A Mechanism-Based Kinetic Analysis of Succinimide-

Mediated Deamidation, Racemization, and Covalent Adduct

Formation in a Model Peptide in Amorphous Lyophiles

The succinimide intermediate generated during deamidation of asparaginecontaining peptides
and proteins has been implicated as having a role in the formation of multiple types of
degradants in addition to hydrolysis products, including racemization products and, more
recently, amide-linked, nonreducible protein and peptide aggregates. The formation of
alternative degradants may be particularly important in solid-state formulations. This study
quantitatively examines the role of the succinimide intermediate in hydrolysis, racemization, and
covalent, amide-linked adduct formation in amorphous lyophiles. The degradation of a model
peptide, GlyPheL-AsnGly, and its L- or D-succinimide intermediates were examined in
lyophiles containing hydroxypropyl methylcellulose and varying amounts of excess GlyVal.
Disappearance of the starting reactants and formation of up to 10 degradants were monitored
when lyophiles were exposed to either 27C/40% relative humidity (RH) or 40C/75 RH using a
stability indicating high-performance liquid chromatography method. Terminal degradant
profiles were the same when the starting reactant was either GlyPheL-Asn Gly or its
succinimide intermediate. Nucleophilic attack occurred preferentially at the a-carbonyl of the
succinimide intermediate at ratios of approximately 2:1 for both water and the N-terminus of
GlyVal as the attacking nucleophiles. A mechanism-based kinetic model analysis indicates that
hydrolysis, racemization, and covalent, amide-linked adduct formation all proceed via the
succinimide intermediate.

MATERIALS AND METHODS
Reagents
The peptide GlyPheL-AsnGly and its hydrolysis products were synthesized by
GenScript (Piscataway, New Jersey) as trifluoroacetate salts with purities greater than 95% as
determined by highperformance liquid chromatography (HPLC). These compounds were further
characterized as previously described.32 The synthesis of the succinimide intermediates
(GlyPheD-AsuGly and GlyPheLAsuGly) and the characterization of covalent adduct
standards are described elsewhere.32 Hydroxypropyl methylcellulose (HPMC, Methocel E5)
was received as a free sample from Dow Chemical (Midland, Michigan) and used as received.
GlyVal was purchased from Bachem (Torrance, California) as the zwitterions (purity 99.0% by
thin layer chromatography). HPLC grade acetonitrile was purchased from Fisher Scientific
(Springfield, New Jersey). Sodium bicarbonate (ACS grade) was purchased from EM Science
(Gibbstown, New Jersey) and succinic acid was purchased from Aldrich (St. Louis, Missouri).
Deionized water was used throughout the experiments.

Kinetic Studies
Lyophiles containing GlyPheL-AsnGly in formulation A (7.5-fold molar excess of
GlyVal) were preequilibrated at 75% relative humidity (RH; over saturated sodium chloride
solution) and ambient temperature for 15 min then placed in a dessicator at the same RH and
40C. A lower temperature and RH were necessary to monitor the reactivities of formulations
B1, B2, and B3 to ensure that the breakdown of the succinimide intermediates would be slow
enough to allow the collection of multiple samples from which complete concentration versus
time profiles could be
generated. Therefore, lyophiles of formulations B1, B2, and B3 (-30-fold molar excess of Gly
Val) were placed directly in a dessicator at 27C containing a saturated solution of potassium
carbonate to provide an RH of 40%. At specific time points, samples were removed from the
chamber and reconstituted with the original fill volume of water. Hydrochloric acid (1N) was
used to adjust the pH of the reconstituted samples to quench the reactions and provide a similar
pH value as the HPLC mobile phase. Samples were either analyzedimmediately by HPLC or
frozen until the time of analysis.

Mechanism-Based Kinetic Model Development
A comprehensive reaction scheme based on the known mechanism of deamidation of Asn-
containing peptides coupled with the assumption that racemization and covalent, amide-linked
adduct formation also proceed through a succinimide intermediate is shown in
Figure 1. Differential equations based on the various pathways depicted in Figure 1 were derived
to simultaneously fit the concentration versus time profiles of each analyte (Eqs. 111). To
simplify the differential equations, the primary sequences of the individual compounds have
been removed and replaced with Roman numerals and subscripts to denote stereochemistry
as listed in Figure 1. The reaction scheme shown does not include possible additional, potential
decomposition products formed, for example, by reactions between the succinimide intermediate
and a second GlyPheL-AsnGly molecule or with excipient (i.e., HPMC) molecules, or
secondary degradation of the degradants described in Figure 1 to produce other covalent adducts
or hydrolysis products. In cases where mass balance was not achieved (e.g., in formulations
containing succinimide as the initial reactant), an additional pathway leading from either
succinimide to unknown products was included as designated by a rate constant kx. Included in
kx were rate constants for any pathways that were not explicitly included in fitting the data
because of the lack of ability to detect or quantify degradant
concentrations.

