de estas clulas para expandir en la cultura, la baja eficiencia de la
reprogramacin , y la presencia de reordenamientos genmicos permanentes en las clulas T . hematopoyticas las
clulas madre derivadas de la mdula sea compartimento pueden ser reprogramado con eficiencias ms altas , pero la
obtencin de estas clulas se
no es trivial , que requiere la movilizacin del compartimento de la mdula sea o bonemarrowaspiration [ 12 , 13 ] . Por
lo tanto , weconsidered otra derivados de la sangre los tipos de clulas que pueden tener una amplia aplicacin .
anterior informes han demostrado la utilidad de otras clulas mononucleares , tales clulas asCD34 ? derivadas de
cordn umbilical y sangre perifrica como sustratos para la generacin de IPSC [ 14-19 ] . Sin embargo , hasta ahora ,
ningn tipo de clula, bloodderived o de otro modo , se ha descrito que demuestra todo el
deseada atributos necesarios para mover iPSCs a la traduccin fase .
Late- excrecencia clulas progenitoras endoteliales ( EPC - L , tambin conocidas como clulas endoteliales de sangre
excrecencia ) surgir de la mononucleares fraccin de clulas de la sangre perifrica bajo endotelial selectiva
condiciones [ 20 , 21 ] . Aunque los primeros informes sugirieron que estos las clulas se derivan de la mdula sea [ 20 ]
, L - CPE aisladas de pacientes con la leucemia mieloide crnica o en la policitemia vera no lleve las mutaciones de las
clulas hematopoyticas madre somticas asociadas con estas condiciones [ 22 , 23 ] , el apoyo a la sugerencia de que L-
EPC son no de linaje mieloide . Aqu mostramos el uso de adultos derivados de la sangre tarde - excrecencia clulas
progenitoras endoteliales ( EPC - L ) [ 20 , 21 ] como
un nuevo sustrato reprogramacin celular, con un potencial de varios ventajas para la traduccin de la tecnologa de
IPSC .
MATERIALES Y MTODOS
Aislamiento y caracterizacin de L- EPC Clulas mononucleares humanas se obtuvieron 40 a 80 ml de perifrico la sangre
por centrifugacin en gradiente de densidad utilizando Ficoll
Paque Plus ( GE Healthcare , Little Chalfont , Reino Unido, http://www . gehealthcare.com ) . Muestras lavadas fueron
cultivadas a 1,5 ? 106 clulas por cm2 sobre el colgeno (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ,
http://www.bdbiosciences.com ) recubiertos con T75 o T25 en matraces
Medio EGM- 2MV ( Lonza , Basilea , Suiza, http://www .lonza.com ) que contiene 20 % de clulas madre embrionarias
de grado fetal bovino suero ( HyClone , Thermo Scientific , Basingstoke , Reino Unido, http://www.hyclone.com ) . El
medio de cultivo se cambi cada 2 das. EPC Late- excrecencia aparecieron entre 10 y 14 das en la cultura. Despus de
la generacin , las CPE se pasaron sobre el tejido plstico de cultivo y mantenido inEGM - 2MVcontaining estndar de 10
%
suero fetal bovino (SFB ) ( Gibco , Invitrogen , Paisley , Reino Unido ,
http://www.invitrogen.com ) . Citometra de Flujo
Las clulas mononucleares de sangre perifrica ( PBMNCs ) se aislaron
a partir de muestras de sangre entera por centrifugacin en gradiente de densidad de Ficoll
y los monocitos se aislaron por seleccin magntica positiva utilizando CD14 (Miltenyi Biotec , Bergisch Gladbach,
Alemania , http://www.miltenyibiotec.com ) como por el fabricante de instrucciones . L - CPE y la arteria pulmonar
humana endotelial clulas ( PAEC ) se trataron con tripsina antes de la resuspensin en tampn de tincin que contiene
2 % de FBS y 2 mM de EDTA . Los monocitos ,
L- EPC y PAECs se tieron con aloficocianina ( APC ) y conjugado ratn - ? - humana del receptor del factor de
crecimiento endotelial vascular
2 (clon 89106 , R & D Systems Inc. , Minneapolis, MN,
http://www.rndsystems.com ) , isotiocianato de fluorescena
CD31 ( FITC ) - ratn conjugado con - ? - Humana (clon WM59 ) , APCconjugated
ratn - ? - CD34 humano (clon 581 ) , conjugado con FITC
ratn - ? - CD14 humano (clon M5E2 ) , y conjugado con FITC
ratn - ? - CD45 humano (clon HI30 , todos de BD Biosciences ) o
controla el isotipo apropiado antes del anlisis .