RESULTS
Lyophile Characterization
After lyophilization, the cakes obtained were white in color and occupied the same volume as the
original fill height. After storage at 75% RH and 40C, lyophiles of formulation A exhibited
partial collapse as indicated by some retraction of the cakes from the vial walls. However, no
evidence of crystallization was observed as indicated by the lack of birefringence under a
polarizing microscope. Upon exposure to storage conditions of 27C and 40% RH, lyophiles of
formulation B underwent partial collapse to approximately half of their original height. Evidence
of partial recrystallization of GlyVal was previously reported when lyophiles stored at 40C
and 40% RH were examined by polarized light microscopy (data not shown). Because of the
overwhelming excess of GlyVal in relation to succinimide in these formulations, the impact
of partial recrystallization of GlyVal on the reaction kinetics of interest in this study was
considered to be inconsequential. The average pH of samples reconstituted with the original
volume of water was 9.58 0.02 for formulation A and 9.36 0.06 for formulation B. The water
content for formulation A lyophiles was 2.4 0.6% and increased to 13.6 0.8% when exposed
to 40C and 75% RH. The water content of formulation B lyophiles was 3.5 0.7% after
lyophilization and 4.53 0.99% after storage at 40% RH and 27C.


DISCUSSION
As mentioned at the outset, many of the reaction pathways most prominent in pharmaceutical
systems are relatively well understood mechanistically, at least in aqueous solution, as a result of
many detailed investigative studies over several decades. Given the importance of reactive
intermediates in a majority of these pathways, an underlying hypothesis of the present work was
that this wealth of understanding of the mechanisms of formation and the ultimate fate of
reactive intermediates based on solution studies may prove useful in predicting or at least
rationalizing differences in reaction kinetics in amorphous solid formulations when compared
with solutions. Deamidation of asparagine residues in peptides and proteins, for example, is well
known to occur via a reactive cyclic imide intermediate, both in aqueous solutions11,12 and in
amorphous lyophiles,21,22 leading to both isoaspartyl and aspartyl hydrolysis products
accompanied by racemization. Recently, we demonstrated in aqueous solution that a more
diverse set of heretofore unidentified degradants may form from Asn-containing peptides and
proteins when other nucleophiles such as amines are present at sufficiently high effective
concentrations to compete with water for the succinimide intermediate.12 More recently, this
finding was extended to reactions of a model asparagine-containing peptide (GlyPheLAsn
Gly) in amorphous lyophiles containing an excess of a second peptide (GlyVal).32 A total of
10 degradation products were identified, including hydrolysis and racemization products as well
as four covalent adducts resulting from the attack of GlyVal on the D- and L-succinimide
intermediates. The same degradant profiles were found when the succinimide was the starting
reactant in lyophile formulations, implicating the cyclic imide as the intermediate for formation
of all degradants. The rationale for the incorporation of a second peptide (GlyVal) in these
studies was to reduce the number of potential degradants that might form. Because both GlyVal
and any amide-linked covalent adducts produced in the reaction of these two peptides would no
longer have an Asn residue, the tendency of the adducts to form higher order aggregates was
reduced. In this manuscript, studies of the same model peptides and the D- and L-succinimide
intermediates have been conducted with the aim of developing a comprehensive, mechanism-
based model to describe the kinetics of degradant formation in two different GlyPheL-Asn
Gly lyophile formulations and storage conditions that produce dramatic disparities in degradant
profiles.

CONCLUSION
A mechanism-based kinetic model that assigns a central role to the D- and L-succinimide
intermediates has been employed to quantitatively account for theformation of hydrolysis and
covalent, amide-linked degradants resulting from the deamidation of a model tetrapeptide in the
presence of excess GlyVal in lyophilized formulations. Terminal degradant profiles were the
same when the starting reactant was either GlyPheL-AsnGly or its L-succinimide
intermediate, further indicating that hydrolysis, racemization, and covalent, amide-linked adduct
formation all proceed via the succinimide intermediate. Nucleophilic attack occurred
preferentially at the "-carbonyl of the succinimide intermediate when the nucleophile was
either water or the N-terminus of GlyVal. The bimolecular reaction between the succinimide
intermediate and the free amine of another peptide reported here in suggests a likely mechanism
for the formation of amide-linked nonreducible aggregates in solidstate formulations of proteins
and peptides. Future studies will examine in a more systematic fashion the kinetics of formation
of hydrolysis and covalent adducts in similar formulations as a function of such variables as
water content and excipient dilution.