Generacin y cultivo de Fibro- iPSCs y L- EPC- iPSCs
Generacin y cultivo de fibro - iPSCs se llev a cabo como se ha
descrito [ 5 , 24 ] utilizando 100.000 clulas de partida y con la
siguientes modificaciones. Los fibroblastos fueron transducidas a 32 C.
Las clulas prximos das se lavaron tres veces con con fosfato
solucin salina ( PBS) y se cambi a fibroblastos de embriones de ratn
( MEF ) a 37 C. El da 5 clulas se dividen y se aaden
a una placa de alimentacin MEF . A partir del da 7 , las clulas se cultivaron en KSR ?
factor de crecimiento de fibroblastos 2 ( FGF2 ) medio. Generacin de L - EPC - IPSC
y el cultivo se lleva a cabo como para fibro - iPSCs excepto que LEPC
fueron mantenidas en EGM - 2MV ? 10 % de suero hasta el da 5
cuando fueron transferidos a placas alimentadoras MEF recubiertos y
Medio MEF . Se calcul Porcentaje de reprogramacin eficiencia
de la siguiente manera : nmero de IPSC colonia en el da 20 /33, 333 100 ? .
Activina y FGF2 fueron proporcionados por Marco Hyvonen ( Departamento
de Bioqumica de la Universidad de Cambridge) .
Evaluacin de la metilacin del promotor Oct4 , bisulfito -
Reaccin en cadena de la polimerasa , y Pyrosequencing
Modificacin bisulfito de ADN genmico se llev a cabo ( 1 ? G )
utilizando el kit de la metilacin del ADN Epitect ( Qiagen , Crawley , Reino Unido ,
http://www.qiagen.com ) segn lo recomendado por el fabricante .
Se llev a cabo la reaccin en cadena de la polimerasa bisulfito ( BS - PCR )
para amplificar la regin del promotor del gen Oct3 / 4
( GRCh37 , chr6 : 31140564 -31140784 ) , reportaron haber usado previamente
cebadores [ 10 ] . El cebador inverso fue biotinilado para la
cadena molde y un solo captulo estreptavidina capturado
ADN se pyrosequenced usando cebadores pirosecuenciacin 2 y 3
para cubrir todos los sitios CpG dentro de esta regin con la excepcin de
la primera CpG . La primera CpG se pyrosequenced usando la biotinilado
cebador directo para la BS -PCR lugar y pirosecuenciacin
se ha realizado mediante la pirosecuenciacin imprimacin - 4 . pyrosequencing
carreras se realizaron con PyroGold Q96 SQA
reactivos en la ID pyrosequencer PyroMark ( Qiagen ) de acuerdo con la
recomendaciones del fabricante. Los datos pirosecuenciacin
se analizaron usando software de Pyro Q - CpG ( Qiagen ) , y los resultados
se presentan como porcentaje de metilacin para cada uno de los CpG
sitios . Todas las secuencias de los cebadores para BS -PCR y pirosecuenciacin puede
se encuentran en la Tabla suplementaria en lnea 1 . BS - PCR se realiz
a una concentracin final del cloruro de magnesio 3 mM con la
siguiente programa: 95 C durante 10 minutos, 50 ciclos de 95 C durante 20
segundos , 55 C durante 20 segundos y 72 C durante 1 minuto , y 1 ciclo
de 72 C durante 10 minutos .
Anlisis de Hibridacin Genmica Comparada
Anlisis comparativo hibridacin genmica ( CGH ) y la identificacin
de la CNV se realizaron como se describe anteriormente [ 5 ] . en
resumen , el ADN genmico fue extrado utilizando el kit DNeasy ( Qiagen ) .
Agilent 244K matrices del genoma humano ( Agilent Technologies,
Palo Alto, CA, http://www.agilent.com ) se utilizaron despus de la
el protocolo del fabricante . Las matrices fueron escaneados utilizando un Agilent
escner de microarrays , y los datos fueron generados por Agilent
Software de extraccin de caractersticas . El anlisis se realiz utilizando
Se realizaron software Agilent Workbench Genmica y CGH llamadas
usando el algoritmo de ADM - 2 ( 6,0 umbral ) con un mnimo de
tres sondeos consecutivos deteccin de una regin de la anomala .
Diferenciacin Dirigida Indica qumica definida
medio
Suero diferenciacin dirigida de extraembyonic y neuroectodermo
se realiz como se ha descrito previamente [ 24 ] . mesendoderm
diferenciacin se realiz en un protocolo de diferenciacin 3 - da en
de la siguiente manera : da 1 las clulas se cultivaron en qumica definida
medio ? alcohol de polivinilo ( como se describi anteriormente ) ? 100 ng / ml
Activina ? 100 ng / ml de FGF2 ? 10 ng / ml de la protena morfogentica sea
4 ( BMP4 ) ? 10 ? MLY ? 3 ? Mchir . El da 2 clulas fueron cambiados a
100 ng / ml de activina ? 100 ng / ml de FGF2 ? 10 ng/mlBMP4 ? 10 ? MLY
clulas excluyendo chir.Onday 3 se cambiaron a RPMImedium ? 100
ng / ml de activina ? 100 ng / ml de FGF2 .
Generacin y anlisis histolgico de los teratomas
EPC- iPSCs fueron inyectados en ratones SCID y SCID beige o bien por va intraperitoneal ,
por va intramuscular , o bajo la cpsula renal . ratones
se mantuvieron durante al menos 14 semanas despus de la inyeccin de iPSCs y
todos se tuvo cuidado en seguir una estricta poltica de tica locales y
Normas del Ministerio del Interior sobre los usos de animales y los procedimientos regulados.
Parafina teratoma Fijado en formol , EPC- IPSC derivado
especmenes se seccionaron ( 4 ? m), y la recuperacin de antgenos
se llev a cabo utilizando una solucin de recuperacin objetivo ( Dako , Ely , Reino Unido,
http://www.dako.com ) . Liso monoclonal de ratn anti-humano
- actina de msculo ? , CD31 , p63 , citoqueratina - 7 , citoqueratina - 20 , y
HMB45 ( todos Dako ) fueron immunolabeled el uso de una peroxidasa acoplada
polmero de dextrano ( Envision , Dako ) . Los anticuerpos se visualizaron
utilizando 3,3 tetrahidrocloruro ? - diaminobencidina para crear un
producto de reaccin marrn , contratincin con hematoxilina
( Dako ) , y examinadas por microscopa de luz.
La tincin de inmunofluorescencia
La inmunotincin se realiz como se describi anteriormente [ 24 ] ,
con el burro y el suero de cabra C07SA de AbD Serotec (Raleigh ,
Carolina del Norte , http://www.ab-direct.com ) . Una lista de los anticuerpos primarios pueden
se encuentran en la Tabla suplementaria en lnea 2 .
Fosfatasa alcalina tincin de IPSC Colonias
Las clulas fueron fijadas en paraformaldehdo al 4% durante 20 minutos a 4 C
y despus se enjuaga tres veces en PBS seguido de fosfatasa alcalina
( AP ) solucin ( 0,1 M Tris , pH 9,5 , NaCl 0,1 M ) . eran
a continuacin, se incubaron durante 24 horas a 4 C en 10 ml de solucin de AP suplementado
con 200 ? l de Nitro azul tetrazolio ? 20 ? l de BCIP
( 5 - bromo - 4-cloro- 3indolyl - fosfatasa ; ningn catlogo S3771 ; . Promega ,
Madison, WI , http://www.promega.com ) . Por ltimo, las clulas
se lavaron con PBS una vez tincin fue completa .