Sebuah Kinetic Analysis Mekanisme Berbasis suksinimida - Mediated deamidasi , rasemisasi ,
dan Formasi kovalen aduk dalam Peptida Model di Amorphous Lyophiles

The suksinimida menengah yang dihasilkan selama deamidasi dari asparaginecontaining peptida
dan protein telah terlibat sebagai memiliki peran dalam pembentukan beberapa jenis degradants
selain produk hidrolisis , termasuk produk rasemisasi dan , baru-baru ini , amida -linked ,
nonreducible protein dan peptida agregat . Pembentukan degradants alternatif mungkin sangat
penting dalam formulasi solid-state . Penelitian ini mengkaji secara kuantitatif peran suksinimida
menengah dalam hidrolisis , rasemisasi , dan kovalen , pembentukan aduk amida -linked di
lyophiles amorf . Degradasi model peptida , Gly - Phe - L - Asn - Gly , dan intermediet L - atau
D - succinimide yang diperiksa dalam lyophiles mengandung hidroksipropil metilselulosa dan
berbagai jumlah kelebihan Gly - Val . Hilangnya reaktan awal dan pembentukan hingga 10
degradants dipantau ketika lyophiles terkena baik 27 C/40 % kelembaban relatif ( RH ) atau 40
C/75 RH menggunakan stabilitas yang menunjukkan kinerja tinggi metode kromatografi cair .
Profil urai Terminal yang sama ketika reaktan awal adalah baik Gly - Phe - L - Asn - Gly atau
succinimide menengah nya . Serangan nukleofilik terjadi secara istimewa di a - karbonil dari
suksinimida menengah pada rasio sekitar 2:01 untuk air dan N - terminus dari Gly - Val sebagai
nukleofil menyerang . Sebuah kinetik model analisis berbasis mekanisme menunjukkan bahwa
hidrolisis , rasemisasi , dan kovalen , pembentukan aduk amida -linked semua melanjutkan
melalui suksinimida menengah.

BAHAN DAN METODE
Reagen
Peptida Gly - Phe - L - Asn - Gly dan produk hidrolisis yang disintesis oleh GenScript (
Piscataway , New Jersey ) sebagai garam trifluoroacetate dengan kemurnian lebih dari 95 %
seperti yang ditentukan dengan kromatografi cair berkinerja tinggi ( HPLC ) . Senyawa ini lebih
lanjut ditandai seperti sebelumnya described.32 Sintesis intermediet suksinimida
( Gly - Phe - D - Asu - Gly dan Gly - Phe - Lasu - Gly ) dan karakterisasi kovalen adisi
standar dijelaskan elsewhere.32 hidroksipropil metilselulosa ( HPMC , Methocel E5 ) diterima
sebagai sampel gratis dari Dow Chemical ( Midland , Michigan ) dan digunakan sebagai diterima
. Gly- Val dibeli dari BACHEM ( Torrance , California ) sebagai Zwitterions ( kemurnian 99,0
% dengan kromatografi lapis tipis ) . HPLC asetonitril dibeli dari Fisher Scientific ( Springfield ,
New Jersey ) . Sodium bikarbonat ( ACS grade) dibeli dari Ilmu EM
( Gibbstown , New Jersey ) dan asam suksinat dibeli dari Aldrich ( St Louis , Missouri ) . Air
deionisasi digunakan di seluruh percobaan .