Insercin Copia Anlisis Nmero viral
Anlisis de nmero de copias de la insercin viral se realiz como anteriormente
se describe [ 24 ] utilizando el Quant -iT Kit de ensayo de ADN , Amplio
Range ( Molecular Probes Q33135 ) con el nmero de copias virales
y la expresin de los transgenes - especfica y gen endgeno
primers que figuran en los cuadros en lnea suplementarios 3-5 .
RESULTADOS
Generacin y caracterizacin de Late- Consecuencia
Las clulas progenitoras endoteliales
Utilizando el protocolo modificado , hemos sido capaces de aislar L- EPC de
las personas estudiadas (n 25 ; ? los datos del paciente y el mtodo de aislamiento
se dan en la Tabla suplementaria lnea 6 ) . Late- consecuencia
EPC surgieron dentro de las culturas de la progenitora endotelial precoz
clulas (Fig. 1A ) . Early- EPC formado cultivos adherentes con un
morfologa de macrfagos derivados de los monocitos y predomin
en el frasco de cultivo hasta alrededor del da 15 , despus de lo cual seniles .
Sin embargo , L - EPC surgi alrededor del da 10 , formando entre
dos y siete colonias altamente proliferativas por matraz .
Estos se convierten en el tipo celular predominante exhibiendo un adoqun
morfologa se asemeja a cultivos de clulas endoteliales y eran
capaz de formar redes endoteliales similares a clulas in vitro . Aunque el
circulantes tipo de clula que da lugar a L - EPC est claro , una vez aparente
en la cultura fueron inequvocamente definen como CD31high :
CD34 : ? CD146 : ? Insercin de la quinasa del receptor de dominio : ? De von Willebrand
factor de : ? CD14 : ? CD45 ? (Fig. 1B , 1C ) . L - CPE eran altamente proliferativa ,
se duplica cada 24-28 horas , se pudo pasar (al menos 10
veces ) , y puede ser congelado y descongelado sin afectar a la viabilidad
o fenotipo de las clulas ( datos no mostrados ) . Es importante destacar que tambin
encontraron que las CPE se generan fcilmente a partir de preparaciones de PBMNC congelados
(n 3 ; ? suplementario Tabla lnea 6 ) , lo que hace que el almacenamiento
y el transporte de muestras sencillas . En este caso , tras
centrifugacin en gradiente de densidad , PBMNCs recin aisladas fueron
congelado en 90 % de FBS grado de clulas ES y 10 % de dimetilsulfxido . para confirmar
la robustez de la L - CPE como un sustrato celular , que deriva
CMPI utilizando clulas de sujetos de control sanos ( n ? 3 ) y desde
pacientes con hipertensin hereditaria arterial pulmonar (HAP ), una
condicin que se caracteriza por la disfuncin endotelial ( n ? 5 ) [ 25 ] .
Generacin y caracterizacin de EPC- iPSCs
Figura 2 proporciona una visin general del enfoque utilizado para generar
iPSCs de L- EPC . generacin de IPSC se llev a cabo por la norma
tcnicas que utilizan la expresin exgena de Oct4 , Sox2 , KLF4
y c-myc como se describi previamente por nuestros laboratorios para generar
fibroblastos-iPSCs [5, 24]. Hemos elegido utilizar mtodos retrovirales
ya que es el mtodo utilizado por la mayora de los laboratorios de reprogramar
fibroblastos y permite una comparacin con los resultados previos obtenidos
utilizando fibroblastos como el sustrato celular de partida [3-5]. Como se ha indicado
arriba, L-EPC se deriva de tres individuos de control sanos
(C3-EPC, C4-EPC y C7-EPC) y cinco pacientes con HAP (suplementarios
Tabla lnea 6). Tres pacientes llevan una mutacin en el
gen que codifica la protena morfogentica sea receptor de tipo II
(BMPR2), el gen ms comnmente mutado en HAP hereditaria [25].
De estos pacientes, las clulas progenitoras endoteliales (1-P1-EPC) y P2-EPC
llevado a una mutacin W9X, y P5-EPC lleva una mutacin C347R. en
dos pacientes (P3-P4-EPC y EPC) no se identific la mutacin BMPR2.
Como trminos de comparacin de la dinmica de reprogramacin se utiliz el fibroblasto
lneas CRL (Fibro1, de prepucio neonatal) y PEDB
(Fibro2, drmica de la piel tomada de un paciente varn de unos 50 aos),
demostrado previamente para reprogramar a iPSCs en el extremo superior de la
rango de eficiencia de la reprogramacin de fibroblastos [24] (un resumen de todos los
lneas de IPSC genera y caracterizacin realizado se pueden encontrar
en suplementario Tabla lnea 7).
Expresin de los marcadores de pluripotencia en todas las lneas confirm que
L-EPC reprogramadas a un estado parecido embrionarias humanas
clulas madre (Fig. 2B; suplementario en lnea la figura 1.). L-EPC-derivado
iPSCs (EPC-iPSCs) mostr desmetilacin del promotor OCT4
(Fig. 2C) y el silenciamiento apropiado de la reprogramacin exgeno
expresin del factor (. suplemental Fig. lnea 1), que introduce
a 1-2 copias por factores (Fig. 2D). La capacidad de diferenciacin
de EPC-iPSCs se puso a prueba in vitro. Se confirm la expresin
de los marcadores asociados con cada una de las tres capas germinales (ectodermo,
mesodermo, endodermo y) y los tejidos extraembryonic
(Fig. 3A) en todas las lneas EPC-IPSC. Adems, la prueba si EPCsiPSCs
podra generar teratomas in vivo mediante la inyeccin de clulas a partir
dos lneas (C7-EPC-IPSC lnea 1 y la lnea P1-EPC-IPSC 1) en inmunocomprometidos
ratones. El anlisis de los tumores resultantes claramente
estructuras demostradas y tipos de clulas especficos para cada uno de los
tres capas germinales, lo que confirma el carcter pluripotente de las reprogramado
EPCs (Fig. 3B). Tambin confirm que la BMPR2
mutaciones descritas en P1-P5-EPC y EPC tambin estuvieron presentes en
Lneas EPC-IPSC derivados de ellos (un BMPR2? Mutacin W9X en
La lnea 1 y un BMPR2 P1-EPC-IPSC? Mutacin C347R en P5-EPCiPSC
lnea 1, lnea suplementaria figura. 2).
La eficiencia y la cintica de la L-EPC Reprogramacin
Wenext evalu la cintica y la eficiencia de la reprogramacin de
L-EPC, el control de nuestro mtodo con la reprogramacin de dos de fibroblastos
lneas celulares anteriores se utilizan para generar IPSC [24]. Con L-EPC,
NANOG, y alcalinas colonias IPSC fosfatasa-positivos aparecieron
tan pronto como 10 das despus de la expresin de los factores de reprogramacin,
en comparacin con 15 das para los fibroblastos, lo que sugiere que la cintica
de L-EPC reprogramacin fue significativamente ms rpido (Fig. 4A, 4C). segundo
IPSC colonias formadas a partir de L- EPC con una eficiencia promedio de
0,22 % , alrededor de 10 veces ms frecuentemente que para los dos fibroblastos
lneas de prueba (Fig. 4B , 4C ) , sin embargo, las comparaciones directas entre
reprogramacin cintica y eficiencias no fueron probados
aqu , como los fibroblastos y EPCs no eran isognicas y eran
derivado diferente . No obstante la cintica y la eficiencia de
L - EPC reprogramacin se compara favorablemente con otros tipos de clulas
utilizado en el campo . Por lo tanto, decidimos tomar ventaja de
estas caractersticas de la L - EPC reprogramacin y diseado un mtodo
que podra ser utilizado para generar clulas iPS de un nmero limitado de
clulas en paralelo . Aadimos ya sea 4000 EPC o fibroblastos de
pocillos individuales de una placa de cultivo tisular de 96 pocillos y ellos infectados
con los factores de reprogramacin retroviral codificados . En el da 5
clulas alimentadoras MEF despus de la infeccin se aadieron a cada pocillo . las clulas
a continuacin, se dejaron durante otros 10 das y se tieron para fosfatasa alcalina
(Fig. 5A ) . colonias IPSC no se observaron en ninguno de los
12 pozos para cualquier lnea celular de fibroblastos utilizados , mientras que entre los tres
y se observaron seis colonias en 34 de 36 pozos para los tres L - EPC
lneas de prueba (Fig. 5B ) , proporcionando una prueba ms para el favorable
la eficiencia de la L - CPE como un sustrato celular y la demostracin de la
potencial de estas clulas tobeused en aplicaciones thatwouldbenefit
de una mayor generacin de rendimiento de iPSCs .