Studi Kinetic
Lyophiles mengandung Gly - Phe - L - Asn - Gly dalam formulasi A ( molar 7,5 kali lipat lebih
dari Gly - Val ) yang preequilibrated pada 75 % kelembaban relatif ( RH , lebih larutan natrium
klorida jenuh ) dan suhu lingkungan selama 15 menit kemudian ditempatkan dalam dessicator
pada saat yang sama RH dan 40 C. Sebuah suhu yang lebih rendah dan RH yang diperlukan
untuk memantau reaktivitas formulasi B1 , B2 , dan B3 untuk memastikan bahwa kerusakan
pada intermediet suksinimida akan cukup lambat untuk memungkinkan pengumpulan sampel
dari beberapa yang konsentrasi penuh terhadap waktu profil bisa
dihasilkan . Oleh karena itu , lyophiles formulasi B1 , B2 , dan B3 ( - 30 - kali lipat molar
kelebihan Gly - Val ) ditempatkan langsung di dessicator pada 27 C yang mengandung larutan
jenuh kalium karbonat untuk memberikan RH 40 % . Pada titik waktu tertentu , sampel
dikeluarkan dari ruangan dan dilarutkan dengan volume mengisi asli air . Asam klorida ( 1N )
digunakan untuk mengatur pH sampel dilarutkan untuk memadamkan reaksi dan memberikan
nilai pH yang sama seperti fase gerak HPLC . Sampel yang baik analyzedimmediately oleh
HPLC atau beku sampai waktu analisis .

Mekanisme Berbasis Kinetic Pengembangan Model
Skema Reaksi komprehensif berdasarkan mekanisme yang dikenal dari deamidasi dari Asn
mengandung peptida ditambah dengan asumsi bahwa racemization dan kovalen , pembentukan
aduk amida -linked juga dilanjutkan melalui suksinimida antara ditunjukkan pada
Persamaan diferensial Gambar 1 . Didasarkan pada berbagai jalur digambarkan pada Gambar 1
berasal untuk secara bersamaan sesuai dengan konsentrasi terhadap profil waktu dari masing-
masing analit ( Eqs. 1-11 ) . Untuk menyederhanakan persamaan diferensial , urutan utama dari
senyawa individu telah dihapus dan diganti dengan angka Romawi dan subscript untuk
menunjukkan stereokimia
seperti yang tercantum pada Gambar 1 . Skema reaksi ditunjukkan tidak termasuk kemungkinan
tambahan , produk dekomposisi potensial terbentuk , misalnya, dengan reaksi antara suksinimida
menengah dan molekul Gly - Phe - L - Asn - Gly kedua atau dengan eksipien (yaitu , HPMC )
molekul , atau
degradasi sekunder dari degradants dijelaskan pada Gambar 1 untuk menghasilkan adduct
kovalen lain atau produk hidrolisis . Dalam kasus di mana keseimbangan massa tidak tercapai (
misalnya, dalam formulasi yang mengandung suksinimida sebagai reaktan awal) , jalur tambahan
terkemuka baik dari succinimide produk yang tidak diketahui dimasukkan sebagai ditunjuk oleh
kx konstanta laju . Termasuk dalam konstanta adalah tingkat kx untuk setiap jalur yang tidak
secara eksplisit dimasukkan dalam data pas karena kurangnya kemampuan untuk mendeteksi
atau mengukur urai
konsentrasi .

HASIL
Lyophile Karakterisasi
Setelah liofilisasi , kue yang diperoleh berwarna putih dan menduduki volume yang sama dengan
ketinggian mengisi original . Setelah penyimpanan pada 75 % RH dan 40 C , lyophiles
formulasi A dipamerkan runtuhnya parsial seperti yang ditunjukkan oleh beberapa pencabutan
dari kue dari dinding botol . Namun, tidak ada bukti kristalisasi diamati seperti yang ditunjukkan
oleh kurangnya birefringence di bawah mikroskop polarisasi . Setelah terpapar kondisi
penyimpanan 27 C dan 40 % RH , lyophiles formulasi B mengalami keruntuhan parsial untuk
sekitar setengah dari tinggi aslinya . Bukti rekristalisasi parsial Gly - Val sebelumnya dilaporkan
ketika lyophiles disimpan pada 40 C dan 40 % RH diperiksa dengan mikroskop cahaya
terpolarisasi ( data tidak ditampilkan ) . Karena kelebihan yang luar biasa dari Gly - Val dalam
kaitannya dengan succinimide dalam formulasi ini , dampak
rekristalisasi parsial Gly - Val pada kinetika reaksi menarik dalam penelitian ini dianggap tidak
penting . PH rata-rata dari sampel dilarutkan dengan volume asli dari air adalah 9,58 0,02
untuk formulasi A dan 9,36 0,06 untuk formulasi B. Air
konten untuk lyophiles Formulasi adalah 2,4 0,6 % dan meningkat menjadi 13,6 0,8 % bila
terkena 40 C dan 75 % RH . Kadar air lyophiles formulasi B adalah 3,5 0,7 % setelah
lyophilization dan 4,53 0,99% setelah penyimpanan pada 40 % RH dan 27 C.