Anlisis Cariotipo de EPC- iPSCs
Una fuente potencial de la CNV en iPSCs es la adquisicin de anomalas
durante el envejecimiento de las clulas somticas in vivo o ex prolongada cultura
in vivo [ 26 -28 ] . Aunque se ha demostrado que el cariotipo de L- EPC
a ser normal [ 21 ] , no se han llevado a cabo anlisis de mayor resolucin .
Para probar la estabilidad genmica de L- CPE en la cultura nos
realizado gama de hibridacin genmica comparada ( aCGH )
anlisis en los pasajes 3-4 ( Tabla 1 ) en comparacin con el ADN de
recin aisladas monocitos CD14 ? de un mismo individuo . este
anlisis revel que los genomas de cinco de seis lneas L - EPC eran
ya sea idntica a su correspondiente referencia de monocitos emparejado
genoma o demuestra un aumento de copia de 13.1 kb en
1p21.3 . Esta regin contiene los genes LCE3B/LCE3C , previamente
vinculada con la susceptibilidad a la psoriasis [ 29 ] . La supresin de esta regin
segn lo evaluado por aCGH se produce en el 55% -71 % de la poblacin europea
el uso de ADN derivado de la sangre entera como el genoma de referencia
[ 29 ] . Es posible que la ocurrencia de las ganancias de copia independientes
de esta regin especfica en tres de los seis genomas L - EPC se explica
por la prdida comn de esta regin en la sangre derivada de CD14 ?
monocitos , que se utilizan como nuestro genoma de referencia . En una lnea L -EPC
( EPC - C6 ) una proporcin ( 20 % -30 % ) de la poblacin de L- EPC apareci
tener monosoma del cromosoma 18 , aunque la mayora
de las clulas que poseen un genoma emparejado . Por lo tanto , L - EPC aparece
demostrar un tranquilizador alto nivel de estabilidad gentica
en cultivo en comparacin con el genoma de referencia obtenido
a partir de monocitos circulantes recin aisladas .
Para determinar el impacto de la reprogramacin en el nmero de copias
variacin se realiz un anlisis aCGH en iPSCs cultivadas para 3-11 pasajes
en comparacin con sus correspondientes lneas parentales EPC . comparado
con L -EPC parental ADN , 9 de 11 lneas EPC- IPSC (derivadas de
tres lneas diferentes EPC ) no mostraron alteraciones genmicas detectables
( Tabla 2 ) . Las dos lneas de EPC- IPSC restantes demostraron sola
ganancias copia de las regiones de 36 o 632 kb en comparacin con el correspondiente
parental L - EPC genoma ( Tabla 2 ; suplementario en lnea la figura .
3 ) . No Interestinglywehave observedCNVsonchromosomes 8 , 12 ,
17 o 20 , inform que es comn en las clulas madre embrionarias humanas
y ( hiPSC ) lneas de IPSC humanos [ 3 , 4 , 26 , 28 ] . Los datos presentados aqu
demuestran que es posible generar iPSCs cuyos genomas
se alteran en comparacin con el tipo celular de sus padres en un significativo
proporcin de aislados .
Para examinar esto ms DNAfrom cuatro lneas, EPC- IPSC de dos
sujetos se compararon con el ADN combinado derivado de su
CD14 ? Monocitos . Una lnea de asunto C7 ( paso 10 ) mostr una
ganancia de copia nica y la prdida en relacin con el correspondiente emparejado
genoma monocitos cubren 230 kb. Las tres lneas del individuo
C4 ( a principios de los pasajes , 3-4 ) mostraron entre 10 y 17 el nmero de copias
Las ganancias y prdidas en comparacin con el genoma de monocitos emparejado
( suplementario Tabla 8 en lnea ), mientras que los fibroblastos IPSC en la
mismo pasaje se han descrito a tener ? 100 CNV [ 3 ] . En este
caso de que se observan CNVs en los cromosomas 8 , 12 , 17 y 20 .
DISCUSIN
El presente estudio demuestra que la L- EPC son altamente proliferativas ,
passageable y financiable y tienen cariotipos normales.
L - EPCs visualizacin cintica de reprogramacin altos y eficiencias
compatible con las plataformas de alto rendimiento , teniendo apenas 10 das
a surgir en la cultura y la formacin de colonias de IPSC alrededor de 10 veces
ms fcilmente que las dos lneas de fibroblastos que utilizamos como comparadores .
Tomando la tasa de expansin clonal de L - EPC ( tasa de duplicacin de
24-28 das ), junto con la observacin de que tan pocas como 4000
EPC pueden ser reprogramadas para generar cinco y cincuenta y siete colonias IPSC ,
el proceso de generacin EPC - IPSC directamente desde un perifrico
muestra de sangre podra tomar 24 das. Otros mtodos han sido
descrito que han informado hiPSCs generacin que utilicen policlonal
poblaciones de clulas de partida en menos tiempo . Sin embargo , si tenemos en cuenta
que (a ) tanto el padre L - EPC y lneas de IPSC son clonalmente
deriva , lo que permite las pruebas genticas significativas, ( b ) L- EPC tiene
un representante genoma de genoma normal de un sujeto , y ( c )
el tranquilizador alto grado de similitud gentica entre los EPCiPSCs
y sus L - EPC lnea parental , a continuacin, utilizando L - CPE como un punto de partida
celular para el perfeccionamiento de la tecnologa de IPSC para la medicina traslacional
aplicaciones tiene ventajas particulares .
Una pregunta que surge de nuestro estudio es la razn por L- EPC son tan
susceptibles de reprogramacin . Una razn podra ser que la L- EPC
poseen caractersticas progenitora - como , por ejemplo su alto
nivel de expresin de CD34 , cuando se compara con endotelial
clulas (Fig. 1 ) . Sin embargo , en los informes anteriores esto no se asoci
con una mayor eficiencia de reprogramacin [ 14 , 17 ] . otro
posibilidad es que las clulas del linaje endotelial son ms plstica
que es ampliamente pensamiento . Trabajos recientes han demostrado que la L- EPC puede
trans - diferenciar a un msculo liso -como fenotipo cuando se expone
a la hipoxia o factor de crecimiento transformante - ? 1 [ 30 ] . Adems ,
plasticidad endotelial hasbeendemonstrated en los informes anumberof
haveshownthat que estas clulas pueden transdiferenciarse en una variedad
de destino mesenquimales , incluyendo osteognico , condrognica , y adipognica
identidades [ 31-34 ] . Estudios adicionales sern necesarios para
descubrir los mecanismos moleculares por los que la biologa de la L - EPC
puede influir en la eficiencia de reprogramacin directa .