PEMBAHASAN
Seperti disebutkan di awal , banyak jalur reaksi yang paling menonjol dalam sistem farmasi
relatif dipahami dengan baik secara mekanis , setidaknya dalam larutan berair , sebagai hasil dari
banyak studi investigasi rinci selama beberapa dekade . Mengingat pentingnya intermediet
reaktif dalam mayoritas jalur ini , hipotesis yang mendasari penelitian ini adalah bahwa kekayaan
ini pemahaman tentang mekanisme pembentukan dan nasib akhir intermediet reaktif berdasarkan
studi solusi mungkin berguna dalam memprediksi atau setidaknya rasionalisasi perbedaan
kinetika reaksi dalam formulasi padat amorf bila dibandingkan dengan solusi . Deamidasi residu
asparagin di peptida dan protein , misalnya, dikenal terjadi melalui imida siklik reaktif
menengah, baik dalam solutions11 berair , 12 dan lyophiles amorf , 21,22 mengarah ke kedua
isoaspartyl dan produk hidrolisis aspartil disertai racemization . Baru-baru ini , kami
menunjukkan dalam larutan berair bahwa satu set lebih beragam degradants sampai sekarang tak
dikenal mungkin terbentuk dari Asn mengandung peptida dan protein ketika nukleofil lainnya
seperti amina hadir pada konsentrasi yang efektif cukup tinggi untuk bersaing dengan air untuk
intermediate.12 suksinimida Baru-baru ini , temuan ini diperpanjang sampai reaksi dari model
asparagin yang mengandung peptida ( Gly - Phe - LAsn -
Gly ) di lyophiles amorf yang mengandung kelebihan peptida kedua ( Gly - Val ) .32 Sebanyak
10 produk degradasi diidentifikasi , termasuk hidrolisis dan racemization produk serta empat
adisi kovalen akibat serangan Gly - Val pada D - dan L - succinimide intermediet . Profil urai
sama ditemukan ketika succinimide adalah reaktan mulai formulasi lyophile , melibatkan para
imida siklik sebagai perantara untuk pembentukan semua degradants . Alasan untuk
penggabungan kedua peptida ( Gly - Val ) dalam studi ini adalah untuk mengurangi jumlah
degradants potensial yang mungkin terbentuk . Karena kedua Gly - Val dan setiap adduct
kovalen amida - linked yang dihasilkan pada reaksi dari dua peptida ini tidak lagi memiliki
residu Asn , kecenderungan adisi untuk membentuk agregat yang lebih tinggi agar berkurang .
Dalam naskah ini , studi tentang peptida model yang sama dan D - dan L - succinimide
intermediet telah dilakukan dengan tujuan untuk mengembangkan komprehensif , model berbasis
mekanisme untuk menggambarkan kinetika pembentukan urai dalam dua berbeda Gly - Phe - L -
Asn - Gly lyophile formulasi dan kondisi penyimpanan yang menghasilkan perbedaan dramatis
dalam profil urai .

KESIMPULAN
Sebuah model kinetik berbasis mekanisme yang memberikan peran sentral bagi L - suksinimida
intermediet D - dan telah digunakan untuk kuantitatif account untuk theformation hidrolisis dan
kovalen , degradants amida -linked yang dihasilkan dari deamidasi model tetrapeptide dengan
adanya kelebihan Gly- Val dalam formulasi lyophilized . Profil urai Terminal yang sama ketika
reaktan awal adalah baik Gly - Phe - L - Asn - Gly atau nya L - suksinimida menengah, lanjut
menunjukkan bahwa hidrolisis , rasemisasi , dan kovalen , pembentukan aduk amida -linked
semua melanjutkan melalui suksinimida menengah. Serangan nukleofilik terjadi secara istimewa
di " - karbonil dari suksinimida perantara ketika nukleofil itu
baik air atau N - terminus dari Gly - Val . Reaksi biomolekuler antara suksinimida menengah dan
amina bebas dari peptida lain yang dilaporkan di sini menunjukkan mekanisme kemungkinan
untuk pembentukan amida -linked agregat nonreducible dalam formulasi solidstate protein dan
peptida . Penelitian selanjutnya akan memeriksa dengan cara yang lebih sistematis kinetika
pembentukan hidrolisis dan kovalen aduk dalam formulasi yang sama sebagai fungsi dari
variabel seperti kadar air dan eksipien pengenceran .