Otra cuestin es por qu EPC - iPSCs parecen ms karyotypically
similares a sus padres las lneas L- EPC que los estudios anteriores
han informado de fibroblastos - iPSCs . Aunque no hicimos un
comparacin directa entre los fibroblastos y las clulas iPS L -EPC derivados
en el presente estudio , los informes anteriores han demostrado que la gran
mayora de los fibroblastos - iPSCs acumulan CNVs significativas en comparacin
con su lnea de fibroblastos padre [ 3-5]. Hemos generado EPCiPSCs
y realizado anlisis aCGH en estas lneas que utilizan mtodos
comparables a los utilizados en uno de estos informes [ 5 ] . en
A diferencia de estos anlisis de fibroblastos iPSCs , EPC- iPSCs general
tener menos CNVs en comparacin con su lnea L -EPC padre .
Curiosamente , en comparacin con los fibroblastos , que representan una
poblacin policlonal , surgen lneas L- EPC individuales de una sola
clon o un pequeo nmero de colonias clonales ( menos de siete por
line) , por lo que la normalidad de iPSCs derivados de las lneas L- EPC,
reflejar la historia relativamente cerca de linaje de las clulas iPS y su
clulas progenitoras , en lugar de las propiedades nicas de L - EPC . o
As, L- EPC proporciona una herramienta potencialmente poderosa para el perfeccionamiento de la
proceso de reprogramacin para la produccin de genticamente sano
iPSCs para aplicaciones clnicas . La falta de coherencia en la
anlisis genmico de L- EPC frente iPSCs y iPSCs frente monocitos
demuestra la importancia de la referencia seleccionada
genoma para llegar a conclusiones sobre el genoma en evaluacin .
Las comparaciones L- EPC frente IPSC era probable que
mayormente normales debido a la naturaleza oligoclonales de CPE y la
hecho de que las clulas iPS resultantes se separaron de su parental
clulas por relativamente pocas divisiones celulares . Las comparaciones de los monocitos frente a IPSC
reflejar la diferencia entre iPSCs clonales y un promedio
genoma somtico policlonal . Variacin somtica subyacente puede
realizar la derivacin de iPSCs " genticamente puras " imposibles [ 26-28 ] ,
ya que tal estado no puede existir en vivo [ 27 ] . Estudios adicionales
ser necesario definir la presencia natural de los cambios genmicos
en las clulas somticas y de entender el significado y las consecuencias
de estas anomalas en las lneas de IPSC derivados. Adems , an ms
perfiles genticos y epigenticos , como la secuenciacin del exoma ,
ser necesario para evaluar plenamente la utilidad de EPC- iPSCs en regenerativo
aplicaciones . La posibilidad de derivar lneas L - EPC clonales
podra facilitar en gran medida estos estudios ya que simplificar la evaluacin
de la variacin resultante en iPSCs evitando el uso de potencialmente
poblaciones heterogneas de clulas somticas.
En los vectores retrovirales actuales del estudio se utilizaron para generar
EPC-iPSCs. Esto era necesario para que podamos comparar la utilidad
de L-EPC como un sustrato de reprogramacin en relacin a los anteriores
estudios, tanto en trminos de eficiencia de reprogramacin y genticos
anlisis. CMPI generados utilizando vectores retrovirales se pueden utilizar
eficazmente en las pantallas de drogas / toxicologa y en en la enfermedad in vitro
modelado, pero transgn libre de generacin de EPC-IPSC necesitar
ser optimizado para las aplicaciones clnicas. Una variedad de nuevos mtodos
se han desarrollado, tal como el virus Sendai [5], ARN modificado
[35], y episomas [36], cada uno con diversos grados de xito en
diferentes tipos de clulas y en diferentes laboratorios. Por lo tanto, una de las principales
objetivo futuro ser probar sistemticamente estos y otros mtodos
con L-EPC para generar ms clnicamente relevante EPC-iPSCs.
CONCLUSIN
L-EPC son fcilmente obtenibles a partir de sangre perifrica, con
manipulacin mnima. Su uso como una reprogramacin nuclear
sustrato permite la rutina, eficiente, y potencialmente highthroughput
generacin de clulas iPS, con la mayora de las lneas de IPSC
haber un cariotipo equivalente a la de su lnea somtica padres.